编码人表皮生长因子2/neu抗原的合成基因及其用途的制作方法

专利名称：编码人表皮生长因子2/neu抗原的合成基因及其用途的制作方法
技术领域：
本发明一般地涉及癌症的治疗。更具体地，本发明涉及编码人肿瘤相关多肽表皮生长因子2/neu抗原的合成多核苷酸(文中命名为hHER2.opt)，其中所述多核苷酸经密码子最优化，以在人类细胞环境中表达。本发明也涉及编码截短形式的HER2/neu抗原的合成多核苷酸(文中命名为hHER2ECDTM.opt)，其中所述多核苷酸经密码子最优化，以在人类细胞环境中表达。本发明还涉及包含所述合成多核苷酸的重组载体和宿主。本发明也提供了携带hHER2.opt的腺病毒载体和质粒构建体，以及它们在用于预防和治疗癌症的疫苗和药物组合物中的用途。
背景技术：
表皮生长因子2是由HER2/neu原癌基因编码的跨膜肿瘤相关抗原(也称之为c-erbB-2)，它是细胞表面受体表皮生长因子家族的一个成员。HER2基因最初是从大鼠神经成胶质细胞瘤(neuroglioblastoma)中分离的(Shih等，Nature 290261-264(1981))，而后来从人类细胞中克隆并表征(Coussens等，Science2301132-39(1985)；King等，Science 229974-76(1985))。
HER2/neu被进一步归类为受体酪氨酸激酶HER家族的成员，其由参与细胞生长和分化的四个受体组成。HER受体通过作为二聚体结合生长因子配体而有助于维持正常的细胞生长。具体地，人HER2与EGFR家族的其它成员(HER1、HER3和HER4)形成杂二聚体(Klapper等，AdvCancer Res 7725-79(2000))。继hHER2二聚化和酪氨酸自身磷酸化之后，产生了胞浆信号传导分子的停泊位点，并发动了第二信号传导分子的募集。从而发动了胞内信号传导级联，其最终导致了细胞生长中重要的基因的激活。
正常地在多种组织的成人上皮细胞中检测到低水平表达的HER2/neu转录本及所编码的185kD蛋白，所述组织包括皮肤和乳房，以及胃肠组织、生殖组织和泌尿道组织(Press等，Oncogene 5953-962(1990))。胚胎发育期间在相应的胎儿组织中也检测到较高水平的HER2/neu表达(Press等，同前)。
若干观测结果使得HER2抗原成为吸引人的主动特异性免疫疗法的靶。首先，HER2/neu基因在多种恶性肿瘤中是普遍超表达或扩增的，如乳腺癌、卵巢癌、子宫癌、结肠癌和前列腺癌，以及肺腺癌(综述于Disis和Cheever，Adv.Cancer Research 71343-371(1997)中)。HER2/neu的超表达与癌症患者差的预后和较高的复发率有关(Slamon等，Science 244707-712(1989))。人HER2的扩增导致MAP激酶活性和细胞增殖增强，并促成了肿瘤细胞的攻击性行为(Ben-Levy等Embo J 13(14)3302-11(1994))。在肿瘤中观察到的高表达水平的HER2和与正常成人组织相关的低水平形成直接的对照。
另外，许多患有与HER2/neu超表达相关的恶性肿瘤的癌症患者业已具有针对HER2蛋白的免疫应答。业已从乳腺癌和卵巢癌患者中分离到抗-hHER2细胞毒性T淋巴细胞(CTL)(Ioannides等CellImmunol 151(1)225-34(1993)；Peoples等Proc Natl Acad SciUSA 92(14)6547-51(1995))。业已阐释了若干HLA-A2.1-相关hHER2肽，并且能够在体外产生肽特异性的T细胞(Fisk等，CancerRes 57(1)8-93(1997)；Yoshino等，Cancer Res 54(13)3387-90(1994)；Lustgarten等，Hum Immunol 52(2)109-18(1997))。
上述发现证明癌症患者中抗-ErbB-2免疫效应器机制被激活，因而突显了增强此类免疫反应性的潜在益处。利用针对HER2/neu的免疫应答的有效疫苗必须既能将这种免疫性提高到保护和/或预防水平，又能克服自身耐受。
基于以上的叙述，HER2/neu业已作为开发恶性肿瘤免疫学治疗的靶而为人们所追随。抗-HER2单克隆抗体业已作为乳腺癌的疗法而被研究，其中每一抗体途径都证明了不同水平的成功(讨论见Yarden，Oncology 61(supp 12)1-13(2001))。
另外，业已报道了基于DNA和肽的HER2/neu靶向疫苗。Amici等(美国专利No.6,127,344)公开了通过施用表达载体诱导针对HER2/neu的免疫性的方法，所述表达载体包含功能性地连接于人巨细胞病毒启动子的全长人HER2/neu cDNA。Morris等(WO 2004/041065)公开了用树突细胞接种的方法，所述树突细胞由表达非信号传导HER2/neu基因的腺病毒载体修饰过。Cheever和Disis公开了用HER2肽免疫人抗HER2/neu相关的癌症的方法(美国专利No.5,846,538)。另外，业已在啮齿动物模型中研究了基于HER2/neu肽的疫苗(综述见Disis和Cheever，Adv.Cancer Res.71343-71(1997))。
许多疫苗的开发和商业化受到了与在成功转化的宿主生物中获得高表达水平的外源基因相关的困难的阻碍。因此，尽管已鉴定了编码上文所述hHER2蛋白的野生型核苷酸序列，但仍然非常需要开发人HER2蛋白容易的可再生来源，该来源利用经最优化以便在目的宿主细胞中表达的编码hHER2的核苷酸序列，所述来源允许开发有效且不受自身耐受阻碍的癌症疫苗。
发明概述本发明涉及引发或增强针对由人HER2基因表达的蛋白产物的免疫性的组合物和方法，该基因与众多的腺癌相关，包括乳腺癌和卵巢癌。具体地，本发明提供了编码人HER2蛋白或截短形式的人HER2蛋白的多核苷酸，所述截短形式的HER2蛋白包含HER2蛋白的胞外及跨膜结构域(下文记做hHER2ECDTM)，其中所述多核苷酸经密码子最优化，以高水平地在人类细胞中表达。本发明还提供了包含所述合成多核苷酸的基于腺病毒和质粒的载体，并公开了所述载体在用于预防和/或治疗HER2相关癌症的免疫原性组合物和疫苗中的用途。文中所述的多核苷酸比野生型HER2能更有效地引发针对人HER2的细胞和体液免疫应答。
本发明也涉及合成核酸分子(多核苷酸)，其包含编码如SEQ IDNO2中所示的人表皮生长因子2抗原(下文记做hHER2)的核苷酸序列，其中所述合成核酸分子经密码子最优化，以在人类细胞中高水平表达(下文记做hHER2.opt)。本发明还涉及合成核酸分子(多核苷酸)，其包含编码如SEQ ID NO14中所示的人HER2ECDTM的核苷酸序列，其中所述合成核酸分子经密码子最优化，以在人类细胞中高水平表达。可将本文公开的核酸分子转染到所选择的宿主细胞中，其中所述重组宿主细胞在大量水平上为表达的功能性hHER2蛋白(SEQID NO2)或hHER2ECDTM蛋白(SEQ ID NO14)提供了来源。
本发明还涉及合成核酸分子，其编码表达人HER2蛋白的mRNA。本发明这部分优选的方面公开在

图1中，该图显示了编码HER2蛋白(SEQ ID NO2)的DNA分子(SEQ ID NO1)。本发明优选的核酸分子经密码子最优化以在人类细胞中高水平表达。这种优选多核苷酸的序列也含有废除酪氨酸激酶活性的突变(AAA2257GCC，K753A)。不含此突变的核苷酸序列也考虑在本发明之中。
本发明另外涉及合成核酸分子，其编码表达人HER2ECDTM蛋白的mRNA。本发明这部分优选的方面公开在图6A中，该图显示了编码hHER2ECDTM蛋白(SEQ ID NO14)的DNA分子(SEQ ID NO9)。本发明优选的核酸分子经密码子最优化以在人类细胞中高水平表达。
本发明也涉及重组载体和重组宿主细胞，既包括原核的又包括真核的，它们含有本说明书从头到尾所公开的核酸分子。
本发明还涉及在重组宿主细胞中表达经密码子最优化的人HER2蛋白的方法，包括(a)将包含编码人HER2蛋白的合成多核苷酸的载体引入到合适的宿主细胞中，其中所述合成多核苷酸经密码子最优化以在人类细胞中最佳表达；和(b)在允许表达所述人HER2蛋白的条件下培养所述宿主细胞。
本发明也涉及在重组宿主细胞中表达经密码子最优化的人HER2ECDTM蛋白的方法，包括(a)将包含编码人HER2ECDTM蛋白的合成多核苷酸的载体引入到合适的宿主细胞中，其中所述合成多核苷酸经密码子最优化以在人类细胞中最佳表达；和(b)在允许表达所述人HER2ECDTM蛋白的条件下培养所述宿主细胞。
本发明的另一方面为预防或治疗癌症的方法，包括向哺乳动物施用这样的疫苗载体，所述疫苗载体包含合成核酸分子，所述合成核酸分子包含编码如SEQ ID NO2中所示的人表皮生长因子2抗原(hHER2)蛋白或如SEQ ID NO14中所示的人HER2ECDTM蛋白的核苷酸序列，其中所述合成核酸分子经密码子最优化，以在人类细胞中高水平表达。
本发明还涉及腺病毒疫苗载体，其包含这样的腺病毒基因组，所述腺病毒基因组在E1区具有缺失，且在E1区中具有插入片段，其中所述插入片段包含表达盒，所述表达盒包含(a)经密码子最优化的编码人HER2蛋白或人HER2ECDTM蛋白的多核苷酸；和(b)可操作地连接于所述多核苷酸的启动子。
本发明也涉及疫苗质粒，其包含质粒部分和表达盒部分，所述表达盒部分包含(a)编码人HER2蛋白或人HER2ECDTM蛋白的合成多核苷酸，其中所述合成多核苷酸经密码子最优化，以在人类细胞中最佳表达；和(b)可操作地连接于所述多核苷酸的启动子。
本发明的另一方面为保护哺乳动物免患癌症或治疗患有HER2相关癌症的哺乳动物的方法，包括(a)向所述哺乳动物引入第一载体，所述载体包含i)经密码子最优化的编码人HER2蛋白或人HER2ECDTM蛋白的多核苷酸；和ii)可操作地连接于所述多核苷酸的启动子；(b)允许经过预定量的时间；和(c)向所述哺乳动物引入第二载体，所述载体包含i)经密码子最优化的编码人HER2蛋白或人HER2ECDTM蛋白的多核苷酸；和ii)可操作地连接于所述多核苷酸的启动子。
如整个说明书和所附权利要求书中所用的，单数形式的“一个(a)”、“一种(an)”和“所述(the)”包括复数含义，除非上下文清楚地另有说明。
如整个说明书和所附权利要求书中所用的，适用如下定义和缩写术语“启动子”是指DNA链上RNA聚合酶与之结合的识别位点。启动子与RNA聚合酶形成起始复合物，以起始并驱动转录活性。所述复合物可由称之为“增强子”的活化序列或称之为“沉默子”的抑制序列修饰。
术语“盒”是指待由载体表达的核苷酸或基因序列，例如，所述核苷酸或基因序列编码HER2蛋白或HER2ECDTM蛋白。通常，将包含基因序列的盒插入到载体中，所述载体在一些实施方案中提供表达所述核苷酸或基因序列的调控序列。在其它实施方案中，所述核苷酸或基因序列提供了用于其表达的调控序列。在另外的实施方案中，载体提供了一些调控序列，而所述核苷酸或基因序列提供了其它调控序列。例如，载体可提供用于转录所述核苷酸或基因序列的启动子，而所述核苷酸或基因序列提供转录终止序列。可由载体提供的调控序列包括，但不限于增强子、转录终止序列、剪接受体和供体序列、内含子、核糖体结合序列和聚腺苷酸添加序列。所述盒在概念上类似于盒式录音带；每一个盒都有其自身的序列。因此通过互换盒，载体将会表达不同的序列。由于5’和3’端的限制位点，盒能够被容易地插入、除去或为另一盒所替换。
术语“载体”是指可通过其将DNA片段引入到宿主生物或宿主组织中的某些工具。存在多种类型的载体，包括质粒、病毒(包括腺病毒)、噬菌体和粘粒。
就腺病毒载体所用的术语“第一代”形容所述腺病毒载体是复制缺陷型的。第一代腺病毒载体一般具有缺失或失活的E1基因区，并且优选具有缺失或失活的E3基因区。
名称“pV1J-hHER2.opt”是指文中公开的质粒构建体，其包含具有内含子A的人CMV立即早期(IE)启动子、经密码子最优化的全长人HER2基因、源于牛生长激素的聚腺苷酸化和转录终止序列、以及最小pUC主链(见实施例2)。
名称“pV1J-hHER2ECDTM.opt”是指文中公开的质粒构建体，其包含具有内含子A的人CMV立即早期(IE)启动子、经密码子最优化的包含HER2基因胞外和跨膜结构域的截短型人HER2基因、源于牛生长激素的聚腺苷酸化和转录终止序列、以及最小pUC主链(见实施例2)。
名称“pV1J-hHER2.wt”是指如上文所述的构建体，只是除了所述构建体包含野生型全长人HER2基因而非经密码子最优化的人HER2基因。
名称“pV1J-hHER2ECDTM.wt”是指如上文所述的构建体，只是除了所述构建体包含野生型截短的人HER2基因，其中所述截短的基因包含编码HER2蛋白胞外和跨膜结构域的核苷酸序列，而不是经密码子最优化的全长人HER2基因。
