专利名称：用于表达、传递及纯化目标多肽的重组载体分子的制作方法
技术领域：
本发明是针对蛋白质表达、纯化及分子生物学领域。特定而言，本发明是针对载体蛋白表达，其中使用热稳定酶的成熟多肽作为载体分子以供产生、回收及传递目标多肽。载体分子可用于在包括植物及哺乳动物细胞培养物的不同表达体系及宿主中产生外源序列。
背景技术：
疫苗是防止并甚至消除传染性疾病最有效的方法。尽管有大量基于全病原体的有效疫苗，但是研制基于部分病原体(亚单位疫苗)的更安全有效而且更经济的疫苗是很重要的。过去二十年中已经研究出若干疫苗抗原表达(细菌、酵母、哺乳动物细胞培养物及植物)及传递(DNA、活病毒载体、纯化蛋白、植物病毒粒子)的方法。所有这些方法对研发和检验新近研制出的候选疫苗具有显著影响。然而，需要改进表达和传递体系以产生更有效而更安全并具有更小副作用的疫苗。未来疫苗所希望的某些特点为(a)高效(刺激免疫体系的两个臂)，(b)具有已知和受控基因组成，(c)具有体系时效性，(d)适于表达小型肽及大型多肽两者，(e)适于在不同体系(细菌、酵母、哺乳动物细胞培养物、活病毒载体、DNA载体、转基因植物和瞬时表达载体)中表达，及(f)能够形成诸如凝聚体(aggregate)或类病毒粒子(virus like particle)之易于回收且具有免疫原性的结构。
因此，需要用于以工程学改变、研制和传递有效亚单位疫苗的新颖载体分子。此等载体分子应提供以下优点和灵活性在不同体系中表达商业上充足量的目标多肽，从源材料中经济地回收目标多肽，容纳不同尺寸(4个氨基酸及更多)的多肽，容纳串连重复的目标多肽，提供增强的免疫功能，用作高通量筛选工具，及用作疫苗免疫原和疾病标记物的传递工具。
发明内容
在本发明中发现了一种新颖重组蛋白。其将作为一种用于表达和回收有用目标多肽的载体分子，这些目标多肽是用作对抗传染性疾病或甚至癌症的治疗性或预防性药剂。本文发现的载体分子可容纳不同大小(4个氨基酸至100kD的蛋白或更大)的多肽(目标多肽)而且可表达于不同体系中。目标多肽可为疫苗抗原。
在一般性方面，本发明提供一种重组载体分子，所述重组载体分子具有缺少一个或一个以上氨基酸节段的热稳定酶的被修饰成熟多肽，或热稳定酶的实质上完整的成熟多肽，其适于在该成熟多肽的每个N端和C端以及视情况在环区(loop region)中与异源多肽融合。被修饰成熟多肽和实质上完整的成熟多肽保留了它们的热稳定性及/或酶活性。修饰成熟多肽是因为它缺少环区或具有被中断的环区，或在环区中具有至少一个并非自然存在于野生型热稳定酶中的限制位点(restriction site)。
在一个优选实施例中，本文发现的载体分子是基于来自热纤梭菌(Clostridiumthermocellum)的地衣多糖酶(lichinase B)(licB)基因(登记号X63355，[gi40697])。本发明者发现此热稳定细菌酶可用作产生目标多肽用载体分子。其具有暴露于远离活性域的表面上的环状结构。本发明者已经发现此环状结构可用于插入目标多肽。所述目标多肽可表达为N端或C端融合或内部融合及/或表达为环状结构插入物。表达被修饰的蛋白质并且表征其任何参数，例如热稳定性、最佳活性的pH与温度条件。工程蛋白(engineered protein)保持了其最佳活性的pH与温度条件。工程蛋白也没有改变其在65℃下的热稳定性。
