专利名称：抗b型流感病毒单克隆抗体及使用该抗体的免疫测定器具的制作方法
技术领域：
本发明涉及抗B型流感病毒单克隆抗体及使用该抗体的免疫测定器具。
背景技术：
流感以前就周期反复地在世界流行，每逢流感流行，就有很多死亡者，在1931年作为流感原因的病毒被检测出，打开了通向阐明流感原因的道路。流感病原体病毒，根据位于病毒内部的可溶性核蛋白(nucleoprotein；NP)的抗原性被分类为A型、B型或C型3种类型。A型流感进一步根据存在于病毒表面的红血球凝聚素(hemagglutinin；HA)和神经氨酸酶(neuraminidase；NA)这2种包膜糖蛋白的抗原性分出亚型。
从1972年开始为了预防流感，使用经醚处理后用福尔马林钝化的疫苗。近年来，在用于预防的疫苗以外，作为治疗药还发现了抗流感药，并被广泛使用。作为这些治疗药，是适应A型流感病毒的盐酸金刚胺、和适应A型流感病毒和B型流感病毒的扎那米韦、磷酸奥赛他米韦等。
在选择这些治疗药时，重要的是检测出样品中的流感病毒，并确定感染是流感病毒所引起的、并确定病毒类型是A型或B型。另外，A型流感病毒与B型流感病毒比，感染力强，引起严重症状，因此在早期的治疗中感染病毒的确定更为重要。
过去，利用抗流感病毒抗体检测出流感病毒。迄今为止针对A型流感病毒的抗体，在判别预想流行的病毒的亚型以及制备疫苗中起作用，了解了特异地识别病毒的HA或NA、用于识别病毒的亚型的抗体(例如参照专利文献1、专利文献2)。
而且，作为检测流感病毒的装置，例如知道准备可结合流感病毒抗原的固相，使样品中的流感病毒与之反应后，进而使结合着第一酶的A型流感病毒抗体和结合着第二酶的B型流感病毒抗体与上述固相反应，加入基质进行反应，目测观察固相上的显色的流通型(flow-through)装置(参照专利文献3)。此装置，虽然试剂中的抗体使用针对流感病毒核蛋白的抗体，但是测定灵敏度低，操作烦杂，不是简便的测定装置。另外还知道使用了针对流感病毒核蛋白的单克隆抗体的免疫测定器具(以下叫做“免疫色谱器具”)(参照非专利文献1)。
另一方面，开发了使用可输液的带状的基体的免疫色谱器具，只在所规定的部位上点滴样品，不需要特别的检测装置、熟练的测定技术而能够在短时间内简便地测定样品中的抗原或抗体。对于免疫色谱器具，根据其测定对象物质开发了例如能够在检测区结合多个梅毒螺旋体抗原(TP抗原)，并在各检测区检测出样品中的多个抗TP抗体的免疫色谱器具(参照专利文献4)。在该器具的检测区中具有结合了不同的TP抗原的多个区，在1次的测定中就分别地检测出不同的抗TP抗体，确定感染时期，用于治疗药的选择等。
专利文献1特开平6-100594号专利文献2特开平7-304799号专利文献3特开2001-124775号专利文献4特开平9-229938号非专利文献1感染症志2001；75；792-799发明内容以往的抗B型流感病毒单克隆抗体，其多数是识别病毒的表面抗原HA和NA的，特异性和反应性低，不能满足高灵敏度的免疫测定。另外，流通型装置，虽然试剂中的抗体使用针对流感病毒核蛋白的抗体，但是测定操作烦杂，不是简便的测定装置，在检测B型流感病毒时假阳性出现的比例高(参照J.Clin.Microbiol；401675-1680，2002)。
另一方面，为了选择治疗药，需求一种装置，该装置使用不与A型流感病毒反应，但与包含流感病毒的变异株的B型流感病毒反应的抗体，在流感A型病毒或B型病毒的判别中不需要特别的诊断仪器设备和测定装置，并在短时间内得到测定结果，用1次操作就能判别A型或B型。
因此，本发明的目的是提供一种特异性高的抗B型流感病毒单克隆抗体。另外，本发明还提供一种能够特异地检测出B型流感病毒的免疫测定器具。
本发明人刻苦研究的结果，成功地制出以B型流感病毒的核蛋白为抗原，与B型流感病毒发生特异反应的抗B型流感病毒单克隆抗体，从而完成了本发明。另外，通过利用这种B型流感病毒单克隆抗体，想到了可提供能够与A型流感病毒区分开地、地检测出B型流感病毒的免疫测定器具。
即，本发明提供与B型流感病毒的分子量60-75kD的核蛋白发生抗原抗体反应，与A型流感病毒基本上不发生抗原抗体反应的抗B型流感病毒单克隆抗体或其抗原结合性片段。另外，本发明提供一种免疫测定器具，该器具是在基体上设置具有可移动的标记的抗B型流感病毒抗体的标记试剂区、样品点滴区、展开液供给区、展开液吸收区及使抗B型流感病毒抗体固定在基体上的B型流感病毒检测区的器具，上述标记的抗B型流感病毒抗体及固定在检测区中的抗B型流感病毒抗体的至少一种抗体是上述本发明的单克隆抗体。
发明效果根据本发明，提供了与B型流感病毒发生免疫反应，但与A型流感病毒不发生反应的抗B型流感病毒单克隆抗体。通过使用本发明的抗B型流感病毒单克隆抗体进行免疫测定，能够与A型流感病毒区分开地、地检测出B型流感病毒或将其定量。根据本发明，还提供了使用了上述本发明的抗B型流感病毒单克隆抗体的免疫测定器具。通过使用本发明的免疫测定器具，能够简便、且与A型流感病毒区分开地、地检测出B型流感病毒。因此，期待着本发明在流感的诊断和治疗上有大的贡献。
附图的简单说明
图1是表示使本发明的单克隆抗体与采用Western印迹法分离的抗原反应时的结果的图。
图2是表示本发明的测定器具的一个实施方案的截面示意图。
图3是表示将本发明的测定器具安置在盒中的一个实例的俯视图。
