专利名称：新型单纯疱疹病毒扩增子载体系统及其用途的制作方法
技术领域：
本发明属于生物技术发明领域。具体涉及用于1型单纯疱疹病毒(HSV-1)扩增子载体的新型包装系统的构建及用途。
I型单纯疱疹病毒(HSV-1)能有效感染神经细胞并在神经元中建立稳定的隐性感染而不影响神经细胞的功能。因此，HSV-1载体可望用作将外源基因导入神经细胞的一种新型病毒载体。
HSV-1扩增子载体质粒只含有HSV-1病毒复制和包装所必需的顺式元件，即复制子oris和包装信号pac，另外还包括需转移的外源基因以及原核复制子和抗性基因。扩增子病毒包装所需的反式元件通常由辅助病毒或含病毒基因组的质粒DNA等辅助包装系统提供。因此扩增子病毒是一种高度缺损的病毒颗粒，它不含HSV病毒的任何结构基因，具有很好的安全性。在能提供反式元件的细胞中，HSV-1扩增子载体质粒经“滚环”复制产生头尾相接的嵌合体，然后被切割、包装成含多拷贝外源基因、DNA总长约150kb的假病毒。因此HSV-1扩增子载体有较高的外源基因表达量。例如，一个10kb大小的扩增子质粒包装成一个150kb的扩增子病毒，其中含有15个拷贝、首尾相接的这种扩增子质粒。
与目前常用的几类病毒载体，比如逆转录病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体相比，HSV-1扩增子病毒载体的优势在于载体含多个拷贝的外源基因，外源基因的表达量高、包装容量大(可包装大到15～30kb的外源基因片段)、载体构建简单等优点，因而在基因转移和基因治疗领域日益受到更多的关注。
HSV-1扩增子病毒载体目前亟待解决的问题是找到一种既能简便、高效产生高滴度扩增子病毒，又能减少、甚至彻底清除扩增子病毒中辅助病毒污染的辅助包装系统。
目前较常用的质粒型HSV-1扩增子载体辅助包装系统通常有以下几类。
以HSV-1复制缺陷型突变株辅助病毒(Geller，A.I.，K.Keyomarski，J.Bryan，A.B.Pardee.1990 An efficient deletion mutant packaging system for defective HSV-1 vectors；potential applications to neuronal physiology and human gene therapy.Proc.Natl.Acad.Sci.USA878950-8954)。这类辅助病毒有的是缺失某个病毒复制所必需的基因，该基因编码的蛋白由细胞反式提供；有的是温度敏感突变株，这种辅助病毒31℃时能正常复制，而37℃时不能复制。这种方法得到的扩增子病毒中含有大量辅助病毒，这些辅助病毒虽然无法正常复制，但仍有感染能力。此类辅助病毒有以下几个问题①辅助病毒的基因表达带来的细胞毒作用和免疫反应；②辅助病毒和内源性病毒间潜在的相互作用；③混合病毒中扩增子病毒与辅助病毒比例的波动而带来外源基因的不稳定表达；④辅助病毒潜在的致癌作用；⑤辅助病毒回复成野生型病毒的可能。
为了使产生的扩增子病毒中无辅毒污染，近几年发展起来了以五个含相互重叠的HSV-1基因组片段的粘粒(SetC粘粒，包括cos6，cos14，cos28，cos48，cos56)为基础的第二代包装系统(Cunningham，C.and A.J.Davison 1993 A cosmid-base system for constructingmutants of Herpes Simplex Virus Type 1.Virology 197116-124)。去除位于两个粘粒上的HSV-1的包装信号pac后，五个粘粒与扩增子质粒共转染细胞，只有HSV扩增子载体被包装成病毒，而不产生辅助病毒颗粒。此方法达到了无辅助病毒污染的目的，但五个粘粒共转染的效率较低，因此得到的扩增子病毒滴度较低(＜106PFU/ml)。用这种方法无法实现扩增子病毒载体的大量生产，限制了其临床应用。
