专利名称：：一种特异和高效的南瓜pp2基因启动子的制作方法
技术领域：
：本发明属于植物基因工程领域，具体的说，本发明涉及调控目的基因在植物韧皮部组织特异和高效表达的新的DNA序列，包含所说的DNA序列与报告基因的融合构建体，携带该构建体的重组表达载体，以及由所说的表达载体转化植物外植体所产生的组织特异性表达外源基因的转基因植物。韧皮部(phloem)是植物长距离运输光合产物的重要组织。筛管元件(sieveelement)是由高度专化的韧皮部细胞组成，是涉及长距离运输的最重要的组织。韧皮部蛋白(phloemprotein，P蛋白)是筛管细胞质中的主要成分，在韧皮部组织发育的早期即开始合成，并一直持续存在到韧皮部老化期。在分化后的筛管细胞中的P蛋白由筛管细胞-伴胞细胞复合体中的伴胞细胞合成，然后转运到筛管细胞(ThompsonGAandSchulz,ATIPS4:354-360,1999)。1975年，Eschrich等(Eschrich,W.,in:TransportinPlantsI.PhloemTransport.,M.H.ZimmermanandJ.A.Milburn,Eds,pp.39-56,1975)通过解剖学观察及结合P蛋白的物理学特征指出，P蛋白可能通过损伤的封闭机制，防止植物光合产物从破损的筛管细胞流失。葫芦科植物许多种的韧皮部组织由较大直径的筛管细胞构成，从这些筛管细胞中可以很容易地收集到富含P蛋白的渗出液。已从葫芦科植物韧皮部渗出液收集物中分离鉴定到两种含量极为丰富的P蛋白PP1(韧皮部蛋白1)和PP2(韧皮部蛋白2)。PP1蛋白分子量96千道尔顿(80-136KDa)；Beyenbach等人(Beyenbach,etal.,Planta119:113-124,1974；Koliman,etal.,Planta95:86-94,1970；Read,etal.,Eur.J.Biochem.134:561-569,1983)的研究认为，PP2蛋白分子量48千道尔顿，是一种二聚体凝集素。此外Beyenbach等(Beyenbach,etal.,Supra；Weber,etal.,Exp.CellRes.87:79-106,1974)认为，PP1和PP2都是碱性蛋白质(PI9.6-10.4)，有相似的氨基酸组成，富含赖氨酸(Lys)、亮氨酸(Leu)、甘氨酸(Gly)、谷氨酸(Glx)和天冬氨酸(Asx)，是活体(invivo)植物韧皮纤维构成成分。对于PP1蛋白，Beyenbach等(Beyenbach,etal.,Planta119:113-124,1974；Read,etal.,Eur.J.Biochem.134:561-569,1983；Sabnisetal.,Planta145:459-466,1979；Walker,Biochem.Biophys.Acta257:433-444,1972)研究表明，PP1单体通过在半胱氨酸之间形成共价二硫键而相互交联形成多聚体。Read等(Read,etal.,Eur.J.Biochem,134:561-569,1983；Walker,Biochem.Biophys.Acta257:433-444,1972；Waller,etal.,AnnBot35:733-790,1971)的研究发现，通过体外(invitro)氧化，纯化的PP1产生明显的纤丝，因而认为PP1作为主要的结构蛋白参与形成在电镜下可见的在受损伤维管组织处产生的凝集小块。对于PP2蛋白，Allen等(Allen,Biochem.J.183:133-137,1979；Beyenbach,etal.,Planta119:113-124,1974；Read,etal.,Eur.J.Biochem134:561-569,1983；Sabnis,etal.,Planta142:97-101,1978)研究揭示PP2是一种凝集素，特异性结合多聚β-1,4-N-乙酰葡萄糖胺或几丁质。此外，Read等(Read,etal.,Eur.J.Biochem.134:561-569,1983)研究认为PP2二聚体由两种不同的亚单位α(Mr26,500)和β(Mr25,000)构成，这两种亚单位通过在半胱氨酸残基之间形成二硫键而结合。但Thompson等(GaryA.Thompson,etal.,US005495007A,1996)研究认为PP2是同源二聚体，由相似的亚单位构成。Kleinig等(Kleinig,etal.,Planta127:163-170,1975；Read,etal.,Eur.J.Biochem.134:56l-569,1983:Read,etal.,Planta158:119-127,1983)指出纯化的PP2蛋白在避免暴露于空气中或氧化剂中被氧化的情况下保持可溶性，且与PP1蛋白通过二硫键桥共价联结构成植物韧皮部纤丝的组成成分。Read等(Read,etal.,Eur.J.Biochem.134:561-569,1983)指出P蛋白纤丝中也可能包含第三种共价交联蛋白。这种蛋白是一种碱性蛋白，分子量45kDa，与PP1和PP2蛋白相比其含量很低，目前对这种蛋白与PP1和PP2蛋白之间的相互关系知之甚少。此外，葫芦科植物韧皮部渗出液的SDS-PAGE电泳还呈现出7-10种低分子量的多肽(9-20kDa)，但它们可能不是P-蛋白。Crafts(Crafts,PlantPhysiol.7:183-225,1932)指出葫芦科植物韧皮部包含不同的类型，由其结构，来源及其在茎中的分布相区别。葫芦科是几种具有双韧皮部维管束的植物科之一，其维管束中包含内韧皮部和外韧皮部。葫芦科植物还存在外维管束韧皮部，增加了其韧皮部解剖学的复杂性。Blyth等(Blyth,Originofprimaryextraxylarystemfibersindicotyledons.Univ.Cal.BerkeleyPubl.Bot.30:145-232,1958；Crafts,PlantPhysiol.7:183-225,1932)揭示外维管束韧皮部在葫芦科植物的树皮中成束产生，弧形镶邻于双韧皮部维管束的两边。Evert等(Evert,etal.,Planta109:193～210,1973)认为植物长距离输送光合产物是在双韧皮部维管束的筛管细胞中而不是在外维管束韧皮部细胞中进行。Cornshaw等(Cornshaw,etal.,J.Cell.Biol.38:25-39,1968)从超微结构水平对葫芦科植物茎的筛管细胞在发育期间的蛋白积累进行了描述。在未成熟筛管细胞中，观察到P蛋白以原纤丝的小的聚集体形式存在于细胞质之中，与核糖体、内质网及高尔基体相间混杂在一起。通常，双韧皮部维管束筛管细胞中P蛋白体分散存在，然而外维管束筛管细胞的中P-蛋白体则保持聚集。