因此，本发明揭示源自热稳定酶的重组分子，其用作各种异源目标多肽(例如疫苗、激素、抗凝剂(anticoaulant)、免疫球蛋白、干扰素、白细胞介素(interleukin)、造血生长因子等)的载体。在特定实施例中揭示Rec LicB和LicKM。载体蛋白(即连接一个或一个以上异源目标多肽的被修饰或工程学改变的rec LicB或LicKM)为融合蛋白且其可表达于原核或真核体系中。特别是已经发现这些载体分子可容纳小型多肽到高达100kD或更多的大型多肽，可容纳相同多肽的串连重复；可表达于不同体系中，包括细菌、酵母、杆状病毒、哺乳动物细胞培养物、植物、DNA及病毒载体；由于其热稳定性或形成凝聚体的能力可提供回收目标产物的经济优点；可用作筛选目标多肽的高通量体系；抗原、疾病标记物或其它治疗性多肽。
本发明也揭示一种以融合蛋白形式表达肽的方法，所述方法是通过将热稳定酶的重组成熟多肽用作异源多肽的载体并使用本发明所描述的肽表达方法。
图1.A以工程学改变重组LicKM载体分子的图示。1为环状结构。A表示环状结构的上游区域。C表示环状结构的下游区域。为生成LicKM，在环区分裂且如图所示组装编码Lic B的基因。以工程学改变过程中产生单一克隆位点。该图B部分展示工程分子LicKM的核酸序列(SEQ ID NO1)。使用特异性引物由PCR进行分裂。PCR产生2个亚克隆(图1A)，命名为A(159个核苷酸，364至522)和C(486个核苷酸，523至1009)。在最后的克隆中，沿片段C的下游克隆片段A，保留原始氨基酸组成。
图1C展示来自野生型LicB的Rec LicB结构。Rec LicB由不含纤维素分解剂(cellulosome)结合域的成熟蛋白组成。目标序列可与N端和C端融合，也可使用BamHI和BglII限制位点融合至环状结构中。
图1D展示工程分子Rec LicB的核酸序列(SEQ ID NO2)。
图1E展示由LicKM核酸(SEQ ID NO1)编码的氨基酸序列(SEQ ID NO3)。
图1F展示由Rec LicB(SEQ ID NO2)编码的氨基酸序列(SEQ ID NO4)。
图1G展示LicKM载体分子变异体的核酸序列(SEQ ID NO5)。它同样具有在5′端产生的KpnI限制位点和在3′端产生的XhoI限制位点以及在环区的BamHI/Bgl位点。
图1H展示由LicKM载体分子变异体(SEQ ID NO5)编码的氨基酸序列(SEQ IDNO6)。
图2.将GFP克隆至rec Lic B的环状结构中以获得重组Lic B-GFP的图示。GFP的编码区域经PCR扩增并克隆至LicB的开放阅读框(open reading frame)中。
用2个步骤由PCR完成克隆。使用图1的图例中所示引物产生2个亚克隆A和C。接着PCR扩增该等编码GFP的序列(在PCR过程中在5′端和3′端分别结合BamHI和BglII限制位点)。接着，使用引入的BamHI和BglII位点将3个片段连接成A-GFP-C以得到LicB-GFP。GFP的引物为正链5′gcag gga tcc atg gtg agc aag ggc gag3′(SEQ ID NO7)反链5′gcag aga tct ctt gta cag ctc gtc cat3′(SEQ ID NO8)。
图3.在0.1％地衣多糖(lichenan)作为基质存在下检测细菌和酵母提取物中地衣多糖酶(lichenase)活性的酶谱。在12％PAGE中分离蛋白。向凝胶中载入由E.coli菌株XL-1blue[C对照，LicB(野生型)，LicKM(工程载体分子)和重组LicB-GFP(E)]和酿酒酵母(Saccharromyces cerevisiae)菌株YPH 857(LicB-GFP(Y)中提取的蛋白。