最近，有研究者在缺失了包装信号pac的HSV-1基因组中插入一个细菌人工染色体(BAC)组件，形成含HSV-1基因组的HSV-BAC辅助质粒(Stavropoulos，T.A.and Strathdee，C.A.，An Enhanced Packaging System for helper-Dependent Herpes Simplex Virus Vectors，Journal of Virology，1998，727137-7143)。该细菌人工染色体HSV-BAC与扩增子质粒共转染细胞，HSV-BAC反式提供扩增子质粒包装成病毒所需的蛋白，但它自身因无包装信号而无法包装出辅助病毒。此方法不但无辅毒产生，而且与SetC粘粒法相比减少了共转染的质粒数，转染效率有较大提高，扩增子病毒达到107PFU/ml。但它仍需要一个质粒和一个细菌人工染色体共转染，效率仍不高，而且HSV-BAC分子量大，操作不便。
本发明的目的在于提供一种既能简便、高效产生高滴度扩增子病毒，又能有效减少扩增子病毒中辅助病毒含量、直至达到无辅助病毒的新型扩增子病毒生产系统，探索一条使HSV-1扩增子载体病毒进入大规模生产及临床治疗的途径。
针对目前扩增子辅助包装系统存在的转染效率低或不稳定、操作复杂、不利于规模化生产、从而难以获得高产量、无辅毒的扩增子病毒载体的弊病，本发明提出了以“含可卸包装信号pac的HSV-1重组病毒”为辅助病毒的包装策略。
本发明提出的rHSV-1/loxP-pac-loxP，其特征在于HSV-1基因组中原有的两个包装信号pac缺失，两侧带有同向排列的Cre重组酶特异识别位点loxP的HSV病毒包装信号pac插入HSV-1基因组中。Cre重组酶是噬菌体编码的343氨基酸的多肽链，它能特异地使两个同向排列的34碱基对的loxP序列间的DNA缺失。Cre重组酶作用于loxP，不依赖于DNA的复制和外源能量(比如ATP)，而且对超螺旋或线性DNA都起作用。(Sternberg，N，Hamilton，D.，J.Mot.Biol.1981，150，467-486)。本发明所构建的rHSV-1/loxP-pac-loxP中，loxP-pac-loxP插入在HSV-1 UL44基因的XbaI位点中(附
图1)。当rHSV-1/loxP-pac-loxP病毒作为辅助病毒感染表达Cre重组酶的BHK/Cre细胞时，Cre重组酶特异性将rHSV-1/loxP-pac-loxP病毒的loxP-pac-loxP切除，切点处病毒DNA自动连接，不留缺口。因此，在Cre酶存在时，rHSV-1/loxP-pac-loxP病毒无法包装出子代病毒，但它仍可以在细胞中复制和表达，为扩增子病毒的包装提供反式蛋白。
本发明所提出的rHSV-1/loxP-pac-loxP病毒是通过对一套含有HSV-1病毒全基因组的粘粒质粒(Set C粘粒，包括cos6，cos14，cos28，cos48，cos56)(Cunningham，C.andA.J.Davison 1993 A cosmid-base system for constructing mutants of Herpes Simplex VirusType 1.Virology 197116-124)进行改造的基础上产生的。首先，将位于粘粒质粒cos6和cos48上的HSV-1基因组中原有的两个包装信号pac切除，成为cos6Δa和cos48Δa。然后，将两侧装上同向排列的Cre重组酶特异识别位点loxP的一个拷贝的pac插入cos56上的HSV-1的非必需基因UL44的XbaI位点中，成为cos56/loxP-pac-loxP.将cos6Δa、cos28、cos14、cos56/loxP-pac-loxP、cos48Δa五个粘粒经PacI酶切去粘粒骨架部分后，用脂质体方法共转染HSV-1敏感细胞(如BHK-21)，5个HSV-1片段在细胞中发生同源重组而产生重组病毒rHSV-1/loxP-pac-loxP。该重组病毒只含有一个pac位点，且pac两侧是loxP序列。该重组病毒能在BHK-21细胞中稳定传代。