Kulikova(Kulikova,SovietPlantPhysiol.39:734-739,1992)研究指出，改变筛管细胞中的环境特别是改变渗透势会引起P-蛋白体分散而产生P蛋白丝。葫芦科植物的叶也具有双韧皮部维管束，包含远轴韧皮部和近轴韧皮部。Turgeon等(Turgeon,etal.,Planta129:265-269,1976)认为远轴韧皮部组织在近轴韧皮部组织之后发育成熟，似乎是光合产物从叶输出的初级途径，而近轴韧皮部组织可能运输光合同化物到充当同化物汇集库的正在伸展叶的叶肉组织之中。Turgeon等(Turgeon,etal.,Protoplasma83:217-232,1975)发现在筛管细胞发育期，P蛋白体在远轴和近轴韧皮部中聚集。在成熟的远轴筛管细胞中，大多数P蛋白是分散的，呈纤丝状，而在成熟的近轴筛管细胞中P蛋白保持凝聚，类似于茎中的外维管束韧皮部。近些年，由于对韧皮部的长距离运输功能的兴趣，已鉴定了一些驱动韧皮部组织基因表达的启动子。然而，在许多情况下，这些启动子也驱动基因表达在非韧皮部组织发生。Benfey等(Benfeyetal.,EMBOJ,9[6],1685-1696,1990)从病毒，Kononowicz等(Kononowiczetal.,PlantCell4:17-27,1992)从土壤农杆菌和Liang等(Liangetal.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA86:9384-9288,1989；KellerandBaumgartner,PlantCell3:1051-1061)从植物中分别克隆、鉴定了一些驱动维管束基因表达的启动子。从韧皮部积聚的DNA病毒中也分离到韧皮部特异基因表达的启动子。如Bhattacharyya-Pakrasi等(Bhattacharyya-Pakrasietal.,PlantJ.4[1]71-79,1993)从水稻tungro病毒和Medberry等(Medberryetal.,Plantcell.4:185-192,1992)从竹节花黄斑驳病毒(commelinayellowmottlevirus)中分别分离到的韧皮部特异启动子。此外，Yang等(YangandRussell,Proc.Natl.Acad.Sci.USA87:4144-4148,1990)研究了庶糖合酶，Edwards等(Edwardsetal.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA:3459-3463,1990)研究了谷氨酰胺合成酶和DeWitt等(DeWittetal.,PlantJ.1[1]:121-128,1991)研究了一种细胞膜H+-ATPase的韧皮部特异异构体，分别揭示了这些编码与韧皮部功能相关蛋白的植物基因的转录调节序列驱动报告基因在植物韧皮部特异表达。本发明涉及本发明人所首次克隆的具有植物韧皮部特异性的南瓜韧皮部蛋白2基因启动子的DNA序列，包含所说DNA序列与GUS基因编码区的构建体，携带该构建体的新的重组表达载体，被所说的表达载体转化的植物组织，以及由所说的植物组织产生的在韧皮部组织特异表达报告基因的转基因植物。韧皮部是植物维管组织的一部分，由于负责植物体内糖等有机营养从叶到其它组织器官的运输而成为许多植物病原微生物和害虫，如刺吸式昆虫蚜虫、飞虱和叶蝉等的直接侵害目标。剌吸式昆虫不仅严重危害农作物，而且是植物病毒在自然界传播的最重要媒介。据统计85％以上的虫媒病毒由这类昆虫传播，如黄瓜花叶病毒(CMV)、马铃薯Y病毒(PVY)、香蕉束顶病毒(RBTV)和马铃薯卷叶病毒(PLRV)由蚜虫传播，水稻黑条矮缩病毒(RBSDV)、水稻条纹叶枯病毒(RSV)、小麦丛矮病毒由飞虱传播，水稻黄矮病毒(RYSV)、水稻Tungro病毒由叶蝉传播。抗虫、抗病基因工程中常用的组成型表达启动子，驱动目的基因在植物体内各部位平均表达，难以在受侵害组织形成较高的作用浓度，而在非侵害部位表达对植物本身是一种额外负担和能源及养分的浪费；如果利用韧皮部组织特异表达启动子使抗虫、抗病基因在韧皮部组织特异地高效表达，就可以更有效、更经济地发挥目的基因的作用，有针对性地防治从韧皮部入侵的病原微生物和害虫的危害，还可降低对害虫及病原微生物的选择压以及可能对环境产生的副作用，减轻植物对抗虫、抗病基因产物的代谢负担。此外，在双价或多价抗虫、抗病基因工程中使用与组成型启动子不同的韧皮部组织特异型启动子可避免启动子之间同源序列的相互作用而导致基因沉默。另一方面，研究植物基因组织特异表达的调控方式对于了解植物组织器官分化及基因调控规律也具有重要的理论意义。南瓜韧皮部蛋白2(phloemprotein2fromCucurbitamoschataDuch，以下简称为南瓜PP2)是一种定位于南瓜植物韧皮部组织中的纤丝蛋白，表达量很高。南瓜PP2由南瓜PP2基因编码，其韧皮部组织特异性表达是由南瓜PP2基因5’端非编码区，即南瓜PP2基因启动子来调控的。有几种为本领域技术人员所熟知的分子生物学方法可以用来获得南瓜PP2基因启动子的核苷酸序列。例如，可以根据所知的南瓜PP2基因的cDNA序列设计合成引物，从南瓜基因组文库中以基因组DNA步移法扩增启动子片段。也可根据南瓜PP2cDNA序列制备探针或引物，用杂交的方法或体外多聚酶链式反应的合成方式从南瓜染色体组文库中“钓”取完整的序列。在未知南瓜PP2cDNA序列情况下可分离南瓜PP2蛋白，制备单克隆或多克隆抗体，与cDNA表达文库杂交从而获得南瓜PP2cDNA序列，然后依此序列制备探针，从南瓜染色体组文库中通过杂交获得包含启动子序列在内的完整序列。也可测出所分离的南瓜PP2蛋白的部分氨基酸残基序列，由此序列设计合成寡核苷酸探针用于由杂交方法获取南瓜PP2启动子序列。本发明采用基因组DNA步移法，根据南瓜PP2基因的核苷酸序列设计引物，从南瓜基因组DNA文库中克隆了南瓜PP2基因启动子。该启动子的核苷酸序列见附图1所示。考虑到同属一科的植物种之间基因的核苷酸序列的同源性，也可使用上述根据南瓜PP2cDNA序列设计制备的探针或引物，采用与获取南瓜PP2启动子序列相类似的方法，从别的葫芦科植物种，如笋瓜、西葫芦或瓠果的基因组文库中获得其PP2基因启动子。本发明下文所要叙述的实施例揭示本发明人所首次获得的南瓜PP2启动子序列1115bp片段(序列如附图1所示)的部分片段855bp(序列如附图2所示)完全足以驱动目的基因编码区的核苷酸序列在转基因植物的韧皮部组织特异表达。分子生物学领域技术人员能够理解，小的缺失、增加和少量点突变很可能不会改变1115bp序列片段的功能，该片段的许多核苷酸残基可能对于其独特的功能并不重要。