图4.在工程载体分子LicKM中克隆目标多肽的图示。编码来自呼吸合胞体病毒(respiratory syncytial virus)(RSV)的G蛋白、来自gely fish的绿色荧光蛋白(GFP)和人类干扰素α(IFNα)的目标多肽的DNA片段经PCR扩增并被插入LicKM的开放阅读框中。
图5.A在0.1％地衣多糖作为基质存在下在细菌提取物中检测到的地衣多糖酶活性的酶谱。在12％PAGE中分离蛋白。将从E.coli菌株XL-1 blue中提取的蛋白载入凝胶中。C为阴性对照。LicKM为工程载体分子。LicKM-RSV、LicKM-GFP和LicKM-IFNα为分别含有目标多肽的工程蛋白。B展示Western印迹分析结果。在12％PAGE中分离蛋白，将其电印迹到尼龙膜上并使它与对来自RSV G蛋白的肽具有特异性的单克隆抗体反应。抗体与LicKM-RSV、RSV阳性对照(RSV(C+))和含有相同肽的植物病毒包被蛋白(RSV(植物))反应。不含有目标肽的LicKM提取物对RSV抗体不具有特异性。
图6.经LicKM-RSV腹腔注射(i.p.)免疫的小鼠的RSV G肽特异性血清抗体(IgG)应答。在包被有重组A1MV粒子的板上使用ELISA测定血清抗体应答，该等重组A1MV粒子含有源自RSV G蛋白的相同肽(氨基酸171至191)。数据代表利用免疫前(LicKM-RSV Pre)与抗原第三剂量后的血清(LicKM-RSV最终)获得的OD490值。数字1、2、3与4指示个体动物。
图7.使用Western分析对LicKM-F200进行酶学(A)与血清学(B)检测。在12％PAGE中分离蛋白。A为在0.1％地衣多糖作为基质存在下在植物提取物中检测到的地衣多糖酶活性的酶谱。LicKM-F200(F200)与对LicKM具有特异性的抗体反应。两种方法都检测到了预期尺寸(47kD)的蛋白。
图8.经LicKM-F200腹腔注射免疫的小鼠的RSV F蛋白特异性血清抗体(IgG)应答。使用包被有灭活RSV长链的板由ELISA测定血清抗体应答。数据代表利用免疫前(LicKM-F200Pre)与抗原第三剂量后的血清(LicKM-F200最终)获得的OD490值。数字1、2、3与4代表从个体动物收集的免疫前及免疫后血清样本。
图9.重组LicKM-PAD4的Western印迹分析。将蛋白质经电泳分离(12％SDS-聚丙烯酰胺凝胶)，转移至膜上，并与不同抗体反应。包括单克隆抗体14B7的所有PA特异性抗体识别出了LicKM-PAD4或对照PA。用作阴性对照的A1MV CP或LicKM没有与任何抗体反应。
具体实施例方式
本发明是基于下述发现特定热稳定酶的重组形式可用作表达、稳定、显示、纯化及/或传递所讨论的许多遗传性融合多肽(目标多肽)的载体或载体分子，该等多肽例如为疫苗抗原、酶、抗体(单链)和治疗性多肽。
本发明尤其揭示(i)从热稳定酶及含载体蛋白的异源多肽中衍生的多种热稳定载体分子，(ii)可编码本发明重组载体分子及载体蛋白的核酸构造，和用载体蛋白表达构造转化的细胞与生物体，(iii)在细胞与生物体内制造疫苗抗原的方法，(iv)在动物与人体内激发产生免疫应答的方法，所述免疫应答是针对载体蛋白、尤其是本发明的目标抗原，(v)使用下述载体融合蛋白诱导抗感染性试剂的体液及细胞应答的方法，以及(vi)制造多种工业酶(除热稳定酶之外)及治疗性蛋白的方法。