图4是图3的A-A’的截面图。
实施发明的最佳方案如上所述，本发明的单克隆抗体与B型流感病毒的分子量60-75kD的核蛋白发生抗原抗体反应。与B型流感病毒的分子量60-75kD的核蛋白发生抗原抗体反应可通过将B型流感病毒作为试样，进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)的Western印迹法来证实。当进行Western印迹(参照下述实施例)时，本发明的单克隆抗体识别分子量60-75kD的核蛋白。
按照上述，本发明的单克隆抗体与A型流感病毒基本上不发生抗原抗体反应。在此，所谓“基本上不发生抗原抗体反应”是指在能检测出的水平下不发生抗原抗体反应或者即使引起抗原抗体反应，其反应的程度也明显弱于与B型流感病毒的抗原抗体反应，不与B型流感病毒发生抗原抗体反应指仅在本领域从业人员明了的程度反应。另外，在此，所谓“与A型流感病毒基本上不发生抗原抗体反应”是与包括A型流感病毒的核蛋白在内的该病毒的各构成要素的蛋白质基本上不发生抗原抗体反应之意。在优选的方案中，本发明的单克隆抗体与C型流感病毒基本上也不反应。
在优选的方案中，本发明的单克隆抗体，与B型流感病毒的各亚型的核蛋白发生抗原抗体反应。即，B型流感病毒虽在其病毒粒子表面具有红血球凝聚素(H)和神经氨酸酶(N)，根据这些H和N的结构不同被分类为种种的亚型。本发明的单克隆抗体，优选至少与下述实施例记载的亚型(参照表3)的核蛋白发生抗原抗体反应，进而优选与公知的所有B型流感病毒的亚型的核蛋白发生抗原抗体反应。
另外，在优选的方案中，本发明的单克隆抗体，与症状至少部分地和流感类似的其他感染症的病原体也基本上不发生抗原抗体反应。例如与腺病毒(1～7型)、柯萨奇病毒(A16、B1～B6型)、单纯疱疹病毒1型、埃可病毒(3型、4型、7型、22型、30型)、肠病毒(71型)、流行性腮腺炎病毒、脊髓灰质炎病毒(1～3型)、RS病毒(亚群A、亚群B)、副流感病毒(1～3型)、大肠杆菌、肺炎杆菌、绿脓菌、粘质沙雷氏菌、表皮葡萄球菌、变形杆菌、黄色葡萄球菌、棒杆菌、白喉棒杆菌、白色念珠菌(Candida albicans)、酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)、链球菌属的细菌(群B、C、G、F)、肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)、流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)、单核细胞增多性李斯特氏菌(Listeriamonocytogenes)、肺炎支原体(Mycoplasmal pneumonia)、沙眼衣原体(Chlamydia trachomatis)、肺炎衣原体(Chlamydia pneumonia)基本上不发生抗原抗体反应。
另外，众所周知，通过用木瓜蛋白酶或胃蛋白酶分解抗体，可以得到Fab片段和F(ab’)2片段之类的具有与对应抗原的结合性的抗体片段(在本说明书中叫做“抗原结合性片段”)，但本发明的单克隆抗体的抗原结合性片段也能够与本发明的单克隆抗体同样地使用，包括在本发明的保护范围内。
本发明的单克隆抗体，将B型流感病毒的核蛋白作为免疫原，采用常规杂交瘤法制备。作为免疫原使用的B型流感病毒的核蛋白，如果核蛋白大量存在，能发挥其免疫原作用，则培养病毒液、流感HA疫苗、HI用HA抗原、重组抗原均能使用。为了抑制抗原所含的免疫原性高的HA和NA的作用，也可通过超离心核蛋白纯化(例如参照J.Biochem.；1021241-1249，1987)或蛋白酶处理(例如参照J.Immunol.Methods；180107-116，1995)的抗原。
上述单克隆抗体可通过下述方式产生，即，将包含上述B型流感病毒的核蛋白的抗原作为免疫原免疫动物，将其产生B型流感病毒单克隆抗体的细胞和肿与瘤细胞融合，利用所得的杂交瘤产生上述单克隆抗体。
上述杂交瘤可采用以下的方法得到。即，将如上述那样得到的上述抗原的B型流感病毒核蛋白与弗氏完全佐剂一起分成数次每隔2-3个星期通过腹腔内或静脉施予来对小鼠等动物进行免疫。接着，使来源于脾脏等的产生抗体细胞、和来自骨髓瘤细胞系的细胞(骨髓瘤细胞)等的在试验管内能繁殖的肿瘤细胞融合。
作为上述融合方法，可按照Kohler和Milstein的常规方法(Nature，256卷，495页，1975年)利用聚乙二醇来进行，或者可采用仙台病毒等来进行。
作为从上述融合细胞选择产生识别B型流感病毒核蛋白的抗体的杂交瘤的方法，例如可如下地进行。即，由上述融合细胞通过有限稀释法选择在HAT培养基和/或HT培养基中生存的细胞作为杂交瘤。接着，利用培养上述杂交瘤的培养液在固定了高纯度纯化的B型流感病毒核蛋白的检测板上反应之后，通过与抗小鼠免疫球蛋白(Ig)等进一步反应的EIA法等，能够选择产生特异地识别B型流感病毒核蛋白的单克隆抗体的杂交瘤。