为了搞清改变后的序列是否还具有原序列的功能，可以产生一系列缺失，增加或突变改造的片段，将改造片段与目的基因编码区的核苷酸序列构建在一起，通过如下文实施例所述的在转基因植物中检测基因组织特异性表达的方法来对此基因构建体进行研究。如果对如上所述1115bp序列进行缺失分析，设计一系列截短了的启动子片段，与报告基因融合并转化植物，进行启动子活性的定性、定量分析，将能获知决定韧皮部组织特异性表达的顺式元件以及能最有效地特异转录目的基因编码区的核苷酸序列的最佳启动子片段。本发明涉及南瓜PP2启动子的DNA序列，包含所说DNA序列的能有效地调控目的基因在植物韧皮部细胞特异表达的部分片段，所述的片段与目的基因编码区的核苷酸序列的融合基因构建体，用所述的融合基因构建体转化植物外植体及再生植株的方法，以及由此产生的显著地在韧皮部特异表达目的基因的转基因植物。本发明要求所述启动子的核苷酸序列的全部或部分片段与目的基因编码区的核苷酸序列相融合产生融合基因构建体。在分子生物学中为本领域技术人员所熟知的常用方法都可用于对该启动子的核苷酸序列进行操作。本发明所述的“产生融合基因构建体”可使用将启动子序列与目的基因编码区的核苷酸序列相结合的许多方法中的任何一种方法来实现。最典型的方法是将启动子的核苷酸序列连接在目的基因编码区核苷酸序列的5′端或“上游区”。例如，将本发明所述的南瓜PP2启动子的核苷酸序列的全部或部分片段与目的基因编码区的核苷酸序列在一质粒载体或病毒载体上相连接产生重组质粒或重组病毒载体。其它一些转录或翻译的调控序列，如35S增强子、Ω序列、分泌信号肽序列、内质网滞留信号肽序列、polyA、3′UTR序列、MAR序列和终止序列都可以加到该基因构建体上。本发明所说的“目的基因编码区的核苷酸序列”指任何能在mRNA水平表达的核苷酸序列。所表达的mRNA被翻译成蛋白或不翻成蛋白，也就是说目的基因编码区的核苷酸序列是有义方向或反义方向的。反义方向的目的基因编码区的核苷酸序列可用于表达反义RNA。报告基因的广泛应用极大地促进了组织特异性启动子的研究。这一研究方法将组织特异性基因的5’端调控序列与报告基因融合，构建成嵌合基因导入植物体中，通过研究报告基因的定性，定量表达特性来探知调控序列的功能。常用的报告基因有CAT基因、GUS基因、荧光素酶(luciferase,LUC)基因和绿色荧光蛋白(GFP)基因等。GUS基因编码β-葡萄糖苷酸酶，可以在体外催化裂解人工合成的X-Gluc(5-溴-4-氯-3-吲哚葡萄糖醛酸苷)底物，产生深蓝色化合物沉淀于植物组织，由此可对启动子调控的外源基因表达进行组织化学定位；β-葡萄糖苷酸酶还可催化4-MUG(4-甲基伞形酮酰-β-葡萄糖醛酸苷)裂解形成萤光物质4-MU(4-甲基伞形酮)，使用荧光光度计可对4-MU进行定量测定，由此获知所研究启动子调控外源基因表达的活性。荧光素酶基因编码的荧光素酶催化荧光素氧化，释放出荧光，可用液闪计数器进行定量测定，由此可定量描述所用的调控序列的活性。GUS基因和荧光素酶基因在植物细胞内的非特异性本底都很低，因而适合于对基因产物进行定量分析。在本发明中，发明人使用GUS、LUC报告基因对发明人首次克隆的南瓜PP2启动子的功能进行了定性和定量分析研究。本发明将首次克隆的南瓜PP2启动子与GUS报告基因的编码区核苷酸序列相融合产生了可用于植物表达的重组质粒pBNG，并将此重组质粒分别转化入大肠杆菌和农杆菌产生了重组微生物以便于进行植物转化。在转基因植物研究中，由于转基因整合的位置效应，即转基因整合在植物染色体的不同位置，其表达受到植物染色体不同程度的影响，表现出不同的表达水平。预计在本发明所涉及的南瓜PP2基因启动子的活性定量研究中，同样会有位置效应，导致不同的转基因植株具有不同的外源基因表达水平，从而影响对启动子的活性作出准确判断。在本发明中，为了消除位置效应的影响，发明人使用了内参基因构建双价植物报告基因表达载体。本发明在前述重组质粒pBNG中南瓜PP2基因启动子与GUS报告基因的编码区核苷酸序列相融合产生的基因构建体的基础上，使用CaMV35S启动子与内参LUC基因融合得到了另一个基因构建体，并使这两个构建体以各自相反的转录方向连接在一起，目的是尽量减少两者在转录起始和转录终止水平上可能产生的相互影响；这样产生了一个新的重组质粒，发明人将其命名为pBL3NG。为了进行植物转化研究，发明人将重组质粒pBL3NG分别转化入大肠埃希氏杆菌(Escherichiacoli)DH5α。由于上述GUS基因和内参LUC基因皆构建在同一个整合区之中，在进行植物转化时它们将整合在植物染色体的同一位置，受同样的影响，并将具有相当的表达水平，这样就可以用内参LUC基因的表达来校正GUS基因的表达。即对于不同的转基因植株，每一植株的GUS表达活性除以LUC表达活性后将具有很相近的数值，这样就能够有效地消除位置效应，更为准确地定量描述本发明所涉及的南瓜PP2启动子的活性。在本发明中，发明人使用叶盘转化法在含有重组质粒pBL3NG的农杆菌的介导下将含有本发明所首次克隆的南瓜PP2启动子融合GUS基因编码区的核苷酸序列以及以35S启动子融合内参LUC基因编码区的核苷酸序列的双价基因构建体导入植物染色体产生了转基因植物。本发明申请人已于1999年8月将本发明构建的含有南瓜PP2启动子855bp片段融合GUS基因编码区的核苷酸序列以及以35S启动子融合内参LUC基因编码区的核苷酸序列的双价报告基因植物中间表达载体pBL3NG的大肠杆菌DH5α转化子保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。保藏登记号为CGMCCNO.0410。本发明涉及调控目的基因编码区的核苷酸序列在韧皮部组织特异表达的启动子。所说的“韧皮部组织特异表达”指在韧皮部组织的表达水平显著高于在其它植物组织部位的表达。本发明所克隆的南瓜PP2启动子的序列与Bostwick等人(BostwicketalPlantMolecularBiology26:887-8971994)及蒋浩等人(蒋浩等农业生物技术学报7(1):63-681999)已发表的笋瓜PP2启动子的序列相比较，同源性只有50％，并且Bostwick等人未对他们发表的那段序列的功能进行研究。所以本发明的启动子应是一个新的韧皮部组织特异性启动子。本发明使用5’RACE分析方法搞清了所克隆的南瓜PP2启动子驱动目的基因表达时的转录起始位点，为如附图1、2中所示的标记为“+1”的腺苷酸“A”。下面结合附图对本发明作进一步详细描述。图1克隆的南瓜PP2基因启动子的核苷酸序列。图2亚克隆的南瓜PP2基因启动子855bp片段的核苷酸序列。图3用于南瓜基因组文库构建的连接子(adapter)序列的正、负链以及连接子(adapter)序列。