突变型腺伴随病毒的病毒颗粒及其使用方法

专利名称：突变型腺伴随病毒的病毒颗粒及其使用方法
技术领域：
本发明涉及重组腺伴随病毒载体领域。
背景技术：
腺伴随病毒(AAV)是一种含有两个开放读框(rep和cap)的4.7Kb、单链DNA病毒。第一个基因编码基因组复制所需的4种蛋白质(Rep78、Rep68、Rep52和Rep40)，第二个基因表达装配形成病毒衣壳的3种结构蛋白(VP1-3)。如其名字所示，AAV的活性复制依赖辅助病毒，例如腺病毒或疱疹病毒的存在。无辅助病毒时，AAV呈潜伏状态，其基因组维持为游离体形式或整合进宿主染色体。虽然AAV2的特征了解最清楚的是可作为基因递送载体，但迄今已鉴定了8种同源性灵长类AAV血清型和许多非人灵长类的类型。
1989年首次制造了重组AAV2(rAAV)基因递送系统，然后基于AAV的载体显示出能提供许多主要优点。首先，既然野生型AAV是非致病性与任何已知的疾病在病原学上无关，基于AAV的载体极其安全。此外，AAV能高效递送基因并且在许多组织中可维持转基因的表达，包括肌肉、肺和脑。另外，AAV在人类临床试验中获得成功。
尽管在这方面取得成功，载体的设计依然存在问题。主要问题是多数人群已接触过各种AAV血清型，结果是将来的任何患者群中相对大的一部分人存在有阻断其基因递送的中和抗体(NAB)。rAAV载体的其它问题包括利用硫酸肝素作为受体的血清型(AAV2和3)的组织分散能力有限，对非感染性(non-permissive)类型细胞(例如，干细胞)的感染能力差，难以高效地使基因靶向递送选择的细胞群以及转基因携带能力有限。
技术上需要改进AAV载体以避免被抗AAV的血清抗体所中和。本发明满足了这种需要。
参考文献Halbert等.，(2000)J Virol 74，1524-32；Blacklow等.，(1971)Am J Epidemiol94，359-66.(1971)；Erles等.，(1999)J Med Virol 59，406-11；Moskalenko等.，(2000)J Virol 74，1761-6；Wobus等.，(2000)J Virol 74，9281-93；Sun等.，(2003)Gene Ther 10，964-76；Nguyen(2001)Neuroreport 12，1961-4；Davidson等.，(2000)Proc Natl Acad Sci美国97，3428-32；Rabinowitz等.，(1999)Virology265，274-85；Opie等.，(2003)J Virol 77，6995-7006；美国专利号6,596,539；美国专利号6,733,757；美国专利号6,710,036；美国专利号6,703,237。
发明概述本发明提供显示衣壳性能改变的突变的腺伴随病毒(AAV)，例如与血清中和抗体的结合能力降低和/或肝素结合能力改变和/或对特定细胞类型的感染力改变的AAV。本发明还提供了在衣壳基因中含有一种或多种突变的突变型AAV文库。本发明还提供生产突变型AAV和突变型AAV文库的方法，以及含有突变型AAV的组合物。本发明还提供含有突变的衣壳蛋白的重组AAV(rAAV)病毒粒子。本发明还提供含有编码突变的衣壳蛋白的核苷酸序列的核酸和含有该核酸的宿主细胞。本发明还提供递送基因产物至个体的方法，该方法通常涉及向需要它的个体施用有效量的所述rAAV病毒粒子。
附图简述

图1a和1b显示了野生型AAV和所述病毒文库的肝素结合性能。
图2a和2b显示了抗体中和逃逸突变体的产生。图2a描述了在各种严谨性(按中和抗体滴度(稀释度的倒数)与实际稀释度之比给出)时所拯救的组分(按照0严谨性时标准化)。图2b描述了兔抗血清使野生型AAV、AAV文库和各AAV逃逸突变体的感染力降低(减少)的百分率。
图3A-C描述了野生型AAV cap(SEQ ID NO1)的核苷酸序列与中和抗体逃逸突变体AbE2(SEQ ID NO2)和AbE L(SEQ ID NO3)的cap的核苷酸序列的对比情况。方框表明与野生型相比核苷酸序列中的改变。
图4A-G描述了野生型AAV-2 VP1的VP-1-编码核苷酸序列(SEQ ID NO4)与示范性中和抗体逃逸突变体的对比情况。
图5A-C描述了野生型AAV-2 VP1的VP-1-编码的氨基酸序列(SEQ ID NO5)与示范性中和抗体逃逸突变体的对比情况。
图6A-J描述了野生型AAV-2 VP1的VP-1-编码核苷酸序列与示范性中和抗体逃逸突变体的对比情况。
图7A-D描述了野生型AAV-2 VP1的VP-1-编码的氨基酸序列与示范性中和抗体逃逸突变体的对比情况。
图8A-G描述了野生型AAV-2 VP1的VP-1-编码核苷酸序列与示范性肝素结合突变体的对比情况。
图9A-C描述了野生型AAV-2 VP1的VP-1-编码的氨基酸序列与示范性肝素结合突变体的对比情况。
定义文中使用的术语“载体”指含有多肽或与多肽结合并可用于介导多肽递送至细胞的大分子或大分子的联合体。说明性的载体包括，例如质粒、病毒载体、脂质体或其它基因递送载体。
“AAV”是腺伴随病毒的缩写并可用于指病毒自身或其衍生物。除了需要指出的地方，该术语包括所有的亚型和天然存在的和重组形式的AAV。缩写“rAAV”指重组腺伴随病毒，也指重组AAV载体(或“rAAV载体”)。术语“AAV”包括1型AAV(AAV-1)、2型AAV(AAV-2)、3型AAV(AAV-3)、4型AAV(AAV-4)、5型AAV(AAV-5)、6型AAV(AAV-6)、7型AAV(AAV-7)、8型AAV(AAV-8)、鸟AAV、牛AAV、犬AAV、马AAV、灵长类AAV、非灵长类AAV和羊AAV。“灵长类AAV”指能感染灵长类的AAV，“非-灵长类AAV”指能感染非灵长类哺乳动物的AAV，“牛AAV”指能感染牛等哺乳动物的AAV。
文中使用的“rAAV载体”指含有非AAV起源(即，对AAV而言是异源性多核苷酸)的多核苷酸序列的AAV载体，通常是用于遗传性转化细胞的感兴趣的序列。总体上，异源多核苷酸的两侧连接有至少一条，一般是两条AAV末端反向重复序列(ITR)。术语rAAV载体包括rAAV载体颗粒和rAAV载体质粒。
“AAV病毒”或“AAV病毒颗粒”或“AAV载体颗粒”指至少含有一种AAV衣壳蛋白(通常是野生型AAV的全部衣壳蛋白)和一种包裹的多核苷酸的rAAV载体的病毒颗粒。如果该颗粒含有异源性多核苷酸(即，除野生型AAV基因组以外的多核苷酸，例如要递送至哺乳动物细胞的转基因)，一般称为“rAAV载体颗粒”或简单地称为“rAAV载体”。由于这种载体包含于rAAV颗粒中，产生rAAV颗粒需要包括产生rAAV载体。
“包装”指导致AAV颗粒装配和包裹的一系列胞内过程。
AAV“rep”和“cap”基因指编码腺伴随病毒的复制和包裹蛋白的多核苷酸序列。文中AAV rep和cap指AAV“包装基因”。
AAV的“辅助病毒”指能使AAV(例如，野生型AAV)被哺乳动物细胞复制和包装的病毒。各种这样的AAV辅助病毒是本领域已知的，包括腺病毒、疱疹病毒和痘病毒(例如牛痘)。虽然C亚群的5型腺病毒是最常用的，但腺病毒还包括许多不同的亚群。已知许多人、非人哺乳动物和鸟源的腺病毒并可得自保藏机构，例如ATCC。疱疹家族的病毒包括，例如单纯疱疹病毒(HSV)和Epstein-Barr病毒(EBV)以及巨细胞病毒和假狂犬病病毒(PRV)，这些病毒也可得自保藏机构，例如ATCC。
“辅助病毒功能物”指包含于辅助病毒基因组中使得AAV复制和包装(以及文中所述复制和包装的其它需要)的功能物。如文中所述，“辅助病毒功能物”可以许多方式提供，包括通过提供辅助病毒或提供，例如将编码所需功能物的多核苷酸序列以反式提供给生产细胞。
“感染性”病毒或病毒颗粒是含有能将多核苷酸成分递送进该病毒种类具有嗜性的细胞。该术语无需暗示病毒有任何复制能力。文中和本领域均描述了计数感染性病毒颗粒的试验。病毒感染力可表达为P∶I比或病毒颗粒总数与感染性病毒颗粒之比。
“可复制型”病毒(例如，可复制型AAV)指具有野生型表型的病毒，该病毒是感染性的并且也能被感染的细胞(即，在辅助病毒或辅助病毒功能物存在时)中复制。就AAV而言，复制能力通常需要存在功能性AAV包装基因。总体上，由于缺少一种或多种AAV包装基因，文中所述的rAAV载体在哺乳动物细胞(尤其是在人细胞中)中无复制能力。为了尽可能降低AAV包装基因和引入的rAAV载体之间重组产生可复制AAV，这种rAAV载体通常缺乏任何AAV包装基因序列。在许多实施方案中，文中所述的rAAV载体制剂含有的可复制性AAV(rcAAV，也称为RCA)即使有也极少(例如，每102个rAAV颗粒中约不到1个rcAAV，每104个rAAV颗粒中约不到1个rcAAV，每108个rAAV颗粒中约不到1个，每1012个rAAV颗粒中约不到1个rcAAV，或无rcAAV)。
术语“多核苷酸”指任何长度的核苷酸的聚合形式，包括脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸或其类似物。多核苷酸可含有修饰的核苷酸，例如甲基化的核苷酸和核苷酸类似物，并且可插入非核苷酸成分。如果核苷酸结构中存在修饰，则这种修饰可在聚合物装配之前或之后进行。文中使用的术语多核苷酸指双链或单链分子。除非另有规定或需要，文中所述的任何多核苷酸的实施方案包括双链形式与已知的或预计要形成双链形式的两条互补单链形式的任一条。
核酸杂交反应可在各种“严谨性”条件下进行。提高杂交反应的严谨性的条件是本领域熟知并公之于众的。参见，引为参考的Sambrook等.，《分子克隆，实验室手册》(Molecular Cloning，A Laboratory Manual)，第二版.，冷泉港实验室出版社，冷泉港，纽约，1989。例如，参见该著作的7.52页。相关条件的例子包括(为增加严谨性)孵育温度为25℃、37℃、50℃和68℃；缓冲液浓度为10×SSC、6×SSC、1×SSC、0.1×SSC(其中1×SSC是0.15M NaCl和15mM柠檬酸盐缓冲液)和采用与它们相等的其它缓冲系统；甲酰胺浓度为0％、25％、50％和75％；孵育时间从5分钟到24小时；1、2次或更多次的洗涤步骤；洗涤孵育时间为1、2或15分钟以及洗涤溶液为6×SSC、1×SSC、0.1×SSC或去离子水。严谨杂交条件的例子是在50℃或更高的温度与0.1×SSC(15mM氯化钠/1.5mM柠檬酸钠)中杂交。另一个严谨杂交条件的例子是于42℃在以下溶液中孵育过夜50％甲酰胺、1×SSC(150mM NaCl、15mM柠檬酸钠)、50mM磷酸钠(pH7.6)、5×Denhardt溶液、10％葡聚糖硫酸酯和20μg/ml经变性剪切的鲑鱼精子DNA，然后于65℃在0.1×SSC中洗涤过滤器。另一个严谨杂交条件的例子包括于65℃在含有以下成分的溶液中预杂交8小时到过夜6×单倍浓度的柠檬酸盐(SSC)(1×SSC是0.15M NaCl、0.015M柠檬酸钠；pH7.0)、5×Denhardt溶液、0.05％焦磷酸钠和100μg/ml鲱鱼精子DNA；然后于65℃在含有以下物质的溶液中杂交18-20小时6×SSC、1×Denhardt溶液、100μg/ml酵母tRNA和0.05％焦磷酸钠；于65℃在含有0.2×SSC和0.1％SDS(十二烷基硫酸钠)的溶液中洗涤过滤物1小时。
严谨杂交条件是至少与上述代表性条件一样严谨的杂交条件。其它严谨杂交条件是本领域已知的也可用于鉴定本发明的该特定实施方案的核酸。
“Tm”是50％通过Watson-Crick碱基配对由互补链的氢以反平行方向结合形成的多核苷酸双螺旋在实验条件下解离成为单链的摄氏温度。Tm可按照标准式估计，例如Tm＝81.5+16.6log[X+]+0.41(％G/C)-0.61(％F)-600/L其中[X+]是以mol/L计的阳离子浓度(一般是钠离子，Na+)；(％G/C)是G和C残基的数目占双螺旋中总残基的百分比；(％F)是溶液中甲酰胺的百分比(重量/体积)；L是该双螺旋中每条链的核苷酸数目。
多核苷酸或多肽与另一条多核苷酸或多肽具有某种“序列相同性”百分比，这意味着当对比时，在两条序列相比中相同的碱基或氨基酸的百分比。序列的相似性可以许多方式确定。为测定序列相同性，可使用得自万维网的ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/方法和计算机程序，包括BLAST来对比序列。另一种对比算法是得自Madison，Wisconsin，美国的Genetics Computing Group(GCG)软件包的FASTA，其是Oxford Molecular Group，Inc的全资子公司。其它用于对比的其它技术描述于《酶学方法》(Methods in Enzymology)226卷“用于大分子序列分析的计算机方法”(Computer Methods for Macromolecular SequenceAnalysis)，(1996)，Doolittle编，Academic Press，Inc.(美国，加利福尼亚，SanDiego，Harcourt Brace & Co.的一个部门)。允许序列中有空格的算法程序是尤其感兴趣的。Smith-Waterman是允许序列对比中有空格的一类算法。参见，Meth.Mol.Biol.70173-187(1997)。同样，可使用Needleman和Wunsch对比方法的GAP程序来对比序列。参见，J.Mol.Biol.48443-453(1970)。
使用Smith Waterman的局部同源性算法(Advances in Applied Mathematics2482-489(1981))来确定序列相同性的BestFit程序是令人感兴趣的。空格产生罚分一般从1到5分，经常是2到4分，在许多实施方案中是3分。空格延伸罚分一般从约0.01到0.20分，在许多例子中是0.10分。该程序的默认参数由待比较的输入序列确定。优选使用由该程序确定的默认参数测定序列的相同性。该程序也得自Madison，Wisconsin，美国的Genetics Computing Group(GCG)软件包。
另一个感兴趣的程序是FastDB算法。FastDB描述于《序列比较和分析、大分子测序与合成、所选择的方法与应用的最新方法》(Current Methods inSequence Comparison and Analysis，Macromolecule Sequencing and Synthesis，Selected Methods and Applications)，127-149页，1988，Alan R.Liss，Inc。基于以下参数通过FastDB计算序列相同性的百分比错配罚分1.00；空格罚分1.00；空格大小罚分0.33；和连接罚分30.0。
“基因”指至少含有一个开放读框的多核苷酸，该多核苷酸在转录和翻译后能编码某特定蛋白质。
“小干扰”或“短干扰RNA”或siRNA是能靶向感兴趣基因(“靶基因”)的核苷酸的RNA双螺旋。“RNA双螺旋”指通过RNA分子的两个区域之间互补配对所形成的结构。siRNA“靶向”某基因，即siRNA双螺旋部分的核苷酸序列与靶基因的核苷酸序列互补。在一些实施方案中，siRNA双螺旋的长度小于30个核苷酸。在一些实施方案中，双螺旋的长度可是29、28、27、26、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11或10个核苷酸。在一些实施方案中，双螺旋的长度可是19-25个核苷酸。siRNA的双螺旋部分可是发夹结构的一部分。除了双螺旋部分，该发夹结构可含有位于形成双螺旋的两条序列之间的环形部分。该环的长度可不同。在一些实施方案中，该环的长度是5、6、7、8、9、10、11、12或13个核苷酸。发夹结构也可含有3’或5’突出端部分。在一些实施方案中，突出端是长度为0、1、2、3、4或5个核苷酸的3’或5’突出端。
应用于多核苷酸的术语“重组子”指该多核苷酸是克隆、限制性酶切或连接步骤和其它方法的各种组合的产物，这些方法导致不同于天然发现的多核苷酸的结构。重组病毒是含有重组多核苷酸的病毒颗粒。这些术语分别包括原始多核苷酸构建物的复制物和原始病毒构建物的后代。