在下述实施例中，得到了多种本发明优选的单克隆抗体，将其中的3种分别命名为杂交瘤FrB1-03、杂交瘤FrB1-07及杂交瘤FVB2-16。这些杂交瘤分别基于布达佩斯条约向独立行政法人产业技术综合研究所特许生物保藏中心(日本茨城县筑波东1丁目1番地1、中央第6)提交了国际保藏，其中，杂交瘤FrB1-03的鉴定表示FrB1-03，保藏号是FERM BP-10070(保藏日2003年7月18日，在2004年7月14日由国内保藏FERM P-19441转为国际保藏)；杂交瘤FrB1-07鉴定表示FrB1-07，保藏号是FERM BP-10071(保藏日2003年7月18日，在2004年7月14日由国内保藏FERM P-19442转为国际保藏)；杂交瘤FVB2-16的鉴定表示FVB2-16，保藏号是FERMBP-10069(保藏日2003年7月18日，在2004年7月14日由国内保藏FERM P-19440转为国际保藏)。
上述各个杂交瘤，通过在用于细胞培养的培养基中培养，能够从培养上清液回收单克隆抗体。另外，通过施予产生杂交瘤的动物，还能贮存腹水，并从该腹水中回收。
作为上述单克隆抗体的回收方法，可使用通常进行的纯化方法，例如举出凝胶过滤色谱法、离子交换色谱法、蛋白质A的亲和色谱法等。
按照上述方法制备的单克隆抗体，经确认可与B型流感病毒的核蛋白，以及B型流感病毒的各种病毒株反应。现已保藏并能得到的B型流感病毒保藏株(参照以下的表3)也与之发生反应，并且它们能用本发明的单克隆抗体检测出。另一方面，作为考虑交叉反应性的微生物，例如证实了与腺病毒(1～7型)、柯萨奇病毒(A16、B1～B6型)、单纯疱疹病毒1型、埃可病毒(3型、4型、7型、22型、30型)、肠病毒(71型)、流行性腮腺炎病毒、脊髓灰质炎病毒(1～3型)、RS病毒(亚群A、亚群B)、副流感病毒(1～3型)、大肠杆菌、肺炎杆菌、绿脓菌、粘质沙雷氏菌、表皮葡萄球菌、变形杆菌、黄色葡萄球菌、棒杆菌、白喉棒杆菌、白色念珠菌、酿脓链球菌、链球菌属的细菌(群B、C、G、F)、肺炎链球菌、流感嗜血杆菌、单核细胞增多性李斯特氏菌、肺炎支原体、沙眼衣原体、肺炎衣原体等的反应性，但反应未发现。
本发明的单克隆抗体，能够在用于B型流感病毒的检测或定量的免疫测定中使用。免疫测定方法是众所周知的，可以采用公知的任何免疫测定方法。即，按测定形式分类有夹层法、竞争法、凝聚法、Western印迹法等，按使用的标记分类，有荧光法、酶法、放射法、生物素法等，可使用这些方法中的任1种方法。而且，还能够通过免疫组织染色来诊断。在免疫测定方法中使用标记抗体时，抗体的标记方法是众所周知的，可采用已知的任何方法。另外众所周知，将抗体用木瓜蛋白酶分解或用胃蛋白酶分解，可得到如Fab片段和F(ab’)2片段那样的、具有与对应抗原有结合性的抗体片段(在本说明书中叫做“抗原结合性片段”)，本发明的单克隆抗体的抗原结合性片段也能够与本发明的单克隆抗体同样地使用。
这些免疫测定方法自身是众所周知的，不需要在本说明书中说明，简单描述如下，例如在夹层法中，将本发明的抗体或其抗原结合性片段作为第1抗体固定于固相，使之与样品反应，洗净后，使之和与本发明的与酶发生抗原抗体反应的第2抗体反应，洗净后，测定结合于固相的第2抗体。通过用酶、荧光物质、放射性物质、生物素等标记第2抗体，能够测定结合于固相的第2抗体。对浓度已知的多个标准试样利用上述方法测定，基于所测定的标记量和标准试样中的本发明的酶的关系制成标准曲线，通过将未知浓度的被检试样的测定结果套用于该标准曲线，能够将被检试样中的本发明的酶定量。也可以将第1抗体和第2抗体在上述说明中相互替换。另外，在凝聚法中，在乳胶等的粒子上固定本发明的抗体或其抗原结合性片段，使之与样品反应，测定吸光度。对浓度已知的多个标准试样利用上述方法测定，基于所测定的标记量和标准试样中的本发明的酶的关系制成标准曲线，通过将未知浓度的被检试样的测定结果套用于该标准曲线，能够将被检试样中的本发明的酶定量。
本发明还提供一种免疫测定器具，该器具利用上述本发明的单克隆抗体，能够简便、且与A型流感病毒区分开地、检测出B型流感病毒。
本发明的免疫测定器具，是在基体上设置了具有可移动的标记的抗B型流感病毒抗体的标记试剂区、样品点滴区、展开液供给区、展开液吸收区及使抗B型流感病毒抗体固定在基体上的B型流感病毒检测区的器具，其中上述标记的抗B型流感病毒抗体及固定在检测区中的抗B型流感病毒抗体中的至少一种是本发明的单克隆抗体。点滴在样品点滴区中的样品，与标记试剂区所含有的标记抗体发生抗原抗体反应，形成被标记了的抗原抗体复合物。该抗原抗体复合物随由展开液供给区供给的展开液流动，到达B型流感病毒检测区。在这里，固定在基体上的抗B型流感病毒抗体和上述标记抗原抗体复合物发生抗原抗体反应，上述标记抗原抗体复合物被固定在基体上。标记抗原抗体复合物是否被固定在B型流感病毒检测区中通过有无标记来判定。在B型流感病毒检测区中通过的展开液被展开液吸收区吸收。样品点滴区和标记试剂区可以是同一个(此种情况下样品被点滴在标记试剂区)。在本发明的免疫测定器具中，标记抗体或固定在B型流感病毒检测区中的抗体的至少任一种是本发明的单克隆抗体。另外，其中一种抗体也可以是多克隆抗体。B型流感病毒的核蛋白通常结合或附着着多个分子，因此标记抗体或固定在B型流感病毒检测区中的抗体这两者即使是相同的单克隆抗体，也能够检测B型流感病毒。
以下分别说明本发明的免疫测定器具的各构成要件。