热稳定酶是在60℃或更高的温度下行使功能的多肽。此项技术中已知的大量热稳定酶可从温泉、火山地区等地中发现的嗜热生物体中获得，并可当作载体分子使用。源自热纤梭菌的地衣多糖酶B(LicB)蛋白为一个此热稳定酶的实例。本发明涵盖从自然来源、即任何微生物源(细菌及真菌)或合成源的热稳定酶中衍生的重组载体分子。这些酶的实例为地衣多糖酶B(Piruzian等人，2002，Mol Genet Genomics，266778-786)、从Bacillus thermactarantis得到并在80℃具有活性的木聚糖酶及木糖苷酶、来自甲烷嗜高热菌(Methanopyrus kandleri)的甲酰基转移酶(formiltransferase)(Shima等人，Biochem Soc.Trans.，2004，32269-272)、Taq聚合酶、来自溜曲霉(Asperigillus tamarii)的α-淀粉酶(Moreira等人，J.Basic Microbiology，2004，4429-35)或从Thermusnonproteolyticus得到的β-葡糖苷酶(Wang等人，J.Bacteriology，2003，1854248-55)。
所属领域技术人员熟知野生型地衣多糖酶B(LicB)基因及蛋白的分子结构(参看，GenBank入藏登记号X63355)。野生型LicB具有27个氨基酸长的单肽和235个氨基酸长的成熟肽。成熟肽具有一个催化域和12个氨基酸(a.a.82-94)的环区。LicB是糖基水解酶家族的成员(水解酶在β葡聚糖1-4位上水解)而且是热稳定蛋白。酶活性的最佳温度在65-70℃范围内。根据野生型Lic B的3D结构，蛋白的N端区与C端区共同位于紧靠活性域处。外环位于远离活性域处并暴露于表面上。
本文可交替使用的术语“载体”、“载体分子”“重组载体分子”是指用于表达、稳定、显示、纯化及/或传递与重组热稳定酶翻译性融合的异源多肽的重组热稳定酶。热稳定酶是所选野生型热稳定酶的被修饰成熟多肽，就此意义而言它是重组体。被修饰的成熟多肽缺少一个或一个以上氨基酸部分(或串列或节段)，但被修饰的成熟多肽必须保持其酶活性或热稳定性。举例而言，所述成熟多肽可缺少一个环区或5个或更多氨基酸的串列。另外，例如，破坏环区是通过(i)引入由至少一个单一限制位点(unique restrictionsite)所编码的几个氨基酸；及/或(ii)在基因的环区将其切开产生所述成熟多肽的两个部分(N端与C端部分)，其中随后将这两部分再以基因工程学改变(循环排列)至从C端至N端的单独阅读框。因此，原始C端部分维持与原始N端部分的上游融合。在此再工程学改变期间，可在5′端与3′端、以及包括对应于融合位点处之位置的内部来结合单一限制位点。进行重组以使得所重组的多肽通过5个或更多个氨基酸的受损环部分或串列而侧立于N端及C端。
在本发明的内容中，所述单一限制位点意为在工程学改变期间被引入核酸内的限制位点并且它是存在于所述被工程学改变核酸内的唯一位点。
或者，热稳定酶为重组体是因为它是所选野生型热稳定酶的完全或实质上完全的成熟多肽并且所述重组体编码核酸在5′端与3′端、及视情况在环区内具有单一限制位点以供在N端与C端和在环区内与异源多肽融合。在5′端单一限制位点上游，结合ATG密码子。在3′端单一限制位点下游，结合终止密码子。所属领域技术人员可知道如何通过在核酸水平上进行操作来制造本发明载体分子。
在一个实施例中，对野生型LicB蛋白进行修饰以使其缺少信号肽和纤维素分解剂结合域以利用引入环区的单一克隆位点来制造重组体LicB载体分子。