“控制元件”或“控制序列”是涉及功能性调节多核苷酸的分子间相互作用的核苷酸序列，包括该多核苷酸的复制、加倍、转录、剪接、翻译或降解。调节作用可影响这些过程的频率、速度或特异性，并且调节可以是增强或抑制。本领域已知的控制元件包括，例如转录调节序列(如启动子和增强子)。启动子是在某些条件下能结合RNA聚合酶并启动通常位于启动子下游(3’方向)的编码区域转录的DNA区域“操作性连接”或“可操作地连接”指遗传元件的并置，其中各元件的关系使得它们能以期待的方式操作。例如，如果某启动子能帮助启动编码序列的转录，则该启动子是操作性连接于编码区域。启动子和编码区域之间可有间插残基，前提是可维持这种功能性关系。
“表达载体”是含有编码感兴趣某多肽区域的载体，可用于影响预定靶细胞中该蛋白质的表达。表达载体也含有操作性连接于该编码区域以协助蛋白质在靶细胞中表达的控制元件。控制元件与和其操作性相连的一个或多个基因的组合有时称为“表达盒”，其中大多数“表达盒”是本领域已知且和可用的，或者可从本领域可用的成分容易地构建。
“异源性”指衍生自基因型不同于要比较实体的剩余部分的实体。例如，通过遗传工程技术引入衍生自不同种类生物的质粒或载体的多核苷酸是异源性多核苷酸。将取自天然编码序列的启动子操作性连接于天然不与之相连的其编码序列，这种启动子是异源启动子。所以，例如，含有编码异源基因产物的异源核酸的rAAV，是含有天然存在的野生型AAV中通常不含有的核酸的rAAV，其编码的异源基因产物是天然存在的野生型AAV通常不编码的基因产物。
术语“遗传改变”或“遗传修饰”(极其语法上的改变形式)在文中可互换使用来指不通过有丝分裂或减数分裂将遗传元件(例如，多核苷酸)引入细胞的方法。所述元件对细胞可是异源的，或者可是早已存在于细胞中的元件的额外拷贝或改进形式。遗传改变可例如通过本领域已知的任何方法用重组质粒或其它多核苷酸转染细胞来实现，所述方法例如电穿孔、磷酸钙沉淀或与多核苷酸脂质体复合物接触。遗传改变也可例如通过用DNA或RNA病毒或病毒载体转导或感染来实现。遗传元件通常引入细胞的染色体或微小染色体中；但任何能改变细胞及其后代的表型和/或基因型的变化均包含于该术语。
如果某基因序列在细胞的体外长期培养期间能被利用执行其功能，就认为该细胞受到该基因序列“稳定”改变、转导、遗传修饰或转化。这种细胞通常是“遗传上”受到改变的(遗传修饰)，即引入的遗传改变也可遗传给所改变细胞的后代。
术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”在文中可互换使用来指任何长度的氨基酸聚合物。该术语也包括被修饰的氨基酸聚合物，例如，二硫键的形成、糖基化、脂质化、磷酸化或与标记成分偶联。当向哺乳动物对象递送文中所述基因产物多肽(例如“CFTR”、“p53”或“EPO”等)及其组合物时，所述多肽及其组合物分别指保留了完整蛋白质所需生化功能的完整多肽、或其任何片段或其遗传工程改造的衍生物。类似地，CFTR、p53、EPO基因和用于递送基因产物至哺乳动物对象(也指向接纳细胞递送“转基因”)的其它这种基因包括编码拥有所需生化功能的完整多肽或任何片段或遗传工程改造的衍生物的多核苷酸。
“分离的”质粒、核酸、载体、病毒、宿主细胞或其它物质，指所述物质至少缺乏某些其它成分的制品，这些成分也可存在于这些物质或类似物质天然状况或最初从其制备时。所以，例如分离的物质可使用纯化技术从来源的混合物中富集而制备。可在绝对基础上测定富集情况，例如重量溶液体积比，或者可相对于起源混合物中存在的第二种潜在的干扰物质来测定。在本发明的实施方案中，富集程度增加则分离程度也增加。在一些实施方案中，分离的质粒、核酸、载体、宿主细胞或其它物质纯度例如为约80％纯化至约90％纯，至少约90％纯、至少约95％纯、至少约98％或至少约99％或更纯。
文中使用的术语“治疗”、“治疗的”等指获得所需的药理和/或生理作用。就完全或部分防止疾病或其症状而言，该作用可是预防性的，就部分或完全治愈疾病和/或疾病导致的不良影响而言，该作用可是治疗性的。文中使用的“治疗”包括治疗哺乳动物特别是人的疾病，并且包括(a)在易于患病或有患病危险但还未诊断出患病的对象中防止发生疾病；(b)抑制疾病，即停止其发展；和(c)缓解疾病，即使疾病消退。
术语“个体”、“宿主”、“对象”和“患者”在文中可互换使用，并且指哺乳动物，包括(但不限于)人和非人灵长类，包括猿和人；哺乳动物中的运动动物(例如，马)；哺乳动物中的农用动物(例如，绵羊、山羊等)；哺乳动物中的宠物(狗、猫等)；和啮齿类动物(例如，小鼠、大鼠等)。
在进一步描述本发明之前，应理解的是本发明不限于所述的具体实施方案，因为这些实施方案当然是可变的。既然本发明的范围仅受附加的权利要求限制，文中使用的术语也应理解是仅为了描述具体的实施方案而非限制。
除非文中另有明确指明，在提供数值范围的地方应理解的是，该范围上下限之间每个插入值或该范围中其它任何描述的或插入的值也包括于本发明中。这些小范围的上下限可独立地包括在属于所述范围任何具体排除端点的范围的较小范围内，并且也包括于本发明中。在所述范围包括一边或两边界限的地方，排除一边或两边的界限的范围也包括于本发明中。
除非另有定义，所有文中使用的技术和科学术语具有和本发明所属领域的普通技术人员通常理解的意义相同。虽然可用任何相似或等价于文中所述的方法和材料来实践或测试本发明，优选的方法和材料是现在所述的。文中提及的所有出版物均引为参考来披露和描述与所引用出版物有关的方法和/或材料。
必须注意的是，除非文中另有明确指明，文中和附加的权利要求所使用的单数形式的“一个”、“和”与“该”包括其复数形式。因此，例如，“一个rAAV载体”包括多个这种载体并且“AAV突变的衣壳蛋白”包括本领域技术人员已知的一个或多个AAV突变的衣壳蛋白及其等价物，等等。
提供文中所述的出版物仅是因为其内容先公开于本申请的提交日期。文中没有什么可被解释为承认由于在先发明而使本发明不具资格早于该出版物。此外，提供的出版物的发表日期可能不同于实际发表日期，这些日期可能需要独立证实。
发明详述本发明提供衣壳性能显示出变化的突变的腺伴随病毒(AAV)，所述性能改变是例如与血清中和抗体的结合能力降低和/或与肝素结合能力改变和/或对特定细胞类型的感染力的改变。本发明还提供在衣壳基因中含有一个或多个突变的突变型AAV文库。本发明还提供产生突变型AAV、突变型AAV文库的方法，和含有突变型AAV或突变型AAV文库的组合物。本发明还提供含有突变的衣壳蛋白的重组AAV(rAAV)病毒颗粒。本发明还提供含有编码突变的衣壳蛋白的核苷酸序列的核酸与含有所述核酸的宿主细胞。本发明还提供向个体递送基因产物的方法，所述方法通常涉及向需要它的个体施用有效量的所述rAAV病毒粒子。在许多实施方案中，所述突变型AAV病毒颗粒、所述核酸等是分离的。
所述突变型AAV病毒颗粒或所述rAAV病毒粒子表现出一种或多种以下性能1)对硫酸肝素的结合亲和力比野生型AAV高；2)对硫酸肝素的结合亲和力比野生型AAV低；3)对AAV感染具有抗性的细胞的感染能力提高，或者与原型可感染细胞相比，不易被AAV感染的细胞的感染力提高；4)对中和抗体的逃逸能力提高；和5)穿过内皮细胞层的能力提高。
编码AAV突变的衣壳蛋白的所述核酸用于产生表现出性能改变的重组AAV病毒颗粒，所述性能改变例如对硫酸肝素的结合亲和力提高，对硫酸肝素的结合亲和力降低，对AAV感染具有抗性的细胞的感染力提高，或者与原型可感染细胞细胞对不易被AAV感染的细胞的感染力提高，对中和抗体的逃逸作用和穿过内皮细胞层的能力提高等。所述rAAV病毒粒子可用于将基因产物递送至个体。
细胞膜结合的硫酸肝素蛋白聚糖是AAV(例如，AAV-2)的主要细胞表面受体。例如在以局部方式(例如，不需要rAAV颗粒从递送位扩散)递送rAAV颗粒时提高硫酸肝素结合能力(例如，提高对肝素的亲和力)是有利的。许多类型的细胞能在细胞表面或紧靠细胞的环境中产生硫酸肝素。所以，对硫酸肝素结合亲和力提高的rAAV病毒粒子可相对接近地维持在施用位置。例如，局部递送所述rAAV病毒粒子对将基因产物递送至位于某解剖学位置(而不递送至例如非癌性组织的周围)的肿瘤、递送至患病的心血管(但不递送至健康心脏组织的周围)等是有利的。
本发明的许多实施方案例举了AAV-2和AAV-2的突变体。然而，文中例举的AAV-2绝非限制性。本领域技术人员可容易地采用文中所述的方法来产生其它AAV的衣壳突变体，例如包括AAV-3、AAV-4、AAV-5等。所以，在例如AAV与整联蛋白αvβ5的β5亚基结合时，本发明考虑了相比于对应的野生型AAV表现出与整联蛋白αvβ5的β5亚基结合能力增加或降低的突变型AAV。另一个例子中，在一种AAV(例如，AAV-4)与O-连接的唾液酸结合的场合，本发明考虑了表现出与O-连接的唾液酸结合能力增加或降低的突变型AAV。另一个例子中，在一种AAV(例如，AAV-5)与N-连接的唾液酸或血小板衍生生长因子受体(PDGFR)结合时，本发明考虑了表现出与N-连接的唾液酸或PDGFR的结合能力增加或降低的突变型AAV。对AAV受体的描述可参见，例如Kaludov等.，((2001)J Virol.756884)；Pasquale等.，((2003)Nat.Med.91306)和Walters等.，((2001)J Biol Chem.27620610)。
提高对肝素的亲和力的优点也在于它提高了对通常AAV难以感染的细胞类型，例如非感染细胞类型和“低感染”细胞类型(例如，相比于原型可感染细胞不易被感染的细胞)的感染力。这种细胞类型包括其表面硫酸肝素含量较少的细胞。提高对硫酸肝素的结合亲和力提高了对表面硫酸肝素较少的细胞的结合水平，从而提高了对这些细胞的感染力。不易被AAV感染的细胞的例子包括干细胞。所述rAAV病毒粒子的优点是因为它能感染干细胞从而能递送基因产物至干细胞。AAV不能感染或不易感染细胞的其它例子包括肺上皮细胞和肝细胞。
降低硫酸肝素结合能力(例如，降低肝素亲和力)的优点是更广泛分布或全身性递送所述rAAV病毒粒子的治疗方法所需的。这种rAAV病毒粒子从施用位置扩散，因此可比含有野生型衣壳蛋白的rAAV病毒粒子感染更多数量的细胞。
降低与中和抗体的结合是有利的。中和抗体能与野生型衣壳蛋白结合。中和抗体与野生型衣壳蛋白结合可具有几种效应，包括限制病毒颗粒中含有野生型衣壳蛋白的rAAV病毒粒子的驻留时间，防止其与细胞表面结合，凝聚病毒，诱导衣壳结构的改变，和防止病毒解装配和脱衣壳(释放DNA需要的步骤)。因此，对中和抗体结合能力降低的rAAV颗粒，可提高其感染细胞的能力以及增加在施用rAAV病毒粒子的对象体内的驻留时间。因此增加了基因产物递送的有效持续时间。
提高穿过内皮细胞层的能力使得rAAV病毒粒子可接近从施用位置被内皮细胞层隔开的组织和细胞。例如，血脑屏障、肿瘤血管系统和心血管系统均存在形成屏障的内皮细胞层阻碍了接近特定的解剖学位置。因此，所述rAAV病毒粒子可表现出一种或多种以下性能1)穿过血脑屏障的能力增加；2)穿过肿瘤血管系统和感染肿瘤细胞的能力增加；和3)穿过心脏中内皮细胞层的能力增加。
突变体腺伴随病毒的病毒粒子本发明提供的突变的腺伴随病毒含有显示衣壳性能改变的突变的衣壳蛋白。由于含有一种或多种突变的衣壳蛋白，所述突变型AAV表现出一种或多种以下性能1)相比于野生型AAV，肝素结合亲和力提高；2)相比于野生型AAV，肝素结合亲和力降低；3)对AAV不能感染细胞的感染力提高；4)逃逸中和抗体作用的能力提高；和5)穿过内皮细胞层的能力提高。所述突变型AAV的这些性能是与对应的亲代野生型AAV相比较。所以，例如当亲代野生型AAV是AAV-2时，所述突变体的性能是与野生型AAV-2的相同性能作比较。
肝素亲和力提高的突变体在一些实施方案中，所述突变型AAV编码的衣壳蛋白显示与硫酸肝素的结合亲和力比野生型AAV提高了。在这些实施方案中，所述突变型AAV编码的衣壳蛋白与硫酸肝素的结合亲和力至少高于野生型AAV衣壳约10％、约15％、约20％、约25％、约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％、约2倍、约2.5倍、约5倍、约10倍、约15倍、约50倍、约75倍、或约100倍或更高。由于肝素是结构上类似于硫酸肝素的分子，肝素经常用于实验性确定衣壳蛋白与硫酸肝素的结合是否得到改变。所以，术语“肝素结合亲和力”和“硫酸肝素结合亲和力”和类似术语在文中可互换使用。
例如，尽管AAV-2与肝素的结合亲和力的K(d)值约2.0nM，而所述突变型AAV与肝素的结合亲和力至少高于野生型AAV-2与肝素的结合亲和力约10％、约15％、约20％、约25％、约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％、约2倍、约2.5倍、约5倍、约10倍、约15倍、约50倍、约75倍、或约100倍或更高。
通常使用浓度范围约从450mM到约550mM的NaCl将野生型AAV从肝素亲和层析介质上洗脱。在一些实施方案中，使用浓度高于550mM的NaCl从肝素亲和层析介质上洗脱所述突变型AAV，例如用约575mM到约600mMNaCl、从约600mM到约625mM NaCl、从约625mM到约650mM NaCl、从约650mM到约675mM NaCl、从约675mM到约700mM NaCl、从约700mM到约725mM NaCl、从约725mM到约750mM NaCl、从约750mM到约775mM NaCl、或从约775mM到约800mM NaCl、或更高。
肝素亲和力降低的突变体在其它实施方案中，所述突变型AAV显示对肝素的亲和力低于野生型AAV。在这些实施方案中，当所述突变型AAV被包装在病毒颗粒中时，其与肝素的亲和力比野生型AAV(例如AAV-2)至少约低10％、约15％、约20％、约25％、约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％。在一些实施方案中，当所述突变型AAV被包装进病毒颗粒中时，可使用NaCl将其从肝素亲和层析介质上洗脱，所用NaCl的浓度范围可从约440mM到约400mM NaCl、从约400mM到约375mM NaCl、从约375mM到约350mM NaCl、从约350mM到约325mM NaCl、从约325mM到约300mM NaCl、从约300mM到约275mM NaCl、从约275mM到约250mM NaCl、从约250mM到约225mM NaCl、从约225mM到约200mMNaCl、或更低。
肝素结合亲和力可使用任何已知的试验来确定。例如，变异衣壳与硫酸肝素的亲和力可通过将病毒颗粒与固定化的肝素结合来测定。参见，例如Qui等，(2000)Virolory 269137-147。
中和抗体逃逸突变体在一些实施方案中，相比于野生型AAV(“wt AAV”)或含有野生型衣壳蛋白的AAV，所述突变型AAV显示对中和抗体的抗性提高。在这些实施方案中，所述突变型AAV对中和抗体的抗性比野生型AAV的约高10倍到约10,000倍的，例如所述突变型AAV对中和抗体的抗性比野生型AAV(“wt AAV”)或含有野生型衣壳蛋白的AAV的约高10倍到约25倍、约25倍到约50倍、约50倍到约75倍、约75倍到约100倍、约100到约150倍、约150倍到约200倍、约200倍到约250倍、约250倍到约300倍、至少约350倍、至少约400倍、约400倍到约450倍、约450倍到约500倍、约500倍到约550倍、约550倍到约600倍、约600倍到约700倍、约700倍到约800倍、约800倍到约900倍、约900倍到约1000倍、约1,000倍到约2,000倍、约2,000倍到约3,000倍、约3,000倍到约4,000倍、约4,000倍到约5,000倍、约5,000倍到约6,000倍、约6,000倍到约7,000倍、约7,000倍到约8,000倍、约8,000倍到约9,000倍或约9,000倍到约10,000倍。
在一些实施方案中，所述突变型AAV与能结合野生型AAV衣壳蛋白的中和抗体的结合能力降低了。例如，所述突变型AAV与能结合野生型AAV衣壳蛋白的中和抗体的结合能力降低了约10倍到约10,000倍。例如，所述突变型AAV与能结合野生型AAV衣壳蛋白的中和抗体的结合能力(例如，结合的亲和力)降低了约10倍到约25倍、约25倍到约50倍、约50倍到约75倍、约75倍到约100倍、约100到约150倍、约150倍到约200倍、约200倍到约250倍、约250倍到约300倍、至少约350倍、至少约400倍、约400倍到约450倍、约450倍到约500倍、约500倍到约550倍、约550倍到约600倍、约600倍到约700倍、约700倍到约800倍、约800倍到约900倍、约900倍到约1000倍、约1,000倍到约2,000倍、约2,000倍到约3,000倍、约3,000倍到约4,000倍、约4,000倍到约5,000倍、约5,000倍到约6,000倍、约6,000倍到约7,000倍、约7,000倍到约8,000倍、约8,000倍到约9,000倍或约9,000倍到约10,000倍。