名称“MRKAd5-hHER2.opt”、“MRKAd5-hHER2ECDTM.opt”和“MRKAd5-hHER2.wt”是指文中公开的三种构建体，它们包含缺失E1和E3区的Ad5腺病毒基因组。在所述“MRKAd5-hHER2.opt”构建体中，E1区被替换为与E1处于平行方向的经密码子最优化的全长人HER2基因，所述基因处于无内含子A的人CMV启动子的控制之下，接下来是牛生长激素聚腺苷酸化信号。所述“MRKAd5-hHER2ECDTM.opt”构建体基本上如上所述，只是除了Ad5基因组E1区被替换为经密码子最优化的截短形式的人HER2基因之外，所述截短型HER2基因包含编码HER2受体胞外和跨膜结构域的核苷酸序列。所述“MRKAd5-hHER2.wt”构建体基本上如上所述，只是除了Ad5基因组E1区被替换为野生型全长人HER2序列之外(见实施例11)。
术语“有效量”是指引入足够的疫苗组合物，以产生足够水平的多肽，从而产生免疫应答。本领域技术人员认识到这种水平是可变的。
术语“治疗”既指治疗性治疗又指预防性或防范性措施。需要治疗的那些包括已经患有紊乱的以及倾向患有有所述紊乱的或有待预防所述紊乱的那些。
“紊乱”是任何将得益于文中所述方法或疫苗和免疫原性组合物治疗的状况。该术语包括慢性和急性紊乱或疾病，包括使得哺乳动物易患所研究紊乱的那些病理状况。本发明的方法和疫苗旨在治疗与异常HER2/neu相关的表达或信号传导有关的紊乱或状况，包括但绝不限于乳腺癌、结肠直肠癌、胃癌、卵巢癌和肺癌。
“保守氨基酸取代”是指一个氨基酸残基被另一个化学上相似的氨基酸残基所替换。此类保守取代的实例有用一个疏水残基(异亮氨酸、亮氨酸、缬氨酸或甲硫氨酸)取代另一个；用一个极性残基取代具有相同电荷的另一个极性残基(如精氨酸取代赖氨酸；谷氨酸取代天冬氨酸)。
“hHER2.wt”和“hHER2.opt”分别指人表皮生长因子2抗原和经密码子最优化的人表皮生长因子2抗原。
“hHER2ECDTM.wt”和“hHER2ECDTM.opt”分别指截短型人表皮生长因子2抗原和经密码子最优化的截短型人表皮生长因子2抗原。截短形式的HER2、“hHER2ECDTM.wt”和“hHER2ECDTM.opt”包含人HER2蛋白的胞外和跨膜结构域。
术语“哺乳动物”是指任何哺乳动物，包括人类。
缩写“Ag”是指抗原。
缩写“Ab”和“mAb”分别是指抗体和单克隆抗体。
缩写“ORF”是指基因的可读框。
附图简述图1显示了编码人HER2蛋白的经密码子最优化的多核苷酸(hHER2.opt，SEQ ID NO1)的核苷酸序列。见实施例1。图表B显示了人HER2蛋白推断的氨基酸序列(SEQ ID NO2)。
图2显示了通过ELISPOT和胞内染色(ICS)分析鉴定人HER2蛋白中的免疫优势T细胞表位。分析了用Ad5-hHER2免疫的BALB/c小鼠对HER2特异性的细胞免疫的诱导。分泌IFN-γ的抗-人HER2T细胞的数目是利用肽库或单个肽通过对来自小鼠组别(示于第一栏)的脾细胞进行ELISPOT测定的。所示数据代表数个独立实验。值表达为斑点形成集落数(SFC)/106总脾细胞减去在肽不存在时所测定背景值(一般小于10SFC/106总脾细胞)。相当于没有抗原肽的对照试验中所测背景的三倍以上的数字被认为是阳性值，并以粗体标示。分泌IFN-γ的CD4+或CD8+T细胞的频率由ICS测量。所示数据代表数个独立实验。值表达为1000×[(IFN-γCD3+和CD4+或CD8+)/(CD3+和CD4+或CD8+)]。高于1％的值被认为是阳性的，并以粗体标示。测定中所用肽库或单个肽所含序列示于左侧。数字是指人HER2蛋白的氨基酸残基位置。
图3显示了在(A)人胚肾HEK-293细胞和(B)小鼠成肌细胞C2C7中转染后hHER2的体外表达。数据表达为减去了由空pV1JnsA质粒所产生的信号的通道荧光几何平均值。对于C2C7细胞，数据根据pEGFPDNA的转染效率进行了标准化。
图4显示了BALB/c小鼠中针对人HER2的免疫应答。图表(A)显示经密码子最优化的HER2与野生型HER2相比，产生了显著提高的ELISPOT值。显示了用质粒pV1J-hHER2.wt或pV1J-hHER2.opt(50μg/剂，四头肌电注射(electroinject))免疫四组每组两只小鼠的结果。末次注射后两周，利用肽hNeu15.3(aa 63-71，包括CD8+表位)、hNeu301(aa 1202-1214，包括CD8+表位)和hNeu42(aa 165-179，包括CD4+表位)介由IFN-γELISPOT测定确定了小鼠脾细胞中分泌IFN-γ的T细胞的频率。显示了来自2.5×105和5×105个脾细胞、各测试量重复两份的结果。平均值通过减去不存在肽时所测的背景水平计算(一般小于10SFC/106总脾细胞)。结果表达为SFC数/106总脾细胞。图表(B)显示pV1J-hHER2.opt与pV1J-hHER2.wt相比引发了显著提高的IgG1和IgG2a体液应答。在第6周(首次免疫前一天，放血前)和第14周(末次注射后两周)从用pV1J-hHER2.wt或pV1J-hHER2.opt质粒DNA免疫的4只小鼠的组中收集血清样品。利用hHER2二聚体胞外结构域(HER2-ECD)作为靶抗原通过ELISA测量了来自各组小鼠的血清集合库的抗-hHER2抗体滴度。利用AP缀合的山羊抗-小鼠IgG1或IgG2a检测结合的小鼠抗体。
图5显示了由pV1J-HER2和Ad5-HER2免疫小鼠所引发的p185特异性T细胞应答的比较。于6和9周龄用pV1J-hHER2.wt DNA(50μg/剂，四头肌注射)，接着进行电刺激，或用Ad5-hHER2.wt免疫野生型BALB/c小鼠和超表达大鼠HER2的BALB/c转基因小鼠(标示为NeuT，见Lucchini等，Cancer Lett 64(3)203-9(1992))。在12周龄时，利用所示的肽由小鼠库通过ELISPOT分析测定分泌IFN-γ的抗-人细胞的数目。所示数据代表数个独立实验。值如图1中那样表达。
图6图表A显示了编码截短型人HER2蛋白的经密码子最优化的多核苷酸(hHER2ECDTM.opt，SEQ ID NO9)的核苷酸序列，所述蛋白包含HER2蛋白的胞外和跨膜结构域。图表B显示了编码HER2蛋白胞外和跨膜结构域的第二多核苷酸，所述第二多核苷酸包含“野生型”核苷酸序列，其未经密码子最优化(hHER2ECDTM.wt，SEQ ID NO10)。
图7显示了在用表达人抗原HER2、CEA和EpCAM的三种质粒混合物免疫的猕猴中所诱导的细胞介导的应答的分析，所述质粒包含经密码子最优化以在人类细胞中高水平表达的核苷酸序列。然后用表达三种抗原中每一种的野生型序列的三种Ad5载体的混合物免疫相同的动物。一年内每个月通过IFN-γELISPOT测量针对高度同源(98.2％序列相似性)的猕猴HER2蛋白的细胞介导的免疫应答。值表达为SFC/106PBMC减去不存在肽时测定的背景值。与在无抗原肽的对照实验中所测背景显著不同(p＜0.05)、且比随意选取的阈值55SFC/106PBMC更高的值以粗体标示。
图8显示了通过pV1J-hHER2opt和pV1J-hHER2ECDTM.opt免疫在小鼠中所引发的细胞介导的免疫应答的比较。值是指通过ELISPOT所测的分泌IFNγ的脾细胞的频率。所示数据来源于三只动物，并代表数个独立实验。值表达为SFC/106总脾细胞减去不存在肽时测定的背景值(一般小于5SFC/106总脾细胞)。与在无抗原肽的对照实验中所测背景显著不同(p＜0.05)、且比随意选取的阈值25SFC/106脾细胞更高的值以粗体标示。
发明详述人表皮生长因子2(hHER2)通常与许多不同类型的肿瘤相关，包括乳腺癌、卵巢癌、胃癌和结肠癌。本发明涉及引发或增强对hHER2基因表达的蛋白产物的免疫性的组合物和方法，其中异常hHER2表达与癌或其发展有关。异常hHER2表达与癌的相关并不要求hHER2蛋白在肿瘤组织发育的所有时间点都在其中表达，因为异常hHER2表达可能在肿瘤起始之时存在，而到肿瘤进程后期不可检测，或者反之亦然。
为此，提供了编码全长人HER2蛋白或文中称之为HER2ECDTM的截短型人HER2蛋白的合成DNA分子。所述截短型HER2包含人HER2蛋白的胞外和跨膜结构域。设计所述合成DNA分子的密码子，以便利用计划宿主细胞偏好的密码子，该宿主细胞在优选的实施方案中为人类细胞。所述合成分子可用于开发基于质粒的疫苗或重组腺病毒，它们通过中和性抗体或细胞介导的免疫性提供抗HER2相关癌症的有效免疫预防。所述合成分子可用作为免疫原组合物。本发明提供了这样的多核苷酸，当将其直接在体内引入到脊椎动物(包括哺乳动物如灵长类和人)中时，在动物中诱导所编码蛋白的表达。
业已报道过野生型人HER2核苷酸序列(Coussens等，Science2301132-39(1985)；King等，Science 229974-76(1985))。本发明提供了编码全长人HER2蛋白或包含HER2蛋白胞外和跨膜结构域的截短型人HER2蛋白HER2ECDTM的合成DNA分子。本发明的合成分子包含这样的核苷酸序列，其中改变了至少一个核苷酸，以便使用人类细胞偏好的密码子，从而允许hHER2或hHER2ECDTM在人宿主细胞中高水平表达。所述合成分子可用作为hHER2或hHER2ECDTM蛋白的来源，其可用在癌症疫苗中，以通过中和性抗体和细胞介导的免疫性提供抗hHER2相关癌的有效免疫预防。备选地，所述合成分子可用作为DNA疫苗或腺病毒疫苗的基础。
四个可能核苷酸碱基的“三联体”密码子能够以超过60种变体形式存在。由于这些密码子提供仅仅20个不同氨基酸(以及转录起始和终止)的信息，所以有些氨基酸可由不止一个密码子编码，即一种称之为密码子冗余的现象。由于尚不完全清楚的原因，备选密码子并非均一地存在于不同类型细胞的内源DNA中。事实上，对于特定类型细胞中的某些密码子，似乎存在着可变的天然的等级体系或“偏好”。作为一个实例，氨基酸亮氨酸受包括CTA、CTC、CTG、CTT、TTA和TTG在内的六个DNA密码子中的任何一个指令。微生物基因组密码子频率的详尽分析已揭示大肠杆菌(E.coli)的内源DNA最常见地含有CTG亮氨酸指令密码子，而酵母和粘菌的DNA最常见地包括TTA亮氨酸指令密码子。考虑到这种等级体系，通常认为实现大肠杆菌宿主高水平表达富含亮氨酸的多肽的可能性将在某种程度上取决于密码子使用的频率。例如，很可能富含TTA密码子的基因在大肠杆菌中将不佳地表达，而富含CTG的基因或许将会在此宿主中高度表达。类似的，在酵母宿主细胞中表达富含亮氨酸的多肽的偏好密码子将会是TTA。
密码子偏好现象对于重组DNA技术的意义是一目了然的，且此现象可用来解释许多以前未能在成功转化的宿主生物中实现外源基因高表达水平的失败，即不怎么“偏好”的密码子可能重复的存在于插入基因之中，且宿主细胞表达机器可能不那么有效地运作。这种现象提示经设计以包括计划宿主细胞的偏好密码子的合成基因为重组DNA技术实践提供了最佳形式的外来遗传材料。从而，本发明的一个方面为经密码子最优化以在人类细胞中高水平表达的人HER2基因。在本发明优选的实施方案中，业已发现使用编码相同蛋白序列的备选密码子可以克服在人类细胞中表达外源hHER2蛋白的约束。本发明的另一个方面是截短型人HER2基因hHER2ECDTM，它经密码子最优化以在人宿主细胞中高水平表达，所述截短型HER2基因包含编码人HER2胞外和跨膜结构域的核苷酸序列。
根据本发明，人HER2基因序列和人HER2ECDTM基因序列被转换成与野生型等同体相比具有相同翻译序列、但具有备选密码子使用的多核苷酸序列，如Lathe，“Synthetic Oligonucleotide ProbesDeduced from Amino Acid Sequence DataTheoretical andPractical Considerations”J.Molec.Biol.1831-12(1985)所述，特此并入作为参考。所述方法通常由以下步骤组成鉴定野生型序列中一般与高表达的人类基因无关的密码子，并把其替换为最佳密码子，以在人类细胞中高表达。所述最佳密码子在这里称之为“人类偏好的”密码子。然后检查所述新基因序列中由密码子替换所产生的不期望的序列(如“ATTTA”序列、无意产生的内含子剪接识别位点、不必要的限制酶位点、高GC含量等)。不期望的序列通过用编码相同氨基酸的不同密码子取代既有的密码子而消除。然后测试合成的基因片段提高的表达。