参看图1C所示的LicB，野生型LicB由前导肽(27个氨基酸，指为Lp)、成熟多肽(235个氨基酸象征性地划分为3个区域(A、1及C))、Pro-thr-框和表示为C-BD的纤维素分解剂结合域所组成。而Rec LicB仅含有缺少Lp及C-BD序列的成熟蛋白(235a.a.)的开放阅读框。然而，在一些实施例中仍保留C-BD。
在另一实施例中，对野生型LicB蛋白进行修饰以使得共同删除其特定区域而且其特定区域经重排及交换以制造重组载体分子。特别是循环改变N端及C端区域(分别表示为A及C)。举例而言，可如下制备本文称为LicKM的重组载体分子。如图1简要说明所述，使用引物组来获得片段A和C，随后把它们连接为C-A，将片段A融合至片段C的开放阅读框内。LicKM保留与野生型相似的酶活性和热稳定性。
载体分子recLicB及LicKM仅为优选及例示性的酶分子。应显而易见的是，可通过突变这些优选载体分子，例如通过删除、增加或替换氨基酸或者通过使这些分子定向进化(directed evolution)或基因重排来制成具有相同或类似或更高热稳定性的大量变异或等同recLicB或LicKM载体分子(及编码等同分子的核苷酸序列)。所属领域技术人员会了解如何执行替换来达到等同或变异LicB基载体分子。本文所用术语变异载体分子将具有与recLicB或LicKM相同的能力，以有助于表达、稳定、显示、纯化或传递与所述分子融合的异源多肽中至少一种作用。
变异或等同载体分子将具有与例示性优选分子(例如LicKM或Rec LicB)一定程度的氨基酸相似性或同一性。此氨基酸的相似性或同一性通常大于60％，优选大于75％，更优选大于80％，仍更优选大于90％，且可大于95％。氨基酸相似性或同一性应在载体分子的关键区域(critical region)最高，所述区域决定分子的热稳定性或涉及决定最终负责其载体功能的三维构型。就此而论，某些氨基酸替换是可接受的而且如果这些替换是在对活性并不关键的区域内或这些替换是不影响分子三维结构的保守氨基酸替换那么它们是可预期的。一类(非极性，如Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Met、Phe、Trp；无电荷极性，如Gly、Ser、Thr、Cys、Tyr、Asn、Gln；碱性，如Lys、Arg、His；或酸性类，如Asp、Glu)中的一种氨基酸被同类中的另一种氨基酸由保守性替换所替代，只要所述替换并不本质上地改变其热稳定性或三维结构。在一些实例中，也可以进行非保守性替换。关键因素在于这些替换不应显著地减损“变异载体分子”促进表达、稳定、显示、纯化或传递异源多肽中至少一种功能的能力。
本文所用术语“载体融合蛋白或载体蛋白”一般是指嵌合融合多肽或蛋白，其中一个或一个以上异源多肽与载体分子融合。
载体蛋白的一般构造可例如为下列任一种NH2-载体分子-异源多肽-COOHNH2-标签(tag)-切割位点-载体分子-异源多肽-COOHNH2-载体分子-切割位点-异源多肽-COOHNH2-标签-载体分子-切割位点-异源多肽-COOHNH2-标签-切割位点-载体分子-异源多肽-COOH。
所述载体分子亦可具有内部融合，在此情况下异源多肽侧接于一个重组载体分子节段的任一边。载体蛋白表现出高度耐热性(至少约为60℃)，此高度耐热性有助于使溶菌液进行加热及/或离心之后从所有其它宿主细胞蛋白、核酸、热原及其类似物分离出融合蛋白。异源多肽在载体分子N端或C端或者在内部融合不会导致酶活性及热稳定性的损失。