在一些实施方案中，抗AAV中和抗体与所述中和抗体逃逸突变型AAV结合的亲和力约小于10-7M、约小于5×10-6M、约小于10-6M、约小于5×10-5M、约小于10-5M、约小于10-4M或更低。
在一些实施方案中，所述突变型AAV的体内驻留时间比野生型AAV增加。例如，所述突变型AAV的驻留时间比野生型AAV的驻留时间长至少约10％、至少约25％、至少约50％、至少约100％、至少约3倍、至少约5倍、至少约10倍、至少约25倍、至少约50倍、至少约100倍或更多倍。
某给定突变型AAV是否表现出与中和抗体的结合能力降低和/或对中和抗体的抗性提高可通过任何已知的试验来测定，包括实施例1所述的试验。例如，使突变型AAV在存在中和抗体时中与可感染细胞类型(例如，293细胞)接触。对照样品含有细胞、突变型AAV但无中和抗体。经合适的时间后，使该细胞与腺病毒接触，并测定AAV颗粒。将AAV颗粒的含量与没有中和抗体时产生的AAV颗粒的量进行比较。
感染力提高的突变体在一些实施方案中，所述突变型AAV显示对AAV不能感染的细胞和低感染细胞的感染力提高。AAV不能感染的细胞和低感染的细胞在文中共同称为“非感染细胞”。当可感染的细胞群在体外或体内与感染复数(moi)为5的AAV接触，约70％到约100％的细胞群被AAV所感染。当非感染细胞群在体外或体内与moi为5的AAV接触，约70％以下的细胞被AAV所感染，例如，细胞群中被AAV所感染的不到约60％到约69％、约50％到约60％、约40％到约50％、约30％到约40％、约20％到约30％、约10％到约20％、或约1％到约10％，并且在一些细胞类型中，基本上无细胞被AAV感染。
可通过使某特定类型的细胞群在体外或体内与moi为5的rAAV构建物接触来容易地确定该细胞是AAV可感染或不能感染的，所述rAAV构建物含有编码提供可检测信号(例如，荧光蛋白，如绿色荧光蛋白)蛋白的核苷酸序列。一定比例的细胞变为该检测蛋白阳性时，表明一定百分比的细胞已受到rAAV感染。当约0％到约69％的细胞受到rAAV感染时，可认为这些细胞对AAV是非感染性的。当约70％到约100％的细胞被rAAV感染时，可认为这些细胞对AAV是感染性的。感染力可表示为293细胞的相对感染力。在一些实施方案中，相比293细胞，AAV显示对非感染性细胞的感染力降低，例如，AAV对非感染细胞的感染力不到对293细胞的感染力的70％，例如AAV对非感染细胞的感染力不到对293细胞的感染力的约70％、不到约60％、不到约50％、不到约40％、不到约30％、不到约20％、不到约10％或更低。
在一些实施方案中，所述突变型AAV对AAV较难感染的细胞(例如，非感染细胞)的感染能力提高。在这些实施方案中，所述突变型AAV对非感染细胞的感染力比野生型AAV高至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约2倍、至少约4倍、至少约5倍、至少约10倍、至少约25倍或更高。
较难被AAV感染的细胞的例子包括干细胞。非感染细胞类型的其它例子包括(但不限于)肺上皮细胞和肝细胞。
文中使用的术语“干细胞”指能自我更新并能产生分化后代的哺乳动物细胞(参见，例如，Morrison等.，(1997)Cell 88287-298)。干细胞通常也具有以下一种或多种性能进行非同步或对称性复制的能力，如此分裂后产生的两个子细胞可具有不同的表型；广泛的自我更新能力；以有丝休眠形式存在的能力；和其存在的所有组织中无性再生的能力，例如造血干细胞重建造血谱系的能力。“组细胞”与干细胞的区别在于它们通常不具有广泛的自我更新能力并且经常仅能产生它们从中衍生的组织谱系的一个亚群，例如仅能产生造血系统中的淋巴谱系或红细胞谱系。
干细胞的特征在于存在与用抗体鉴定的特异性表位相连的标记，同时不存在通过缺乏与特异性抗体的结合而鉴定的特定标记。干细胞也可通过体外和体内的功能性试验来鉴定，特别是涉及干细胞产生多重分化后代能力的试验。
感兴趣的干细胞包括造血干细胞和其衍生的组细胞(美国专利号5,061,620)；神经嵴干细胞(参见Morrison等.，(1999)Cell 96737-749)；成人神经干细胞和神经组细胞；胚胎干细胞；间充质干细胞；中胚层干细胞等。其它感兴趣的造血“组细胞”包括属于淋巴谱系的细胞，例如不成熟的T细胞和B细胞群。
结构特征所述突变型AAV病毒粒子在至少一种衣壳蛋白(例如，VP1、VP2和VP3中的至少一种)中含有突变。所以，相比于野生型AAV衣壳蛋白，VP1、VP2和VP3含有至少一个氨基酸取代。在一些实施方案中，相比于野生型AAV衣壳蛋白，VP1、VP2和VP3含有至少含有约1到25个氨基酸取代，例如相比于野生型AAV VP1、VP2和VP3，含有约1到5个、约5到10个、约10到15个、约15到20个或约20到25个氨基酸取代。或者，相比于野生型衣壳蛋白，所述突变型AAV病毒粒子在至少一种衣壳蛋白中含有一个或多个氨基酸缺失和/或插入。在一些实施方案中，相比于野生型衣壳蛋白，所述突变型AAV病毒粒子在衣壳蛋白中含有一个或多个氨基酸取代和/或缺失和/或插入。
在一些实施方案中，所述突变型AAV病毒粒子与中和抗体的结合能力比野生型AAV降低，并且其所含VP1的氨基酸序列与SEQ ID NO7、9、11、I3、15、17、19、21、23、25、27、29、31和33之一所示或图5A-C或图7A-D所示氨基酸序列至少具有约85％、至少约90％、至少约95％、至少约98％或至少约99％、或更高的氨基酸序列相同性。在一些实施方案中，所述突变型AAV病毒粒子显示与中和抗体的结合能力比野生型AAV降低，并且其所含VP1的氨基酸序列与SEQ ID NO7、9、11、I3、15、17、19、21、23、25、27、29、31和33之一所示或图5A-C或图7A-D所示氨基酸序列具有1-5、5-10或10-20个氨基酸差异。在一些实施方案中，所述突变型AAV病毒粒子与中和抗体的结合能力比野生型AAV降低，并且其所含VP1具有如SEQ ID NO7、9、11、I3、15、17、19、21、23、25、27、29、31和33之一所示或图5A-C或图7A-D所示的氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述突变型AAV病毒粒子显示与硫酸肝素的亲和力比野生型AAV增加，并且其所含VP1的氨基酸序列与SEQ ID NO35或SEQ IDNO37所示或图9A-C(D14H1或D14L3)所示氨基酸序列至少具有约85％、至少约90％、至少约95％、至少约98％或至少约99％、或更高的氨基酸序列相同性。在一些实施方案中，所述突变型AAV病毒粒子与硫酸肝素的亲和力比野生型AAV增高，并且其所含VP1的氨基酸序列与SEQ ID NO35或SEQ ID NO37所示或图9A-C(D14H1或D14L3)所示氨基酸序列具有1-5、5-10或10-20个氨基酸差异。在一些实施方案中，所述突变型AAV病毒粒子与硫酸肝素的亲和力比野生型AAV增高，并且其所含VP1具有如SEQ ID NO35或SEQ ID NO37所示或如图9A-C(D14H1或D14L3)所示的氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述突变型AAV病毒粒子显示与硫酸肝素的亲和力比野生型AAV降低，并且其所含VP1的氨基酸序列与SEQ ID NO39或SEQ IDNO41所示或图9A-C(P1BH1或P1BH2)所示氨基酸序列至少具有约85％、至少约90％、至少约95％、至少约98％或至少约99％、或更高的氨基酸序列相同性。在一些实施方案中，所述突变型AAV病毒粒子显示与硫酸肝素的亲和力比野生型AAV降低，并且其所含VP1的氨基酸序列与SEQ ID NO39或SEQ IDNO41所示或图9A-C(P1BH1或P1BH2)所示氨基酸序列具有1-5、5-10或10-20个氨基酸差异。在一些实施方案中，所述突变型AAV病毒粒子显示与硫酸肝素的亲和力比野生型AAV降低，并且其所含VP1具有如SEQ ID NO39或SEQID NO41所示或如图9A-C(P1BH1或P1BH2)所示的氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述突变型AAV病毒粒子含有野生型Rep73、Rep68、Rep52和Rep40蛋白。在其它的实施方案中，所述突变型AAV除了含有一个或多个突变的衣壳蛋白外，在一个或多个Rep78、Rep68、Rep52、和Rep40蛋白中还含有一个或多个突变。
核酸与宿主细胞本发明提供含有编码AAV突变的衣壳蛋白的核苷酸序列的核酸以及含有所述核酸的宿主细胞。该核酸与宿主细胞可如下所述用于产生rAAV病毒粒子。所述核酸编码含有一个或多个氨基酸取代的一种或多种VP1、VP2和VP3。对象核酸含有编码VP1、VP2和VP3中至少一种的核苷酸序列，其中所编码的衣壳蛋白与野生型AAV衣壳蛋白相比含有1到约15个氨基酸取代，例如与野生型AAV衣壳蛋白相比，所编码的衣壳蛋白含有约1到5个、约5到10个、约10到15个、约15到20个、或约20到25个氨基酸取代。所编码的衣壳蛋白与野生型AAV衣壳蛋白相比可额外含有一个或多个氨基酸缺失和/或插入。
在一些实施方案中，所述核酸含有的核苷酸序列与SEQ ID NO2、3、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38和40中任一所示或图4A-G、图6A-J或图8A-G中所示任一核苷酸序列具有约1到30个核苷酸的差异(例如，约1到5、约5到10、约10到20或约20到30核苷酸差异)。在一些实施方案中，所述核酸含有的核苷酸序列在严谨杂交条件下能与含有SEQ ID NO2、3、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38和40中任一所示或图4A-G、图6A-J或图8A-G中所述任一核苷酸序列的核酸杂交。在一些实施方案中，所述核酸含有的核苷酸序列与SEQID NO2、3、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38和40中任一所示或图4A-G、图6A-J或图8A-G中所示任一核苷酸序列具有至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约98％、至少约99％或更高的相同性。在一些实施方案中，所示核酸含有的核酸具有SEQ IDNO2、3、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38和40中任一所示或图4A-G、图6A-J或图8A-G中所示任一核苷酸序列。
本发明还提供含有所述核酸的宿主细胞，例如，分离的宿主细胞。所述宿主细胞通常是分离的细胞，例如，体外培养中的细胞。所述宿主细胞可如下所述用于生产所述rAAV病毒粒子。当将所述宿主细胞用于生产所述rAAV病毒粒子时，所述宿主细胞指“包装细胞”。在一些实施方案中，用所述核酸稳定地遗传修饰所述宿主细胞。在其它实施方案中，用所述核酸瞬时修饰所述宿主细胞。
使用已知的技术将所述核酸稳定地或瞬时引入宿主细胞中，所述技术包括(但不限于)电穿孔、磷酸钙沉淀、脂质体介导转化等。为进行稳定的转化，所述核酸通常还包含可选择标记，例如新霉素抗性等几种已知的可选择标记中的任一种。
通过将所述核酸引入各种细胞得到所述宿主细胞，所述各种细胞是例如包括鼠细胞和灵长类细胞(例如，人细胞)的哺乳动物细胞。合适的哺乳动物细胞包括(但不限于)灵长类细胞和细胞系，其中合适的细胞系包括(但不限于)293细胞、COS细胞、HeLa细胞、Vero细胞、3T3小鼠成纤维细胞、C3H10T1/2成纤维细胞、CHO细胞等。
在一些实施方案中，除了含有编码突变的衣壳蛋白的核苷酸序列的核酸之外，所述宿主细胞还含有编码一种或多种AAV rep蛋白的核苷酸序列的核酸。在其它实施方案中，所述宿主细胞还含有下述rAAV载体。使用所述宿主细胞来生产rAAV病毒粒子将在下文详述。
rAAV病毒粒子突变的衣壳蛋白掺入含有异源核酸的AAV，该异源核酸产生异源基因产物(例如，异源核酸或异源蛋白质)。所述重组AAV病毒粒子(“rAAV病毒粒子”)含有突变的衣壳蛋白和含有编码异源基因产物的异源核酸。所以，本发明提供含有上述突变的衣壳蛋白和异源核酸的rAAV病毒粒子。所述rAAV病毒粒子用于将基因产物引入个体。
所述rAAV病毒粒子含有上述突变的衣壳蛋白。由于含有突变的衣壳蛋白，所述rAAV病毒粒子显示一种或多种以下性能1)相比于野生型AAV，肝素结合亲和力提高；2)相比于野生型AAV，肝素结合亲和力降低；3)对AAV非感染细胞的感染力提高；4)逃逸中和抗体的能力提高；和5)穿过内皮细胞层的能力提高。
在一些实施方案中，所述rAAV病毒粒子与肝素的结合亲和力高于野生型AAV病毒粒子。在这些实施方案中，所述对象rAAV病毒粒子编码的衣壳蛋白显示与肝素的亲和力比野生型AAV衣壳高至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约2倍、至少约2.5倍、至少约5倍、至少约10倍、至少约15倍、至少约50倍、至少约75倍、或至少约100倍或更高。通常使用浓度范围约从450mM到约550mM的NaCl将野生型AAV从肝素亲和层析介质上洗脱。在一些实施方案中，使用浓度高于550mM的NaCl从肝素亲和层析介质上洗脱所述rAAV，例如从约575mM到约600mM NaCl、从约600mM到约625mM NaCl、从约625mM到约650mM NaCl、从约650mM到约675mM NaCl、从约675mM到约700mM NaCl、从约700mM到约725mM NaCl、从约725mM到约750mM NaCl、从约750mM到约775mM NaCl、或从约775mM到约800mM NaCl、或更高。
在其它实施方案中，所述rAAV病毒粒子与肝素的亲和力低于野生型AAV。在这些实施方案中，所述rAAV病毒粒子与肝素的亲和力比野生型AAV低至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％。在一些实施方案中，可使用NaCl将所述rAAV病毒粒子从肝素亲和层析介质上洗脱，NaCl的浓度范围可从约440mM到约400mM NaCl、从约400mM到约375mM NaCl、从约375mM到约350mM NaCl、从约350mM到约325mM NaCl、从约325mM到约300mM NaCl、从约300mM到约275mM NaCl、从约275mM到约250mMNaCl、从约250mM到约225mM NaCl、从约225mM到约200mM NaCl、或更低。
肝素结合亲和力可使用任何已知试验来确定。例如，变异衣壳与硫酸肝素的亲和力可通过使病毒颗粒与固定化肝素结合来测定。参见，例如Qui等，(2000)Virolory 269137-147。
在一些实施方案中，相比于野生型AAV或含有野生型衣壳蛋白的AAV，所述rAAV病毒粒子对中和抗体的抗性提高。在这些实施方案中，所述rAAV病毒粒子对中和抗体的抗性比wt AAV高约10倍到约10,000倍的，例如对象rAAV病毒粒子对中和抗体的抗性比野生型AAV或含有野生型衣壳蛋白的AAV的高约10倍到约25倍、约25倍到约50倍、约50倍到约75倍、约75倍到约100倍、约100到约150倍、约150倍到约200倍、约200倍到约250倍、约250倍到约300倍、至少约350倍、至少约400倍、约400倍到约450倍、约450倍到约500倍、约500倍到约550倍、约550倍到约600倍、约600倍到约700倍、约700倍到约800倍、约800倍到约900倍、约900倍到约1000倍、约1,000倍到约2,000倍、约2,000倍到约3,000倍、约3,000倍到约4,000倍、约4,000倍到约5,000倍、约5,000倍到约6,000倍、约6,000倍到约7,000倍、约7,000倍到约8,000倍、约8,000倍到约9,000倍或约9,000倍到约10,000倍。