将HSV扩增子载体DNA转染表达Cre酶的细胞株(如BHK/Cre)，并用rHSV-1/loxP-pac-loxP病毒感染。由于辅助病毒rHSV-1/loxP-pac-loxP包装信号pac被Cre酶切除，因此无法包装成病毒颗粒。但是包装信号的切除并不影响HSV病毒的复制及病毒基因的大量表达，它们为HSV扩增子DNA的复制和包装提供了充足的反式作用蛋白，从而明显增加子代病毒中扩增子病毒的滴度。
本发明的单纯疱疹病毒载体系统提出了一种较传统的无辅助病毒生产方法的效率有较大提高扩增子载体生产方法，为扩增子载体的大规模生产打下了基础。该系统有望使HSV-1扩增子载体进入基因治疗的实际应用阶段。
本发明产生的HSV扩增子载体辅助包装系统可作为各种携带不同外源基因的HSV-1扩增子载体的辅助包装系统，用于哺乳动物细胞的基因转移和神经系统(如帕金森氏症)疾病的基因治疗。
除本发明使用的噬菌体Pl Cre/loxP系统外，其它类似的DNA重组酶系统，比如酵母Flp/Frt系统(Mark et al.Nucleic Acids Research，20，4451-4455(1992))也能用于本发明中。
除单纯疱疹病毒外，其它疱疹病毒，比如Marek’s disease virus(MDV)，也能构建扩增子载体(Camp et al，J Virol 65(11)，1991，6320-6324)。本发明提出的用“可卸包装信号的辅助病毒”辅助包装扩增子载体的策略不仅适用于辅助包装HSV-1扩增子载体，也适用于辅助包装其它疱疹病毒扩增子载体。
本发明中用到的原始生物材料有SetC粘粒系统其中包含五个粘粒cos6、cos28、cos14、cos56和cos48(Cunningham，C.and A.J.Davison 1993 A Cosmid-base System for Constructing mutants of Herpes SimplexVirus Type 1.Virology 197116-124)；Cos6Δa、cos48Δa本室构建。在cos6和cos48的基础上，用RecA辅助的限制性核酸内切酶切割法分别去除了HSV-1的包装信号pac(Fraefel，C，Song，S，Geller，A.I.，1996，Helper Virus-Free Transfer of Herpes Simplex Virus Type 1 Plasmid Vectors into Neural Cells，Journal of Virology，70，7190-7197)；pBS246质粒GIBCO BRL公司商品质粒pMC-Cre表达含核定位信号的Cre重组酶蛋白(Hua Gu 1993 Independent Control ofImmunoglobulin Switch Recombination at Individual switch Regions Evidenced through Cre-loxP-Mediated Gene Targeting，Cell 731155-1164)；p3zf-pacPromega公司商品质粒；pBluescript KS(+)Stratagene公司商品质粒；pcDNA2.1Invitrogene公司商品质粒；pWCDN由本室伍志坚博士构建；pWAV2由本室伍志坚博士构建；pAV53由本室伍志坚博士提供；pHSV-LacZ由本室吴小兵博士构建；本发明cos56/loxP-pac-loxP粘粒的构建过程如下如附图2所示。用EcoRI和BamHI双酶切p3zf-pac，回收1.7kb的pac序列，插入pBluescript KS(+)(Stratagene公司)的相应位点中，成为pKS-pac.