基体本发明的免疫测定器具中的带状基体，采用利用毛细管作用而能输送液体的吸收性材料构成。作为该吸收性材料，例如是单独使用纤维素、硝基纤维素等的纤维素或其衍生物、玻璃纤维等制备的或将它们混合使用而制备的纸、膜、多孔性材料。该基体的大小没有限制，但宽3mm-10mm左右、长30mm-100mm左右的带状基体因操作容易故优选。基体可使用厚度为100μm-1mm的。另外，基体为了防止在测定时来源于样品的蛋白质在基体上的非特异反应所致的吸附，例如可用牛血清白蛋白(BSA)等的动物血清、酪蛋白、蔗糖等将其一部分或全体封闭(blocking)而使用。
检测区在检测区能够设置在上述基体上固定了抗B型流感病毒抗体的B型流感病毒检测部。固定在该检测部的抗B型流感病毒抗体和后述的标记的抗B型流感病毒抗体，至少一种是本发明的抗B型流感病毒单克隆抗体，优选这两种抗体是抗B型流感病毒单克隆抗体。检测部的上述抗B型流感病毒抗体在基体上与在基体中展开的液体的输液方向(基体的纵向)正交的方向上，线条状地设置时能提供灵敏度好地测定，故优选。作为抗B型流感病毒多克隆抗体，可从市场销售、并能容易得到的多克隆抗体中适宜选择使用。
该检测区的抗B型流感病毒抗体，是上述的抗体，还能将单克隆抗体单独使用或混合而使用。抗B型流感病毒抗体，可以是IgG抗体、IgM抗体、还可以是这些抗体的抗原结合性片段F(ab)、F(ab’)2等。
被固定在检测部的抗B型流感病毒抗体可以使之直接物理吸附在基体的检测区上，也可以利用共价键等化学键进行固定从而设置。另外，还可以使抗B型流感病毒抗体与水不溶性的载体结合，从而使基体内含有该抗体。作为该不溶性的载体，可举出将由明胶、阿拉伯胶及六偏磷酸钠组成的混合物不溶化而得到的粒子(特公昭63-29223)、聚苯乙烯乳胶粒子、玻璃纤维等。在使不溶性载体和抗B型流感病毒单克隆抗体结合时，可通过上述化学键或物理吸附来进行。
在检测区中，除了采用抗B型流感病毒抗体的B型流感病毒检测部以外，还可设置采用抗A型流感病毒抗体的A型流感病毒检测部。该A型流感病毒检测部，如果是上述B型流感病毒检测部的近旁，则在展开液的输液方向可以是上述B型流感病毒检测部上游侧或下游侧的任一侧。在A型流感病毒检测区固定的抗A型流感病毒抗体，也可以是多克隆抗体或单克隆抗体，与上述抗B型流感病毒抗体同样，能通过化学键或物理吸附固定在基体上。
如上述，在基体上的检测区至少设置采用抗B型流感病毒抗体的B型流感病毒检测部，进而设置A型流感病毒检测部，在同时测定B型流感病毒和A型流感病毒上为优选。这些检测部在基体的输液方向上是酶标记试剂区、样品点滴区及展开液供给区的下游侧，是添加液吸收区的上游侧。检测部在基体上接近于宽0.5mm～5mm左右的线条状，可设置多条的线。如果是宽5mm左右的基体，则通常将上述抗体和抗原分别点滴0.1μg-10μg左右，使之干燥，从而能作成检测部。
标记试剂区标记试剂区，向设置于基体上的区可移动地点滴标记的抗B型流感病毒抗体从而进行设置。该区在来自展开液供给区的展开液的输液方向可设置在上述检测区的上游侧。该区利用下述方法构成向基体点滴酶标记试剂的方法；将含有酶标记试剂的吸水性垫层叠在基体上的方法；或者使与垫粘合的基体部分的一部分或全部与垫一起含有酶标记试剂的方法。作为吸水性垫，可使用后述的样品点滴区的垫。
作为标记的抗B型流感病毒抗体的抗体，和上述设置在检测区的抗体，至少一种是抗B型流感病毒单克隆抗体，优选这两种抗体是抗B型流感病毒单克隆抗体。作为标记的抗B型流感病毒抗体的抗体，与上述检测区的抗体同样地还能使用其片段。
上述标记的抗B型流感病毒抗体，使上述抗体和标记物结合而制备。作为标记物，可举出酶、金属胶体粒子、着色乳胶粒子、发光物质、荧光物质等。作为酶，是酶免疫测定法(EIA)所使用的各种酶，作为这种酶例如可举出碱性磷酸酶、过氧化物酶、β-D-半乳糖苷酶等。另外，作为金属胶体粒子例如可使用胶体金粒子、胶体硒粒子等。
另外，标记物和抗B型流感病毒抗体的结合方法，可利用公知的形成共价键或非共价键的方法制备。结合的方法例如可举出戊二醛(グタルアルデヒド)法、过碘酸法、马来酰亚胺法、吡啶基二硫化物法、使用各种交联剂的方法等(例如参照“蛋白质核酸酶”增刊31号，37-45页(1985))。在使用交联剂的结合方法中，作为交联剂例如可使用N-琥珀酰亚胺基(スクシンイミジル)-4-马来酰亚胺基丁酸(GMBS)、N-琥珀酰亚胺基-6-马来酰亚胺基己酸、N-琥珀酰亚胺基-4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸等。在共价结合的方法中，除了能使用在抗体中存在的官能团以外，例如采用常规方法导入硫醇基、氨基、羧基、羟基等官能团之后，利用上述结合法能够制备标记的抗B型流感病毒抗体。另外，作为非共价结合的方法，可举出物理吸附法等。
按照上述的那样，除了检测B型流感病毒以外，同时还检测A型流感病毒时，在标记试剂区添加标记的抗A型流感病毒抗体而制备器具。标记试剂区中含有的标记的抗B型流感病毒抗体和标记的抗A型流感病毒抗体，在基体或吸水性垫的其中一种中含有，或者可使基体和吸水性垫这两者中含有标记的抗B型流感病毒抗体和标记的抗A型流感病毒抗体。在进行B型流感病毒和A型流感病毒的同时测定时，由于较多地使用标记试剂，因此在基体和垫这两者中单独或混合地含有酶标记试剂在进行高灵敏度测定上是有利的。标记的抗B型流感病毒抗体和标记的抗A型流感病毒抗体量通常可相应于检查对象物的预测量适宜变更，但通常干燥重量是0.01μg-5μg左右。标记的抗B型流感病毒抗体和标记的抗A型流感病毒抗体在酶标记区中含有时，能够与试剂的稳定剂、溶解调节剂等一起涂布。