利用上文所述的方法创建合成的人HER2和人HER2ECDTM的基因序列，得到了包含最优化密码子以在人类细胞中高水平表达的全长和截短型基因。尽管上述方法提供了我们设计密码子最优化基因以用于癌症疫苗的方法学的概述，但本领域技术人员理解可通过所述方法的微小变动或所述序列的微小变动而实现相似的疫苗功效或提高的基因表达。本领域技术人员也将会认识到可以构建另外的DNA分子，以提供人类细胞中hHER2或hHER2ECDTM的高水平表达，其中仅仅一部分所述DNA分子的密码子是经密码子最优化的。本发明的核酸分子基本上不含其它核酸。
相应地，本发明涉及包含编码人HER2蛋白(例如，SEQ ID NO2中所示人HER2蛋白或人HER2蛋白的生物学活性片段或突变体形式)的核苷酸序列的合成多核苷酸，所述多核苷酸序列包含经最优化以在人类宿主中表达的密码子。所述突变体形式的hHER2蛋白包括但不限于保守氨基酸取代、氨基末端截短、羧基末端截短、缺失或添加。任何这样的生物学活性片段和/或突变体将编码至少基本上模拟如SEQ ID NO2中所示hHER2蛋白的免疫学性质的蛋白或蛋白片段之一。本发明的合成多核苷酸编码表达功能性人HER2蛋白的mRNA分子，从而可用于开发治疗性或预防性癌症疫苗。
本发明优选的多核苷酸是包含编码截短型人HER2ECDTM蛋白(SEQ ID NO14)的核苷酸序列的多核苷酸，所述多核苷酸序列包含经最优化以在人类宿主中表达的密码子。本发明尤其优选的多核苷酸包含如SEQ ID NO9中所示的核苷酸序列。
本发明也涉及合成核酸分子(多核苷酸)，其包含编码表达人HER2蛋白(例如，SEQ ID NO2中所示的全长人HER2蛋白，或截短型HER2ECDTM蛋白，例如，SEQ ID NO14中所示的HER2ECDTM序列)的mRNA的核苷酸序列。本发明的合成核酸分子经密码子最优化以在人类宿主细胞中高水平表达。
同样包括在本发明范围之内的是密码子最优化了的多核苷酸，其包含编码与SEQ ID NO2的氨基酸序列具有至少90％同一性的变体HER2多肽的核苷酸序列，所述变体HER2多肽在SEQ ID NO2的整个长度范围内可包括最多达Na个氨基酸改变，其中Na为最大氨基酸改变数，并由如下公式计算Na＝Xa-(XaY)，其中Xa为SEQ ID NO2中的氨基酸总数，而Y值为0.90，其中在从Xa中减去Xa和Y的乘积之前，将任何这样非整数的乘积四舍五入为最接近的整数。同样地，本发明也考虑经密码子最优化的编码如SEQ ID NO14中所示的HER2ECDTM多肽的变体的核苷酸序列。
本发明也涉及重组载体和重组宿主细胞，既包括原核的又包括真核的，它们含有本说明书从头到尾所公开的核酸分子。本发明的合成DNA分子、相关载体和宿主可用于开发癌症疫苗。
本发明优选的DNA分子包含文中公开的如SEQ ID NO1(示于图1)所示的核苷酸序列，其编码示于图2且如SEQ ID NO2中所示的人HER2蛋白。如SEQ ID NO1中所示的核苷酸序列经密码子最优化以在人类细胞中最佳表达。为避免PCR扩增问题，在本发明的这种实施方案中，对hHER2序列3601和3805位之间采取不太严格的最优化设计，这降低了GC含量，而同时保留了相同的氨基酸组成。见实施例5。
本发明另外优选的DNA分子包含文中公开的如SEQ ID NO9(示于图6A)所示的核苷酸序列，其编码如SEQ ID NO14中所示的人HER2ECDTM蛋白。如SEQ ID NO9中所示的核苷酸序列经密码子最优化以在人类细胞中最佳表达。
本领域技术人员将会意识到可设计经密码子最优化以在人类细胞中高水平表达的其它HER2序列，前提是将一个或多个密码子改变成人类偏好的密码子。优选构成本发明的合成HER2核苷酸序列的至少大约80％的密码子是人类偏好的密码子。更优选至少大约85％的密码子是人类偏好的，并且甚至更优选至少大约90％的密码子是人类偏好的。
本发明也包括SEQ ID NO1的生物学活性片段或突变体，其编码表达人HER2蛋白的mRNA。任何这样的生物学活性片段和/或突变体将编码至少基本上模拟hHER2蛋白(包括但不限于如SEQ ID NO2中所示的hHER2蛋白)的药理学性质的蛋白或蛋白片段之一。任何这样的多核苷酸包括但不必然限于核苷酸取代、缺失、添加、氨基末端截短和羧基末端截短。本发明的突变编码在真核细胞中表达功能性hHER2蛋白的mRNA分子，从而可用于癌症疫苗开发。
本发明也涉及合成的经密码子最优化的编码hHER2蛋白或hHER2ECDTM蛋白的DNA分子，其中所述合成DNA的核苷酸序列显著不同于SEQ ID NO1或SEQ ID NO9的核苷酸序列，但仍然编码如SEQ ID NO2中所示的hHER2蛋白或如SEQ ID NO14中所示的hHER2ECDTM蛋白。这样的合成DNA旨在落入本发明的范围之内。因此，本发明公开了可产生表达相同蛋白的众多DNA分子的密码子冗余。同样包括在本发明范围之内的是DNA序列中基本上不改变所表达蛋白的最终物理性质的突变。例如，用缬氨酸取代亮氨酸、用精氨酸取代赖氨酸、或用天冬酰胺取代谷氨酰胺可能并不导致多肽功能的变化。
已知可以改变编码肽的DNA序列，以使之编码具有不同于天然存在的肽的性质的肽。改变DNA序列的方法包括但不限于定点诱变。改变的性质的实例包括但不限于酶对底物或受体对配体的亲和力的改变。
本发明也涉及hHER2opt和hHER2ECDTMopt的融合构建体，包括但不限于表达连接于各种标记的部分人HER2蛋白的融合构建体，所述标记包括但绝不限于GFP(绿色荧光蛋白)、MYC表位、GST和Fc。任何这样的融合构建体可在目的细胞系中表达，并用于筛选文中公开的人HER2蛋白的调节剂。同样考虑的是经构建以增强对人HER2的免疫应答的融合构建体，包括但不限于DOM、hsp70和LTB。
本发明还涉及包含本说明书从头到尾公开的合成核酸分子的重组载体。这些载体可由DNA或RAN组成。对于多数克隆目的，优选DNA载体。一般的载体包括质粒、修饰的病毒、杆状病毒、噬菌体、粘粒、酵母人工染色体以及能够编码hHER2蛋白或hHER2ECDTM蛋白的其它形式的游离型或整合的DNA。确定用于特定基因转移或其它用途的合适载体是充分落入技术人员的技术范围之内的。
含有经密码子最优化的编码hHER2蛋白的DNA的表达载体可用于在重组宿主细胞中高水平表达hHER2。另外，含有经密码子最优化的编码hHER2ECDTM蛋白的DNA的表达载体可用于在重组宿主细胞中高水平表达hHER2ECDTM。表达载体可包括但不限于克隆载体、修饰的克隆载体、特定设计的质粒或病毒。同样，如果需要，许多细菌表达载体可用于在细菌细胞中表达重组hHER2或hHER2ECDTM。另外，许多真菌细胞表达载体可用于在真菌细胞中表达重组hHER2或hHER2ECDTM。此外，许多昆虫细胞表达载体可用于在昆虫细胞中表达重组蛋白。
本发明也涉及用包含本发明的核酸分子的载体转化或转染的宿主细胞。重组宿主细胞可以是原核或真核的，包括但不限于细菌如大肠杆菌；真菌细胞如酵母；哺乳动物细胞，包括但不限于牛、猪、猴及啮齿动物起源的细胞系；以及昆虫细胞，包括但不限于果蝇(Drosophila)和蚕来源的细胞系。这样的重组宿主细胞可在合适的条件下培养以产生hHER2、hHER2ECDTM或其生物学等同形式。在本发明优选的实施方案中，宿主细胞为人的。如文中所定义的，术语“宿主细胞”并不旨在包括处于转基因人类、转基因人胎儿或转基因人胚胎体中的宿主细胞。
如上文所指出的，含有编码hHER2蛋白或hHER2ECDTM蛋白的DNA的表达载体可用于在重组宿主细胞中表达hHER2或hHER2ECDTM。因此，本发明的另一个方面是在重组宿主细胞中表达人HER2蛋白或人HER2ECDTM蛋白的方法，包括(a)将包含经密码子最优化的编码人HER2或人HER2ECDTM的核酸的载体引入到合适的人类宿主细胞中；和(b)在允许表达所述人HER2蛋白或所述人HER2ECDTM蛋白的条件下培养所述宿主细胞。
本发明这方面优选的实施方案提供了在重组宿主细胞中表达人HER2蛋白的方法，包括(a)将包含如SEQ ID NO1中所示的核酸的载体引入到合适的人类宿主细胞中；和(b)在允许表达所述人HER2蛋白的条件下培养所述宿主细胞。
本发明这方面的另一个优选实施方案提供了在重组宿主细胞中表达人HER2ECDTM蛋白的方法，包括(a)将包含如SEQ ID NO9中所示的核酸的载体引入到合适的人类宿主细胞中；和(b)在允许表达所述人HER2ECDTM蛋白的条件下培养所述宿主细胞。
继在宿主细胞中表达hHER2或hHER2ECDTM之后，可将hHER2或hHER2ECDTM蛋白回收为活性形式的蛋白。存在着若干的蛋白纯化方法并适合于使用。可通过各种组合或单独应用的盐分级分离、离子交换层析、大小排阻层析、羟基磷灰石吸附层析和疏水相互作用层析从细胞裂解物和提取物中纯化重组hHER2蛋白或HER2ECDTM蛋白。另外，可使用由特异于全长hHER2蛋白或hHER2蛋白多肽片段的单克隆或多克隆抗体制备的免疫亲和柱从其它细胞蛋白中分离重组蛋白。
可以将本发明的核酸组装到表达盒中，所述表达盒包含设计用以在人类细胞中提供所述蛋白有效表达的序列。在本发明的一个实施方案中，所述盒含有全长经密码子最优化的hHER2基因，连同与之可操作地连接的相关转录和翻译控制序列如启动子以及终止序列。在本发明的第二实施方案中，所述盒含有截短型HER2基因HER2ECDTM，其编码人HER2蛋白的胞外和跨膜结构域。在优选的实施方案中，启动子为不含内含子A序列的巨细胞病毒启动子(CMV)，尽管本领域技术人员将会认识到可以使用许多其它已知的启动子如强免疫球蛋白或其它真核基因启动子的任何一个。优选的转录终止子是牛生长激素终止子，尽管也可以使用其它已知的转录终止子。尤其优选CMV-BGH终止子组合。
根据本发明，将hHER2opt或hHER2ECDTMopt表达盒插入到载体中。载体优选为腺病毒载体，尽管也可以使用连接于启动子的线性DNA或者其它载体，如腺伴随病毒或修饰的痘苗病毒、逆转录病毒或慢病毒载体。
如果所选的载体为腺病毒，则所述载体优选为所谓的第一代腺病毒载体。这些腺病毒载体特征在于具有非功能性的E1基因区，且优选具有缺失的腺病毒E1基因区。在有些实施方案中，将表达盒插入到腺病毒E1基因正常定位于此的位置上。另外，这些载体任选地具有有非功能性或缺失的E3区。优选所用的腺病毒基因组在E1和E3区都缺失(ΔE1ΔE3)。所述腺病毒可在已知的表达病毒E1基因的细胞系如293细胞或PERC.6细胞、或在由293或PERC.6细胞衍生的被瞬时或稳定转化以表达附加蛋白的细胞系中增殖。例如，当使用具有可控基因表达的构建体，如四环素可调控的启动子系统时，细胞系可表达参与此调控系统的组分。这样的细胞系的一个实例是T-Rex-293；其它的是本领域公知的。
为便于操纵腺病毒载体，所述腺病毒可以是穿梭质粒的形式。本发明也涉及包含质粒部分和腺病毒部分的穿梭质粒载体，所述腺病毒部分包含具有缺失的E1和任选地E3缺失的腺病毒基因组，并具有插入的包含经密码子最优化的人HER2或经密码子最优化的hHER2ECDTM的表达盒。在优选的实施方案中，存在侧接所述质粒的腺病毒部分的限制位点，从而能够容易地除去所述腺病毒载体。所述穿梭质粒可以在原核细胞或真核细胞中复制。
在本发明优选的实施方案中，将所述表达盒插入到pMRKAd5-HVO腺病毒质粒(见Emini等，WO 02/22080，特此并入作为参考)中。该质粒包含缺失了E1和E3区的Ad5腺病毒基因组。所述pMRKAd5-HVO质粒的设计较之于现有的腺病毒载体(adenovector)得到了改善，其通过将5’顺式作用包装区进一步延伸到E1基因中，以整合入发现对于最优化病毒包装重要的元件，从而导致增强病毒扩增。有利地，这种增强的腺病毒载体继高度传代繁殖后能够维持遗传稳定性。
用于制备和纯化DNA构建体的分子生物学标准技术使得制备本发明的腺病毒、穿梭质粒和DNA免疫原成为可能。
根据本发明，已经确定文中所述的经密码子最优化以在人类细胞中高水平表达的合成cDNA分子(如SEQ ID NO1和SEQ ID NO9)，比相应的野生型序列以更高的效率表达。另外，本文显示hHER2opt比hHER2更具免疫原性，并且在引发细胞和体液免疫应答方面更为有效。
因此，上文所述的载体可用在免疫原性组合物和疫苗中，以用于预防与异常HER2表达相关的腺癌的发展和/或治疗既有的癌症。本发明的载体通过排除在成功转化的宿主生物中获得高表达水平的外源HER2的困难，允许疫苗开发和商业化。为此，本发明的一个方面是预防或治疗HER2相关癌症的方法，包括向哺乳动物施用包含合成的经密码子最优化的核酸分子的疫苗载体，所述合成的经密码子最优化的核酸分子包含编码如SEQ ID NO2中所示的人HER2蛋白或如SEQID NO14中所示的人HER2ECDTM蛋白的核苷酸序列.