用Hind3和BamH1切下pKS-pac上的pac片段，插入pBS246(Gibco公司)的相应点中，成为pBS246-pac.用Pst1单酶切pAV53，回收约1kb的带一个Xba1酶切位点的小片段，插入pcDNA2.1的相应位点。筛选此Xba1位点与pcDNA2.1上的Xba1位点相距较近的克隆，成为pcDNA2.1-Xba1。用Not1酶切pBS246-pac，回收pac片段，插入pcDNA2.1-Xba1的相应位点中，成为pcDNA2.1-pac.再用Xba1酶切pcDNA2.1-pac，回收pac片段，插入cos56的Xba1位点中，成为cos56/loxP-pac-loxP。
本发明提出的粘粒cos56/loxP-pac-loxP保存于大肠杆菌(E.coli.)DH5α株(MAXEfficiency DH5α，GIBCO#18258-012)中，在含有50-100μg/ml氨苄青霉素的LB培养基中37℃传代培养。含有cos56/loxP-pac-loxP粘粒的菌种命名为cos56/loxP-pac-loxP/DH5α(中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号0414)。
以下实施对本发明的重组辅助病毒rHSV-1/loxP-pac-loxP的制备和用途作了详细说明，但不意味着限制本发明的内容。
实施例1rHSV-1/loxP-pac-loxP重组病毒的产生、传代和保存cos6Δa，cos28，cos14，cos56-loxP-pac-loxP，cos48Δa五个粘粒等浓度混合，用PacI酶切后，分别用酚、酚氯仿、氯仿抽提，酒精沉淀后，用蒸馏水溶解DNA。取5μgDNA，用LipofectAMINE(GIBCO公司)转染BHK-21细胞。48小时后挑取病毒斑。经过连续两次空斑纯化后，得到rHSV-1/loxP-pac-loxP重组病毒。
rHSV-1/loxP-pac-loxP重组病毒以MOI＝0.1在约80％汇片的BHK-21细胞上37℃吸附1h后，加适量含10％胎牛血清培养液1640，37℃养约48小时，至完全病变。将细胞与上清一并收集，反复冻融三次，1500rpm离心5min，收集上清，测定滴度并保存在-20℃冰箱中。
实施例2pCHneocre质粒的构建过程如下用BamHI酶切pWCDN，回收约1.3kb的neor片段，插入pWAV2的相应位点，筛选neor启动子与pWAV2上CMV启动子方向一致的克隆，成为pSNAV2。用XhoI酶切pMC-Cre，回收约1.7kb的cre片段，与pSNAV2被XhoI酶切后回收的、去掉cmv启动子和polyA的大片段连接，筛选cre方向与neor方向相反的克隆，成为pCHneocre。如附图3所示。
实施例3表达Cre重组酶的BHK/CHneocre细胞株的建立、传代和保存用LipofectAMINE(GIBCO公司)将pCHneocre转染至BHK-21细胞中，24小时后，在培养液1640中加入终浓度为400μg/ml的G418，连续培养两周后，挑单克隆。用RrHSV-1/loxP-pac-loxP重组病毒感染各株克隆，测连续三代的滴度，筛选出重组病毒滴度最高的细胞株，即为BHK/Cre细胞株。BHK/Cre细胞株可用含10％胎牛血清和400μg/ml G418的1640培养液长期稳定传代，细胞株在含10％胎牛血清和10-20％二甲基亚砜的1640培养液中，液氮保存。
实施例4rHSV-1/loxP-pac-loxP辅助包装系统功能检测按照GIBCO BRL公司LipofectAMINE产品说明书，分别将扩增子质粒pHSV-LacZ转染BHK/Cre和BHK-21(对照)细胞。24小时后，用rHSV-1/loxP-pac-loxP病毒以MOI＝0.5感染，室温吸附1h，用无血清1640培养液洗细胞2次，用含10％胎牛血清1640培养液37℃培养。继续培养至细胞完全病变(约2-3天)。将细胞与上清一并收集，反复冻融3次，1500rpm离心5min，收集上清。