图4用于南瓜PP2基因启动子克隆的连接子引物(AP-1、2)。图5用于南瓜PP2基因启动子克隆的基因特异性引物(GSP-1、2)。图6用于南瓜PP2基因启动子855bp片段克隆的引物(NP-1、2)。图7用于南瓜PP2基因5′RACE分析的基因特异性引物(GSP-Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ)。图8植物中间表达载体pBL3NG和的构建图解。图9转南瓜PP2基因启动子-GUS基因构建体在烟草中的GUS活性组织化学定位。(a．叶片；b．叶柄横截面；c．茎纵切面)图10转pBL3NG和pBL3CG烟草的Southern杂交检测。(1．阳性对照4.7H/B和GUS1.8f；2．HindⅢ酶解的非转基因烟草DNA；3．HindⅢ酶解的转pBL3NG烟草DNA；4．HindⅢ酶解的转pBL3CG烟草DNA。)实施例南瓜PP2基因启动子核苷酸序列的克隆及其驱动GUS基因的表达特点一．采用抑制PCR(SuppressionPCR)作基因组DNA步移，从南瓜基因组文库中克隆到南瓜PP2基因启动子核苷酸序列。1．连接物(adapter)的制备用AppliedBiosystemsInc.的380ADNA合成仪(中科院微生物所技术中心)分别合成连接物的两条寡核苷酸片段(序列见附图4)并经C18柱纯化，然后以氯仿抽提和2.5倍95％的乙醇在-80℃沉淀1小时，离心(10,000rpm,30min.)收集寡核苷酸沉淀，真空干燥后溶于一定体积的无菌蒸馏水中，经测在260nm的光密度来计算引物的浓度。为了使上述两条片段复性，各取1nmol，再加入1ulNaCl(1mol/L)的和2ul10×TE(100mmol/lTris-HCl,pH8.0和1mmol/lEDTA)，以双蒸水定容至20ul，在80℃加热5分钟，离心(10,000rpm,1min.),将混和物在室温放置(复性)15分钟，然后贮存于-20℃。如上制备好的adapter的序列如附图3所示。2．南瓜基因组DNA的提取使用核抽提裂解法(AndrewH.Paterson,CurtL.Brubaker,andJonathanF.WendelPlantMolecularBiologyReporter,Vol11(2):122-127,1993)制备南瓜基因组DNA。取新鲜幼嫩南瓜(Cucurbitamoschata)叶片约1克，在液氮中研成粉，加入5ml核提取缓冲液(0.35mol/l葡萄糖，0.1mol/lTris-HCl,pH8.0,5mmol/lNa2-EDTA,pH8.0,2％(w/v)polyvinylpyrolidone(PVP40)和0.1％(w/v)diethyldithiocarbamicacid(DIECA)，用前加入0.2％(w/v)巯基乙醇和0.5％(w/v)Triton-x-100)，混匀，4℃离心(5,000rpm,5min.)，弃上清，往沉淀(核)中加入2ml核裂解缓冲液(0.1mol/lTris-HCl(pH8.0),1.4mol/lNaCl,20mmol/lNa2-EDTA(pH8.0),2％(w/v)hexadecyltriammoniumbromide(CTAB),2％(w/v)PVP40和0.1％(w/v)DIECA，用前再加入0.2％(v/v)硫基乙醇和0.5％TritonX-100)，充分悬浮，在65℃水浴保温30分钟，加入2.5ml氯仿∶异戊醇(24∶1)，上下巅倒离心管10～50次抽提蛋白，4℃离心(6,000rpm,5min.)，吸取上清，在上清中加入0.6倍体积的异丙醇，缓慢地上下巅到离心管10-20次直至DNA沉淀产生，4℃离心(10,000rpm,5min.)沉淀DNA，以70％乙醇洗涤DNA沉淀2次，室温(或37℃)使DNA干燥。加入500ulTE(10mmol/lTris-HCl,pH8.0，0.1mmol/lEDTA)溶解DNA，然后65℃保温30分钟以灭活可能残留的脱氧核糖核酸酶，冷却至室温后用于酶切或贮存于4℃或-20℃。3．基因组文库构建取步骤2制备的基因组DNA0.5-1.0ug，在200ul缓冲体系中分别以EcoRⅤ、ScaⅠ、StuⅠ、DraⅠ和PvuⅡ五种限制性核酸内切酶在37℃消化12小时以上，然后加入20ug糖原(glycogen)、20ulNaAc(3mol/L,pH5.2)、100ul0.1mol/LTris-HCl饱和酚(pH8.0)和100ul氯仿，混匀，离心(12,000rpm,10min)，吸取上清液，再以等体积氯仿抽提，吸取上清，加入500ul95％乙醇，混匀，离心(10,000rpm,10min)沉淀DNA，以80％乙醇洗涤沉淀两次，室温干燥DNA，加入15ulTE(10mmol/lTris-HCl,pH8.0,0.1mmol/LEDTA)溶解DNA。取上述DNA溶液7ul在l7℃进行连接。在0.5mlEppendorf管中加入7ul酶解DNA、1ul连接缓冲液(10×)、0.5ul0.2mmol/LATP、0.5ul步骤1制备的adapter(50umol/L)和1ulT4DNA连接酶(lunit),混匀，17℃连接24小时以上，加入90ulTE(10mmol/lTris-HCl,pH8.0,0.1mmol/lEDTA)，混匀，70℃灭活连接酶5分钟。4．基因组DNA步移和扩增取1ul步骤3中制备的基因组文库DNA进行扩增。使用珀金一埃尔默(PerkinElmer)LAPCR系统，在24ul扩增体系中含有1ul步骤3中制备的基因组文库DNA、2.4ul扩增缓冲液、2.4uldNTPs(2mmol/L)、1.2ulMg(Ac)2(2.5mmol/L)、0.5ulAP-1引物(20umol/L)、0.5ulGSP-1引物(20umol/L)、0.3ulTaqpolymerase(2units/ul)和11.7ul重蒸水。手控热启始PCR，然后执行30次循环，每次循环由96℃变性7秒，62℃复性30秒和68℃延伸3分钟构成。从上述扩增反应物中取1ul稀释到100ul重蒸水中，然后取1ul作为模板，以AP-2引物和南瓜PP2基因特异性巢式引物GSP-2作巢式PCR，扩增条件与上述第一次PCR相同。再取巢式PCR扩增产物1ul稀释到100ul重蒸水中作为模板进行第三次PCR，提高复性温度为65℃，减少执行循环数为25次，其它条件与巢式PCR相同。如上所用AP-1、2引物的序列见附图4所示，GSP-1、2引物的序列见附图5所示。分别从StuⅠ和PvuⅡ消化的基因组文库中都获得了约1.2kb片段，纯化此1.2kb片段后各克隆到pBluescriptⅡSK(+)载体上，经测序，上述两片段的核苷酸序列完全相同。此片段的核苷酸序列如附图1所示。5．