样品点滴区样品点滴区，尤其可不含有试剂等而设置在展开液供给区的展开液的输液方向的下游侧、检测区的上游侧的基体上。而且，样品点滴区能设置在1)展开液区的展开液输液方向的下游侧、酶标记试剂区的上游侧的所规定的部位；2)标记试剂区的下游侧、检测区的上游侧的所规定的部位；3)标记试剂区上的所规定的部位等。另外，在上述酶标记试剂区中设置样品点滴区的装置中，如上述，附设含有酶标记的吸水性垫在高效率地进行分析上为优选。在附加了该垫的装置中，能够点滴大量的样品液，因此能够以好的检测灵敏度进行样品中微量成分的测定。作为该吸水性垫，从对标记试剂和样品中的流感病毒的吸附少的材料中选择，例如可单独地用由聚乙烯醇(PVA)、无纺布、纤维素等多孔的合成或天然的高分子化合物组成的材料构成或将这些材料组合从而构成。该垫的大小、厚度、密度等不限定，通常使用长和宽为3mm-10mm左右、厚度为0.5mm-4mm左右的垫能高效率地进行测定，故优选。
展开液供给区展开液供给区是设置在基体的纵向的一端，供给展开液的区。在开始测定时可将该区浸渍在装有至少到达展开液吸收区的量的展开液的容器中。而且，为了供给展开液，在展开液区附加装有展开液的液槽，通过破除该液槽的罩使展开液和基体接触，开始测定。可在展开液中适宜含有表面活性剂、缓冲剂、稳定剂、抗菌剂等。另外，作为标记物也使用酶时，可以与后述的基质试剂区一起向展开液中添加基质。作为含有缓冲剂的缓冲液，例如可举出乙酸缓冲液、硼酸缓冲液、Tris-盐酸缓冲液、二乙醇胺缓冲液等。另外，在展开液供给区，为了稳定并连续地实施向基体供给展开液，可附设展开液垫。作为展开液垫例如可使用纤维素或纤维素衍生物等的滤纸。
展开液吸收区展开液吸收区，相对于设置在基体一端的上述展开液区设置在基体另一端。该区为了吸收向基体供给的展开液并顺利进行分析而设置。展开液吸收区，可长长地形成基体以确保该区。另外，也能在基体上附设吸水性材料以促进展开。该吸水性材料可使用由天然高分子化合物、合成高分子化合物等构成的保水性高的滤纸、海绵等。展开液吸收区有具有完全吸收展开液的容积的垫状吸收性材料，通过将吸收性材料层叠在基体之上或之下就能够制备小型化的免疫测定器具。
基质试剂区而且，作为标记试剂区的标记物使用酶时，按照上述的那样，能够使展开液中含有基质、或将基质试剂区设置在基体的上述展开液供给区近旁。基质试剂区，包含、设置在附设于展开液供给区的上述展开液垫上时，在增多基质量进行高灵敏度测定时为优选。
作为基质，可与标记试剂的酶对应地使用以下所示的各种显色基质、荧光基质、发光基质等。
(a)显色基质过氧化物酶用与过氧化氢组合的2，2’-连氮基-双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)(ABTS)、3，3’，5，5’-四甲基联苯胺(TMB)、二氨基联苯胺(DAB)碱性磷酸酶用5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸(BCIP)(b)荧光基质碱性磷酸酶用4-甲基伞形苯基-磷酸酯(4MUP)β-D-半乳糖苷酶用4-甲基伞形苯基-β-D-半乳糖苷(4MUG)(c)发光基质碱性磷酸酶用3-(2’-螺金刚烷)-4-甲氧基-4-(3”-磷酰氧基)苯基-1，2-二氧杂环丁烷·二钠盐(AMPPD)β-D-半乳糖苷酶用3-(2’-螺金刚烷)-4-甲氧基-4-(3”-β-D-半乳糖吡喃糖基(ガラクトピラノシル))苯基-1，2-二氧杂环丁烷(AMGPD)过氧化物酶用与过氧化氢组合的鲁米诺、异鲁米诺。
在将上述基质设置成为基质区时，通常将上述基质溶解于水溶液中，在展开液垫上线条状地涂布之后，使之干燥由此能够形成，还可根据需要添加基质的信号增强剂、稳定剂、溶解调节剂等。基质区如果是附设在基体端部的展开液垫内，则不特别限定。展开液及添加到展开液垫上的基质量可根据测定条件确定，但每1个器具，通常可使用5～500μg左右。
各区的配置图6-图8示意地表示出本发明的1例优选的免疫测定器具。图6中，编号2是基体，4是标记试剂区，8是样品点滴区，3是展开液供给区，5是展开液吸收区，6a是A型流感病毒检测区，7是基质试剂区，9是样品。在该例子中，样品点滴区8和标记试剂区4为同一个。编号6b是B型流感病毒检测区，10是展开液确认区，11是展开液槽(参照下述实施例4)。
测定器具的使用方法可利用本发明的测定器具测定各种样品试样中的B型流感病毒。测定如下进行，首先将样品供给本发明的测定器具的样品点滴区之后，向展开液垫供给展开液，在基体上展开。作为样品的稀释液，作为试样稀释液可使用含有表面活性剂的缓冲液。展开液通过毛细管作用在基体中移动，到达展开液吸收区，未与检测区结合的样品中的成分、酶标记试剂等被吸收，完成了展开。经过规定的时间(通常为10分～20分)后，观察检测区，利用样品液中的B型流感病毒测定固定在检测部的标记物，由此能够进行B型流感病毒的测定。该检测可根据标记物或和标记物使用的酶分别对应使用目测或比色计、荧光光度计、光子计数器、感光膜等的测定装置来实施。在测定中，例如通过目测来测定检测区的显色的方法是简便的。另外，在该方法中，通过使用与B型流感病毒的浓度对应的色标(比色图表)，能够进行半定量的分析。而且，还能够利用比色计等将检测区的显色数值化，从而进行定量。