所述载体分子或载体蛋白也可以连接一个标签作为纯化工具。所述标签将用作纯化载体分子或载体蛋白的额外工具。所述标签也可以用作纯化作用的逆转(fall back)工具。所述标签是指用于促进纯化通过基因重组表达所制成的融合蛋白的肽。较佳情况是标签与其所能够结合的基质间的键合是可逆的。例如，所述标签可以为与谷胱甘肽有亲和力的谷胱甘肽S转移酶、其中组氨酸与金属具有亲和力的组氨酸残基的肽序列以及所属领域已知的类似物。在本发明一个优选实施例中，此标签为His His His His His His(SEQ ID NO2)，即(His6)。在本发明中，可按需要于载体蛋白内置放一个或一个以上联结子(linker)序列。本文所用术语“异源多肽或蛋白”是指由引入宿主细胞内的核酸所编码的受讨论多肽或蛋白(用于预防、诊断或治疗用途)。术语异源多肽或蛋白不包括热稳定酶或热稳定酶域或其信号肽。用于本发明目的的异源多肽表示高达100kDa和更高的多肽而且它一般是指非所选宿主内源性的多肽，但在需要此过量表达的情况下此定义也包括内源肽。此外，异源多肽也将展示某种形式的可用活性、通常为用于重组疫苗及/或免疫测定的抗原活性或者其它生物活性(例如作为肽激素、生物标记物等)。
所述异源多肽包括生长因子、细胞分裂素、配体、受体和抑止子，以及抗原决定子与抗体。异源蛋白也可包括诸如水解酶的酶，水解酶包括糖酶和脂肪酶。本发明范畴内的代表性多肽包括(但不限于)GFP、IFNα、诸如从破伤风毒素、炭疽热、麻疹病毒、结核杆菌(Mycobacterium tuberculosis)、瘟疫获得的抗原(或抗原决定部位)、及RSV特异性单克隆抗体、胰岛素及其类似物。
此外，也可以按需要使用其它肽或蛋白(或其片段)来补充免疫体系的不同效应子体系，此类肽或蛋白例如为从如白细胞介素-2(IL-2)的细胞分裂素或粒细胞-巨噬细胞菌落刺激因子(GM-CSF)获得的抗原决定部位或同时含有T细胞与B细胞抗原决定部位的肽。举例而言，基于目标抗原的可用核苷酸序列，可以克隆出计算机产生的开放阅读框，在一个适当体系中表达目标多肽并利用自受感染个体获得的材料筛选它们。基于其免疫反应原性(immunoreactogenicity)所选择的目标多肽可用于研制候选疫苗、治疗性或诊断性试剂。筛选可提供高度省时及有效的方法而且如果需要掌握新兴病原体或诸如SARS之疾病爆发动态那么这将变得尤其重要。此外，可以使用所述载体分子来测定用于研制对抗诸如SARS、肺结核的病原体的有效疫苗及亚单元疫苗(例如，使用表面抗原抗B型肝炎)的适当疫苗抗原。
视所述异源多肽在所述载体蛋白中的位置而定，可在载体分子与异源多肽之间引入一个或一个以上切割位点。这可以促进目标多肽的进一步纯化。它也可以提供超过当前蛋白合成方法的优势，当前方法产生必须经过处理的大量反应物和溶剂毒性废物。
举例而言，可引入对蛋白酶或其它可用于有效水解肽键的此等酶类或化学物质具有特异性的先前技术中已知的大量切割位点任何者。所属领域中已知作为内肽酶与外肽酶均具有活性的蛋白酶。举例而言，可将蛋白酶特异性切割位点引入重组LicKM载体蛋白中，以使得所述LicKM载体分子在N端具有聚His标签且在C端具有切割位点，后接诸如抗原决定子及/或受讨论治疗性多肽(如干扰素)的目标多肽。
在一些实施例中，可以添加分泌信号序列以供改进目标多肽的定性与定量参数。使用前导序列或分泌信号序列对于实施本发明而言仅为选择性而非必要的。举例而言，可构筑含具有一个前导序列的载体蛋白的重组载体，以便将异源蛋白的分泌物导向用于培养不同宿主细胞的培养基内。
此体系可使得能够同源合成重组蛋白而且这个体系可允许简单地等比例增加和后续下游处理，例如纯化。该等修饰已运用于所属领域已知的大量蛋白。