南瓜PP2基因启动子片段克隆以步骤4所获约1.2kb片段为模板，以如附图6所示的南瓜PP2启动子5’端正链引物NP-1和3’端负链引物NP-2在100ul体系中作PCR扩增。使用购自上海生工公司的TaqplusⅠDNA聚合酶系统，在100ul扩增体系中含有10ul扩增缓冲液(10x)、10uldNTPs(2mmol/L)、10ulNP-1(10umol/l)、10ulNP-2(10umol/L)、0.3ulTaqplusⅠDNA聚合酶(1.2U)和59.7ul重蒸水。扩增过程为先在94℃预变性2分钟，然后执行25次扩增循环反应。每次循环反应条件为94℃变性30秒，54℃复性1分钟，70℃延伸1分钟。结果产生了持异性良好的约900bp靶带。以购自上海华舜公司的胶纯化回收试剂盒纯化回收上述PCR产物中的900bp靶带，与购自Promega公司的克隆载体pGEM-T载体连接，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，然后以质粒电泳法(比较转化子质粒与克隆载体质粒电泳迁移率，有插入克隆质粒迁移率小于无插入克隆载体质粒迁移率)筛选阳性克隆。从10个白斑转化子中筛选到4个阳性克隆(命名为N6、N8、N9和N10)，对N6,N8两个克隆插入片段分别进行测序分析，结果N8克隆含有所需靶片段。该靶片段序列如附图2所示。二．南瓜PP2基因的5′RACE分析通过对南瓜PP2基因的5′RACE分析，确定了南瓜PP2基因启动子3′端的转录起始位点。1．南瓜总RNA的提取南瓜总RNA的提取采取热酚法，具体步骤为取萌发了7天的南瓜下胚轴10克置于液氮中研磨成粉状，按每克鲜重2ml的量加入预热至90℃的RNA提取液∶苯酚(1∶1)混和液(RNA提取缓冲液100mmol/LLiCl、1％SDS、100mmol/LTris-NaOH,PH9.0和10mmo/LEDTA)，振荡混匀，于90℃加热至溶液呈乳状，于室温300rpm摇动5分钟，按每克鲜重1ml的量加入氯仿，室温摇动15-30分钟后，在25℃,20,000g离心15分钟，取上清，加入1/3体和LiCl(8mol/L)，混和后，4℃沉淀16-48小时；4℃离心(12,000g,30min.)，在4℃度用LiCl溶液(2mol/L)洗涤RNA沉淀，再用80％乙醇洗涤三次，真空抽干，溶于适量经DEPC处理的双蒸水中。2．5′RACE分析从萌发了7天的南瓜下胚轴中提取RNA，使用GSP-Ⅰ引物(序列如附图7所示)，按照GIBCOBRL公司的5′RACE分析系统(5′RACESystemforRapidAmplificationofcDNAEnds)操作说明反转录合成第一链cDNA并经纯化(使用GlassMAXDNAisolationspincartridgesystem)后作为模板，以GSP-Ⅱ引物(序列如附图7所示)和5′RACE系统提供的AAP引物(AbridgedAnchorprimer)，在50ul反应体系中先94℃预变性4分钟，然后以94℃、1分钟，55℃、1分钟，72℃、1分钟的条件进行30次循环反应，在1％琼脂糖胶上电泳检查PCR产物；将所获PCR产物稀释100倍后作为模板，再以GSP-Ⅲ引物(序列如附图7所示)和5′RACE系统提供的AUAP引物，在同样条件下进行扩增，获得大量目的片段，将该目的片段从PCR体系中纯化，经SalI/EcoRⅠ双酶切并经酚仿抽提纯化后与SalI/EcoRⅠ双酶切的pBluescriptⅡSK(+)载体连接，转化大肠埃希氏杆菌，重组子经酶切和PCR鉴定无误后做序列分析。由对两个重组子克隆的序列分析结果确定了南瓜PP2基因启动子上的转录起始位点为如附图1所示的位于“+1”位点的核苷酸“A”。三．转基因植物的产生1．植物表达中间载体的构建为了定性和定量研究上述实施例一所克隆的南瓜PP2基因启动子在植物中的功能，对其进行了转基因植物研究。将该启动子与GUS基因编码区核苷酸序列构建成在植物中表达的融合构建体，方法是以HindⅢ和BamHⅠ两种限制酶将实施例一步骤5中所获N8克隆中的855bp启动子片段(序列如附图2所示)从其克隆载体质粒上切下，再以此片段与同样经HindⅢ和BamHⅠ两种限制酶消化去掉35S启动子片段的pBI121载体大片段相连接，所产生的重组质粒命名为pBNG(构建过程如附图8所示)。为了消除位置效应引起的转基因植株间表达水平的较大差异，使用了来源于萤火虫的萤光素酶(Luciferase,LUC)基因作为内参基因。方法是在pBl221载体的基础上以LUC基因取代了GUS基因，并在NOS基因终止序列的3’端用HindⅢlinker连接产生一个附加的HindⅢ酶切位点，从而产生如附图8所示的由35S启动子、萤光素酶基因编码区的核苷酸序列和NOS基因终止序列组成的表达盒(2.9kb)，命名为35S/LUC-HindⅢ盒以HindⅢ切下上述2.9kb表达盒，回收，纯化之，插入前述构建的经HindⅢ消化并以虾碱性磷酸酯酶(shrimpalkalinephosphatase,SAP)作脱磷处理的重组质粒pBNG的HindⅢ位点，产生的新的含有双报告基因构建体的重组质粒转化大肠埃希氏杆菌后，通过EcoRⅠ酶切分析筛选到35S/LUC-HindⅢ盒以与GUS基因表达框架的转录方向相反的方向插入的克隆，其所含重组质粒命名为pBL3NG(构建过程如附图8所示)。为了确定本发明所涉及的南瓜PP2基因启动子的相对活性，对一种已知的植物韧皮部特异性强启动子竹节花黄班驳病毒(commelinayellowmottlevirus,CoYMV)启动子(MedberrySL,etal.,PlantCell4[2]:185-192,1992)作与上述南瓜PP2基因启动子855bp片段构建完全相同的构建，所产生的新的植物中间表达载体命名为pBL3CG。所用的CoYMV启动子片段为本实验室吴标(吴标等竹节花黄斑驳病毒启动子的缺失分析及其功能微生物学报39卷1期1999年)所作的由原CoYMV启动子全长1026bp5’端缺失的882bp(-87012)片段。上述两种构建体中的GUS基因和LUC基因两个表达框架的转录方向皆互为相反，可以更为准确地比较南瓜PP2基因启动子与CoYMV启动子的相对活性。2．植物转化以碱变性法(J.Sambrooketal.,Molecularcloning,ALaboratoryManual,2nded,ColdSpringHarborLaboratoryPress1989)制备pBL3NG和pBL3CG质粒，用液氮冻融转化法(贾盘兴，蔡金科等微生物遗传学实验技术北京科学出版社1992108-109)转入土壤农杆菌LBA4404，然后以PCR和酶切筛选克隆。