根据上文所述的方法，可在任何哺乳动物中施用所述疫苗载体以治疗或预防癌症。在本发明优选的实施方案中，所述哺乳动物为人。
另外，本领域技术人员可以选择任何类型的载体以用于所述的治疗和预防方法。优选地，所述载体为腺病毒载体或质粒载体。在本发明优选的实施方案中，所述载体为腺病毒载体，其包含在腺病毒E1区具有缺失且在腺病毒E1区具有插入片段的腺病毒基因组，其中所述插入片段包含表达盒，所述表达盒包含(a)合成的经密码子最优化的编码人HER2蛋白或人HER2ECDTM蛋白的多核苷酸；和(b)可操作地连接于所述多核苷酸的启动子。
本发明还涉及腺病毒疫苗载体，其包含在E1区具有缺失且在E1区具有插入片段的腺病毒基因组，其中所述插入片段包含表达盒，所述表达盒包含(a)合成的经密码子最优化的编码人HER2蛋白或人HER2ECDTM蛋白的多核苷酸；和(b)可操作地连接于所述多核苷酸的启动子。
在本发明这方面优选的实施方案中，所述腺病毒载体为Ad5载体。
在本发明其它优选的实施方案中，所述载体为Ad6载体或Ad24载体。
在另一个方面，本发明涉及包含质粒部分和表达盒部分的疫苗质粒，所述表达盒包含(a)合成的经密码子最优化的编码人HER2蛋白的多核苷酸；和(b)可操作地连接于所述多核苷酸的启动子。
本发明也涉及包含质粒部分和表达盒部分的疫苗质粒，所述表达盒包含(a)合成的经密码子最优化的编码人HER2ECDTM蛋白的多核苷酸；和(b)可操作地连接于所述多核苷酸的启动子。
在本发明的有些实施方案中，本文公开的重组腺病毒疫苗与基于质粒的多核苷酸疫苗用于多种致敏(prime)/加强组合，以诱导增强的免疫应答。在这种情况下，两个载体以“致敏和加强”方案施用。例如，施用第一类型的载体，然后在预定量的时间后，例如2周、1个月、2个月、6个月或其它合适的间隔，施用第二类型的载体。优选所述载体携带编码相同多核苷酸或多核苷酸组合的表达盒。在也使用质粒DNA的实施方案中，优选所述载体含有一个或多个为哺乳动物或昆虫细胞所识别的启动子。在优选的实施方案中，所述质粒将含有强启动子，例如但不限于CMV启动子。待表达的合成人HER2基因、HER2ECDTM基因或其它基因将与这样的启动子相连。这种质粒的实例将是所述的哺乳动物表达质粒V1Jns(J.Shiver等in DNA Vaccines，M.Liu等编辑，N.Y.Acad.Sci.，N.Y.，772198-208(1996)，特此并入作为参考)。
如上所述，腺病毒载体疫苗和质粒疫苗可作为单一治疗方案的一部分施用于脊椎动物，以诱导免疫应答。为此，本发明涉及保护哺乳动物免患癌症的方法，包括(a)向所述哺乳动物引入第一载体，其包含i)合成的经密码子最优化的编码人HER2蛋白或人HER2ECDTM的多核苷酸；和ii)可操作地连接于所述多核苷酸的启动子；(b)允许经过预定量的时间；和(c)向所述哺乳动物引入第二载体，其包含i)合成的经密码子最优化的编码人HER2蛋白或人HER2ECDTM的多核苷酸；和ii)可操作地连接于所述多核苷酸的启动子。
在上文所述保护方法的一个实施方案中，第一载体为质粒而第二载体为腺病毒载体。在备选的实施方案中，第一载体为腺病毒载体而第二载体为质粒。
本发明还涉及治疗患有HER2相关癌症的哺乳动物的方法，包括(a)向所述哺乳动物引入第一载体，其包含i)合成的经密码子最优化的编码人HER2蛋白或人HER2ECDTM蛋白的多核苷酸；和ii)可操作地连接于所述多核苷酸的启动子；(b)允许经过预定量的时间；和(c)向所述哺乳动物引入第二载体，其包含i)合成的经密码子最优化的编码人HER2蛋白或人HER2ECDTM蛋白的多核苷酸；和ii)可操作地连接于所述多核苷酸的启动子。
在上文所述治疗方法的一个实施方案中，第一载体为质粒而第二载体为腺病毒载体。在备选的实施方案中，第一载体为腺病毒载体而第二载体为质粒。
待引入疫苗受体的可表达DNA或转录的RNA的量将部分地取决于所用启动子的强度和所表达的基因产物的免疫原性。一般而言，将大约1ng到100mg且优选大约10μg到300μg免疫或预防有效剂量的质粒疫苗载体直接施用于肌肉组织。重组腺病毒的有效剂量为大约106-1012颗粒，且优选大约107-1011颗粒。也考虑皮下注射、皮内引入、透皮按压以及其它施用方式如腹膜内、静脉内或吸入递送。也考虑可提供加强接种。肠胃外施用，如静脉内、肌内、皮下或与肠胃外引入本发明的疫苗同时或顺序地进行的利用佐剂如白细胞介素12蛋白的其它施用方式也是有利的。
本发明的疫苗载体可以是裸露的，即未与任何影响受体免疫系统的蛋白、佐剂或其它试剂结合。在这种情况下，期望疫苗载体处于生理学可接受的溶液之中，例如但不限于无菌盐水或无菌缓冲盐水中。备选地，与本发明的疫苗或免疫原性组合物一起施用免疫刺激剂如佐剂、细胞因子、蛋白或其它载体可能是有利的。因此，本发明包括此类免疫刺激剂与本发明的组合物和方法联合的用途。如本文所用的免疫刺激剂实质上是指增强或加强针对外源抗原的免疫应答(抗体和/或细胞介导的)的任何物质。所述免疫刺激剂可以以DNA或蛋白的形式施用。可采用许多免疫刺激剂的任何一种与本发明的疫苗和免疫原性组合物联合，所述免疫刺激剂包括但不限于GM-CSF、IFNα、破伤风类毒素、IL12、B7.1、LFA-3和ICAM-1。所述免疫刺激剂是本领域所熟知的。也可以使用有助于DNA细胞吸收的试剂，例如但不限于钙离子。这些试剂一般称为转染促进试剂和药学上可接受的载体。本领域技术人员将能够确定特定的免疫刺激剂或药学上可接受的载体，以及合适的施用时间和施用方式。
为描述和公开就本发明而言可能用到的方法学和材料，特此将文中提及的所有出版物并入作为参考。此处绝不应解释为承认本发明无权借助于优先权发明而早于这些公开内容。
尽管已参照附图描述了本发明的优选实施方案，但应当理解本发明不限于那些确切的实施方案，且其中本领域技术人员可实现多种变动和修饰而不会偏离如所附权利要求书中所限定的本发明的范围或精神。
如下实施例阐释但并非限制本发明。
实施例1人HER2最优化的密码子序列全长hHER2.opt编码序列由BIONEXUS(Bionexus Inc.OaklandCA.)合成和组装，并克隆进pCR-平端载体(Invitrogen，荷兰)中。利用寡核苷酸构建hHER2.opt cDNA，并通过PCR组装。对于文中描述的许多实验，所用的hHER2.opt核苷酸序列在其5’-末端携带最优化了的Kozak序列，完整的核苷酸序列示于SEQ ID NO11之中。
另外，通过用GCA替换密码子AAA，用丙氨酸取代结合ATP的赖氨酸残基753(K753A)。该突变废除了相应蛋白的酪氨酸激酶活性，并取消了人(Messerle等Mol Cell Endocrinol 105(1)1-10(1994))或大鼠HER2(Ben Levi等，同前)下游的信号传导事件及其所致的致癌活性。另外，激酶缺陷型K756A突变体能够灭活共表达的致癌性hHER2.wt的信号传导活性。
实施例2质粒构建体pV1J-hHER2.wt人HER2野生型编码序列是通过PCR由质粒pLTR-2/erb-B2(由P.DiFiore馈赠，欧洲肿瘤学研究所(EuropeanInstitute of Oncology)，米兰，意大利；DiFiore等Science 237(4811)178-82(1987))利用引物hNeu.forl(5’-CCAGTTTAAACATTTAAATGCCGCCACCATGGAGCTGGCGGCCT-3’；(SEQ ID NO3，编码序列以下划线标出)和hNeu.rev2(5’-GCCGTCGACTTTACACTGGCACGTCCAGACCC A-3’(SEQ ID NO4)以及TaKaRa LA Taq聚合酶(TaKaRa Otsu，Shiga，日本)扩增的。扩增产物整合了最优化的翻译起始位点(Kozak，M.，J Mol Biol 196(4)947-50(1987)；Kozak，M.，Nucleic AcidsRes 15(20)8125-48(1987))，其用PmeI和SalI限制酶消化，并克隆进哺乳动物表达质粒pV1JnsA(见Montgomery等DNA Cell Biol12(9)777-83(1993))的EcoRV和SalI位点中。这样产生的质粒pV1J-hHER2含有全长野生型人HER2序列，其处于具有其内含子A序列的人类巨细胞病毒立即早期启动子的控制之下。人野生型HER2编码序列接下来是牛生长激素聚腺苷酸化信号序列。
pV1J-hHER2.opt从质粒pCR-hHER2opt上切下3793bp的EcoRI-SalI片段，并克隆进质粒pV1JnsB(Montgomery等，同前)的相应位点中，产生了pV1J-hHER2.opt质粒。
pV1J-hHER2ECDTM.opt通过PCR(使用TaKaRa taq)利用引物EcoRV-for(5’-CCAGATATCGAATTCTAGAGCCGCCACCATGGA-3’(SEQ ID NO12))和SalI-rev(5’-GCTGTCGACTTTATCAGATCAGGATGCCGAACACCACGCCC-3’(SEQ ID NO13))由pV1J-hHER2.opt扩增2168bp的片段。所得片段用EcoRV和SalI限制酶消化，并克隆进质粒pV1JnsB(Montgomery等，同前)的相应位点中，产生了pV1J-hHER2ECDTM.opt质粒。
实施例3密码子最优化了的hHER2 cDNA设计合成的人HER2基因(hHER2.opt，图1)以整合入每一个氨基酸(下文作aa)残基的人类偏好的(人源化)密码子。在基因组装期间，PCR扩增一贯地删除自3642位起的86bp序列，这归因于该区序列的高GC含量。为克服此问题，对hHER2序列3601和3805位之间采取不太严格的最优化设计，这降低了GC含量，而同时保留了相同的氨基酸组成。
修饰密码子最优化了的cDNA，以维持与原始克隆83.9％的核苷酸同一性。将密码子最优化了的cDNA克隆进pV1J载体(Montgomery等，同前)中，置于Kozak最优化序列(5’-GCCGCCACC-3’，SEQ ID NO8)之前，并处于人类巨细胞病毒(CMV)/内含子A启动子外加牛生长激素(BGH)终止信号的控制之下。所述构建体被命名为pV1J-hHER2opt(见实施例2)。
实施例4质粒构建体的体外表达pV1J-hHER2.wt和pV1J.hHER2.opt构建体的体外表达通过瞬时转染人胚肾HEK-293或小鼠成肌细胞C2C7细胞系、并通过流式细胞术检测人HER2表达来评估。用于免疫的编码人HER2表达盒的超螺旋的不含内毒素的质粒DNA pV1J-hHER2-wt是通过Qiagen endo-freeplasmid Giga试剂盒(Qiagen，Hilden，德国)从大肠杆菌DH12S细胞(Invitrogen，Groningen，荷兰)纯化的。
将质粒pV1J-hHER2.wt或pV1J-hHER2.opt用脂转染胺(lipofectamine)(Gibco BRL Invitrogen，Groningen，荷兰)转染到HEK-293细胞中。类似地，将小鼠成肌细胞C2C7细胞用1∶1或10∶1混合的质粒pHygEGFP(BD Biosciences Clontech，PaloAlto，CA)和pV1J-hHER2.wt或pV1J-hHER2.opt转染。
HEK-293或C2.7细胞的体外转染表明与野生型序列相比，密码子最优化了的序列显著地提高了hHER2的表达(图3A和3B)。
实施例5小鼠免疫六周龄近交雌性BALB/c小鼠(H-2d；由都灵大学(University ofTurin)G.Forni馈赠)在标准条件下饲养。小鼠按照欧共体和公共机构指导方针(European union and institutional guidelines)处理。具体地，当对于方法必要的时候，用氯胺酮(Imalgene 500；Merial Italia，Milano，意大利)100mg/kg体重和甲苯噻嗪(Xilor，BIO 98；S.Lazzaro，Bologna，意大利)5.2mg/kg对小鼠实施全身麻醉。
将50μl体积的50微克质粒DNA于6、8和10周龄电注射到小鼠的四头肌中，如先前所描述的那样(Rizzuto等Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.96(11)6417-22(1999))。将最优化或未最优化的50μgpCMV_hNeu注射到双侧四头肌(25μg溶于50μl生理溶液/注射剂)中而无需切开皮肤，并如先前所述(Zucchelli等J.Virol.74(24)11598-607(2000)；Rizzuto等，同前)进行电刺激(ES)。简要地，电击由10串1000双极脉冲(130V，75mA，200μs/相位)组成。
在小鼠四头肌中用50μl体积进行Ad注射。在7周(首次免疫前1周，放血前)和12周(末次免疫后两周)收集血清。
实施例6小鼠IFN-γELISPOT测定利用标准酶联免疫斑点(immunospot)(ELISPOT)测定检测以抗原特异性方式分泌IFN-γ的小鼠脾细胞(Miyahira等，J ImmunolMethods 181(1)45-54(1995))。多屏(multiscreen)96孔MAIP过滤板(cat.No.MAIPS4510；Millipore，Bedford，MA)用在无菌PBS中稀释的亲和纯化的大鼠抗-小鼠IFN-γ抗体((IgG1，克隆R4-6A2，cat No.18181D，Pharmingen，San Diego，CA)涂覆。过夜温育后，板子用PBST(0.005％Tween溶于PBS)洗涤，并与R10培养基于37℃温育2小时，以封闭非特异性结合。
通过以无菌方式从麻醉小鼠中取出脾脏而获得脾细胞。通过在金属网格上磨碎切碎的脾脏进行脾脏的破裂。通过向细胞沉淀中添加1ml 0.1X PBS并涡旋不超过15秒通过渗透裂解除去红细胞。然后加入1ml 2X PBS，并用1X PBS将体积补至4ml。通过在室温下以1200rpm离心10分钟沉淀细胞，并将沉淀重悬于1ml R10培养基(RPMI1640，补充有10％胎牛血清，2mM L-谷氨酰胺，50U青霉素/ml，50μg链霉素/ml，10mM HEPES，50μM 2-巯基乙醇)中。存活细胞利用Türks染色计数。
将来源于两个或更多个免疫小鼠脾脏的脾细胞以2.5-5 105细胞/孔的密度，在6μg/ml单个肽或肽库的存在下温育15小时。利用5μg/ml的伴刀豆球蛋白A(ConA)作为每只小鼠的阳性内部对照。在用PBST彻底洗涤后，添加生物素化的大鼠抗-小鼠IFN-γ抗体(cat No.18112D，PharMingen；San Diego，CA)。将板子于4℃温育过夜，随之用PBST洗涤，之后添加链霉抗生物素蛋白-碱性磷酸酶(Cat No.13043E，PharMingen；San Diego，CA)。室温下温育2小时后，将板子用PBST彻底洗涤，并通过与一步氮蓝四唑-5-溴-4-氧-3-吲哚磷酸底物(cat.No.34042，Pierce，Rockford，IL)温育5至15分钟显色，以使斑点显现。在水中冲洗所述板以终止反应。DMSO和伴刀豆球蛋白A(10μg/ml)被包括进来作为每个样品的背景和阳性对照。通过计算机辅助成像分析(AID ELR02外加AID ELISPOT 2.6软件，Strassberg，德国)计数斑点。