在一些实施方案中，所述rAAV病毒粒子与能结合野生型AAV衣壳蛋白的中和抗体的结合能力降低。例如，所述突变型rAAV病毒粒子与能结合野生型AAV衣壳蛋白结合的中和抗体的结合能力降低约10倍到约10,000倍。例如，所述突变型rAAV病毒粒子与能结合野生型AAV衣壳蛋白的中和抗体的结合能力降低约10倍到约25倍、约25倍到约50倍、约50倍到约75倍、约75倍到约100倍、约100到约150倍、约150倍到约200倍、约200倍到约250倍、约250倍到约300倍、至少约350倍、至少约400倍、约400倍到约450倍、约450倍到约500倍、约500倍到约550倍、约550倍到约600倍、约600倍到约700倍、约700倍到约800倍、约800倍到约900倍、约900倍到约1000倍、约1,000倍到约2,000倍、约2,000倍到约3,000倍、约3,000倍到约4,000倍、约4,000倍到约5,000倍、约5,000倍到约6,000倍、约6,000倍到约7,000倍、约7,000倍到约8,000倍、约8,000倍到约9,000倍或约9,000倍到约10,000倍。
在一些实施方案中，抗AAV中和抗体与所述rAAV病毒粒子结合的亲和力约小于10-7M、约小于5×10-6M、约小于10-6M、约小于5×10-5M、约小于10-5M、约小于10-4M或更低。
与中和抗体的结合能力降低的所述rAAV病毒粒子显示在体内的驻留时间比含有野生型衣壳蛋白的AAV病毒粒子的长。例如，所述rAAV病毒粒子在体内的驻留时间比含有野生型衣壳蛋白的AAV病毒粒子的驻留时间至少长约25％、至少约50％、至少约75％、至少约2倍、至少约2.5倍、至少约3倍、至少约4倍、至少约5倍、至少约10倍、至少约15倍、至少约20倍、至少约50倍或更多倍。
某给定的突变型rAAV病毒粒子是否表现出与中和抗体的结合能力降低和/或对中和抗体的抗性提高可通过任何已知试验来确定，包括实施例中所述的试验。例如，使突变型rAAV病毒粒子在有中和抗体时与可感染细胞类型(例如，293细胞)接触。对照样品含有细胞、突变型rAAV病毒粒子但无中和抗体。合适的时间后，细胞与腺病毒接触，并测定rAAV颗粒。rAAV颗粒的含量与在无中和抗体时产生的rAAV颗粒的量进行比较。
在一些实施方案中，所述rAAV病毒粒子显示对AAV较难感染的细胞(例如，非感染细胞)的感染能力增加。在这些实施方案中，所述突变型AAV对非感染细胞的感染力比野生型AAV或含有野生型衣壳蛋白的AAV病毒粒子高至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约2倍、至少约4倍、至少约10倍、至少约20倍、至少约50倍或更高。
较难被AAV感染的细胞的例子包括(但不限于)干细胞、肺上皮细胞和肝细胞。
文中使用的术语“干细胞”指能自我更新并产生分化后代的哺乳动物细胞(参见，例如，Morrison等.，(1997)Cell 88287-298)。干细胞通常也具有以下一种或多种性能进行非同步或对称性复制的能力，如此分裂后产生的两个子细胞可具有不同的表型；广泛的自我更新能力；以有丝分裂静止形式存在的能力；和其存在的所有组织中无性再生能力，例如造血干细胞重建所有造血谱系的能力。“组细胞”与干细胞的区别在于它们通常不具有广泛的自我更新能力并且经常仅能产生它们从中衍生的组织谱系的一个亚群，例如仅能产生造血系统中的淋巴谱系或红细胞谱系。
干细胞的特征是存在与用抗体鉴定的特异性表位相连的标记，同时不存在通过缺乏与特异性抗体的结合而鉴定的特定标记。干细胞也可通过体外和体内的功能性试验来鉴定，特别是涉及干细胞产生多重分化后代能力的试验。
感兴趣的干细胞包括造血干细胞和其衍生的组细胞(美国专利号5,061,620)；神经嵴干细胞(参见Morrison等.，(1999)Cell 96737-749)；成人神经干细胞和神经组细胞；胚胎干细胞；间充质干细胞；中胚层干细胞等。其它感兴趣的造血“组细胞”包括属于淋巴谱系的细胞，例如不成熟的T细胞和B细胞群。
在一些实施方案中，所述rAAV病毒粒子显示穿过内皮细胞层的能力增强。例如，在这些实施方案中，所述rAAV病毒粒子显示穿过内皮细胞层的能力增强至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约2倍、至少约5倍、至少约10倍、至少约25倍或致死约50倍。
可用熟知的系统经实验来确定某给定的rAAV病毒粒子穿过内皮细胞层的能力是否增强。
所述rAAV病毒粒子在至少一种衣壳蛋白(例如，VP1、VP2和VP3中的至少一种)中含有突变。所以，与野生型AAV衣壳蛋白相比，VP1、VP2和VP3的至少一种含有至少一个氨基酸取代。在一些实施方案中，与野生型AAV VP1、VP2和VP3相比，VP1、VP2和VP3的至少一种含有1到约25个氨基酸取代，例如与野生型AAV VP1、VP2和VP3相比，含有约1到5个、约5到10个、约10到15个、约15到20个或约20到25个氨基酸取代。此外，相比于野生型衣壳蛋白，所述rAAV病毒粒子在至少一种衣壳蛋白中含有一个或多个氨基酸缺失和/或插入。在一些实施方案中，相比于野生型衣壳蛋白，所述rAAV病毒粒子在一种衣壳蛋白中含有一个或多个氨基酸取代和/或缺失和/或插入。
在一些实施方案中，所述rAAV病毒粒子显示与中和抗体的结合能力比野生型AAV降低，其所含VP1的氨基酸序列与SEQ ID NO7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31和33之一所示或图5A-C或图7A-D所示氨基酸序列至少具有约85％、至少约90％、至少约95％、至少约98％或至少约99％、或更高的氨基酸序列相同性。在一些实施方案中，所述rAAV病毒粒子与中和抗体的结合能力比野生型AAV降低，其所含的VP1的氨基酸序列与SEQID NO7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31和33之一所示或图5A-C或图7A-D所示氨基酸序列具有1-5、5-10或10-20个氨基酸差异。在一些实施方案中，所述rAAV病毒粒子与中和抗体的结合能力比野生型AAV降低，其所含的VP1具有如SEQ ID NO7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31和33之一所示或图5A-C或图7A-D所示的氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述rAAV病毒粒子显示与硫酸肝素的亲和力比野生型AAV的高，其所含的VP1的氨基酸序列与SEQ ID NO35或SEQ ID NO37所示或图9A-C(D14H1或D14L3)所示氨基酸序列至少具有约85％、至少约90％、至少约95％、至少约98％或至少约99％、或更高的氨基酸序列相同性。在一些实施方案中，所述rAAV病毒粒子与硫酸肝素的亲和力比野生型AAV的高，其所含的VP1的氨基酸序列与SEQ ID NO35或SEQ ID NO37所示或图9A-C(D14H1或D14L3)所示氨基酸序列具有1-5、5-10或10-20个氨基酸差异。在一些实施方案中，所述rAAV病毒粒子显示与硫酸肝素的亲和力比野生型AAV的高，其所含的VP1具有如SEQ ID NO35或SEQ ID NO37所示或如图9A-C(D14H1或D14L3)所示的氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述rAAV病毒粒子显示与硫酸肝素的亲和力比野生型AAV的低，其所含的VP1的氨基酸序列与SEQ ID NO39或SEQ ID NO41所示或图9A-C(P1BH1或P1BH2)所示氨基酸序列至少具有约85％、至少约90％、至少约95％、至少约98％或至少约99％、或更高的氨基酸序列相同性。在一些实施方案中，所述rAAV病毒粒子显示与硫酸肝素的亲和力比野生型AAV的低，其所含的VP1的氨基酸序列与SEQ ID NO39或SEQ ID NO41所示或图9A-C(P1BH1或P1BH2)所示氨基酸序列具有1-5、5-10或10-20个氨基酸差异。在一些实施方案中，所述rAAV病毒粒子显示与硫酸肝素的亲和力比野生型AAV的低，其所含的VP1具有如SEQ ID NO39或SEQ ID NO41所示或如图9A-C(P1BH1或P1BH2)所示的氨基酸序列。
所述rAAV病毒粒子的生产rAAV引入后，通常利用宿主或“生产”细胞来复制和包装rAAV载体。这种生产细胞(通常是哺乳动物宿主细胞)一般含有或经修饰而含有几种不同类型的rAAV产生所需的组分。第一种组分是可被宿主包装细胞复制并包装进载体颗粒中的重组腺伴随病毒(rAAV)载体基因组(或“rAAV原-载体”)。既然将转基因包装进rAAV载体颗粒中可有效地用于将转基因递送至各种哺乳动物细胞，rAAV原载体通常含有在基因治疗中在遗传上改变另一种细胞所需的异源多核苷酸(或“转基因”)。转基因的两翼通常连接两个AAV反向末端重复序列(ITR)，该序列含有在AAV载体的切除、复制和包装过程中以及在该载体整合入宿主细胞基因组的过程中可识别的序列。
第二种组分是可提供AAV复制辅助功能物的辅助病毒。虽然通常使用腺病毒，但如本领域所知也可使用其它辅助病毒。或者，所需的辅助病毒的功能物可从辅助病毒用遗传方法分离，其编码基因可用于提供反式辅助病毒功能物。可将AAV载体元件和辅助病毒(或辅助病毒功能物)同时或以任何顺序依次引入宿主细胞。
生产细胞中要提供的用于AAV产生的最终元件是“AAV包装基因”，例如分别提供复制和衣壳化蛋白质的rep和cap基因。可提供几种不同的AAV包装基因(包括rep-cap表达盒与分开的rep和/或cap表达盒)，其中rep和/或cap基因被置于天然启动子或操作性相连的异源启动子的控制下。可将这种AAV包装基因瞬时或稳定地引入宿主包装细胞，这是本领域已知的并详述于下文。
1.rAAV载体含有感兴趣的异源DNA的所述rAAV病毒粒子(感兴趣的异源DNA在本文还指异源核酸)可使用本领域的技术人员已知的方法生产。这些方法通常涉及以下步骤(1)将所述rAAV载体引入宿主细胞；(2)将AAV辅助构建物引入宿主细胞，其中辅助构建物包含的AAV编码区域能在宿主细胞中表达来补充AAV载体所缺乏的AAV辅助功能物；(3)将一种或多种AAV辅助病毒和/或附属的功能载体引入宿主细胞，其中辅助病毒和/或附属的功能载体提供能在宿主细胞中支持重组AAV(“rAAV”)病毒粒子有效产生的辅助功能物；和(4)培养该宿主细胞来产生rAAV病毒粒子。AAV表达载体，AAV辅助构建物和辅助病毒或附属功能物载体可使用标准转染技术同时或连续引入宿主细胞。
使用已知技术构建AAV表达载体来至少提供作为以转录方向操作性相连的组分的控制元件，包括转录起始区、感兴趣的DNA和转录终止区。选择在哺乳动物肌肉细胞中有功能的控制元件。使得到的含有操作性相连诸组分的构建物与功能性AAV ITR序列相连(5’和3’)。
AAV ITR区的核苷酸序列是已知的。参见，例如有关AAV-2序列的Kotin，R.M.(1994)Human Gene Therapy 5793-801；Berns，K.I.，《基础病毒学》(Fundamental Virology)中的“细小病毒及其复制”(Parvoviridae and theirReplication)，第2版，(B.N.Fields和D.M.Knipe编)。本发明的载体使用的AAVITR无需具有野生型核苷酸序列，并且可通过，例如核苷酸的插入、缺失或取代来改变。此外，AAV ITR可衍生自几种AAV血清型中的任一种，包括(不限于)AAV-1、AAV-2、AAV-3、AAV-4、AAV-5、AAV-7等。另外，AAV表达载体中其两翼是所选择核苷酸序列的5’和3’ITR无需和同一AAV血清型或分离物相同或从其衍生，前提是它们具有功能，即当细胞中存在AAV Rep基因产物时，可从宿主细胞基因组或载体中切除或拯救感兴趣的序列，和可将DNA分子整合入受体细胞基因组。ITR能使在合适的Rep蛋白混合物存在时复制该载体序列。ITR也使得该载体序列得以插入衣壳以产生AAV颗粒。
用于所述rAAV载体中的合适的异源DNA分子(文中也称为“异源核酸”)的大小通常约不到5千碱基(kb)并且含有，例如编码接受对象缺乏或丢失的蛋白的基因(核苷酸序列)；编码具有所需生物学或治疗作用(例如，抗细菌、抗病毒或抗肿瘤功能)蛋白质的基因；编码能抑制或降低有害或其它不期望的蛋白产生的RNA的核苷酸序列；编码抗原蛋白的核苷酸序列；或能抑制或降低蛋白产生的RNA的核酸序列。
合适的异源核酸包括(但不限于)编码用于治疗以下疾病蛋白质的核酸内分泌、代谢、血液、心血管、神经、肌肉骨骼、泌尿、肺和免疫疾病，包括如炎性疾病，自身免疫疾病，慢性疾病和感染性疾病(例如获得性免疫缺陷综合症(AIDS))、癌症、高胆固醇血症；胰岛素紊乱，例如糖尿病；生长紊乱，各种血液疾病，包括各种贫血症、地中海贫血和血友病；遗传缺陷，例如囊肿性纤维化、高歇病、胡尔勒病、腺苷酸脱氨酶(ADA)缺乏症、肺气肿等。
合适的异源核酸包括(但不限于)编码以下各种蛋白质的核酸，包括(但不限于)干扰素(例如，IFN-γ、IFN-α、IFN-β、IFN-ω；IFN-τ)；胰岛素(例如，诺和灵、优泌林、优泌乐、耐而可、长效胰岛素锌欣混旋液等)；促红细胞生成素(“EPO”；例如Procrit_、Eprex_或Epogen_(倍他依泊汀-α)；Aranesp_(darbepoietin-α)；NeoRecormon_、Epogin_(倍他依泊汀-β)等；抗体(例如单克隆抗体)(例如，Rituxan_(莱图昔单抗(rituximab))；Remicade_(因福利昔单抗(infliximab))；Herceptin_(特拉苏珠单抗(trastuzumab))；HumiraTM(阿得利母人单抗(adalimumab))；Xolair_(奥马利珠单抗(omalizumab))；Bexxar_(图西图莫单抗(tositumomab))；RaptivaTM(依法利组单抗(efalizumab))；ErbituxTM(采图昔单抗(cetuximab)等)，包括单克隆抗体的抗原结合片段；血液因子(例如，Activase_(纤维蛋白溶酶原活化剂(alteplase))组织血纤蛋白溶酶原激活剂；NovoSeven_(重组人因子VIIa)；因子VIIa；因子VIII(例如，Kogenate_)；因子IX(β-球蛋白；血红蛋白等)；集落刺激因子(例如，Neupogen_(非格司亭；G-CSF)；Neulasta(peg化的非格司亭)；粒细胞集落刺激因子(G-CSF)，粒细胞-单核细胞集落刺激因子，巨噬细胞集落刺激因子，巨核细胞集落刺激因子等)；生长激素(例如，生长激素，如Genotropin_、Nutropin_、Norditropin_、Saizen_、Serostim_、Humatrope_等；人生长激素等)；白介素(例如，IL-1；IL-2，包括例如Proleukin_；IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9等)；生长因子(例如，Regranex_(beclapermin；PDGF)；Fiblast_(曲氟尿苷；bFGF)；Stemgen_(ancestim；干细胞因子)；角化细胞生长因子；酸性成纤维细胞生长因子，干细胞因子，碱性成纤维细胞生长因子，肝细胞生长因子等)；可溶性受体(例如，TNF-α结合可溶性受体，如Enbrel_(依那西普)；可溶性VEGF受体；可溶性白介素受体；可溶性γ/δ/T细胞受体等)；酶(例如，α-葡糖苷酶；Cerazyme_(imiglucarase；β-葡糖脑甘脂酶、Ceredase_(algucerase))；酶激活剂(例如，组织血纤蛋白溶酶原激活剂)；趋化因子(例如，IP-10；Mig；Groα/IL-8，RANTES；MIP-1α；MIP-1β；MCP-1；PF-4等)；血管生成剂(例如，血管内皮生长因子(VEGF))；抗血管生成剂(例如，可溶性VEGF受体)；蛋白疫苗；神经活性肽，例如缓激肽、缩胆囊肽、gastin、促胰液素、催产素、促性腺素释放激素、β-内啡肽、脑啡肽、P物质、促生长素抑制素、促乳素、甘丙肽、生长激素释放激素、铃蟾肽、强啡肽、神经加压素、促胃动素、促甲状腺激素、神经肽Y、促黄体素、降钙素、胰岛素、胰高血糖素、加压素、血管紧张肽II、促甲状腺激素释放激素、血管活性肠肽、睡眠肽等；其它肽，例如溶血栓剂、心房利尿钠肽、骨形成蛋白、血栓形成素、松弛素、胶质细胞原纤维酸性蛋白、促卵泡激素、人α-1抗胰蛋白酶、白血病抑制因子、转化生长因子、胰岛素样生长因子、促黄体激素、巨噬细胞活化因子、肿瘤坏死因子、中性粒细胞趋化因子、神经生长因子、金属蛋白酶组织抑制剂；血管活性肠肽、血管生成素、血管营养素、纤维蛋白；水蛭素；白血病抑制因子；IL-1受体拮抗剂(例如，Kineret_(阿那白滞素))；离子通道，例如囊性纤维化跨膜传导调节蛋白(CFTR)；抗肌萎缩蛋白；肌营养相关蛋白，一种肿瘤抑制剂；溶酶体酶酸性α-葡糖苷酶(GAA)等。合适的核酸也包括编码任何前述蛋白的功能性片段的核酸，与编码任何前述蛋白的功能性变体的核酸。