无论是在单一位置还是在非邻接位置，所述异源多肽可如先前所概述与载体分子框架融合。一般而言，在载体蛋白作为疫苗的内容中，所含一个或一个以上抗原决定部位能激发免疫应答的异源多肽或氨基酸序列(意即具有两个或多个相同或非相同抗原决定部位的含抗原决定部位节段)为候选多肽，所述免疫应答保护免受或防止感染性疾病或过敏反应。当试图创造用于实验、诊断或治疗用途的双功能抗体时，优选使用含抗原决定部位的节段，在此节段中显示两个或多个独立抗原决定部位。异源多肽可含有可为B细胞抗原决定部位、T细胞抗原决定部位或B细胞与T细胞抗原决定部位混合物的抗原决定部位。在一些内容中，优选的抗原决定部位是B细胞抗原决定部位，其已知为用于中和抗体的目标。
本发明的一个优选实施例是关于具有重组载体分子的载体蛋白，所述重组载体分子与两个或多个含抗原决定部位的非邻接异源多肽节段融合。适于融合的非邻接位置是载体蛋白内的内部位置，包括所述重组载体分子的环区或N端或C端。
在本发明中已发现可在这些环区内进行插入和取代，而不破坏载体分子的完整性或消除使所述重组热稳定酶成为传递表达各种多肽或显示含抗原决定部位异源多肽的有用载体的特点。这些环区内的插入和取代并不会改变所述载体分子显著结构特点之间的关系。所属领域的技术人员会了解如何通过在核酸水平上进行操作来制备本发明的载体蛋白。
在一些实施例中，所述载体蛋白将具有切割位点，以使得与本发明重组载体分子的C端、N端及/或其内部融合的异源多肽可在活体内或活体外被特异蛋白酶切除。此允许待投予至细胞的肽作为更大融合蛋白的一部分，从而使所述更大融合蛋白与游离异源多肽相比更易于纯化和处理。随细胞吸收之后，所述附着于载体分子的异源多肽可从所述分子上剪切下来。
所属领域的技术人员应了解如何通过在核酸水平上进行操作来制备本发明的载体蛋白。构筑含所需编码及控制序列的适当载体采用了所属领域所熟知的标准连接和限制技术。将所分离的质粒、DNA序列或合成的寡核苷酸切割、剪裁(tailor)及重连接成期望形式。可使用诸如植物、昆虫与哺乳动物病毒载体等病毒载体或细菌质粒作为载体。
以下可作为表达载体的代表性实例病毒粒子、质粒、黏粒、细菌人工染色体、病毒DNA(例如牛痘、腺病毒、腐烂痘病毒(foul pox virus)、假狂犬病病毒及SV40衍生物)、酵母质粒、酵母人工染色体和任何其它对特定所讨论宿主(诸如细菌、酵母及其它真菌、植物等)具有特异性的载体。因此，举例而言，多种表达重组载体蛋白的表达载体中的任意一种均可包括DNA。大量适当载体已为所属领域的技术人员所熟知并有市售。举例提供下列载体；细菌pQE70(Qiagen)、pBluescript SK、pBluescript KS(Stratagene)；pTRC99a、pRIT2T(Pharmacia)；真核生物pWLNEO、pXT1、pSG(Stratagene)、pSVK3、pSVLSV40(Pharmacia)。可以使用任何其它质粒或载体，只要它们可在宿主中复制和存活。
可以通过多种程序将能够编码载体蛋白的重组DNA插入所述载体中。一般而言，通过所属领域已知的程序将DNA序列插入至适当限制性核酸内切酶位点中。