将每孔铺平板的每细胞总数的阳性产生IFN-γ的脾细胞频率计算为得自于两不同细胞浓度的一式两份的斑点平均值减去类似地得自于在含有非脉冲脾细胞的对照孔中测量的斑点的平均值之差。产生IFN-γ的细胞频率的变化定义为超过95％置信界限(confidencebound)，所述置信界限由对照的测量值计算。认为p值＜0.05的差异是显著的。
实施例7人HER2蛋白中免疫优势T细胞表位的鉴定将312种彼此重叠11个氨基酸的15个氨基酸的肽设计成跨越整个人HER2序列。这些肽也包括设计用于克服不溶性问题的七肽，是通过SynPep(Dublin，CA)合成的。所有的肽经HPLC证明＞90％纯，因而无需HPLC纯化而使用。将肽以35mg/ml在DMSO中重构。将并不立即溶解的那些肽于37℃摇动以助其溶解。如有必要，再加入1到3体积的DMSO以充分溶解经数小时摇动后依然不溶的那些肽。组合重构的肽，从而每一种肽都等同地在混合物中呈现。混合物中每一种肽的终浓度经计算为1mg/ml。将每一种混合物等分试样并贮存于80℃。
为鉴定BALB/c小鼠(H-2d遗传背景)中人HER2基因的免疫优势T细胞表位，将6周龄雌性BALB/c小鼠通过在四头肌中注射109vpAd5-hHER2进行免疫。二次注射于3周后进行。将第二组小鼠类似地用生理盐水溶液注射，作为阴性对照。二次注射后三周，处死动物，并通过干扰素-γ酶联免疫斑点(IFN-γELISPOT)测定评价小鼠脾细胞中分泌IFN-γ的T细胞的频率。
将跨越整个人HER2蛋白序列、彼此重叠11个残基、各自长15个氨基酸的311种肽自N末端到C末端组合到以字母表字母A到K标示的11个库中。对这些库中的每一个都测试其刺激IFN-γ脾T细胞的能力。对于肽库A、B和M，与不存在肽的对照相比，IFN-γELISPOT测量到用Ad5-hHER2免疫的小鼠具有统计学显著的IFN-γ生产。为鉴定负责所述活性的个体肽，将来自库A、B和M的肽划分成亚库，其中AIII和AIV、BIII及MI得分为正。然后对来自这些阳性亚库的单个肽测试其触发IFN-γ释放的能力。重叠肽hNeu-15和hNeu-16展示出高且相当的反应性。而重叠肽hNeu-41和hNeu-42展示出低得多的反应性。另一种肽hNeu-301也证明含有T细胞表位。
为证实这些数据并鉴定负责IFN-γ生产的CD4+或CD8+T细胞亚型，通过胞内染色(ICS)表征了分泌IFN-γ的T细胞。将小鼠脾细胞与单个肽在分泌抑制剂布雷菲尔德菌素A的存在下温育12小时，固定，渗透，然后进行胞内IFN-γ、CD3和CD4或CD8标记染色，并通过流式细胞术分析。ICS证实了肽hNeu-15的反应性，从而将其鉴定为能够活化CD8+细胞的表位。肽hNeu15和hNeu16在ELISPOT分析中等同地起反应，提示CD8+表位应当包含在这两个肽所共有的11个氨基酸残基中。
为鉴定靶九聚体序列，我们测试了跨越hNeu15和hNeu16之间的重叠区的三种长9个氨基酸的肽。hNeu15.3经证明是最具反应性的，与15个氨基酸长的肽hNeu15和hNeu16相比，表现出略微增大的反应性。有意思的是，对于hNeu15.1也检测到大约一半的反应性，从而表明两个重叠但截然不同的CD8+表位共存于这11个氨基酸序列之中。
IFN-γICS分析也证实了hNeu301的反应性，并将其类型测定为CD8+表位。通过IFN-γELISPOT对这些CD8+表位的分析证实了由ICS获得的结果。最后，对于hNeu41和hNeu42肽，检测到低反应性，它们的低水平应答主要地为CD4+。
实施例8胞内细胞因子染色胞内IFN-γ产生根据BD Pharmingen标准方案测量。简要地，在6μg/ml单个肽或肽库和作为蛋白转运抑制剂的布雷菲尔德菌素A的存在下，将2×106脾细胞在R10培养基中培养15小时(Cytofix/Cytoperm PlusTM连同GolgiPlugTM试剂盒；BD Pharmingen；San Diego，CA)。将10μg/ml的葡萄球菌肠毒素B(SEB)(cat.No.S4881，SIGMA，Saint Louis，MI)和DMSO分别作为阳性和背景对照与脾细胞一起进行测试。
在表面抗原染色之前，利用Ab抗-小鼠CD16/CD32降低非特异性免疫荧光信号(cat No.553142，BD PharMingen，San Diego，CA)。特异性信号是用APC-抗-小鼠CD3e、PE-抗-小鼠CD4和PerCP-抗-小鼠CD8a(cat.No.553066，553653和553036，BD Pharmingen；SanDiego，CA)获得的。然后洗涤细胞，固定，渗透，并利用FITC-缀合的mAb(cat.No.554411，BD Pharmingen San Diego，CA)进行胞内IFN-γ染色。T淋巴细胞IFN-γ计算为1000×[(IFN-γ+、CD3+和CD4+或CD8+)/(CD3+和CD4+或CD8+)]。通常，通过同时门控CD3+事件和小淋巴细胞，收集至少50,000个CD3+淋巴细胞。所有的样品都是利用FACSCalibur流式细胞仪和CellQuest软件(Becton Dickinson，San Jose，CA)在染色24小时内获取的。
实施例9抗体滴定和同种型分型用于抗体滴定的血清是通过眶后放血获得的。将ELISA板(NuncMaxisorpTM，Roskilde，丹麦)于4℃用2μg/ml浓度溶于50mM NaHCO3(pH 9.6)之中的山羊抗-人IgG Fc-特异性(Pierce；Cat.n.31123)涂覆过夜。除去过量抗体，并通过在PBBST5缓冲液(BSA 5％.Tween0.05％)中于37℃温育60分钟来封闭非特异性结合。洗涤后，加入饱和条件的IgB2细胞上清液，并于室温(RT)温育2小时(Chen等，JBiol Chem 271(13)7620-9(1996))。IgB2细胞(由Dr.Y.Yarden馈赠，Weizmann Institute of Science，Rehovot，以色列)是分泌HER2胞外结构域和人Ig Fc部分之间的二聚体融合物的HEK-293细胞。洗涤板子，并将PBBST1缓冲液(BSA 1％，Tween 0.05％)中的血清系列稀释物(从1∶4,000到1∶25,600)于4℃温育过夜。将免疫前血清用作为背景。洗涤用PBBST1进行。将二抗(山羊抗-小鼠IgG1或IgG2a，AP-缀合的(Pharmingen，557272和553389))于PBBST5中以1∶40,000进行稀释，并在摇动器上于室温温育2-3小时。洗涤后，将板子通过与Sigma 106磷酸酶底物(Sigma；cat.n.A106)在二乙醇胺中温育显色。板子通过自动化ELISA读数器(Labsistems MultiskanBichromatic，Helsinki，芬兰)读数，且结果表达为A＝A405nm-A62nm。对于每一个样品，都减去用免疫前血清检测到的背景信号。
抗-hHER2血清滴度计算为产生比相同稀度下自体免疫前血清的吸收值大至少3倍的吸收值的血清有限稀度的倒数。
实施例10
hHER2opt提高的免疫原性为研究由野生型和密码子最优化了的hHER2表达载体所诱导的体内免疫应答，将BALB/c小鼠用pV1J-hHER2.wt或pV1J-hHER2.opt质粒DNA进行肌内免疫，接着进行ES(如实施例5中所述)。对小鼠于6、8和10周龄进行三次注射。末次免疫后两周，从各小鼠中分离脾细胞。为定量通过质粒DNA免疫所产生的分泌IFNγ的hHER2特异性CD8T细胞前体的频率，使用了对H-2d限制的T细胞表位hNeu15.3和hNeu42的ELISPOT测定。用HER2野生型序列免疫引发了刚刚可检测的CD8+应答，且不存在与CD4+肽的反应性。相反，最优化的HER2序列诱导针对CD8+肽增强10倍的应答，从而得到最多达286个特异于所测表位的IFNγ斑点形成细胞(SFC，平均值)。也检测到较低的CD4+活性。在pV1J-nsB免疫小鼠中未检测到肽特异性的IFNγSFC(数据未显示)。
利用IgB2蛋白作为底物通过ELISA测试了来自相同小鼠的血清(图4B)。在所有pV1J-hHER2.opt免疫小鼠中检测了hHER2特异性的抗体滴度，且Ab滴度的几何平均值对于IgG1或IG2a为46,000或78,000。相反，pV1J-hHER2.wt免疫组表现出低大约100倍的hHER2特异性抗体的几何平均滴度。从而，这些结果证明经密码子最优化的hHER2 cDNA在引发细胞和体液免疫应答方面比野生型序列更为有效。
实施例11腺病毒载体MRKAd5-hHER2.wt将来自含有人HER2 cDNA的pV1J_hHER2的SwaI-SalI DNA片段克隆在穿梭质粒polyMRKΔE1的相应位点中(Bett等，Proc Natl Acad Sci USA 91(19)8802-04(1994))。所得质粒pMRKΔE1_hHER2含有驱动人HER2 cDNA表达的人CMV启动子，接下来是牛生长激素聚腺苷酸化信号。将质粒pMRKΔE1_hHER2与腺病毒主链质粒pAd5_HV0重组以产生前腺病毒质粒pAd5-hHER2wt。
MRKAd5-hHER2ECDTM.opt将质粒pCR-hHER2opt用EcoRI消化。纯化所得的2156bp插入片段，并克隆到polyMRK-Ad5穿梭质粒的EcoRI中(见Emini等，WO 02/22080，特此并入作为参考)。
将质粒pAd5-hHER2.wt和pMRKAd5-hHER2.opt通过PacI消化而线性化，并转染到PerC6细胞中以产生Ad5-hHER2重组腺病毒。病毒通过多轮扩增进行大量生长，并通过氯化铯梯度超速离心纯化(Fallaux等，Hum Gene Ther 9(13)1909-17(1998))。病毒DNA通过蛋白酶K消化提取，并通过限制酶切分析证实基因组的完整性。
将HEK 293细胞由MRKAd5-hHER2.wt或MRKAd5-hHER2ECDTM.opt使用多种感染复数(m.o.i.)感染。由蛋白印迹分析监控的表达揭示了由密码子最优化了的序列表达的截短蛋白与由野生型HER2序列表达的全长蛋白之间超过10倍的差异(数据未显示)。
实施例12免疫方案的比较将腺病毒诱导抗-人HER2细胞介导的免疫应答的效率同与电刺激相关的质粒DNA的效率进行了比较，两者都携带有CMV-HER2表达盒。于6和9周龄将50μg质粒pV1J-HER2注射到野生型BALB/c小鼠或超表达大鼠HER2的BALB/c转基因小鼠(记做NeuT，见Lucchini等，Cancer Lett 64(3)203-9(1992))的四头肌中，接着进行ES。加强免疫后两周，处死动物，收集脾细胞并用含免疫优势p185表位的肽刺激。继用人肽刺激后，在BALB/c和neuT小鼠中都检测到极低的斑点形成细胞(SFC)(图5)。平均起来，所述应答比由Ad5-HER2免疫所诱导的低50倍。上述数据表明对于每一种方案而言，用质粒pV1J-HER2免疫小鼠在BALB/c和neuT小鼠中诱导相当的应答。
实施例13用人HER2联合人CEA和EpCAM抗原免疫猕猴(rhesus macaques)为评估用人肿瘤抗原HER2联合其他肿瘤抗原免疫猕猴(macacamulatta)的效率，将一组4只猕猴(2雄和2雌)用表达密码子最优化了的人肿瘤抗原Ep-CAM、CEA和HER2/neu序列的质粒DNA载体混合物进行免疫。
免疫研究在生物医学灵长动物研究中心(Biomedical PrimateResearch Centre)(BPRC，Rijswijk，荷兰)进行。设计这些免疫研究以评价由人类抗原诱导的针对相同抗原的猕猴同系物的T细胞应答。
于第0、2、4、6、8、10、12、14和16周由注射对猴子进行肌内接种，接着进行电刺激。在麻醉状态下，对于体重2-5千克的动物用含6mg质粒DNA的1ml溶液(分至两个注射部位，0.5ml/部位)注射动物。
对于电刺激，每隔1秒递送2串100方形双级脉冲(每次1秒)，总治疗时间为3秒。脉冲宽度为2毫秒/相位，脉冲频率和振幅分别为100Hz和100mA(恒流方式)。
将相同的猴子随后于第27和31周用分别表达人HER2野生型序列、人CEA或人EpCAM的三种腺病毒5(ΔE1-ΔE3，“第一代”，P2水平)的混合物接种。
为测量针对使用上述免疫方案的人HER2猕猴同系物的免疫应答，每四周一次收集血样，总持续时间为1年。通过IFNγElispot测定测量细胞介导的免疫应答。在图7中报告的结果显示上文所讨论的免疫方案在诱导针对人HER2/neu的内源性猕猴同系物的特异性免疫应答方面是有效的。
实施例14用pV1J-HER2opt和pV1J-HER2ECDTM.opt免疫在小鼠中所引发的p185-特异性T细胞应答的比较评价了保留胞外和跨膜结构域的C-末端缺失突变体p185(HER2ECDTM)的免疫效率。于第10和12周电注射表达密码子最优化了的全长(pV1J-HER2.opt)或截短型蛋白(pV1J-HER2ECDTM.opt)序列的质粒DNA，并于第14周进行分析。正如由IFN-γELISPOT分析所测量的那样，作为CD4+和CD8+反应性两者，截短型蛋白HER2ECDTM诱导的抗-p185细胞介导的应答比由全长p185蛋白诱导的更高(图8)。C2.7小鼠成肌细胞中的体外表达分析未揭示这两个质粒之间表达上的差异(数据未显示)。
序列表<110>Merck & Co.，Inc.
Monaci，PaoloGallo，PasqualeNuzzo，Maurizio<120>编码人表皮生长因子2/NEU抗原的合成基因及其用途<130>ITR0065Y-PCT<150>60/489,237<151>2003-07-21<160>14<170>FastSEQ for Windows Version 4.0<210>1<211>3768<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>HER2opt<400>1atggagctgg ccgccctgtg ccgctggggc ctgctgctgg ccctgctgcc ccccggcgcc 60gccagcaccc aggtgtgcac cggcaccgac atgaagctgc gcctgcccgc cagccccgag 120acccacctgg acatgctgcg ccacctgtac cagggctgcc aggtggtgca gggcaacctg 180gagctgacct acctgcccac caacgccagc ctgagcttcc tgcaggacat ccaggaggtg 240cagggctacg tgctgatcgc ccacaaccag gtgcgccagg tgcccctgca gcgcctgcgc 300atcgtgcgcg gcacccagct gttcgaggac aactacgccc tggccgtgct ggacaacggc 360gaccccctga acaacaccac ccccgtgacc ggcgccagcc ccggcggcct gcgcgagctg 420cagctgcgca gcctgaccga gatcctgaag ggcggcgtgc tgatccagcg caacccccag 480ctgtgctacc aggacaccat cctgtggaag gacatcttcc acaagaacaa ccagctggcc 540ctgaccctga tcgacaccaa ccgcagccgc gcctgccacc cctgcagccc catgtgcaag 600ggcagccgct gctggggcga gagcagcgag gactgccaga gcctgacccg caccgtgtgc 660gccggcggct gcgcccgctg caagggcccc ctgcccaccg actgctgcca cgagcagtgc 720gccgccggct gcaccggccc caagcacagc gactgcctgg cctgcctgca cttcaaccac 780agcggcatct gcgagctgca ctgccccgcc ctggtgacct acaacaccga caccttcgag 840agcatgccca accccgaggg ccgctacacc ttcggcgcca gctgcgtgac cgcctgcccc 900