以图2-图4所示的本发明的一例优选的免疫测定器具为例，进一步说明测定原理。在将样品9点滴在样品点滴区8中的同时，将展开液槽11中的展开液向展开液供给区3供给。展开液利用毛细管现象在基体2中朝横向的白箭头方向移动。基质试剂区7中含有的基质被溶解于展开液中，随展开液移动。另一方面，样品9与标记试剂区4中的标记抗体反应，形成标记的抗原抗体复合物。展开液达到这里时，标记的抗原抗体复合物一边与展开液中的基质发生反应，一边在基体2中移动，当到达B型流感病毒检测区6b时，与固定在B型流感病毒检测区6b中的抗B型流感病毒抗体发生反应，被固定在B型流感病毒检测区6b中。在样品中含有B型流感病毒时，通过标记酶和基质的反应，引起显色。另一方面，在样品中不含有B型流感病毒时，标记抗体不能发生抗原抗体反应，由于标记未被固定在B型流感病毒检测区6b中，故未引起显色。因此，根据A型流感病毒检测区6b显色与否就能知道样品中是否含有B型流感病毒。在展开液确认区10中，与展开液中的试剂发生反应而显色的酶被固定，如果展开液确认区10显色，则知道展开液到达到那里。或者也可以在展开液确认区10中固定针对标记酶的抗体，到达展开液确认区10的标记试剂被该抗体捕获，进而当展开液到达时，被捕获的标记和展开液中的基质发生反应从而显色(在下述实施例中，将抗碱性磷酸酶抗体固定)。另外，在标记试剂区4中含有标记的抗A型流感病毒抗体，另一方面，如果设置固定了抗A型流感病毒抗体的A型流感病毒检测区6a，则也能同时进行A型流感病毒的检测，能够以单一的测定操作调查流感病毒是B型还是A型。
另外，上述基体还能够层叠、固定在塑料、金属、纸等的支撑构件上而使用。上述基体通过固定在塑料等的壳中，在展开液供给区附设含有展开液的液槽，对上述各区部分用开了孔的壳进行保护，从而能够构成易于操作的器具。作为在本发明的免疫测定器具中使用的样品，是从人、动物等采集的、被认为含有流感病毒的样品，可举出各种体液、例如鼻腔拭液、鼻腔吸液、咽拭液等体液提取液。
以下通过参考例、实施例进一步说明本发明，但本发明不被这些实施例实施例1 抗B型流感病毒单克隆抗体的制备免疫原使用含有流感核蛋白抗原的流感HA疫苗(B/山梨/166/98株)或者B型流感重组核蛋白(来源于B/山梨/166/98的(r-NP/B)；DDBJ/GeneBank数据库)。
在免疫原中加入等量的弗氏完全佐剂(ヤトロン公司制)，完全混合后，对Balb/c小鼠以2星期间隔计4次进行免疫。在细胞融合的3天前向小鼠腹腔内注射免疫原，使用PEG融合了小鼠脾细胞和骨髓瘤细胞(P3U1)。培养液使用HAT选择培养基，在约2星期后采集培养上清液供筛选用。在1次筛选时使用了将流感HA疫苗、流感B型重组核蛋白(r-NP/B)固相化了的酶联免疫吸附测定(ELISA法)。即，流感HA疫苗用0.1M碳酸缓冲液pH9.6稀释至×300倍，同样B型重组核蛋白抗原稀释至1μg/ml的浓度，在微型培养板模块(Nunc公司制)的各孔中各加入100μl，在4℃孵育一晚，固相化。其次，用含有0.1％的Tween20(商品名)的PBS(PBS-Tween)洗各孔后，加入用PBS稀释的1％的牛血清白蛋白(BSA)300μl，在4℃封闭过夜。去除封闭液之后，加入100μl培养上清液，在37℃反应1小时。用PBS-Tween充分洗净后，将用含有0.2％BSA、0.2％エマルゲン985、1％蔗糖、1％KCl的0.05M磷酸缓冲液pH7.5(反应用液)稀释2000倍的酶标记抗鼠Igs抗体(DAKO公司制)每孔加入100μl，在37℃反应1小时。反应后，用用PBS-Tween充分洗净，每孔加入100μl的2，2’-连氮基-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸(ABTS)，在室温反应30分钟后，每孔加入100μl的反应终止液，在主波长415nm副波长490nm下测定了显色水平。
关于判定为阳性的培养上清液，采用以流感A型重组核蛋白抗原(来源于A/New Caledonia/20/99的(r-NP/H1N1)、来源于A/北九州/159/93的(r-NP/H3N2)；DDBJ/GeneBank数据库)为抗原的ELISA进行2次筛选，最终得到了产生与B型流感病毒核蛋白抗原发生反应，与流感A型核蛋白抗原不反应的抗体的杂交瘤3株(杂交瘤FrB1-03、杂交瘤FrB1-07和杂交瘤FVB2-16)。由该杂交瘤3株得到的单克隆抗体的亚类全部是IgGl。表1表示出结果。
表1 单克隆抗体的反应性
实施例2 单克隆抗体在Western印迹法中的反应性使用重组抗原、流感HA疫苗(含有核蛋白抗原)、病毒液利用Western印迹法确认了反应性。将各试样溶解在含有0.001M EDTA、1％SDS、5％2ME(2-巯基乙醇)、10％丙三醇、0.005％BPB(溴酚蓝)的0.01M Tris-HCl(pH8.0)中，在100℃加热处理后，供电泳用。十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，使用e-PAGEL10％凝胶浓度(ATTO公司制)并遵循常规方法。电泳后转印在PVDF膜(ATTO公司制)上，用Block Ace(大日本制药公司制)在4℃进行封闭过夜。除掉封闭液用PBS-Tween洗净后，加入调整成10μg/ml的浓度的单克隆抗体，室温下反应45分。用PBS-Tween充分洗净后，用反应用液稀释至4000倍的酶标记的抗鼠IgG抗体(Cappel公司制)在室温下反应45分。用PBS-Tween充分洗净后，使用ECLWestern印迹检测系统(アマシヤム生命科学公司制)用X射线膜(kodak公司制)曝光1～15分钟，检测信号。