用叶盘法(Horsch,R.B.etal.,Science227,1229-1231,1985)将pBL3NG及pBL3CG的农杆菌克隆分别转化烟草(K326)，通过卡那霉素抗性筛选获得了转pBL3NG构建体和转pBL3CG构建体的烟草再生植株各40余株。四．转基因烟草GUS活性的组织化学定位按照顾红雅等(顾红雅，瞿礼嘉等植物基因与分子操作1994277-278北京大学出版社)所述，取转基因烟草的叶片，叶柄和茎的切片，加入GUS染色液(15.25ml0.2mol/L的Na2HPO4、9.75ml0.2mol/L的NaH2PO4、0.25ml0.1mol/L的K3[Fe(CN)6]、0.25ml0.1mol/L的K2[Fe(CN)6])、0.5ml0.1mol/L的Na2EDTA、50mgX-Gluc[5-溴-4-氯-3-吲哚葡萄糖醛酸苷]和24ml重蒸水)，在37℃保温5-24小时。用70％乙醇在65℃脱色2小时或室温脱色2天，解剖镜观察，显微照像。染色结果(如附图9所示)显示，在转南瓜PP2启动子与GUS融合基因烟草的茎、叶片及叶柄组织的GUS表达具有显著的韧皮部特异性。GUS染色检测转pBL3NG烟草再生植株共43株，其中GUS染色阳性的共22株，占51％。五．转基因烟草的GUS活性分析1．烟草总可溶性蛋白的提取参照Jefferson等(JeffersonRA,KavanaghTA,BevenMW.EMBOJournal,1987,6:3901-3907.JeffersonRA,PlantMolecularBiologyReporter,1987,5:387～405)和Promega公司的荧光素酶分析系统(LuciferageAssaySystem,E1500,PromegaTeclnicalBulletin)的方法提取烟草叶片或叶脉的总可溶性蛋白取50mg烟草叶片或叶脉组织，经液氮冷冻研磨后，加入200ul蛋白提取液(25mmol/LTris-phosphate,pH7.8,2mmol/LDTT,2mmol/L1,2-diaminocyclohexane-N,N,N′,N′-tetraaceticacid,10％glycerol和1％TritonX-100)，混匀，4℃离心(12,000rm,2min.)，取上清液即为烟草总可溶性蛋白提取液。蛋白浓度的测定采用Bio-RadProteinⅡ测定液，按厂家提供的方法进行。2．荧光素酶(LUC)活性检测参照Promega(TechnicalBulletin,LuciferaseAssaySystem,Cat.#E1500,Promega)的方法，取1ul步骤1中制备的蛋白提取液加入含有50ul反应底物的Eppendorf管中，24℃反应10秒，立即在液闪计数器(LKB1209型)中测定反应产生的荧光强度，记录每分钟产生的荧光计数(countsperminute,CPM)。液闪计数器参数设定为Tritium,Windows0005-1024，时间30秒。如上所述对22株GUS染色阳性的转基因烟草进行LUC活性测定，由于所得CPM数值与烟草蛋白提取液中总可溶性蛋白的含量成线性关系，故在本发明中以单位质量的总可溶性蛋白在每分钟产生的荧光强度表征转基因烟草的荧光素酶(LUC)活性。LUC活性单位最终确定为“荧光计数/分钟·10皮克总可溶性蛋白”，即“counts/min..10pgtotalprotein”。3．GUS活性检测参照顾红雅等所述(顾红雅，瞿礼嘉等，植物基因与分子操作，1994,275-276)，取10ul步骤1中制备的烟草叶片或叶脉的总可溶性蛋白提取液与90ulGUS反应液(在步骤1所述蛋白提取液中加入lmmol/L4-甲基伞形酮酰-葡萄糖醛酸苷，即4-MUG和10mmol/Lβ-巯基乙醇即为GUS反应液)混匀，在37℃保温反应。每一种样品设置4个反应时间，即分别在0′,10′,20′和30′时各加入900ul0.2mol/L的Na2CO3溶液终止反应。以0.2mol/L的Na2CO3溶液制备0.2umol/L的4-甲基伞形酮(4-MU)作为荧光标准物，使用HoeferPharmacia生物技术公司生产的荧光计(DyNAQuantTM200Fluorometer)在激发光365nm，发射光455nm条件下测荧光。在正式测量之前，先用系列稀释浓度的标准物4-MU测量荧光值，作出标准曲线，确定荧光值与4-MU浓度的线性范围。测量转基因植物时，用每个样品的测量荧光值从标准曲线查出生成的4-MU的含量，作出不同时间对应于4-MU的函数曲线，求出每分钟生成的4-MU的含量，再除以每个样品的总可溶性蛋白量，即为GUS活性，最后单位为“4-MUpmol./min..mgtotalprotein”。如上所述测得的GUS活性数值除以步骤2中测量的LUC活性，得到校正的相对GUS活性数值。4．南瓜PP2基因启动子驱动外源基因表达的活性按步骤3所述对22株实施例四中所述GUS染色阳性的转pBL3NG烟草进行活性检测，结果GUS活性最高植株为4312(4-MUpmol./min..mgtotalprotein)，最低为167(4-MUpmol./min..mgtotalprotein)，前者为后者的26倍；对13株GUS染色阳性的转pBL3CG烟草植株作GUS活性检测，GUS活性最高植株为2384，最低为126，最高值为最低值的19倍。由上述可见，转基因植株的株间GUS表达水平差异相当大，这可能是由于基因构建体整合区插入植物染色体DNA的不同位置所致。但在本发明中使用3SS启动子驱动荧光素酶基因作为内参基因，有效地消除了位置效应的影响。以具有最高、最低和居中GUS表达活性的各三株转pBL3NG及转pBL3CG植株为例，如表1所示，校正前转pBL3NG烟草最高GUS值为最低值的26倍，校正后前者仅为后者的2.8倍；转pBL3CG烟草最高GUS值为最低值的19倍，校正后前者仅为后者的1.9倍。显然地，通过内参基因的校正极大地消除了上述转基因植株中外源基因表达水平的株间差异。表1利用LUC活性对GUS活性的校正分析<tablesid="table1"num="001"><table>转基因植株GUS活性pmol./min..mgLUC活性counts/min..10pg校正GUS活性pmol./min..mg最大GUS值/最小GUS校正前校正后N1N2N3C1C2C34312410167238420381269.802.001.0713.1910.401.0744020515618119610126192.81.9</table></tables>注N1,N2和N3为三株转pBL3NG基因烟草；C1,C2和C3为三株转pBL3CG基因烟草。以上结果为每株植株测3次的平均值。对22株有GUS表达的转pBL3NG烟草及13株转pBL3CG烟草叶片组织GUS活性进行校正，分别计算两者的平均值，结果前者为后者的168％。