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610 615 620Pro Cys Pro Ile Asn Cys Thr His Ser Cys Val Asp Leu Asp Asp Lys625 630 635 640Gly Cys Pro Ala Glu Gln Arg Ala Ser Pro Leu Thr Ser Ile Ile Ser645 650 655Ala Val Val Gly Ile Leu Leu Val Val Val Leu Gly Val Val Phe Gly660 665 670Ile Leu Ile Lys Arg Arg Gln Gln Lys Ile Arg Lys Tyr Thr Met Arg675 680 685Arg Leu Leu Gln Glu Thr Glu Leu Val Glu Pro Leu Thr Pro Ser Gly690 695 700Ala Met Pro Asn Gln Ala Gln Met Arg Ile Leu Lys Glu Thr Glu Leu705 710 715 720Arg Lys Val Lys Val Leu Gly Ser Gly Ala Phe Gly Thr Val Tyr Lys725 730 735Gly Ile Trp Ile Pro Asp Gly Glu Asn Val Lys Ile Pro Val Ala Ile740 745 750Ala Val Leu Arg Glu Asn Thr Ser Pro Lys Ala Asn Lys Glu Ile Leu755 760 765Asp Glu Ala Tyr Val Met Ala Gly Val Gly Ser Pro Tyr Val Ser Arg770 775 780Leu Leu Gly Ile Cys Leu Thr Ser Thr Val Gln Leu Val Thr Gln Leu785 790 795 800Met Pro Tyr Gly Cys Leu Leu Asp His Val Arg Glu Asn Arg Gly Arg805 810 815Leu Gly Ser Gln Asp Leu Leu Asn Trp Cys Met Gln Ile Ala Lys Gly820 825 830Met Ser Tyr Leu Glu Asp Val Arg Leu Val Hi s Arg Asp Leu Ala Ala835 840 845Arg Asn Val Leu Val Lys Ser Pro Asn His Val Lys Ile Thr Asp Phe850 855 860Gly Leu Ala Arg Leu Leu Asp Ile Asp Glu Thr Glu Tyr His Ala Asp865 870 875 880Gly Gly Lys Val Pro Ile Lys Trp Met Ala Leu Glu Ser Ile Leu Arg885 890 895Arg Arg Phe Thr His Gln Ser Asp Val Trp Ser Tyr Gly Val Thr Val900 905 910Trp Glu Leu Met Thr Phe Gly Ala Lys Pro Tyr Asp Gly Ile Pro Ala915 920 925Arg Glu Ile Pro Asp Leu Leu Glu Lys Gly Glu Arg Leu Pro Gln Pro930 935 940Pro Ile Cys Thr Ile Asp Val Tyr Met Ile Met Val Lys Cys Trp Met945 950 955 960Ile Asp Ser Glu Cys Arg Pro Arg Phe Arg Glu Leu Val Ser Glu Phe
965 970 975Ser Arg Met Ala Arg Asp Pro Gln Arg Phe Val Val Ile Gln Asn Glu980 985 990Asp Leu Gly Pro Ala Ser Pro Leu Asp Ser Thr Phe Tyr Arg Ser Leu995 10001005Leu Glu Asp Asp Asp Met Gly Asp Leu Val Asp Ala Glu Glu Tyr Leu101010151020Val Pro Gln Gln Gly Phe Phe Cys Pro Asp Pro Ala Pro Gly Ala Gly1025103010351040Gly Met Val His His Arg His Arg Ser Ser Ser Thr Arg Ser Gly Gly104510501055Gly Asp Leu Thr Leu Gly Leu Glu Pro Ser Glu Glu Glu Ala Pro Arg106010651070Ser Pro Leu Ala Pro Ser Glu Gly Ala Gly Ser Asp Val Phe Asp Gly107510801085Asp Leu Gly Met Gly Ala Ala Lys Gly Leu Gln Ser Leu Pro Thr His109010951100Asp Pro Ser Pro Leu Gln Arg Tyr Ser Glu Asp Pro Thr Val Pro Leu1105111011151120Pro Ser Glu Thr Asp Gly Tyr Val Ala Pro Leu Thr Cys Ser Pro Gln112511301135Pro Glu Tyr Val Asn Gln Pro Asp Val Arg Pro Gln Pro Pro Ser Pro114011451150Arg Glu Gly Pro Leu Pro Ala Ala Arg Pro Ala Gly Ala Thr Leu Glu115511601165Arg Pro Lys Thr Leu Ser Pro Gly Lys Asn Gly Val Val Lys Asp Val117011751180Phe Ala Phe Gly Gly Ala Val Glu Asn Pro Glu Tyr Leu Thr Pro Gln1185119011951200Gly Gly Ala Ala Pro Gln Pro His Pro Pro Pro Ala Phe Ser Pro Ala120512101215Phe Asp Asn Leu Tyr Tyr Trp Asp Gln Asp Pro Pro Glu Arg Gly Ala122012251230Pro Pro Ser Thr Phe Lys Gly Thr Pro Thr Ala Glu Asn Pro Glu Tyr123512401245Leu Gly Leu Asp Val Pro Val12501255<210>3<211>43<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>PCR引物<400>3ccagtttaaa catttaaatg ccgccaccat ggagctggcg gcc43<210>4<211>33<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>PCR引物<400>4gccgtcgact ttacactggc acgtccagac cca 33<210>5<211>19<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>HER2肽<400>5Gln Gly Asn Leu Glu Leu Thr Tyr Leu Pro Thr Asn Ala Ser Leu Ser1 5 10 15Phe Leu Gln<210>6<211>19<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>HER2肽<400>6Leu Cys Tyr Gln Asp Thr Ile Leu Trp Lys Asp Ile Phe His Lys Asn1 5 10 15Asn Gln Leu
<210>7<211>15<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>HER2肽<400>7Gly Gly Ala Ala Pro Gln Pro His Pro Pro Pro Ala Phe Ser Pro1 5 10 15<210>8<211>9<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>Kozak序列<400>8gccgccacc 9<210>9<211>2028<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>HER2ECDTMopt<400>9atggagctgg ccgccctgtg ccgctggggc ctgctgctgg ccctgctgcc ccccggcgcc 60gccagcaccc aggtgtgcac cggcaccgac atgaagctgc gcctgcccgc cagccccgag 120acccacctgg acatgctgcg ccacctgtac cagggctgcc aggtggtgca gggcaacctg 180gagctgacct acctgcccac caacgccagc ctgagcttcc tgcaggacat ccaggaggtg 240cagggctacg tgctgatcgc ccacaaccag gtgcgccagg tgcccctgca gcgcctgcgc 300atcgtgcgcg gcacccagct gttcgaggac aactacgccc tggccgtgct ggacaacggc 360gaccccctga acaacaccac ccccgtgacc ggcgccagcc ccggcggcct gcgcgagctg 420cagctgcgca gcctgaccga gatcctgaag ggcggcgtgc tgatccagcg caacccccag 480
ctgtgctacc aggacaccat cctgtggaag gacatcttcc acaagaacaa ccagctggcc 540ctgaccctga tcgacaccaa ccgcagccgc gcctgccacc cctgcagccc catgtgcaag 600ggcagccgct gctggggcga gagcagcgag gactgccaga gcctgacccg caccgtgtgc 660gccggcggct gcgcccgctg caagggcccc ctgcccaccg actgctgcca cgagcagtgc 720gccgccggct gcaccggccc caagcacagc gactgcctgg cctgcctgca cttcaaccac 780agcggcatct gcgagctgca ctgccccgcc ctggtgacct acaacaccga caccttcgag 840agcatgccca accccgaggg ccgctacacc ttcggcgcca gctgcgtgac cgcctgcccc 900tacaactacc tgagcaccga cgtgggcagc tgcaccctgg tgtgccccct gcacaaccag 960gaggtgaccg ccgaggacgg cacccagcgc tgcgagaagt gcagcaagcc ctgcgcccgc 1020gtgtgctacg gcctgggcat ggagcacctg cgcgaggtgc gcgccgtgac cagcgccaac 1080atccaggagt tcgccggctg caagaagatc ttcggcagcc tggccttcct gcccgagagc 1140ttcgacggcg accccgccag caacaccgcc cccctgcagc ccgagcagct gcaggtgttc 1200gagaccctgg aggagatcac cggctacctg tacatcagcg cctggcccga cagcctgccc 1260gacctgagcg tgttccagaa cctgcaggtg atccgcggcc gcatcctgca caacggcgcc 1320tacagcctga ccctgcaggg cctgggcatc agctggctgg gcctgcgcag cctgcgcgag 1380ctgggcagcg gcctggccct gatccaccac aacacccacc tgtgcttcgt gcacaccgtg 1440ccctgggacc agctgttccg caacccccac caggccctgc tgcacaccgc caaccgcccc 1500gaggacgagt gcgtgggcga gggcctggcc tgccaccagc tgtgcgcccg cggccactgc 1560tggggccccg gccccaccca gtgcgtgaac tgcagccagt tcctgcgcgg ccaggagtgc 1620gtggaggagt gccgcgtgct gcagggcctg ccccgcgagt acgtgaacgc ccgccactgc 1680ctgccctgcc accccgagtg ccagccccag aacggcagcg tgacctgctt cggccccgag 1740gccgaccagt gcgtggcctg cgcccactac aaggaccccc ccttctgcgt ggcccgctgc 1800cccagcggcg tgaagcccga cctgagctac atgcccatct ggaagttccc cgacgaggag 1860ggcgcctgcc agccctgccc catcaactgc acccacagct gcgtggacct ggacgacaag 1920ggctgccccg ccgagcagcg cgccagcccc ctgaccagca tcatcagcgc cgtggtgggc 1980atcctgctgg tggtggtgct gggcgtggtg ttcggcatcc tgatctga 2028<210>10<211>2028<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>HER2ECDTMwt<400>10atggagctgg cggccttgtg ccgctggggg ctcctcctcg ccctcttgcc ccccggagcc 60gcgagcaccc aagtgtgcac cggcacagac atgaagctgc ggctccctgc cagtcccgag 120acccacctgg acatgctccg ccacctctac cagggctgcc aggtggtgca gggaaacctg 180gaactcacct acctgcccac caatgccagc ctgtccttcc tgcaggatat ccaggaggtg 240cagggctacg tgctcatcgc tcacaaccaa gtgaggcagg tcccactgca gaggctgcgg 300attgtgcgag gcacccagct ctttgaggac aactatgccc tggccgtgct agacaatgga 360gacccgctga acaataccac ccctgtcaca ggggcctccc caggaggcct gcgggagctg 420cagcttcgaa gcctcacaga gatcttgaaa ggaggggtct tgatccagcg gaacccccag 480