对于单克隆抗体FrB1-03、FrB1-07而言，在60-75kD附近看到了谱带。图1表示出此结果。
实施例3 在使用了单克隆抗体的ELISA中的抗原测定将3种纯化单克隆抗体采用0.1M磷酸缓冲液pH7.5以2μg/ml的浓度向微型培养板模块(Nunc公司制)的各孔中各加入100μl，在4℃孵育过夜，固相化。然后用含有0.1％Tween20(商品名)的PBS(PBS-Tween)洗净各孔，加入300μl用PBS稀释的1％的牛血清白蛋白(BSA)，在4℃封闭过夜。将用反应用液稀释的A型流感病毒液向各孔中各加入100μl，在37℃反应1小时。用PBS-Tween充分洗净后，将用反应用液调整的3种碱性磷酸酶标记单克隆抗体向各孔中各加入100μl，在37℃反应1小时。反应后，用PBS-Tween充分洗净，每孔加入100μl的4-硝基苯基磷酸酯(4-NPP)，在室温反应30分钟后，每孔加入100μl的反应终止液，在主波长415nm副波长490nm下测定了显色水平。阳性定为缓冲液空白(buffer blank)的显色水平的2.1倍以上，用变成阳性的最终稀释倍率表示反应性的强弱。
用所得的3种单克隆抗体组合形成的全部9组中均显示出比市场销售的抗A型流感病毒单克隆抗体同等乃至高出4倍的反应性。表2表示出此结果。
表2
表2 抗原测定ELISA
*Fab′标记**市售的单克隆抗体参考例1 碱性磷酸酶标记抗B型流感病毒单克隆抗体的制备将上述抗B型流感病毒单克隆抗体(FrB1-03)进行胃蛋白酶处理，切断Fc区得到F(ab’)2，其次，使用2ME(2-巯基乙醇、ナカライテスク公司制)，切断二硫键，得到游离的露出了硫醇基的F(ab’)。然后偶联引入马来酰亚胺基的碱性磷酸酶和F(ab’)，通过凝胶过滤纯化，得到碱性磷酸酶标记的抗B型流感病毒抗体。
参考例2 抗A型流感病毒单克隆抗体的制备免疫原使用了含有流感核蛋白抗原的流感HA疫苗(化血研制A/New Caledonia/20/99(H1N1)(IVR-116)株、A/巴拿马/2007/99(H3N2)(NIB-41)、B/山梨/166/98株)。
在免疫原中加入等量的弗氏完全佐剂(ヤトロン公司制)，完全混合后，对Balb/c小鼠以2星期间隔计4次进行免疫。在细胞融合的3天前向小鼠腹腔内注射免疫原，使用PEG融合小鼠脾细胞和骨髓瘤细胞(P3U1)。培养液使用HAT选择培养基，在约2星期后采集培养上清液供筛选用。在1次筛选时使用将流感HA疫苗、流感A型重组核蛋白抗原(来源于A/New Caledonia/20/99的(r-NP/H1N1)、来源于A/北九州/159/93的(r-NP/H3N2))固相化了的酶联免疫吸附测定(ELISA法)。即，流感HA疫苗用0.1M碳酸缓冲液pH9.6稀释至×300倍，同样B型重组核蛋白抗原稀释至1μg/ml的浓度，在微型培养板模块(Nunc公司制)的各孔中各加入100μl，在4℃孵育过夜，固相化。然后用含有0.1％的Tween20(商品名)的PBS(PBS-Tween)洗净各孔，加入300μl用PBS稀释的1％的BSA，在4℃进行封闭过夜。去除封闭液之后，加入100μl培养上清液，在37℃反应1小时。用PBS-Tween充分洗净后，将用含有0.2％BSA、0.2％エマルゲン985、1％蔗糖、1％KCl的0.05M磷酸缓冲液pH7.5(反应用液)稀释2000倍的酶标记抗鼠Igs抗体(DAKO公司制)每孔加100μl，在37℃反应1小时。反应后，用PBS-Tween充分洗净，每孔加入100μl的2，2’-连氮基-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸(ABTS)，在室温反应30分钟后，每孔加入100μl的反应终止液，在主波长415nm副波长490nm下测定了显色水平。
关于判定为阳性的培养上清液，采用以流感B型重组核蛋白抗原(B/山梨/166/98(r-NP/B))为抗原的ELISA进行2次筛选，最终得到了产生与A型流感病毒核蛋白抗原反应，与流感B型核蛋白抗原不反应的抗体的杂交瘤3株(杂交瘤FVA2-3、杂交瘤FVA2-6及杂交瘤FVA2-11)。上述各个杂交瘤根据布达佩斯条约在产业技术综合研究所特许生物保藏中心进行了保藏，杂交瘤FVA2-3的保藏号是FERM BP-10066，杂交瘤FVA2-6的保藏号是FERM BP-10067，杂交瘤FVA2-11的保藏号是FERM BP-10068。
参考例3 碱性磷酸酶标记抗A型流感病毒单克隆抗体的制备使用在上述参考例2中制备的抗A型流感病毒单克隆抗体(FVA2-11)，重复与上述参考例1相同的处理，得到了碱性磷酸酶标记抗A型流感病毒单克隆抗体。