扩增子病毒和辅助病毒的滴度检测将分别从BHK/Cre细胞和BHK-21细胞中收集的病毒上清以10倍倍比稀释，感染BHK-21细胞，吸附1h后，洗去未吸附的病毒，37℃培养至出现病毒斑，用PBS液洗细胞3次，用固定液(含2％甲醛的PBS液)4℃固定5min，再用PBS液洗细胞3次，加检测液(含1mg/ml X-gal，2mmol MgCl2，5mmol铁氰化钾，5mmol亚铁氰化钾的PBS液)覆盖细胞，37℃作用6h，显微镜下观察细胞染蓝的情况。结果显示BHK/Cre细胞株产生的病毒中，95％以上的病毒斑呈蓝色，蓝色病毒斑、即扩增子病毒的滴度达到108/ml；而对照组BHK-21细胞产生的病毒斑中呈蓝色的少于50％，扩增子病毒的滴度只有107/ml。该结果证明本发明能有效减少扩增子病毒中辅助病毒的含量，同时大幅增加扩增子病毒的滴度。
权利要求
本发明涉及用于神经系统疾病(或其它系统疾病)的病理生理及基因治疗研究和应用的单纯疱疹病毒I型(HSV-1)扩增子病毒载体系统。1.一种表达外源DNA序列的单纯疱疹病毒载体系统，其特征在于由以下成分组成a)一种重组辅助单纯疱疹病毒rHSV-loxP-a-loxP，其基因组中去除了2个天然的HSV包装信号序列，并插入了一个两侧带有噬菌体loxP序列的HSV包装信号序列；b)一种辅助病毒依赖性单纯疱疹病毒载体(亦称扩增子载体)，包括单纯疱疹病毒包装信号序列pac、复制起点oriS、外源DNA序列及大肠杆菌质粒骨架；c)一株支持单纯疱疹病毒复制并表达重组酶Cre的细胞。
2.为产生权利要求1中的辅助单纯疱疹病毒的一组包含单纯疱疹病毒全基因组的粘性质粒cos6，cos28，cos14，cos48，cos56，其中cos6和cos48中的HSV包装信号序列pac被删除，cos56的HSV DNA的UL44基因中插入了两侧带有噬菌体loxP序列的HSV包装信号序列。
3.根据权利要求1，噬菌体loxP序列长34bp。
4.根据权利要求1，两侧带有噬菌体loxP序列的HSV包装信号序列位于重组辅助HSV病毒基因组的其它位置；
5.根据权利要求1，噬菌体loxP序列在HSV包装信号两侧的插入方向相同。
6.根据权利要求1，细胞来源于BHK-21、Vero、293细胞。
7.根据权利要求1，重组酶Cre表达单位整合在细胞株中。
8.根据权利要求1，可诱导表达的重组酶Cre表达单位插入在rHSV-loxP-a-loxP病毒基因组DNA的某一位置中。
9.本发明提出的单纯疱疹病毒载体系统用于HSV扩增子载体的无辅助病毒包装。
10.本发明提出的单纯疱疹病毒载体系统用于基因转移和基因治疗。
全文摘要
本发明根据Cre蛋白重组酶特异切除同向排列的loxP序列间DNA的特点,在去除原有包装信号pac的HSV－1中插入两侧带有同向排列的loxP序列的HSV－1包装信号loxP－pac-loxP,得到“含可卸包装信号的重组辅助病毒”rHSV-1/loxP-pac-loxP。该辅助病毒在表达Cre重组酶的细胞中只有感染和复制能力,不能包装出子代病毒。以rHSV-1/loxP-pac-loxP为辅助病病,在表达Cre重组酶的细胞中生产扩增子病毒,达到了大幅减少辅助病毒的同时又增加扩增子病毒滴度的目的;其生产效率比传统的无辅助病毒生产方法的效率有较大提高,为扩增子载体的大量生产打下了基础。该系统产生的HSV扩增子病毒可用于基因转移和基因治疗。
文档编号C12N7/01GK1263159SQ9912206
公开日2000年8月16日 申请日期1999年10月27日 优先权日1999年10月27日
发明者曹晖, 吴小兵, 侯云德 申请人:北京东康龙病毒生物技术工程研究中心