ctctgctacc aggacacgat tttgtggaag gacatcttcc acaagaacaa ccagctggct 540ctcacactga tagacaccaa ccgctctcgg gcctgccacc cctgttctcc gatgtgtaag 600ggctcccgct gctggggaga gagttctgag gattgtcaga gcctgacgcg cactgtctgt 660gccggtggct gtgcccgctg caaggggcca ctgcccactg actgctgcca tgagcagtgt 720gctgccggct gcacgggccc caagcactct gactgcctgg cctgcctcca cttcaaccac 780agtggcatct gtgagctgca ctgcccagcc ctggtcacct acaacacaga cacgtttgag 840tccatgccca atcccgaggg ccggtataca ttcggcgcca gctgtgtgac tgcctgtccc 900tacaactacc tttctacgga cgtgggatcc tgcaccctcg tctgccccct gcacaaccaa 960gaggtgacag cagaggatgg aacacagcgg tgtgagaagt gcagcaagcc ctgtgcccga 1020gtgtgctatg gtctgggcat ggagcacttg cgagaggtga gggcagttac cagtgccaat 1080atccaggagt ttgctggctg caagaagatc tttgggagcc tggcatttct gccggagagc 1140tttgatgggg acccagcctc caacactgcc ccgctccagc cagagcagct ccaagtgttt 1200gagactctgg aagagatcac aggttaccta tacatctcag catggccgga cagcctgcct 1260gacctcagcg tcttccagaa cctgcaagta atccggggac gaattctgca caatggcgcc 1320tactcgctga ccctgcaagg gctgggcatc agctggctgg ggctgcgctc actgagggaa 1380ctgggcagtg gactggccct catccaccat aacacccacc tctgcttcgt gcacacggtg 1440ccctgggacc agctctttcg gaacccgcac caagctctgc tccacactgc caaccggcca 1500gaggacgagt gtgtgggcga gggcctggcc tgccaccagc tgtgcgcccg agggcactgc 1560tggggtccag ggcccaccca gtgtgtcaac tgcagccagt tccttcgggg ccaggagtgc 1620gtggaggaat gccgagtact gcaggggctc cccagggagt atgtgaatgc caggcactgt 1680ttgccgtgcc accctgagtg tcagccccag aatggctcag tgacctgttt tggaccggag 1740gctgaccagt gtgtggcctg tgcccactat aaggaccctc ccttctgcgt ggcccgctgc 1800cccagcggtg tgaaacctga cctctcctac atgcccatct ggaagtttcc agatgaggag 1860ggcgcatgcc agccttgccc catcaactgc acccactcct gtgtggacct ggatgacaag 1920ggctgccccg ccgagcagag agccagccct ctgacgtcca tcatctctgc ggtggttggc 1980attctgctgg tcgtggtctt gggggtggtc tttgggatcc tcatctga 2028<210>11<211>3778<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>hHER2opt+Kozak<400>11gccgccacca tggagctggc cgccctgtgc cgctggggcc tgctgctggc cctgctgccc 60cccggcgccg ccagcaccca ggtgtgcacc ggcaccgaca tgaagctgcg cctgcccgcc 120agccccgaga cccacctgga catgctgcgc cacctgtacc agggctgcca ggtggtgcag 180ggcaacctgg agctgaccta cctgcccacc aacgccagcc tgagcttcct gcaggacatc 240caggaggtgc agggctacgt gctgatcgcc cacaaccagg tgcgccaggt gcccctgcag 300cgcctgcgca tcgtgcgcgg cacccagctg ttcgaggaca actacgccct ggccgtgctg 360gacaacggcg accccctgaa caacaccacc cccgtgaccg gcgccagccc cggcggcctg 420cgcgagctgc agctgcgcag cctgaccgag atcctgaagg gcggcgtgct gatccagcgc 480
aacccccagc tgtgctacca ggacaccatc ctgtggaagg acatcttcca caagaacaac 540cagctggccc tgaccctgat cgacaccaac cgcagccgcg cctgccaccc ctgcagcccc 600atgtgcaagg gcagccgctg ctggggcgag agcagcgagg actgccagag cctgacccgc 660accgtgtgcg ccggcggctg cgcccgctgc aagggccccc tgcccaccga ctgctgccac 720gagcagtgcg ccgccggctg caccggcccc aagcacagcg actgcctggc ctgcctgcac 780ttcaaccaca gcggcatctg cgagctgcac tgccccgccc tggtgaccta caacaccgac 840accttcgaga gcatgcccaa ccccgagggc cgctacacct tcggcgccag ctgcgtgacc 900gcctgcccct acaactacct gagcaccgac gtgggcagct gcaccctggt gtgccccctg 960cacaaccagg aggtgaccgc cgaggacggc acccagcgct gcgagaagtg cagcaagccc 1020tgcgcccgcg tgtgctacgg cctgggcatg gagcacctgc gcgaggtgcg cgccgtgacc 1080agcgccaaca tccaggagtt cgccggctgc aagaagatct tcggcagcct ggccttcctg 1140cccgagagct tcgacggcga ccccgccagc aacaccgccc ccctgcagcc cgagcagctg 1200caggtgttcg agaccctgga ggagatcacc ggctacctgt acatcagcgc ctggcccgac 1260agcctgcccg acctgagcgt gttccagaac ctgcaggtga tccgcggccg catcctgcac 1320aacggcgcct acagcctgac cctgcagggc ctgggcatca gctggctggg cctgcgcagc 1380ctgcgcgagc tgggcagcgg cctggccctg atccaccaca acacccacct gtgcttcgtg 1440cacaccgtgc cctgggacca gctgttccgc aacccccacc aggccctgct gcacaccgcc 1500aaccgccccg aggacgagtg cgtgggcgag ggcctggcct gccaccagct gtgcgcccgc 1560ggccactgct ggggccccgg ccccacccag tgcgtgaact gcagccagtt cctgcgcggc 1620caggagtgcg tggaggagtg ccgcgtgctg cagggcctgc cccgcgagta cgtgaacgcc 1680cgccactgcc tgccctgcca ccccgagtgc cagccccaga acggcagcgt gacctgcttc 1740ggccccgagg ccgaccagtg cgtggcctgc gcccactaca aggacccccc cttctgcgtg 1800gcccgctgcc ccagcggcgt gaagcccgac ctgagctaca tgcccatctg gaagttcccc 1860gacgaggagg gcgcctgcca gccctgcccc atcaactgca cccacagctg cgtggacctg 1920gacgacaagg gctgccccgc cgagcagcgc gccagccccc tgaccagcat catcagcgcc 1980gtggtgggca tcctgctggt ggtggtgctg ggcgtggtgt tcggcatcct gatcaagcgc 2040cgccagcaga agatccgcaa gtacaccatg cgccgcctgc tgcaggagac cgagctggtg 2100gagcccctga cccccagcgg cgccatgccc aaccaggccc agatgcgcat cctgaaggag 2160accgagctgc gcaaggtgaa ggtgctgggc agcggcgcct tcggcaccgt gtacaagggc 2220atctggatcc ccgacggcga gaacgtgaag atccccgtgg ccatcgccgt gctgcgcgag 2280aacaccagcc ccaaggccaa caaggagatc ctggacgagg cctacgtgat ggccggcgtg 2340ggcagcccct acgtgagccg cctgctgggc atctgcctga ccagcaccgt gcagctggtg 2400acccagctga tgccctacgg ctgcctgctg gaccacgtgc gcgagaaccg cggccgcctg 2460ggcagccagg acctgctgaa ctggtgcatg cagatcgcca agggcatgag ctacctggag 2520gacgtgcgcc tggtgcaccg cgacctggcc gcccgcaacg tgctggtgaa gagccccaac 2580cacgtgaaga tcaccgactt cggcctggcc cgcctgctgg acatcgacga gaccgagtac 2640cacgccgacg gcggcaaggt gcccatcaag tggatggccc tggagagcat cctgcgccgc 2700cgcttcaccc accagagcga cgtgtggagc tacggcgtga ccgtgtggga gctgatgacc 2760ttcggcgcca agccctacga cggcatcccc gcccgcgaga tccccgacct gctggagaag 2820ggcgagcgcc tgccccagcc ccccatctgc accatcgacg tgtacatgat catggtgaag 2880tgctggatga tcgacagcga gtgccgcccc cgcttccgcg agctggtgag cgagttcagc 2940cgcatggccc gcgaccccca gcgcttcgtg gtgatccaga acgaggacct gggccccgcc 3000agccccctgg acagcacctt ctaccgcagc ctgctggagg acgacgacat gggcgacctg 3060gtggacgccg aggagtacct ggtgccccag cagggcttct tctgccccga ccccgccccc 3120