合适的异源核酸也包括编码抗原蛋白的核酸。含有编码抗原蛋白的异源核酸的所述rAAV合适用于在哺乳动物宿主细胞中激发产生针对该抗原蛋白的免疫应答。抗原蛋白得自自身抗原、过敏原、肿瘤相关抗原、致病性病毒、致病性细菌、致病性原虫、致病性蠕虫或任何其它能感染哺乳动物宿主的致病生物。文中使用的术语“得自某来源的编码抗原蛋白的核酸”包括编码野生型抗原蛋白的核酸，例如分离自致病性病毒的编码病毒蛋白的核酸；实验室中合成的核酸，该核酸编码氨基酸序列与天然存在的抗原蛋白相同的抗原蛋白；实验室中合成的核酸，该核酸编码氨基酸序列(例如，1到约15个氨基酸不同)与天然存在的抗原蛋白不同的抗原蛋白，但该抗原蛋白仍能诱导对相应的天然存在抗原蛋白的免疫应答；实验室中合成的核酸，该核酸编码抗原蛋白的片段(例如，约5个到约50个氨基酸的片段，该片段含有一个或多个抗原表位)，该片段诱导对相应天然存在抗原蛋白的免疫应答；等等。
类似地，“得自”自身抗原、过敏原、肿瘤相关抗原、致病性病毒、致病性细菌、致病性原虫、致病性蠕虫或任何其它能感染哺乳动物宿主的致病性生物的抗原蛋白包括氨基酸序列与天然存在的抗原蛋白相同的蛋白；氨基酸序列(例如，1到约15个氨基酸)与天然存在的抗原蛋白不同的抗原蛋白，但该抗原蛋白仍能诱导对相应的天然存在抗原蛋白的免疫应答；抗原蛋白的片段(例如，约5个到约50个氨基酸的片段，其中含有一个或多个抗原表位)，该片段能诱导对相应的天然存在抗原蛋白的免疫应答。
在一些实施方案中，对所述rAAV编码的抗原蛋白的免疫应答能刺激针对在哺乳动物宿主中显示抗原蛋白或抗原表位(或是能与rAAV编码的抗原蛋白或抗原表位发生交叉反应的蛋白或表位)的致病生物的保护性免疫应答。在一些实施方案中，哺乳动物宿主中会诱导针对rAAV编码的抗原蛋白的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)应答。在其它实施方案中，在哺乳动物宿主中可诱导针对rAAV编码的抗原蛋白的体液应答。在许多实施方案中，在哺乳动物宿主中可诱导针对rAAV编码的抗原蛋白的TH1免疫应答。合适的抗原蛋白包括肿瘤相关抗原、病毒抗原、细菌抗原、和原虫抗原及它们的抗原片段。在一些实施方案中，抗原蛋白得自胞内病原体。在其它实施方案中，抗原蛋白是自身抗原。在其它实施方案中，抗原蛋白是过敏原。
肿瘤特异性抗原包括(但不限于)各种MAGE(黑色素瘤相关抗原E)，包括MAGE 1(例如，GenBauk登录号M77481)、MAGE 2(例如，GenBank登录号U03735)、MAGE 3、MAGE 4等；各种酪氨酸酶；突变的ras大鼠；突变的p53(例如，GenBank登录号X54156和AA494311)；和p97黑色素瘤抗原(例如，GenBank登录号M12154)。其它肿瘤特异性抗原包括与晚期癌症相关的Ras肽和p53肽，与子宫颈癌相关的HPV16/18和E6/E7抗原，与乳腺癌相关的MUCI1-KLH抗原(例如，GenBank登录号J03651)，与结直肠癌相关的CEA(癌胚抗原)(例如，GenBank登录号X98311)，与黑色素瘤相关的gp100(例如，GenBank登录号S73003)或MART1抗原，与前列腺癌相关的PSA抗原(例如，GenBank登录号X14810)。p53基因序列是已知的(参见，例如Harris等.，(1986)Mol.Cell.Biol.，64650-4656)并由GenBank以登录号M14694保藏。所以，本发明可用于以下癌症的免疫治疗，包括(但不限于)子宫颈癌、乳腺癌、结直肠癌、前列腺癌、肺癌和黑色素瘤。
病毒抗原得自已知的致病病原体，包括(但不限于)麻疹病毒、流行性腮腺炎病毒、风疹病毒、脊髓灰质炎病毒、甲型、乙型(例如，GenBank登录号E02707)和丙型(例如，GenBank登录号E06890)肝炎病毒、以及其它肝炎病毒，流感病毒、腺病毒(例如，4型和7型)、狂犬病毒(例如，GenBank登录号M34678)、黄热病毒、日本脑炎病毒(例如，GenBank登录号E07883)、登革热病毒(例如，GenBank登录号M24444)、汉坦病毒和人免疫缺陷病毒(例如，GenBank登录号U18552)。
合适的细菌和寄生虫抗原包括衍生自已知的导致以下疾病的生物，包括(但不限于)白喉、百日咳(例如，GenBank登录号M35274)、破伤风(例如，GenBank登录号M64353)、肺结核、细菌性和真菌性肺炎(例如，流感嗜血杆菌、卢氏肺孢子虫等)、霍乱、伤寒、鼠疫、志贺菌病、沙门菌病(例如，GenBank登录号L03833)、军团菌病、莱姆病(例如，GenBank登录号U59487)、疟疾(例如，GenBank登录号X53832)、钩虫、盘尾丝虫病(例如，GenBank登录号M27807)、血吸虫病(例如，GenBank登录号L08198)、锥虫病、蟠尾丝虫症、贾第虫病(例如，GenBank登录号M33641)、阿米巴病、丝虫病(例如，GenBank登录号J03266)、包揉螺旋体病和旋毛虫病。
合适的编码异源基因产物的异源核酸包括非翻译RNA，例如反义RNA、核酶、RNAi和siRNA。干扰RNA(RNAi)片段，特别是双链(ds)RNAi可用于抑制基因表达。本领域熟知的用于抑制基因表达的一种方法是短干扰RNA(siRNA)介导的基因沉默，该方法通过特异性双链siRNA核苷酸序列来降低靶基因表达产物的水平，其中该双链siRNA核苷酸序列与靶基因转录物长至少19-25个核苷酸的区段(例如，20-21个核苷酸的序列)互补，所述片段包括5′未翻译(UT)区域、ORF或3′UT区域。在一些实施方案中，短干扰RNA约长19-25个核苷酸。参见，例如描述siRNA技术的PCT申请WO0/44895、WO99/32619、WO01/75164、WO01/92513、WO01/29058、WO01/89304、WO02/16620和WO02/29858；和美国专利公布号20040023390。siRNA可被某核酸序列所编码，该核酸序列也可含有启动子。核酸序列也可含有聚腺苷酸化信号。在一些实施方案中，聚腺苷酸化信号是合成的最小聚腺苷酸化信号。
靶基因包括编码有害(例如，致病的)的靶基因产物(RNA或蛋白质)、功能异常的靶基因产物的任何基因。靶基因产物包括(但不限于)亨廷顿病、丙型肝炎病毒、人免疫缺陷病毒、淀粉样前体蛋白、τ、含有聚谷氨酰胺重复的蛋白、疱疹病毒(例如，带状疱疹)、任何致病病毒等。
如此，含有编码siRNA的异源核酸的所述rAAV可用于治疗各种疾病和病症，包括(但不限于)神经变性疾病，例如三核苷酸重复疾病、与聚谷氨酰胺重复相关的疾病(如亨廷顿病、脊髓小脑性共济失调、脊髓与延髓性肌萎缩(SBMA)、齿状核红核苍白球路易体萎缩症(DRPLA)等)；获得性疾病(例如，表现为异常的生理、生化、细胞、结构或分子生物学状态的疾病或综合症)，例如病毒感染，HCV感染导致或可能导致的肝炎、HIV感染导致的获得性免疫缺陷综合症等。
在许多实施方案中，编码siRNA的异源核酸操作性连接有启动子。合适的启动子为本领域技术人员已知包括任何蛋白编码基因的启动子，例如内源性调节基因或结构性表达基因的启动子。例如，可将细胞生理活动(例如，热休克、氧水平和/或一氧化碳水平，如缺氧时)所调节的基因的启动子操作性连接于siRNA编码核酸。
选择的异源核苷酸序列(例如，编码EPO的或感兴趣的核酸)操作性连接于指导该核苷酸序列的体内转录或表达的控制元件。这种控制元件可含有通常与所选择的基因(例如，内源性细胞控制元件)相连的控制序列。或者，可使用异源控制序列。有用的异源控制序列通常包括衍生自编码哺乳动物或病毒基因的序列。其例子包括(但不限于)SV40早期启动子、小鼠乳房瘤病毒长末端重复序列(LTR)启动子、腺病毒主要晚期启动子(AdMLP)、单型疱疹病毒(HSV)启动子、对感兴趣的基因是异源性的内源细胞启动子、巨细胞病毒(CMV)启动子，例如CMV立即早期启动子区域(CMVIE)，rous肉瘤病毒(RSV)启动子、合成启动子、杂交启动子等。此外，本发明也使用的衍生自非病毒基因，例如鼠金属硫蛋白基因的序列。这种启动子序列市售可得自，例如Stratagene(San Diego，Calif.)。
在一些实施方案中，细胞类型特异性或组织特异性的启动子可操作性连接于编码异源基因产物的异源核酸，因此可在特定细胞类型或组织中选择性或择优地生产该基因产物。在一些实施方案中，可诱导的启动子可操作性连接于异源核酸。
例如，肌肉特异性和可诱导的启动子、增强子等可用于将基因产物递送至肌肉细胞。这种控制元件包括(但不限于)衍生自肌动蛋白和肌球蛋白基因家族，例如myoD基因家族的元件；肌细胞特异性增强子结合因子MEF-2；衍生自人骨骼肌动蛋白基因和心脏肌动蛋白基因的控制元件；肌肉肌酸激酶序列元件和鼠肌酸激酶增强子(mCK)元件；衍生自骨骼抽搐肌钙蛋白C基因、慢抽搐心脏肌钙蛋白C基因和慢抽搐肌钙蛋白I基因的控制元件；缺氧诱导的核因子；甾体诱导的元件和启动子，例如糖皮质激素反应元件(GRE)；诱导RU486的融合共有元件；和能提供四环素调节的基因表达的元件。
具有和AAV ITR相连的感兴趣的DNA分子(异源DNA)的AAV表达载体，可通过将所选择的序列直接插入到切除了主要AAV开放读框(“OPT”)的AAV基因组来构建。AAV基因组的其它部分也可删除，只要保留的ITR部分足够执行复制和包装功能。可使用本领域熟知的技术来设计这种构建物。参见，例如美国专利号5,173,414和5,139,941；国际公布号WO 92/01070(1992年1月23日公布)和WO 93/03769(1993年3月4日公布)；Lebkowski等.，(1988)Molec.Cell.Biol.83988-3996；Vincent等.，(1990)Vaccines 90(冷泉港实验室出版社)；Carter，B.J.(1992)Current Opinion in Biotechnology 3533-539；Muzyczka，N.(1992)Current Topics in Microbiol.and Immunol.15897-129；Kotin，R.M.(1994)Human Gene Therapy 5793-801；Shelling和Smith(1994)Gene Therapy 1165-169和Zhou等.，(1994)J.Exp.Med.1791867-1875。
或者，可使用标准连接技术(见Sambrook，同上)从含有相同或融合的存在于另一个载体中的所选核酸构建物5’和3’端的病毒基因组或AAV载体上切下AAV ITR。例如，连接可在20mM Tris-Cl pH7.5、10mM MgCl2、10mM DTT、33μg/ml BSA、10mM-50mM NaCl和40μM ATP、0.01-0.02(Weiss)单位的T4DNA连接酶于0到16℃进行(进行“粘性末端”连接)或用1mM ATP、0.3-0.6(Weiss)单位的T4DNA连接酶于14℃(“平头末端”连接)进行。分子间“粘性末端”连接通常在30-100μg/ml总DNA浓度下进行(5-100nM总的终浓度)。含有ITR的AAV载体描述于美国专利号5,139,941。特别是，该专利描述了几种得自美国模式培养物保藏所(“ATCC”)、登录号为53222、53223、53224、53225和53226的AAV载体。
此外，可合成产生嵌合基因使之含有位于一种或多种所选核酸序列5’和3’端的AAV ITR序列。优选使用能在哺乳动物肌肉细胞中表达该嵌合性基因序列的密码子。从用标准技术制备的重叠寡核苷酸装配成完整的嵌合序列。参见，例如Edge，Nature(1981)292756；Nambair等.，Science(1984)2231299；Jay等.，J.Biol.Chem.(1984)2596311。
为产生rAAV病毒粒子，使用已知的技术(例如，通过转染)将AAV表达载体引入合适的宿主细胞。许多转染技术是本领域已知的。参见，例如Graham等.，(1973)Virology，52456，Sambrook等.，(1989)《分子克隆，实验室手册》(Molecular Cloning，A Laboratory Manual)，冷泉港实验室，纽约，Davis等.，(1986)《分子生物学的基本方法》(Basic Methods in Molecular Biology)，Elsevier和Chu等.，(1981)Gene 13197。尤其合适的转染方法包括磷酸钙共沉淀(Graham等.，(1973)Virol.52456-467)，直接显微注射入培养的细胞(Capecchi，M.R.(1980)Cell 22479-488)，电穿孔(Shigekawa等.，(1990)Bio Techniques6742-751)，脂质体介导的基因转移(Mannino等.，(1988)Bio Techniques6682-690)，脂质介导的转染(Felgner等.，(1987)Proe.Natl.Acad.Sci.美国847413-7417)和使用高速微粒递送核酸(Klein等.，(1987)Nature 32770-73)。
出于本发明的目的，合适的用于产生rAAV病毒粒子的宿主细胞包括可用作异源DNA分子受体的微生物、酵母、昆虫细胞和哺乳动物细胞。该术语包括被转染的原始细胞的后代。所以，文中使用的“宿主细胞”通常指被外源DNA序列转染的细胞。在许多实施方案中使用得自稳定的人细胞系的细胞293(可容易通过，例如美国模式培养物保藏所以登录号ATCC CRL1573获得)。特别是，人细胞系293是用5型腺病毒DNA片段(Graham等.，(1977)J.Gen.Virol.3659)转化的人胚胎肾细胞系，能表达腺病毒E1a和Elb基因(Aiello等.，(1979)Virology 94460)。293细胞系易于转染从而提供用于产生rAAV病毒粒子的特别便捷的平台。
2.AAV辅助功能物为复制和衣壳化两翼接有AAV ITR的核苷酸序列来生产rAAV病毒粒子，必须向含有上述AAV表达载体的宿主细胞提供AAV辅助功能物。AAV辅助功能物通常是AAV-衍生的编码序列，该序列可被表达来提供AAV基因产物，进而对生产性AAV复制起反式作用。本发明的AAV辅助功能物用于补充AAV表达载体缺失的所需AAV功能。所以，AAV辅助功能物包括一种或两种主要的AAV ORF(即rep和cap编码区域)或其功能性同系物。本发明的cap功能物包括一种或多种突变的衣壳蛋白，其中至少一种衣壳蛋白含有至少一个上述的突变。
“AAV rep编码区域”指编码复制蛋白Rep78、Rep68、Rep52和Rep40的AAV基因组中技术上可识别的区域。这些Rep表达产物显示拥有许多功能，包括DNA复制的AAV起点的识别、结合与切口，DNA解旋酶活性和调节AAV(或其它异源)启动子的转录。复制AAV基因组总体需要Rep表达产物。对AAV rep编码区域的描述参见，例如Muzyczka，N.(1992)Current Topics in Microbiol.andImmunol.15897-129和Kotin，R.M.(1994)Human Gene Therapy 5793-301。合适的AAV rep编码区域同系物包括人疱疹病毒6(HEIV-6)rep基因，该基因也已知能介导AAV-2 DNA复制(Thomson等.，(1994)Virology 204304-311)。