考虑到在本发明所涉及的南瓜PP2启动子的韧皮部组织特异性，推测GUS活性在含有更多韧皮部细胞的叶脉组织高于叶片组织，故分别对转基因烟草叶脉和叶片组织测定了GUS活性，再以叶脉组织活性除以叶片GUS活性，结果转pBL3NG烟草叶脉GUS活性为叶片的2-4倍，11株平均为2.6倍；转pBL3CG烟草叶脉GUS活性为叶片的2-8倍，5株平均为5倍。叶脉组织的GUS活性高于叶片组织的结果从另一个方面反应了南瓜PP2启动子和CoYMV启动子的韧皮部组织特异性。另外，以LUC活性校正叶脉组织GUS活性后进行比较，发现南瓜PP2启动子855bp片段驱动GUS基因在叶脉组织表达活性为CoYMV启动子882bp片段的87％。吴标等(吴标等竹节花黄班驳病毒启动子的缺失分析及其功能微生物学报39卷1期1999年2月)的研究结果表明，CoYMV启动子882bp片段(-870～+12)驱动GUS基因在烟草叶脉组织表达活性为35S启动子的70％左右，但考虑到韧皮部细胞占叶脉总细胞量的比例不超过10％，认为在韧皮部CoYMV启动子驱动GUS表达活性可能会与35S启动子驱动GUS表达活性相当或更高，CoYMV启动子在韧皮部是一个强启动子，由前述可知在叶脉组织南瓜PP2启动子855bp片段驱动GUS表达活性为CoYMV启动子882bp片段的87％，两者相差仅13％，故发明人认为本发明所涉及的南瓜PP2启动子855bp片段也应是一个韧皮部组织特异性的强启动子。六．转基因烟草的Southern分析由实施例三步骤1所产生的两种基因构建体pBL3NG和pBL3CG，在其约8.7kb整合区所含有的GUS基因表达框架的5’端有-个HindⅢ位点，如果用HindⅢ酶解转基因烟草的基因组DNA，然后进行Southern杂交分析，可以鉴定目的基因是否整合进烟草基因组以及整合的拷贝数情况。按实施例一步骤1中所述方法制备转基因烟草基因组DNA约30ug，以HindⅢ按如下条件进行酶解在500ul反应体系中含有30ug基因组DNA、50ul酶解缓冲液(10×)、20ulHindⅢ酶(200units)及2ul无DNA酶的RNA酶(20ug)，加无菌重蒸水至终体积为500ul；37℃酶解24小时后再补加5ulHindⅢ酶(50units)继续酶解10小时。取5ul酶解物在0.8％琼脂糖凝胶上电泳检查，DNA酶解很好。酒精沉淀上述HindⅢ酶解后的DNA，重新溶解到40ulTE(10mmol/LTris-HCl,pH8.0,0.1mmol/LEDTA)里,在0.8％琼脂糖凝胶上进行电泳，以由HindⅢ和BamHⅠ酶解pBI221质粒所产生并回收纯化的含有GUS基因的4.7kb片段(命名为“4.7H/B”)10ng和用BamHⅠ及SacⅠ酶解pBI221质粒所产生并回收纯化的GUS基因编码区1.8kb片段(命名为“GUS1.8f”)5ng作为阳性对照，以由HindⅢ酶解的非转基因烟草k326的基因组DNA30ug作为阴性对照，在40V电压下电泳12小时，然后按AmershamLIFESCIENCE公司的杂交尼龙膜操作说明(HybondTM-N+；positivehychargednylonmembraneVersion2.0)对胶进行处理以200ml0.25mol/L盐酸净化处理胶两次，每次15分钟，然后以蒸馏水洗胶30秒；以200ml碱变性溶液(0.5mol/LNaOH,1.5mol/LNaCl)变性处理胶两次，每次20分钟，然后蒸馏水洗胶30秒；以200ml中和溶液(0.5mol/LTris-HCl,pH7.2,1.5mol/LNaCl和1.0mmol/LEDTA)处理胶两次，每次20分钟，最后再以蒸馏水洗30秒，接着进行DNA真空转膜。使用HYBAID公司的真空转膜系统，在40V真空泵电压下以20×SSC(0.3mol/柠檬酸钠、3.0mol/L氯化钠，pH7.0)作转移缓冲液转移DNA2小时。关掉真空转膜仪，将胶移下进行EB染色，紫外灯下检查胶中的DNA已转移干净。以2×SSC溶液洗膜10秒，放滤纸上室温晾干(30分钟)后，用美国SanGobriel公司的紫外交联仪(CL-1000ULTRAVIOLETCROSSLINKER,CA91778)进行处理，设定条件能量参数1200，时间2分钟，共处理2次。使用宝灵曼公司的随机引物DNA标记盒(Cat.No.1004760)，以随机引物标记法标记杂交探针，步骤为取前述的GUS1.8f片段25ng作为模板，100℃变性5分钟，冰上骤冷后加入含有1uldATP(0.5mmol/L)、1uldGTP(0.5mmol/L)、1uldTTP(0.5mmol/L)、50uCi[α-32P]dCTP、2ul随机引物、1ulklenow酶(lunit)溶液和重蒸水若干微升补足剩余体积的20ul标记反应体系中，混匀，37℃标记反应1小时。按AmershamLIFESCIENCE公司的杂交尼龙膜操作说明(NybondTM-N+；positivehychargednylonmembraneVersion2.0)中的杂交程序进行杂交，步骤为将膜放入杂交杯中，加入25ml预杂交液(6.25ml20×SSC、2.5ml50×Denhardt′溶液、6.25ml2％SDS、500微克经超声处理并在100℃变性5分钟后再冰上骤冷的鱼精DNA和重蒸水若干毫升定容至25ml)，使用HYBAID公司的MIDIDUAL14杂交箱，65℃预杂交1小时；将标记好的探针在100℃变性5分钟，冰上骤冷，加入到杂交液中，65℃杂交16小时。杂交完毕后洗膜，步骤为以40ml溶液Ⅰ(2xSSC,0.1％SDS)在室温洗2次，每次10分钟；用40ml溶液Ⅱ(1xSSC,0.1％SDS)在65℃洗10分钟；用40ml溶液Ⅲ(0.1xSSC,0.1％SDS)在65℃洗10分钟。用同位素探测器检查杂交膜放射性，如果背景放射性过高则再以溶液Ⅲ在65℃洗膜直至背景放射性低于50CPM。取出滤膜于纸巾上吸去大部分液体，用保鲜膜包好，放入曝光夹中压上X光片(Bio-Rad公司产品，货号170-7320)及增感屏，置于-70℃曝光12-36小时。对X光片进行显影、定影后得到了Southern杂交的阳性结果(如附图10所示)。Southern杂交结果证明，经GUS染色和GUS活性检测均为阳性的转pBL3NG烟草植株和转pBL3CG烟草植株的基因组DNA中均含有与探针特异杂交的GUS基因片段，且皆为单拷贝，而对照非转基因烟草植株的基因组DNA中未检测到上述片段。总之，本发明克隆的南瓜PP2基因启动子序列，与报告基因融合构建成植物表达中间载体后，通过农杆菌介导转化烟草，证明该启动子序列能够驱动目的基因编码区的核苷酸序列在植物韧皮部高效、特异地表达，该启动子可用于植物的抗虫、抗病等基因工程的研究和开发利用。