ggcgccggcg gcatggtgca ccaccgccac cgcagcagca gcacccgcag cggcggcggc 3180gacctgaccc tgggcctgga gcccagcgag gaggaggccc cccgcagccc cctggccccc 3240agcgagggcg ccggcagcga cgtgttcgac ggcgacctgg gcatgggcgc cgccaagggc 3300ctgcagagcc tgcccaccca cgaccccagc cccctgcagc gctacagcga ggaccccacc 3360gtgcccctgc ccagcgagac cgacggctac gtggcccccc tgacctgcag cccccagccc 3420gagtacgtga accagcccga cgtgcgcccc cagcccccca gcccccgcga gggccccctg 3480cccgccgccc gccccgccgg cgccaccctg gagcgcccca agaccctgag ccccggcaag 3540aacggcgtgg tgaaggacgt gttcgccttc ggcggcgccg tggagaaccc cgagtacctg 3600accccccagg gcggagctgc tcctcagcct caccctccac ctgctttcag ccctgctttc 3660gacaacctgt actactggga ccaggaccct cctgagaggg gtgctcctcc tagcaccttc 3720aagggcaccc ccaccgccga gaaccccgag tacctgggcc tggacgtgcc cgtgtaaa 3778<210>12<211>33<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>PCR引物<400>12ccagatatcg aattctagag ccgccaccat gga 33<210>13<211>41<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>PCR引物<400>13gctgtcgact ttatcagatc aggatgccga acaccacgcc c41<210>14<211>675<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>HER2ECDTM多肽<400>14Met Glu Leu Ala Ala Leu Cys Arg Trp Gly Leu Leu Leu Ala Leu Leu
1 5 10 15Pro Pro Gly Ala Ala Ser Thr Gln Val Cys Thr Gly Thr Asp Met Lys20 25 30Leu Arg Leu Pro Ala Ser Pro Glu Thr His Leu Asp Met Leu Arg His35 40 45Leu Tyr Gln Gly Cys Gln Val Val Gln Gly Asn Leu Glu Leu Thr Tyr50 55 60Leu Pro Thr Asn Ala Ser Leu Ser Phe Leu Gln Asp Ile Gln Glu Val65 70 75 80Gln Gly Tyr Val Leu Ile Ala His Asn Gln Val Arg Gln Val Pro Leu85 90 95Gln Arg Leu Arg Ile Val Arg Gly Thr Gln Leu Phe Glu Asp Asn Tyr100 105 110Ala Leu Ala Val Leu Asp Asn Gly Asp Pro Leu Asn Asn Thr Thr Pro115 120 125Val Thr Gly Ala Ser Pro Gly Gly Leu Arg Glu Leu Gln Leu Arg Ser130 135 140Leu Thr Glu Ile Leu Lys Gly Gly Val Leu Ile Gln Arg Asn Pro Gln145 150 155 160Leu Cys Tyr Gln Asp Thr Ile Leu Trp Lys Asp Ile Phe His Lys Asn165 170 175Asn Gln Leu Ala Leu Thr Leu Ile Asp Thr Asn Arg Ser Arg Ala Cys180 185 190His Pro Cys Ser Pro Met Cys Lys Gly Ser Arg Cys Trp Gly Glu Ser195 200 205Ser Glu Asp Cys Gln Ser Leu Thr Arg Thr Val Cys Ala Gly Gly Cys210 215 220Ala Arg Cys Lys Gly Pro Leu Pro Thr Asp Cys Cys His Glu Gln Cys225 230 235 240Ala Ala Gly Cys Thr Gly Pro Lys His Ser Asp Cys Leu Ala Cys Leu245 250 255His Phe Asn His Ser Gly Ile Cys Glu Leu His Cys Pro Ala Leu Val260 265 270Thr Tyr Asn Thr Asp Thr Phe Glu Ser Met Pro Asn Pro Glu Gly Arg275 280 285Tyr Thr Phe Gly Ala Ser Cys Val Thr Ala Cys Pro Tyr Asn Tyr Leu290 295 300Ser Thr Asp Val Gly Ser Cys Thr Leu Val Cys Pro Leu His Asn Gln305 310 315 320Glu Val Thr Ala Glu Asp Gly Thr Gln Arg Cys Glu Lys Cys Ser Lys325 330 335Pro Cys Ala Arg Val Cys Tyr Gly Leu Gly Met Glu His Leu Arg Glu340 345 350Val Arg Ala Val Thr Ser Ala Asn Ile Gln Glu Phe Ala Gly Cys Lys
355 360 365Lys Ile Phe Gly Ser Leu Ala Phe Leu Pro Glu Ser Phe Asp Gly Asp370 375 380Pro Ala Ser Asn Thr Ala Pro Leu Gln Pro Glu Gln Leu Gln Val Phe385 390 395 400Glu Thr Leu Glu Glu Ile Thr Gly Tyr Leu Tyr Ile Ser Ala Trp Pro405 410 415Asp Ser Leu Pro Asp Leu Ser Val Phe Gln Asn Leu Gln Val Ile Arg420 425 430Gly Arg Ile Leu His Asn Gly Ala Tyr Ser Leu Thr Leu Gln Gly Leu435 440 445Gly Ile Ser Trp Leu Gly Leu Arg Ser Leu Arg Glu Leu Gly Ser Gly450 455 460Leu Ala Leu Ile His His Asn Thr His Leu Cys Phe Val His Thr Val465 470 475 480Pro Trp Asp Gln Leu Phe Arg Asn Pro His Gln Ala Leu Leu His Thr485 490 495Ala Asn Arg Pro Glu Asp Glu Cys Val Gly Glu Gly Leu Ala Cys His500 505 510Gln Leu Cys Ala Arg Gly His Cys Trp Gly Pro Gly Pro Thr Gln Cys515 520 525Val Asn Cys Ser Gln Phe Leu Arg Gly Gln Glu Cys Val Glu Glu Cys530 535 540Arg Val Leu Gln Gly Leu Pro Arg Glu Tyr Val Asn Ala Arg His Cys545 550 555 560Leu Pro Cys His Pro Glu Cys Gln Pro Gln Asn Gly Ser Val Thr Cys565 570 575Phe Gly Pro Glu Ala Asp Gln Cys Val Ala Cys Ala His Tyr Lys Asp580 585 590Pro Pro Phe Cys Val Ala Arg Cys Pro Ser Gly Val Lys Pro Asp Leu595 600 605Ser Tyr Met Pro Ile Trp Lys Phe Pro Asp Glu Glu Gly Ala Cys Gln610 615 620Pro Cys Pro Ile Asn Cys Thr His Ser Cys Val Asp Leu Asp Asp Lys625 630 635 640Gly Cys Pro Ala Glu Gln Arg Ala Ser Pro Leu Thr Ser Ile Ile Ser645 650 655Ala Val Val Gly Ile Leu Leu Val Val Val Leu Gly Val Val Phe Gly660 665 670Ile Leu Ile67权利要求
1.一种合成核酸分子，其包含编码如SEQ ID NO2中所示的人HER2/neu蛋白的核苷酸序列，所述合成核酸分子经密码子最优化，以在人类细胞中高水平表达。
2.根据权利要求1的合成核酸分子，其中所述核苷酸序列包含如SEQ ID NO1中所示的核苷酸序列。
3.包含权利要求1的核酸分子的载体。
4.包含权利要求3的载体的宿主细胞。
5.一种合成核酸分子，其包含编码与SEQ ID NO2的氨基酸序列具有至少90％同一性的变体人HER2/neu多肽的核苷酸序列，所述变体人HER2/neu多肽在SEQ ID NO2的整个长度范围内可包括最多达Na个氨基酸改变，其中Na为最大氨基酸改变数，并由如下公式计算Na＝Xa-(XaY)，其中Xa为SEQ ID NO2中的氨基酸总数，而Y值为0.90，其中在从Xa中减去Xa和Y的乘积之前，将任何这样非整数的乘积四舍五入为最接近的整数，其中所述核苷酸序列经密码子最优化，以在人类细胞中高水平表达。
6.一种合成核酸分子，其包含编码如SEQ ID NO14中所示的人HER2ECDTM蛋白的核苷酸序列，所述合成核酸分子经密码子最优化，以在人类细胞中高水平表达。
7.权利要求6的合成核酸分子，其中所述核苷酸序列包含如SEQID NO9中所示的核苷酸序列。
8.包含权利要求6的核酸分子的载体。
9.包含权利要求8的载体的宿主细胞。
10.一种合成核酸分子，其包含编码与SEQ ID NO14的氨基酸序列具有至少90％同一性的变体人HER2ECDTM多肽的核苷酸序列，所述变体人HER2ECDTM多肽在SEQ ID NO14的整个长度范围内可包括最多达Na个氨基酸改变，其中Na为最大氨基酸改变数，并由如下公式计算Na＝Xa-(XaY)，其中Xa为SEQ ID NO14中的氨基酸总数，而Y值为0.90，其中在从Xa中减去Xa和Y的乘积之前，将任何这样非整数的乘积四舍五入为最接近的整数，其中所述核苷酸序列经密码子最优化，以在人类细胞中高水平表达。
11.一种在重组宿主细胞中表达人HER2/neu蛋白的方法，其包括(a)将包含权利要求1的核酸的载体引入到合适的宿主细胞中；和(b)在允许表达所述人HER2蛋白的条件下培养所述宿主细胞。
12.一种在重组宿主细胞中表达人HER2ECDTM蛋白的方法，其包括(a)将包含权利要求6的核酸的载体引入到合适的宿主细胞中；和(b)在允许表达所述人HER2ECDTM蛋白的条件下培养所述宿主细胞。
13.一种预防或治疗HER2相关癌症的方法，其包括向哺乳动物施用这样的疫苗载体，所述疫苗载体包含合成的经密码子最优化的核酸分子，所述核酸分子包含编码如SEQ ID NO2中所示的人HER2/neu蛋白或如SEQ ID NO14中所示的人HER2ECDTM蛋白的核苷酸序列。
14.根据权利要求13的方法，其中所述哺乳动物为人。
15.根据权利要求14的方法，其中所述载体为腺病毒载体或质粒载体。
16.根据权利要求15的方法，其中所述载体为腺病毒载体，其包含在腺病毒E1区具有缺失，且在腺病毒E1区中具有插入片段的腺病毒基因组，其中所述插入片段包含表达盒，所述表达盒包含(a)经密码子最优化的编码人HER2蛋白或人HER2ECDTM蛋白的多核苷酸；和(b)可操作地连接于所述多核苷酸的启动子。
17.根据权利要求15的方法，其中所述载体为质粒疫苗载体，其包含质粒部分和表达盒，所述表达盒包含(a)经密码子最优化的编码人HER2蛋白或人HER2ECDTM蛋白的多核苷酸；和(b)可操作地连接于所述多核苷酸的启动子。
18.一种腺病毒疫苗载体，其包含这样的腺病毒基因组，其在E1区具有缺失，且在E1区中具有插入片段，其中所述插入片段包含表达盒，所述表达盒包含(a)经密码子最优化的编码人HER2蛋白或编码人HER2ECDTM蛋白的多核苷酸；和(b)可操作地连接于所述多核苷酸的启动子。
19.根据权利要求18的腺病毒载体，其为Ad 5载体。
20.根据权利要求18的腺病毒载体，其为Ad 6载体或Ad 24载体。
21.一种疫苗质粒，其包含质粒部分和表达盒部分，所述表达盒部分包含(a)经密码子最优化的编码人HER2蛋白或人HER2ECDTM蛋白的多核苷酸；和(b)可操作地连接于所述多核苷酸的启动子。
22.一种治疗患有HER2相关癌症的哺乳动物的方法，其包括(a)向所述哺乳动物引入第一载体，其包含i)经密码子最优化的编码人HER2蛋白或人HER2ECDTM蛋白的多核苷酸；和ii)可操作地连接于所述多核苷酸的启动子；(b)允许经过预定量的时间；和(c)向所述哺乳动物引入第二载体，其包含i)经密码子最优化的编码人HER2蛋白或人HER2ECDTM蛋白的多核苷酸；和ii)可操作地连接于所述多核苷酸的启动子。
23.根据权利要求22的方法，其中所述第一载体为质粒，而所述第二载体为腺病毒载体。
24.根据权利要求22的方法，其中所述第一载体为腺病毒载体，而所述第二载体为质粒。
全文摘要
提供了编码人HER2/neu或其截短形式的合成多核苷酸，该合成多核苷酸经密码子最优化，以在人类细胞环境中表达。编码hHER2的基因通常与人类癌的发展有关。本发明提供了引发或增强对由hHER2肿瘤相关抗原所表达的蛋白产物的免疫性的组合物和方法，其中异常的hHER2表达与癌或其发展有关。本发明具体地提供了携带密码子最优化了的人HER2以及密码子最优化了的截短型HER2的腺病毒载体和质粒构建体，并公开了它们在用于预防和治疗癌症的疫苗和药物组合物中的用途。
文档编号C12N15/86GK1826409SQ200480020917
公开日2006年8月30日 申请日期2004年7月20日 优先权日2003年7月21日
发明者P·加洛, P·莫卡茨, M·努佐 申请人:P.安杰莱蒂分子生物学研究所