AAV cap蛋白含有VP1、VP2和VP3，其中VP1、VP2和VP3至少含有一个上述突变。
在AAV表达载体染之前或同时通过用AAV辅助构建物转染宿主细胞将AAV辅助功能物引入宿主细胞。因此，AAV辅助构建物至少用于提供AAV rep和/或cap基因的瞬时表达来补充生产性AAV感染所需的缺失的AAV功能。AAV辅助构建物缺少AAV ITR因而既不能复制也不能包装自身。这些构建物可是质粒、噬菌体、转座子、粘粒、病毒或病毒粒子。许多AAV辅助构建物已见描述，例如通常使用的编码Rep和Cap表达产物的质粒pAAV/Ad和pIM29+45。参见，例如Samulski等.，(1989)J.Virol.633822-3828和McCarty等.，(1991)J.Virol.652936-2945。许多编码Rep和/或Cap表达产物的其它载体已见描述。参见，例如美国专利号5,139,941。
可构建AAV表达载体与AAV辅助构建物使之含有一种或多种可任选的标记。合适的标记包括当这些细胞在合适的选择性培养基中生长时，赋予含有选择性标记的核酸构建物所转染的细胞以抗生素抗性或敏感性、赋予颜色或改变其抗原特性的基因。几种用于实践本发明的选择性标记基因包括能赋予潮霉素抗性而可对哺乳动物进行选择的潮霉素B抗性基因(编码氨基糖苷磷酸转移酶(APH))；能赋予G418抗性而可对哺乳动物细胞进行选择的新霉素磷酸转移酶基因(编码新霉素磷酸转移酶)；等等。其它合适的标记是本领域技术人员已知的。
3.AAV附属功能物为生产rAAV病毒粒子，也必须向宿主细胞(或包装细胞)提供非AAV衍生的功能物或“附属功能物”。附属功能物是AAV复制所依赖的非AAV衍生的病毒和/或细胞功能物。所以，附属功能物至少包括AAV复制所需的非AAV蛋白和RNA，包括参与AAV基因转录的激活、阶段特异性AAV mRNA剪接、AAV DNA复制、Cap表达产物的合成以及AAV衣壳装配的那些蛋白和RNA。基于病毒的附属功能物可从任何已知的辅助病毒衍生。
特别是可使用本领域的技术人员已知的方法将附属功能物引入宿主细胞然后表达。附属功能物通常可用无关的辅助病毒感染宿主细胞来提供。许多合适的辅助病毒是已知的，包括腺病毒；疱疹病毒，例如1型和2型单型疱疹病毒；牛痘病毒。本发明也可使用非病毒辅助功能物，例如使用各种已知试剂的任一种通过细胞同步化提供。参见，例如Buller等.，(1981)J.Virol.40241-247；McPherson等.，(1985)Virology 147217-222；Schlehofer等.，(1986)Virology 152110-117。
或者，可使用附属功能物载体来提供附属功能物。附属功能物载体包括提供一种或多种附属功能物的核苷酸序列。为支持宿主细胞有效产生AAV病毒粒子，可将附属功能物载体引入合适的宿主细胞。附属功能物载体的形式可是质粒、噬菌体、转座子、粘粒或其它病毒。附属载体的形式也可是一种或多种线形化的DNA或RNA片段，当其与合适的控制元件或酶相连时，这些片段可在宿主细胞中转录或表达来提供辅助功能物。
提供附属功能物的核酸序列可得自天然来源，例如腺病毒颗粒的基因组，或用本领域已知的重组或合成方法构建。就此而言，腺病毒衍生的附属功能物已得到广泛研究，并且鉴定了许多涉及附属功能物的腺病毒基因，其中一部分作了特性分析。参见，例如，Carter，B.J.(1990)《细小病毒CRC手册》(CRC Handbook ofParvoviruses)中的“腺伴随病毒辅助功能物”(Adeno-Associated Virus HelperFunctions)，I卷(P.Tijssen编)和Muzyczka，N.(1992)Curr.Topics.Microbiol.andImmun.15897-129。具体说，据认为早期腺病毒基因区域E1a、E2a、E4、VAIRNA和可能还有Elb参与了该附属过程。Janik等.，(1981)Proc.Natl.Acad.Sci.美国781925-1929。疱疹病毒衍生的附属功能物已见描述。参见，例如Young等.，(1979)Prog.Med.Virol.25113。牛痘病毒衍生的附属功能物也已见描述。参见，例如，Carter，B.J.(1990)，同上，Schlehofer等.(1986)Virology152110-117。
用辅助病毒感染宿主细胞或用附属功能物载体感染宿主细胞的结果是附属功能物被表达，而反式激活AAV辅助构建物以产生AAV Rep和/或Cap蛋白。Rep表达产物将重组DNA(包括感兴趣的DNA，例如异源核酸)从AAV表达载体上切下。Rep蛋白的作用还可复制AAV基因组。表达的Cap蛋白装配进衣壳，重组AAV基因组也包装进该衣壳。因此，结果是生产性AAV复制，其DNA被包装进rAAV病毒粒子中。
重组AAV复制后，可使用各种常规的纯化方法(例如，CsCl梯度法)从宿主细胞中纯化rAAV病毒粒子。此外，如果利用感染来表达附属功能物，可使用已知的方法使残留的辅助病毒失活。例如，可通过加热至温度约60℃，20分钟或更长时间使腺病毒失活。因为AAV对热极其稳定，而辅助腺病毒是热不稳定的，该处理方法仅有效地使辅助病毒失活。
得到的rAAV病毒粒子然后可用于DNA递送(例如用于基因治疗)或用于递送基因产物至哺乳动物宿主。
递送基因产物本发明还提供将基因产物递送至需要它的个体的方法。该方法通常涉及将所述rAAV病毒粒子引入个体。
通常使用体内或体外转导技术将rAAV病毒粒子引入细胞。如果是体外转导，需要取得对象的受体细胞，用rAAV病毒粒子转导并重新引入受试对象。或者，当使用的细胞在受试对象中不产生不恰当的免疫应答时，可使用同系或异种细胞。
将转导细胞递送或引入受试对象的合适方法已见描述。例如，可在合适的培养基中使重组AAV病毒粒子与细胞结合进行体外转导细胞，并使用常规技术，例如Southern印迹和/或PCR，或通过使用选择性标记来筛选含有感兴趣DNA的细胞。转导的细胞然后可配制进下文详述的药物组合物，并可通过各种技术将该组合物引入受试对象，例如通过肌肉内、静脉内、皮下和腹膜内注射。
为进行体内递送，rAAV病毒粒子可配制进药物组合物并一般通过胃肠外(例如，通过肌肉内、皮下、肿瘤内、透皮、鞘内等施用)途径施用。
药物组合物含有足够量的遗传物质来产生治疗有效量的感兴趣的基因产物，即其量足够降低或缓解有待解决的疾病的症状或足够带来所需的益处。药物组合物也含有药学上可接受的赋形剂。这种赋形剂包括本身不含诱导接受该组合物的个体产生有害的抗体的任何药学试剂，并且所述试剂无不适当的毒性。药学上可接受的赋形剂包括(但不限于)液体，例如水、盐水、甘油和乙醇。药学上可接受的盐是例如盐酸盐、氢溴酸盐、磷酸盐(pho)，有机酸盐是例如乙酸盐、丙酸盐、丙二酸盐、苯甲酸盐等。此外，辅助物质，例如润湿剂或乳化剂、pH缓冲物质等可存在于这种运载体中。许多药学上可接受的赋形剂是本领域已知的，本文无需详细讨论。药学上可接受的赋形剂已在各种出版物中广泛讨论，包括，例如A.Gennaro(2000)《雷明顿药剂学科学与实践》(RemingtonThe Science and Practice of Pharmacy)，第20版，Lippincott，Williams，& Wilkins；《药物剂型与药物递送系统》(Pharmaceutical Dosage Forms and Drug DeliverySystems)(1999)H.C.Ansel等编，第7版，Lippincott，Williams，& Wilkins和《药物赋形剂手册》(Handbook of Pharmaceutical Excipients)(2000)A.H.Kibbe等编，第3版，Amer.Pharmaceutical Assoc.
合适的剂量取决于所治疗的哺乳动物(例如，人或非人灵长类或其它哺乳动物)、有待治疗的对象的年龄和全身情况、所治疗疾病的严重性、具体使用的治疗性蛋白、其施用方式等。本领域的技术人员可容易地确定合适的有效量。
所以，“治疗有效量”的范围相对较宽，该范围可通过临床试验确定。例如，为进行体内注射(即直接注射进骨骼肌或心肌)，治疗有效剂量可为约106到1015个rAAV病毒粒子，例如约108到1012个rAAV病毒粒子。为进行体外转导，要递送入细胞的rAAV病毒粒子的有效量约为108到1013个rAAV病毒粒子。本领域的普通技术人员可通过建立剂量应答曲线的常规试验来容易地确定其它有效剂量。
剂量治疗方案可是单剂量方案或多剂量方案。此外，受试对象可适当地施用多次剂量。本领域的技术人员可容易地确定合适的剂量数。
在一些实施方案中，本发明提供将基因产物递送至干细胞的方法。在这些实施方案中，所述rAAV病毒粒子可在体外或体内引入干细胞。感兴趣的干细胞包括造血干细胞和其衍生的祖细胞(美国专利号5,061,620)；神经嵴干细胞(参见Morrison等.，(1999)Cell 96737-749)；成人神经干细胞和神经祖细胞；胚胎干细胞；间充质干细胞；中胚层干细胞等。其它感兴趣的造血“组细胞”的例子包括属于淋巴谱系的细胞，例如不成熟的T细胞和B细胞群。
可使用纯化的干细胞或祖细胞群。例如，人造血干细胞可使用对CD34、thy-1具特异性的抗体来阳性选择；或可使用含有血型糖蛋白A、CD3、CD24、CD16、CD14、CD38、CD45RA、CD36、CD2、CD19、CD56、CD66a和CD66b的谱系特异性标记、T细胞特异性标记、肿瘤特异性标记等来阴性选择。用于分离中胚层干细胞的标记包括FcγRII、FcγRIII、Thy-1、CD44、VLA-4α、LFA-1β、HAS、ICAM-1、CD45、Aa4.1、Sca-1等。神经嵴干细胞可使用对低亲和力神经生长因子受体(LNGFR)的特异性抗体来阳性选择，和使用标记硫苷脂、胶质细胞原纤维酸性蛋白(GFAP)、髓鞘蛋白Po、外周蛋白和神经丝来阴性选择。人间充质干细胞可使用标记SH2、SH3和SH4来阳性分离。
当术语感兴趣的细胞指分类为哺乳动物的任何动物时，包括人、家用或农用动物、动物园动物、实验室动物、运动或宠物动物，如狗、马、猫、小鼠、大鼠、兔等，感兴趣的细胞通常是哺乳动物细胞。在一些实施方案中，干细胞是人干细胞。
使用的细胞可是新鲜的、冷冻的或经过预先培养的。它们可是胎儿的、新生儿的或成人的。造血干细胞可得自胎儿肝脏、骨髓、血液、特别是固定有G-CSF或GM-CSF的外周血或任何其它常规来源。从造血谱系或其它谱系分离干细胞的方式对本发明而言不重要。如上所述，基本上同源的干细胞群或祖细胞群可通过选择性分离以下细胞来获得，这些细胞不存在与分化细胞相关的标记但显示与干细胞相关的表位特性。
各种蛋白可使用所述方法递送至个体。合适的蛋白包括(但不限于)干扰素(例如，IFN-γ、IFN-α、IFN-β、IFN-ω；IFN-τ)；胰岛素(例如，诺和灵、优泌林、优泌乐、耐而可、长效胰岛素锌混旋液等)；促红细胞生成素(“EPO”；例如Procrit_、Eprex_或Epogen_(倍他依泊汀-α)；Aranesp_(darbepoietin-α)；NeoRecormon_、Epogin_(倍他依泊汀-β)等；抗体(例如单克隆抗体)(例如Rituxan_(莱图昔单抗(rituximab))；Remicade_(因福利昔单抗(infliximab))；Herceptin_(特拉苏珠单抗(trastuzumab))；HumiraTM(阿得利母人单抗(adalimumab))；Xolair_(奥马利珠单抗(omalizumab))；Bexxar_(图西图莫单抗(tositumomab))；RaptivaTM(依法利组单抗(efalizumab))；ErbituxTM(采图昔单抗(cetuximab)等)，包括单克隆抗体的抗原结合片段；血液因子(例如，Activase_(纤维蛋白溶酶原活化剂)组织血纤蛋白溶酶原激活剂；NovoSeven_(重组人因子VIIa)；因子VIIa；因子VIII(例如，Kogenate_)；因子IX(β-球蛋白；血红蛋白等)；集落刺激因子(例如，Neupogen_(非格司亭；G-CSF)；Neulasta(peg化的非格司亭)；粒细胞集落刺激因子(G-CSF)，粒细胞-单核细胞集落刺激因子，巨噬细胞集落刺激因子，巨核细胞集落刺激因子等)；生长激素(例如，生长激素，如Genotropin_、Nutropin_、Norditropin_、Saizen_、Serostim_、Humatrope_等；人生长激素等)；白介素(例如，IL-1；IL-2，包括例如Proleukin_；IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9等)；生长因子(例如，Regranex_(beclapermin；PDGF)；Fiblast_(曲氟尿苷；bFGF)；Stemgen_(ancestim；干细胞因子)；角化细胞生长因子；酸性成纤维细胞生长因子，干细胞因子，碱性成纤维细胞生长因子，肝细胞生长因子等)；可溶性受体(例如，TNF-α结合可溶性受体，如Enbrel_(依那西普)；可溶性VEGF受体；可溶性白介素受体；可溶性γ/δ/T细胞受体等)；酶(例如，α-葡糖苷酶；Cerazyme_(imiglucarase；β-葡糖脑甘脂酶、Ceredase_(algucerase))；酶激活剂(例如，组织血纤蛋白溶酶原激活剂)；趋化因子(例如，IP-10；Mig；Groα/IL-8，RANTES；MIP-1α；MIP-1β；MCP-1；PF-4等)；血管生成剂(例如，血管内皮生长因子(VEGF))；抗血管生成剂(例如，可溶性VEGF受体)；蛋白疫苗；神经活性肽，例如缓激肽、缩胆囊肽、gastin、促胰液素、催产素、促性腺素释放激素、β-内啡肽、脑啡肽、P物质、促生长素抑制素、促乳素、甘丙肽、生长激素释放激素、铃蟾肽、强啡肽、神经加压素、促胃动素、促甲状腺激素、神经肽Y、促黄体素、降钙素、胰岛素、胰高血糖素、加压素、血管紧张肽II、促甲状腺激素释放激素、血管活性肠肽、睡眠肽等；其它肽，例如溶血栓剂、心房利尿钠肽、骨形成蛋白、血栓形成素、松弛素、胶质细胞原纤维酸性蛋白、促卵泡激素、人α-1抗胰蛋白酶、白血病抑制因子、转化生长因子、胰岛素样生长因子、促黄体激素、巨噬细胞活化因子、肿瘤坏死因子、中性粒细胞趋化因子、神经生长因子、金属蛋白酶组织抑制剂；血管活性肠肽、血管生成素、血管营养素、纤维蛋白；水蛭素；白血病抑制因子；IL-1受体拮抗剂(例如，Kineret_(阿那白滞素))；离子通道，例如囊性纤维化跨膜传导调节蛋白(CFTR)；抗肌萎缩蛋白；肌营养相关蛋白，一种肿瘤抑制剂；溶酶体酶酸性α-葡糖苷酶(GAA)等。可使用对象方法递送的蛋白也包括任何前述蛋白的功能性片段，以及任何前述蛋白的功能性变体。
在一些实施方案中，治疗有效量的蛋白在哺乳动物宿主中生产。使用所述方法在哺乳动物宿主中是否产生了治疗有效量的具体蛋白可使用适合于该具体蛋白的试验来容易地确定。例如，当蛋白是EPO时，测量血细胞比容。
当rAAV编码某抗原蛋白时，可使用所述方法递送至个体的合适的抗原蛋白包括(但不限于)肿瘤相关抗原、自身抗原(“自我”抗原)、病毒抗原、细菌抗原、原虫抗原和过敏原；及其抗原片段。在一些实施方案中，可在哺乳动物宿主中诱导针对rAAV编码的抗原蛋白的细胞毒性淋巴细胞(CTL)应答。在其它的实施方案中，可在哺乳动物宿主中诱导针对rAAV编码的抗原蛋白的体液应答，例如产生该抗原蛋白的特异性抗体。在许多实施方案中，在哺乳动物宿主中可诱导针对rAAV编码的抗原蛋白的TH1免疫应答。使用建立好的方法可容易地确定针对抗原蛋白的免疫应答是否产生。例如，酶联免疫吸收分析可用于确定针对抗原蛋白的抗体是否产生。测定抗原特异性CTL的方法是本领域已知的。例如，可利用在其表面表达该抗原蛋白的含有可检测标记的靶细胞来测定血液样品中抗原特异性CTL的存在。
可使用所述方法递送至个体的核酸包括非翻译的RNA，例如反义RNA、核酶、RNAi和siRNA。在一些实施方案中，治疗有效量的非翻译RNA在哺乳动物宿主中生产。治疗有效量的非翻译RNA是否可使用所述方法递送至哺乳动物宿主可使用任何合适的试验来容易地确定。例如，当基因产物是抑制HIV的siRNA时，可测量病毒负荷量。