权利要求1．一种新克隆的编码植物韧皮部蛋白的基因的启动子，其特征在于选自下列的蛋白质基因启动子的核苷酸-1078至+37的1115bp序列。-1078GCTGCCTAAAAGTGCAACCCCATATCTACTTGGGTGATTT-1038AAATTAGTTAAATGTATATTTGGATATGTTATGACATATA-998AATATAATTTAAATAAGTTATATCTTAACAAATTAGATAC-958ATTCGACTCATATTCTTGTAAATAAGACTATTGGATGAGT-918CAAAAAGCATCTTGTCTGTCTATGGGAATTCTCCCTAAAT-878ATTTTTTCTAATTTATTAAAAAATTTCTTTAGAGATTTTT-838ACAAACCTTAACTCGAAGATTTTGCCGGAGGAGTTGAAGC-798TAGTAAATTAAAAATTAGCCAGAACTTTCTTCATATTTCT-758TATAAATTTAGGTAACTTTTTGTTTAGTTTAATTCTAAAT-718AAAATTAAAGTTGATCCTAATGCTTATGCCACGGGAATAA-678AGCCGTTCATTCTCAACCATATCTTCAAAATATTCATTTG-638ATATCTTTCCAAATAAAGATCATATACTCATTCAACACAT-598CGTCACATATATTTAATTTATTCTTTATAATCAAACATCA-558CATTATAAAAAATAAATAAATAAATAAAACTTGAGGTAAG-518CTCAATTTTTATAAATTTTAAAATACTTTAAAAATCAATA-478GTGAATAAATAAATGTGATTAACTGGCAATATCTACTAAT-438AAAAACTCTAGAAAATATTTATCTTTCAACAAAAAAAAAT-398AAAAAAAACCGTTCTAGATTTATAATTTATTAACGAACAA-358AATATTATATTTAAATAATGTTTCATACAAAAATGAGATA-318TACTTGCATCAAGTATTACTCGAAAGTACTCGGTTACTTT-278TTAAAAGAACGGAATAAAGGGCCACCTTTTTTTATTTACA-238AATAATTTAAATATATATTAAAATATTGTTAATTATTTTT-198CAACTATAGAAAAACACAAATATAAATGAAAAGGTAAAAT-158ACATAAAATTTACTTTTTTAAAGAATTAAAATGTCTTTTC-118ATTTCTTTTACAACCTCGTAAACGGAAAATAATATAACAA-78TTGTGCATGGCTTATCTTCAAAATATTGTACCAAAGAAGG+1-38GGTTATATATATCCCTTCTTCCCTCTCACTTTTAACTCAT+3ATCACAATTCAGTTCATAAAAAGGAAGACACTATA+372．根据权利要求1所述的核苷酸序列，其特征在于其中所包含的855bp核苷酸序列片段完全足以驱动外源基因编码区的核苷酸序列在转基因植物的韧皮部组织特异性表达。-839AAGCTTCCTTAACTCGAAGATTTTGCCGGAGGAGTTGAAG-799CTAGTAAATTAAAAATTAGCCAGAACTTTCTTCATATTTC-759TTATAAATTTAGGTAACTTTTTGTTTAGTTTAATTCTAAA-719TAAAATTAAAGTTGATCCTAATGCTTATGCCACGGGAATA-679AAGCCGTTCATTCTCAACCATATCTTCAAAATATTCATTT-639GATATCTTTCCAAATAAAGATCATATACTCATTCAACACA-599TCGTCACATATATTTAATTTATTCTTTATAATCAAACATC-559ACATTATAAAAAATAAATAAATAAATAAAACTTGAGGTAA-519GCTCAATTTTTATAAATTTTAAAATACTTTAAAAATCAAT-479AGTGAATAAATAAATGTGATTAACTGGCAATATCTACTAA-439TAAATAACTCTAGAAAATATTTATCTTTCAACAAAAAAAA-399AAAAAAAAACCGTTCTAGATTTATAATTTATTAACGAACA-359AAATATTATATTTAAATAATGTTTCATACAAAAATGAGAT-319ATACTTGCATCAAGTATTACTCGAAAGTACTCGGTTACTT-279TTTAAAAGAACGGAATAAAGGGCCACCTTTTTTTATTTAC-239AAATAATTTAAATATATATTAAAATATTGTTAATTATTTT-199TCAACTATAGAAAAACACAAATATAAATGAAAAGGTAAAA-159TACATAAAATTTACTTTTTTAAAGAATTAAAATGTCTTTT-119CATTTCTTTTACAACCTCGTAAACGGAAAATAATATAACA-79ATTGTGCATGGCTTATCTTCAAAATATTGTACCAAAGAAG-39GGGTTATATATATCCCTTCTTCCCTCTCACTTTTAACTCA+1+2TATCACACGGGATCC+163．重组质粒，其特征在于含有权利要求1和2所述的核苷酸序列的全部或部分片段与所需目的基因的编码区核苷酸序列相连接。4．能在植物韧皮部组织特异表达的一组重组质粒，它们含有权利要求1,2和3所述的核苷酸序列的全部或部分片段。5．根据权利要求4所述的重组质粒，它们是pBNG和pBL3NG。6．两种重组微生物，是由权利要求5所述重组质粒分别转化微生物所获得的。7．根据权利要求6所述的重组微生物，其特征在于所述微生物是大肠埃希氏杆菌(Escherichiacoli)DH5α。8．重组微生物，含有权利要求4和5所述的质粒。9．根据权利要求8所述的重组微生物，其中所述重组微生物是土壤农杆菌。10．根据权利要求8和9所述的土壤农杆菌，其特征在于可应用于植物转化。全文摘要本发明提供了采用基因组DNA步移法克隆的南瓜韧皮部蛋白2(PP2)基因启动子的序列;包含所述的DNA序列与GUS报告基因的融合基因构建体;用所说的构建体转化植物外植体所产生的在韧皮部组织特异性高效表达GUS转基因的植株。文档编号C12N15/63GK1302891SQ9912189公开日2001年7月11日申请日期1999年10月22日优先权日1999年10月22日发明者田颖川,袁正强申请人:中国科学院微生物研究所