实施例3 同时免疫测定A型流感病毒和B型流感病毒的器具如图2所示，在距离宽5mm、长50mm的硝基纤维素膜(ミリポア公司制)基体2的展开液吸收区5侧的末端16mm和13.5mm的位置上，分别点滴0.7μl含有在实施例2中制备的抗A型流感病毒抗体(FVA2-11)和在参考例2中制备的抗B型流感病毒抗体(FrB1-3)的水溶液在硝基纤维素膜上并使之干燥，作成了检测区6a和6b。进而，在距离基体2的展开液吸收区5侧的末端11mm的位置上点滴抗碱性磷酸酶抗体(ダコ公司制)并使之干燥，作成了展开液确认部10。接着，向基体上点滴5μl在参考例3中制备的碱性磷酸酶标记的抗A型流感病毒抗体(5μg/ml)与在参考例1中制备的碱性磷酸酶标记的抗B型流感病毒抗体(5μg/ml)的混合水溶液，使之干燥，作成了由酶标记试剂垫4构成的标记试剂区。
在宽5mm、长20mm的滤纸(ミリポア公司制)上将100μg作为基质的5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸(BCIP)点滴成宽6.1mm的线条状，并使之干燥制展开液垫3。将上述基体2、展开液垫3、酶标记试剂垫4及展开液吸收垫5(宽10mm、长20mm、厚1mm的滤纸(ミリポア公司制))固定在具有展开液槽11的塑料壳中，制备图3和图4所示的同时免疫测定A型流感病毒和B型流感病毒的器具1。
参考例4同时免疫测定A型流感病毒和B型流感病毒的器具(以往测定器具)使用在实施例3中制成的同时免疫测定A型流感病毒和B型流感病毒的器具1的检测区6a和6b，关于碱性磷酸酶标记抗流感病毒抗体，分别使用购买的抗A型流感病毒单克隆抗体和抗B型流感病毒单克隆抗体，从而作成了同时免疫测定A型流感病毒和B型流感病毒的器具(エスプライン病毒A&B(富士レビオ公司制)；以往的测定器具)。
实施例4 A型流感病毒和B型流感病毒的测定向在上述实施例3中制备的同时免疫测定A型流感病毒和B型流感病毒的器具1(本发明的测定器具)的样品点滴区8中点滴表3所记载的B型流感病毒的亚型试样(作为试样稀释液，使用含有表面活性剂的缓冲液(pH8.0))各30μl之后，将设置在变形构件上的按压部12向下方加压使之变形，通过附设在变形构件上的突起部13将展开液垫3插入展开液槽11中，向展开液垫3供给展开液，开始测定。测定开始15分钟后，根据对象试剂区10的显色确认了展开液展开之后，通过目测测定检测区6a和6b的显色。表3表示出其结果。
表3 B型流感病毒株的测定结果
*由于鸡蛋未驯化，故为采用MDCK培养上清液得到的测定结果另外，作为对照，利用在参考例4中作成的以往测定器具对表3记载的上述试样30μl同样地进行了病毒检测。表3表示出其测定结果。
从结果看，关于以往的测定器具不能检测的B型流感病毒的各种样品，本发明的测定器具能够全部检测。
实施例5使用在上述实施例3中制备的同时测定A型流感病毒和B型流感病毒的器具1(本发明的测定器具)，与实施例6同样地调查了与腺病毒(1～7型)、柯萨奇病毒(A16、B1～B6型)、单纯疱疹病毒1型、埃可病毒(3型、4型、7型、22型、30型)、肠病毒(71型)、流行性腮腺炎病毒、脊髓灰质炎病毒(1～3型)、RS病毒(亚群A、亚群B)、副流感病毒(1～3型)、大肠杆菌、肺炎杆菌、绿脓菌、粘质沙雷氏菌、表皮葡萄球菌、变形杆菌、黄色葡萄球菌、棒杆菌、白喉棒杆菌、白色念珠菌、酿脓链球菌、链球菌属的细菌(群B、C、G、F)、肺炎链球菌、流感嗜血杆菌、单核细胞增多性李斯特氏菌、肺炎支原体、沙眼衣原体、肺炎衣原体的交叉反应性。其结果，与其中的任何病毒或菌都不反应。
权利要求
1.一种抗B型流感病毒单克隆抗体或其抗原结合性片段，其与B型流感病毒的分子量60-75kD的核蛋白发生抗原抗体反应，与A型流感病毒基本上不发生抗原抗体反应。
2.根据权利要求1所述的单克隆抗体或其抗原结合性片段，其由根据布达佩斯条约以保藏号FERM BP-10070进行了国际保藏的杂交瘤FrB1-03、以保藏号FERM BP-10071进行了国际保藏的杂交瘤FrB1-07或者以保藏号FERM BP-10069进行了国际保藏的杂交瘤FVB2-16产生。
3.一种免疫测定器具，该器具是在基体上设置了具有可移动的标记的抗B型流感病毒抗体的标记试剂区、样品点滴区、展开液供给区、展开液吸收区及使抗B型流感病毒抗体固定在基体上的B型流感病毒检测区的器具，上述标记的抗B型流感病毒抗体及固定在检测区中的抗B型流感病毒抗体的至少一种抗体是权利要求1或2所述的单克隆抗体。
4.根据权利要求3所述的免疫测定器具，其中，在标记试剂区中还进一步含有标记的抗A型流感病毒抗体，且在固定了B型流感病毒单克隆抗体的B型流感病毒检测区的近旁还进一步具有固定了A型流感病毒单克隆抗体的抗A型流感病毒检测区。
5.根据权利要求3或4所述的免疫测定器具，其中，标记物是酶，在展开液中和/或展开液供给区的近旁含有针对酶的基质。
全文摘要
本发明公开了特异性高的抗B型流感病毒单克隆抗体及使用了该抗体的、能特异地检测出B型流感病毒的免疫测定器具。本发明的抗B型流感病毒单克隆抗体，与B型流感病毒的分子量60－75kD的核蛋白发生抗原抗体反应，与A型流感病毒基本上不发生抗原抗体反应。
文档编号C12P21/08GK1826355SQ200480021130
公开日2006年8月30日 申请日期2004年7月23日 优先权日2003年7月23日
发明者安住纯一, 山田崇, 本多智惠, 藤井信之 申请人:富士瑞必欧株式会社