产生突变型AAV病毒粒子的方法本发明提供产生在VP1、VP2和VP3的一个或多个中含有一个或多个突变的突变型AAV病毒粒子的方法。该方法通常包括产生突变型AAV文库；在文库中筛选衣壳性能改变的衣壳突变体。本发明还提供突变型AAV文库和含有突变型AAV文库的组合物。
在一些实施方案中，重复给定的筛选步骤两次、三次、四次或更多次以富集衣壳性能改变的所述AAV文库。在一些实施方案中，AAV文库筛选后，分离单个克隆并测序。
产生突变型AAV文库产生AAV cap基因中含有一个或多个突变的突变型AAV文库。使用已知的方法在AAV cap基因中产生突变。合适的诱变AAV cap基因的方法包括(但不限于)基于聚合酶链式反应(PCR)的方法、寡核苷酸定点诱变等。产生突变的方法在本领域已得到充分描述。参见，例如Zhao等.，(1998)Nat.Biotechnol.16234-235；美国专利号6,579,678；美国专利号6,573,098和美国专利号6,582,914。
在一些实施方案中，使用交错延伸方法产生在cap基因中含有突变的突变型AAV文库。交错延伸方法包括使用基于PCR的方法扩增cap基因。使用特异性PCR引物引发模板cap基因，然后重复多轮变性和极短时间退火/聚合酶催化的延伸。在每轮中，生长出片段的基于序列互补性与不同模板退火并且进一步延伸。重复多轮变性、退火和延伸直至形成全长的序列。相比于野生型AAVcap基因，得到的全长序列在cap基因中含有至少一个突变。
在AAV cap序列中含有一个或多个突变的PCR产物插入含有野生型AAV基因组的质粒。结果得到AAV cap突变体的文库。因此，本发明提供含有约10到1010个成员以及在AAV cap基因中含有突变的突变型AAV cap基因文库。文库中的某成员在AAV cap基因中含有约1到50个突变。所述文库含有10到约109个不同的成员，每个成员在AAV cap基因中含有不同的突变。
cap突变体文库产生后，就可生产病毒颗粒，然后这些颗粒可基于改变的衣壳性能来选择。文库质粒DNA转染进合适的宿主细胞(例如，293细胞)，然后将辅助病毒导入细胞。收集转染宿主细胞产生的病毒颗粒(“AAV文库颗粒”)。
文库选择文库产生后，就可选择特定的衣壳性能。按照上述产生病毒颗粒，使之经历一步或多步选择。要选择的衣壳性能包括(但不限于)1]对肝素的结合亲和力比野生型AAV的高；2]对肝素的结合亲和力比野生型AAV的低；3]对AAV感染具有抗性的细胞的感染力提高；4]逃逸中和抗体的能力提高；和5]穿过内皮细胞层的能力提高。
1.选择肝素结合能力改变的在一些实施方案中，选择所述文库改变的肝素结合能力，包括与野生型AAV病毒粒子的肝素结合能力相比，肝素结合能力提高和降低的。AAV文库颗粒与肝素亲和力基质接触。例如，在允许AAV文库颗粒与肝素结合的条件下将其加载于肝素亲和力柱上。示范性的条件包括用0.15M NaCl和50mM Tris、pH7.5平衡柱。AAV文库颗粒与肝素亲和力基质结合后，用几体积的缓冲液洗涤AAV文库颗粒/肝素亲和力基质复合物，所述缓冲液含有浓度渐增的NaCl并且收集在每个NaCl浓度处洗脱的AAV文库颗粒。例如，AAV文库颗粒与肝素亲和力基质结合后，用含有200mM NaCl的1体积50mM Tris缓冲液、pH7.5洗涤AAV文库颗粒/肝素亲和力基质复合物，收集洗脱的AAV文库颗粒。用50mM Tris缓冲液、pH7.5重复洗脱步骤，所述缓冲液含有约250mM NaCl、约300mM NaCl、约350mM、约400mM NaCl、约450mM NaCl、约500mM NaCl、约550mM NaCl、约600mM NaCl、约650mM NaCl、约700mM NaCl或约750mMNaCl。
用浓度约低于450mM的NaCl洗脱的AAV文库颗粒显示与肝素的结合能力低于野生型AAV的。用浓度约高于550mM的NaCl洗脱的AAV文库颗粒显示与肝素的结合能力高于野生型AAV的。
在一些实施方案中，洗脱的AAV文库颗粒通过使用辅助病毒共转染进可感染细胞来扩增，并在肝素亲和力基质上再次分级。该步骤可重复多次以富集肝素结合亲和性能改变的AAV文库颗粒。
2.选择与中和抗体的结合能力降低的在一些实施方案中，与中和抗体结合野生型AAV病毒粒子而中和野生型AAV病毒粒子的情况相比，选择所述AAV文库与结合并中和野生型AAV病毒粒子的中和抗体的结合能力降低。AAV文库颗粒与中和抗体接触并测试AAV文库颗粒感染可感染宿主细胞的能力。一般使AAV文库颗粒与各种浓度的中和抗体接触。降低AAV文库颗粒感染力所需的中和抗体的浓度越高，AAV颗粒对中和抗体的抗性越高。
3.选择对非感染性细胞的感染力提高的在一些实施方案中，选择所述AAV文库对非感染性细胞的感染力提高的AAV病毒粒子。AAV文库颗粒与非感染细胞(例如，非感染性细胞群)接触。用AAV文库颗粒感染细胞合适的时间后，加入辅助病毒，收集成功感染非感染性细胞的AAV文库颗粒。在一些实施方案中，每轮感染中加入辅助病毒和收集AAV颗粒，重复一次、两次、三次或更多次。
在本发明的方法中，产生了AAV文库颗粒后可进行一次或多次选择步骤。例如，在一些实施方案中，该方法包括选择肝素结合能力提高、然后选择与中和抗体的结合能力降低的病毒粒子。在其它实施方案中，该方法包括选择与中和抗体的结合能力降低、然后选择肝素结合能力提高的病毒粒子。在其它实施方案中，该方法包括选择肝素结合能力降低、然后筛选与中和抗体的结合能力降低的病毒粒子。在其它实施方案中，该方法包括选择与中和抗体的结合能力降低、然后选择肝素结合能力降低的病毒粒子。在其它实施方案中，该方法包括选择与中和抗体的结合能力降低、然后选择对干细胞的感染力提高的病毒粒子。
因此，本发明提供含有多种核酸的腺伴随病毒(AAV)文库，其中每种核酸含有编码突变型AAV衣壳蛋白的核苷酸序列。相比于野生型AAV衣壳蛋白，编码的突变型AAV衣壳蛋白至少含有一个氨基酸取代。本发明提供含有多个AAV颗粒的突变的腺伴随病毒(AAV)颗粒的文库，其中每个颗粒含有AAV衣壳蛋白，相比于野生型AAV衣壳蛋白，该AAV衣壳蛋白至少含有一个氨基酸取代。编码突变型AAV衣壳蛋白的核酸描述于上文，编码的突变型AAV衣壳蛋白的性能也描述于上文。
实施例给出以下实施例是为了向本领域的普通技术人员完全公开和说明如何制备和使用本发明，既非为了限制本发明人所认为的本发明的范围，也非表明以下实验是所进行的全部或仅有的实验。发明人尽力保证所用数字(例如，量、温度等)的精确性，但应该考虑到一些实验错误和偏差。除非另有指出，部分与部分之比是重量比，分子量是平均分子量，温度以摄氏度计，压力是大气压或接近大气压。使用的标准缩写是，例如bp，碱基对；kb，千碱基；pl，皮升(picoliter)；s，秒；min，分钟；hr，小时等。
实施例1AAV衣壳变体的产生和特性分析方法文库的产生和载体包装使用描述于Zhao等((1998)Nat.Biotechnol.16258-261)的交错延伸方法产生AAV2 cap ORF遗传文库，得到的cap产物插入含有野生型AAV2基因组的质粒。得到的质粒转化进大肠杆菌进行大规模的质粒生产和纯化。然后产生AAV并基本上按照早先的描述(Kaspar等.，(2002)Proc.Natl.Acad.Sci.美国992320-2325和Lai等.，(2003)Nat.Neurosci.621-27)通过CsCl离心纯化。简言之，使用磷酸钙方法将文库质粒DNA转染进293人胚胎肾细胞(ATCC)，然后以感染复数(MOI)3加入5血清型腺病毒(Ad5)。使用CsCl密度离心纯化病毒。对所有实验而言，按前述(Kaspar等.，同上和Lai等.，同上)提取载体DNA，然后使用SYBR-绿染料(分子探针)和Biorad iCycler作实时PCR来定量以确定AAV基因组滴度。
肝素柱层析约1012个AAV文库颗粒上样于已用0.15M NaCl和50mM Tris、pH7.5预平衡的1ml HiTrap肝素柱(Amersham)。使用浓度从50mM增加至750mM含有NaCl的0.75ml相同缓冲液进行洗涤，然后用含1M NaCl的缓冲液洗涤。rAAV-GFP作为对照也进行肝素亲和层析。为用不同的盐浓度洗脱的文库诸组分分离各个病毒克隆，提取诸组分的病毒DNA、PCR扩增并插入基于pAd8的rAAV包装质粒。然后包装rAAV-GFP来分析这些突变的衣壳包装rAAV载体的能力。在U.C.Berkeley测序设施中对衣壳变体进行测序。最后，使用Qiu等人((2000)Virol.269137-147)的方法对变体衣壳的肝素亲和力进行定量测定，除了与固定化肝素结合的病毒用实时PCR定量测定。
抗血清的产生和抗体中和筛选按照用于U.C.Berkeley动物照料和使用委员会与NIH的照料实验室动物标准(U.C.Berkeley Animal Care and Use Committee and NIH standards)，在两只新西兰白兔中产生了含有抗AAV2中和抗体(NAB)的多克隆血清。简言之，5×1010个CsCl纯化的rAAV颗粒与0.5ml TitreMax佐剂(CytRx)混合并注射入后肢前部肌肉。间隔3周用相同的AAV剂量进行两次加强接种，然后收集抗血清。
野生型和突变型AAV文库与75μl磷酸盐缓冲盐水(PBS)(pH7.4)配制的不同量血清(0-6.25μl)一起于室温孵育30分钟，然后加入6孔板上的2.5×105个293细胞中。48小时后，加入Ad5从感染的细胞中拯救AAV，24小时后收集细胞。
从即使存在NaBH(OAc)3时，文库中也成功受感染的细胞组分获得各个病毒克隆，将其插入rAAV包装质粒，并按上述产生rAAV-GFP。将含有突变衣壳的rAAV与上述5μl多克隆血清一起孵育，接着加入1×105个293细胞。感染72小时后，在U.C.Berkeley癌症中心(U.C.Berkeley CancerCenter)(Beclman-Coulter EPICS)通过流式细胞技术定量测定绿色细胞的组分。
结果产生文库交错延伸方法(Zhao等，同上)用于生产含有随机分布于VP1-3中的点突变的cap突变体文库，该方法是一种基于聚合酶链式反应(PCR)，以类似于DNA改组的方式产生各种遗传文库的方法。该产物插入含有完全野生型AAV基因组的质粒中，如细菌转化后通过定量菌落数测定的那样，产生了含有约106个独立克隆的病毒文库。对该质粒文库测序评估序列多样性的程度。瞬时转染入293细胞然后用Ad5感染将质粒包装进病毒产生病毒颗粒文库。选择此大AAV文库中具有各种新性能或功能的病毒变体，并对颗粒中衣壳化的AAV基因组进行DNA序列分析而容易地回收了赋予这些新功能的衣壳结构。
肝素结合突变体作为该文库的序列多样性如何翻译成衣壳功能多样性的初步判断，对CsCl纯化的文库颗粒以NaCl浓度渐增步骤作肝素亲和层析。如同早先报道的(Zolotukhin等.，(1999)Gene Ther.6973-985)，野生型AAV在450和550mMNaCl之间从肝素上洗脱(图1)。完全相反，突变型AAV文库在宽的盐浓度范围洗脱，即从上样时的150mM到最终的750mM组分中洗脱。该结果表明此文库含有显著的序列和功能多样性。既然体内注射后其与硫酸肝素的亲和力限制了rAAV2载体的扩散，当需要在大的组织或区域实现宽分布时，亲和力较低的突变体可能是所需的基因递送载体。相反，亲和力较高的突变体有利于区域定点与高水平的基因表达。
图1a和1b.野生型AAV与该病毒文库的肝素结合特征。a)显示野生型AAV(有阴影的柱)和突变体文库(空白的柱)肝素亲和层析的洗脱图。随着NaCl浓度增加病毒逐渐从柱上洗脱。b)从该突变体文库选出的肝素亲和力较低(有阴影的柱)和肝素亲和力较高(空白的柱)的合并物的层析图。
为分离肝素亲和力低和肝素亲和力高的突变体，初始文库的150mM和700mM NaCl组分分别用Ad5共感染293细胞来扩增，并在肝素柱上再次分级。三轮富集后，得到的两个病毒合并物的大部分在150mM和750mM处从柱上洗脱(图1b)。重要的是，因为每轮富集均涉及293细胞感染，这些合并物依然含有高感染性病毒。然后，从每份盐组分中分离得到各个衣壳克隆并测序。
这些突变体以不同的盐浓度从肝素柱上洗脱的事实表明它们对肝素具有不同的亲和力。然而为精确地测定这些亲和力，可用Qiu等人(同上)的方法。通过进行病毒与固定于微滴定板上的肝素的Scatchard结合分析，相比于野生型AAV与肝素的亲和力，突变体对肝素亲和力的差异得到确定。
中和性抗血清逃逸突变体从我们的突变型AAV文库分离得到功能多样的肝素结合突变体，证明该方法可用于产生具有新颖性能的载体。将该方法应用于更重要的问题通过中和抗体消除载体。产生了兔抗-AAV2中和性抗血清，并且相比于人血清中的NAB滴度，1∶1500的血清稀释度足以抑制50％rAAV-GFP基因递送至293细胞。
图2a和2b.产生抗体中和逃逸突变体。a)病毒在加到293细胞中之前与抗血清一起孵育。相比于无抗血清时的对照感染，成功逃逸抗体中和作用的病毒的水平通过加入Ad5和对AAV基因组作定量实时PCR而滴定被拯救的AAV来测定。b)给出了对各个变体的数据。
抗体逃逸突变体从病毒文库中分离。在连续几轮选择中，对该文库提高严谨性，其中严谨性定义为减少50％具有野生型衣壳rAAV2所需的稀释度(对兔抗血清而言是1500倍)与实际使用的稀释度的比例。因此，向病毒中加入的抗血清越多，严谨性越高。三轮选择后，用Ad5共感染293细胞来扩增，相比于野生型病毒，得到的病毒合并物对抗体的中和作用敏感性降低。然后，用它们包装rAAV-GFP分析了该合并物的5个单独的衣壳克隆。结果表明得到的重组载体对中和抗体的抗性提高了100到1000倍。这是与治疗有关的结果。
中和抗体对rAAV基因递送的抑制作用可按照以下方式观察。具有野生型衣壳的rAA-V2加入293细胞并于24小时后观察。病毒呈现绿色(Alexa488)、微管是红色(Alexa546)、核是蓝色(TO-PRO-3)。在中和抗血清中预孵育后，具有野生型衣壳的rAAV2的胞内转移如预计受到显著抑制。
在图3A-C显示了相比于野生型cap序列的两个中和抗体逃逸突变体的cap核苷酸序列。
实施例2其它AAV衣壳变体的特征鉴定按照以下方式产生突变型AAV一包括抗体逃逸株、肝素结合能力降低的突变体、肝素结合能力提高的突变体。
文库的产生采用易错PCR和交错延伸方法(StEP)相组合来产生编码衣壳蛋白的突变体DNA片段文库。然后将此文库插入质粒，通过这些质粒和腺病毒辅助质粒一起转染进293细胞将此文库包装进病毒。然后用氯化铯密度离心纯化此文库。
选择然后使此文库经过筛选步骤。例如，就抗体逃逸突变体而言，文库的样品与多克隆抗AAV抗血清混合，然后加到293细胞中。加入腺病毒扩增能成功逃避抗血清作用的变体。
在293细胞中扩增了“成功的”变体(例如，在有抗AAV抗体时感染293细胞的变体)后，纯化变体，再次与抗血清混合，感染293细胞，最后用腺病毒再次扩增来进一步富集变体。几轮富集后，纯化、克隆并测序病毒DNA来确定何种突变产生了成功的变体。
产生载体在这点上，仅用病毒衣壳DNA来包装可复制活性病毒，即基因组中含rep和突变cap基因而能在腺病毒存在时复制的病毒。然而，为了在基因治疗方案中使用这些变体，用突变的cap基因来包装含有治疗基因的重组颗粒是重要的。为证明文中所述的突变的cap基因能包装重组病毒，将该cap基因转移入包装/辅助质粒。加入这种辅助质粒及腺病毒辅助质粒和含有驱动报道基因(GEP)在细胞中表达的启动子的载体质粒，导致产生重组病毒颗粒。
抗体逃逸突变体使用两种来源的抗血清来产生抗体逃逸突变体。一种是用野生型AAV颗粒注射家兔产生的兔血清(新西兰白兔产生的抗AAV兔血清)。第二种是许多个体的合并人血清(Sigma产品#H-1388；Lot#122K0424；来源40位北美供血者)。
肝素结合突变体为产生肝素结合突变体，对CsCl纯化的文库病毒颗粒如实施例1所述进行NaCl浓度提高步骤的肝素亲和层析。肝素结合能力降低的突变体用相同于病毒颗粒上样使用的NaCl浓度(例如，0.15M NaCl)洗脱。肝素结合能力降低的突变体在650-700mM NaCl之间洗脱。
特征鉴定下表1-4提供了各种突变体的VP1中不同于野生型AAV VP1的氨基酸位置。所有的氨基酸差异均是相对于图5A-C(SEQ ID NO5)所示的VP1氨基酸序列而言。各种突变体的VP1编码核苷酸序列示于图4A-G、图6A-J和图8A-G。图4A-G、图6A-J和图8A-G中与野生型AAV-2 VP1不同核苷酸以黑体表示。各种突变体的VP1氨基酸序列示于图5A-C、图7A-D和图9A-C。在图5A-C、图7A-D和图9A-C中，保守性氨基酸变化以方框表示，非保守性氨基酸变化以黑体表示。
表1显示了各种AAV中和抗体逃逸突变体的克隆数和氨基酸变化。
表15个兔抗血清逃逸克隆中的突变


Moskalenko等.，(2000)J.Virol.741761-1766_Wobus等.，(2000)J.Virol.749281-9293_Xie等.，(2002)Proc.Natl.Acad.Sci.美国9910405-10410表2显示了各种AAV中和抗体逃逸突变体的克隆数和氨基酸变化。
表29个人抗血清逃逸克隆中的突变


表3显示了各种肝素结合能力提高的突变型AAV的克隆数和氨基酸变化。
表3肝素亲和力提高的克隆的突变

表4显示了各种肝素结合能力降低的突变型AAV的克隆数和氨基酸变化。
表4肝素亲和力降低的克隆的突变


尽管参考其具体的实施方案描述了本发明，本领域的技术人员应该理解的是可做出各种改变并可用等价物替换而不脱离本发明的构思和范围。此外，可对本发明的目的、构思和范围做出许多改进以适应具体的条件、材料、物质的组合物、方法、加工步骤。所有这些改进也要包括在附加的权利要求的范围中。
序列表<110>D.V.谢弗(SCHAFFER，DAVID V.)B.卡斯帕(KASPAR，BRIAN)N.马赫什里(MAHESTRI，NARENDRA)<120>突变型腺伴随病毒的病毒颗粒及其使用方法<130>BERK-024WO<140>未指定<141>
<150>60/484,111<151>2003-06-30<160>41<170>FastSEQ for Windows Version 4.0<210>1<211>2225<212>DNA<213>腺伴随病毒<400>1atggctgccg atggttatct tccagattgg ctcgaggaca ctctctctga aggaataaga 60cagtggtgga agctcaaacc tggcccacca ccaccaaagc ccgcagagcg gcataaggac 120gacagcaggg gtcttgtgct tcctgggtac aagtacctcg gacccttcaa cggactcgac 180aagggagagc cggtcaacga ggcagacgcc gcggccctcg agcacgacaa agcctacgac 240cggcagctcg acagcggaga caacccgtac ctcaagtaca accacgccga cgcggagttt 300caggagcgcc ttaaagaaga tacgtctttt gggggcaacc tcggacgagc agtcttccag 360gcgaaaaaga gggttcttga acctctgggc ctggttgagg aacctgttaa gacggctccg 420ggaaaaaaga ggccggtaga gcactctcct gtggagccag actcctcctc gggaaccgga 480aaggcgggcc agcagcctgc aagaaaaaga ttgaattttg gtcagactgg agacgcagac 540tcagtacctg acccccagcc tctcggacag ccaccagcag ccccctctgg tctgggaact 600aatacgatgg ctacaggcag tggcgcacca atggcagaca ataacgaggg cgccgacgga 660gtgggtaatt cctcgggaaa ttggcattgc gattccacat ggatgggcga cagagtcatc 720accaccagca cccgaacctg ggccctgccc acctacaaca accacctcta caaacaaatt 780tccagccaat caggagcctc gaacgacaat cactactttg gctacagcac cccttggggg 840tattttgact tcaacagatt ccactgccac ttttcaccac gtgactggca aagactcatc 900aacaacaact ggggattccg acccaagaga ctcaacttca agctctttaa cattcaagtc 960aaagaggtca cgcagaatga cggtacgacg acgattgcca ataaccttac cagcacggtt 1020
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<210>40<211>2208<212>DNA<213>腺伴随病毒-2<400>40atggctgccg atggttatct tccagattgg ctcgaggaca ctctctctga aggaataaga 60cagtggtgga agctcaaacc tggcccacca ccaccaaagc ccgcagagcg gcataaggac 120gacagcaggg gtcttgtgct tcctgggtac aagtacctcg gacccttcaa cggactcgac 180aagggagagc cggtcaacga ggcagacgcc gcggccctcg agcacgacaa agcctacgac 240cggcagctcg acagcggaga caacccgtac ctcaagtaca accacgccga cgcggagttt 300caggagcgcc ttaaagaaga tacgtctttt aggggcaacc tcggacgagc agtcttccag 360gcgaaaaaga gggttcttga acctctgggc ctggttgagg aacctgttaa gacggctccg 420ggaaaaaaga ggccggtaga gcactctcct gtggagccag actcctcctc gggaaccgga 480aaggcgggcc agcagcctgc aagaaaaaga ttgaattttg gtcagactgg agacgcagac 540tcagtacctg acccccagcc tctcggacag ccaccagcag ccccctctgg tctgggaact 600aatacgatgg ctacaggcag tggcgcacca atggcagaca ataacgaggg cgccgacgga 660gtgggtaatt cctcgggaaa ttggcattgc gattccacat ggatgggcga cagagtcatc 720accaccagca cccgaacctg ggccctgccc acctacaaca accacctcta cgaacaaatt 780tccagccaat caggagcctc gaacgacaat cactactttg gctacagcac cccttggggg 840tattttgact tcaacagatt ccactgccac ttttcaccac gtgactggca aagactcatc 900aacaacaact ggggattccg acccaagaga ctcaacttca agccctttaa cattcaagtc 960aaaggggtca cgcagaatga cggtacgacg acgattgcca ataaccttac cagcacggtt 1020caggtgttta ctgactcgga gtaccagctc ccgtacgtcc tcggctcggc gcatcaagga 1080tgcctcccgc cgttcccagc agacgtcttc atggtgccac agtatggata cctcaccctg 1140aacaacggga gtcaggcagt aggacgctct tcattttact gcctggagta ctttccttct 1200cagatgctgc gtaccggaaa caactttacc ttcagctaca cttttgagga cgttcctttc 1260cacagcagct acgctcacag ccagagtctg gaccgtctca tgaatcctct catcgaccag 1320tacctgtatt acttgagcag aacaaacact ccaagtggaa ctaccacgca gtcaaggctt 1380cagttttctc aggccggagc gagtgacatt cgggaccagt ctaggaactg gcttcctgga 1440ccctgttacc gccagcagcg agtatcaaag acatctgcgg ataacaacaa cagtgaatac 1500tcgtggactg gagctaccaa gtaccacctc aatggcagag actctctggt gaatccgggc 1560ccggccatgg caagccacaa ggacgatgaa gaaaagtttt ttcctcagag cggggttctc 1620atctttggga agcaaggctc agagaaaaca gatgtggaca ttgaaaaggt catgattaca 1680gacgaagagg aaatcaggac aaccaatccc gtggctacgg agcagtatgg ttctgtatct 1740accaacctcc agagaggcaa cagacaagca gctaccgcag atgtcaacac acaaggcgtt 1800cttccaggca tgatctggca ggacagagat gtgtaccttc aggggcccat ctgggcaaag 1860attccacaca cggacggaca ttttcacccc tctcccctca tgggtggatt cggacttaaa 1920caccctcctc cacagattct catcaagaac accccggtac ctgcgaatcc ttcgaccacc 1980ttcagtgcgg caaagtttgc ttccttcatc acacagtact ccacgggaca ggtcagcgtg 2040gagatcgagt gggagctgca gaaggaaaac agcaaacgct ggaatcccga aattcagtac 2100acttccaact acaacaagtc tgttaatgtg gactttactg tggacactaa tggcgtgtat 2160tcagagcctc gccccattgg caccagatac ctgactcgta atctgtaa 2208
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1.一种含有编码突变型腺伴随病毒(AAV)衣壳蛋白的核苷酸序列的分离的核酸，其中，相比于野生型AAV衣壳蛋白，所述突变型AAV衣壳蛋白含有至少一个氨基酸取代。
2.如权利要求1所述的分离的核酸，其特征在于，相比于野生型AAV衣壳蛋白，所述编码的突变型AAV衣壳蛋白显示肝素结合能力提高。
3.如权利要求1所述的分离的核酸，其特征在于，相比于野生型AAV衣壳蛋白，所述编码的突变型AAV衣壳蛋白显示肝素结合能力降低。
4.如权利要求1所述的分离的核酸，其特征在于，相比于野生型AAV衣壳蛋白，所述编码的突变型AAV衣壳蛋白显示结合中和抗体的能力降低。
5.一种含有如权利要求1所述核酸的分离的宿主细胞。
6.如权利要求5所述的分离的宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞用核酸稳定转染。
7.如权利要求5所述的分离的宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞还含有核酸，该核酸含有编码腺伴随病毒(AAV)rep蛋白的核苷酸序列。
8.如权利要求7所述的分离的宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞还含有重组AAV载体。
9.一种腺伴随病毒(AAV)文库，所述文库含有多个核酸，所述核酸含有编码突变型AAV衣壳蛋白的核苷酸序列，其中，相比于野生型AAV衣壳蛋白，所述突变型AAV衣壳蛋白含有至少一个氨基酸取代。
10.一种突变型腺伴随病毒(AAV)颗粒文库，所述文库包含多个含有AAV衣壳蛋白的AAV颗粒，相比于野生型AAV衣壳蛋白，该AAV衣壳蛋白含有至少一个氨基酸取代。
11.一种含有AAV衣壳蛋白和异源核酸的重组腺伴随病毒(rAAV)病毒粒子，相比于野生型AAV衣壳蛋白，所述AAV衣壳蛋白含有至少一个氨基酸取代。
12.如权利要求11所述的rAAV病毒粒子，其特征在于，相比于野生型AAV，所述rAAV病毒粒子显示肝素结合能力降低。
13.如权利要求11所述的rAAV病毒粒子，其特征在于，相比于野生型AAV，所述rAAV病毒粒子显示肝素结合能力提高。
14.如权利要求11所述的rAAV病毒粒子，其特征在于，相比于中和抗体对野生型AAV病毒粒子感染的抑制，中和抗体对所述rAAV病毒粒子感染的抑制降低。
15.如权利要求11所述的rAAV病毒粒子，其特征在于，相比于野生型AAV病毒粒子，所述rAAV病毒粒子穿过内皮细胞层的能力提高。
16.如权利要求11所述的rAAV病毒粒子，其特征在于，相比于野生型AAV病毒粒子，所述rAAV病毒粒子对非感染细胞的感染力提高。
17.一种产生含有AAV衣壳蛋白的突变型腺伴随病毒(AAV)颗粒的方法，相比于野生型AAV衣壳蛋白，所述AAV衣壳蛋白含有至少一个氨基酸取代，其中所述突变型AAV颗粒显示衣壳性能改变，所述方法包括a)产生在AAV cap基因中含有突变的突变型AAV文库；b)将该AAV文库包装进AAV颗粒，产生AAV文库颗粒；和c)选择衣壳性能改变的AAV文库颗粒。
18.如权利要求17所述的方法，其特征在于，所述突变型AAV文库的产生包括聚合酶链式反应诱变。
19.如权利要求18所述的方法，其特征在于，所述诱变包括交错延伸方法。
20.如权利要求17所述的方法，其特征在于，所述突变型AAV文库的产生包括寡核苷酸定点诱变。
21.如权利要求17所述的方法，其特征在于，所述选择步骤包括选择肝素结合能力降低。
22.如权利要求17所述的方法，其特征在于，所述选择步骤包括选择肝素结合能力提高。
23.如权利要求17所述的方法，其特征在于，所述选择步骤包括选择与中和抗体的结合能力降低。
24.如权利要求17所述的方法，其特征在于，所述选择步骤包括选择对非感染性细胞的感染力提高。
25.如权利要求17所述的方法，其特征在于，所述选择步骤包括选择穿过内皮细胞层的能力提高。
26.一种将基因产物递送至需要它的个体的方法，所述方法包括给予个体如权利要求11所述的重组腺伴随病毒(r AAV)病毒粒子。
27.如权利要求26所述的方法，其特征在于，所述基因产物是蛋白质。
28.如权利要求26所述的方法，其特征在于，所述基因产物是短干扰RNA。
全文摘要
本发明提供显示衣壳性能改变的突变的腺伴随病毒(AAV)，所述性能改变例如是与血清中和抗体的结合能力降低和/或与肝素的结合能力改变和/或对特定细胞类型的感染力改变。本发明还提供在衣壳基因中含有一个或多个突变的突变型AAV的文库。本发明还提供产生突变型AAV、突变型AAV文库的方法，以及含有突变型AAV的组合物。本发明还提供含有突变体衣壳蛋白的重组AAV(rAAV)病毒粒子。本发明还提供含有编码突变体衣壳蛋白的核苷酸序列的核酸，以及含有该核酸的宿主细胞。本发明还提供将基因产物递送至个体的方法，所述方法通常包括将有效量的所述rAAV病毒粒子施用至需要它的个体。
文档编号C12N15/74GK1826414SQ200480021115
公开日2006年8月30日 申请日期2004年6月29日 优先权日2003年6月30日
发明者D·V·谢弗, B·卡斯帕, N·马赫什里 申请人:加利福尼亚大学董事会