表达载体中的DNA序列以人工操作方式连接适当表达控制序列或引导mRNA合成的启动子。本发明中使用的启动子可为源自原核与真核生物体的周身性或组成性及/或组织特异性启动子。组成性启动子的实例为CaMV 35S启动子、胭脂碱合酶启动子、章鱼碱合酶启动子、核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶启动子、Actl、SAM合酶启动子与Ubi启动子及叶绿素a/b结合蛋白启动子。组织特异性启动子的实例为马铃薯蛋白酶抑止剂II(pin2)基因启动子、油菜蛋白(napin)基因启动子、油菜储藏蛋白(cruciferin)基因启动子、β-黄豆蛋白(β-conglycinin)基因启动子、菜豆蛋白(phaseolin)基因启动子、玉米蛋白(zein)基因启动子、油质蛋白(oleosin)基因启动子、酰基载体蛋白十八烷酰-ACP去饱和酶基因启动子、脂肪酸去饱和酶(desaturase)基因启动子、大豆球蛋白、Bec4以及许多来自结瘤(nodule)基因的启动子。许多此类启动子为所属领域中所已知。也涵盖了特异性响应于某些化学物质(铜等)或热休克(HSP)的可诱导启动子。此外，所述启动子还包括被设计成充当启动子的人工序列。选择适当载体及启动子充分位于所属领域一般技术人员水平范围内。表达载体也含有其它适当控制序列或其它有助于转录、翻译及选择的区域。
可将所述表达载体引入一个合适宿主中。所述宿主细胞可以是真核生物细胞，如哺乳动物细胞、植物细胞或酵母细胞；或者所述宿主细胞可以是原核生物细胞，如细菌细胞。也可可用植物及动物细胞培养物来制造本发明的载体蛋白。选择合适宿主被视为在本文教示内容所属领域技术人员范畴内。优选宿主细胞为植物细胞且生物体为植物。可由转化、磷酸钙转染、DEAE-Dextran介导转染或电击(electroporation)或者所属领域已知的其它方法来将构筑体引入宿主细胞中。
视所用宿主细胞而定，使用适合于所述细胞的标准技术来完成转化作用。可对真核生物或其它含有实质细胞壁屏障的细胞使用所属技术领域中已知的采用氯化钙的钙处理。根据所属领域中已知的方法来转化至酵母中。对于无细胞壁的哺乳动物细胞可使用电击或DNA吸收法。已知和常规用于蛋白表达目的的昆虫细胞也可以用作本发明的宿主细胞。对某些植物细胞使用根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)感染。因此，在本发明方法中，利用含受讨论载体蛋白的载体来转化受讨论植物以制造转基因植物。基于农杆菌(Agrobacterium)的转化方法可用于制造转基因植物。若干其它稳定转化植物的方法可在所属领域中获得(参看Piruzian等人，2002，Mol Genet Genomics 266778-786，其以引用的方式并入本文中)。在本发明中，可在植物中表达含有几种目标抗原的RecLicB和LicKM构筑体，所述目标抗原包括RSV肽和B型肝炎表面抗原。
在用所选病毒载体感染宿主植物之后，也可从合适病毒载体表达本发明的载体蛋白。重组病毒载体可通过操作野生型病毒的基因组成分来构筑。优选病毒为含RNA的植物病毒。尽管许多植物病毒具有RNA基因组，但我们熟知遗传信息的组织作用在各组中是不同的。因此，病毒可以是单分体、双分体、三分体病毒。“基因组”是指病毒的总遗传材料。“RNA基因组”阐明作为病毒体(病毒粒子)形式存在的基因组是RNA形式。
满足此需要并因此适合的一些病毒包括苜蓿花叶病毒(Alfalfa Mosaic Virus)(A1MV)，等轴不稳定环斑病毒组(ilarvirus)，黄瓜花叶病毒属(cucumovirus)、如黄瓜绿斑花叶病毒(Cucumber Green Mottle Mosaic virus)(CGMMV)、黄化丝状病毒属(closterovirus)或烟草花叶病毒组(tobamavirus，tobacco mosaic virus group)、如烟草花叶病毒(Tobacco Mosaic virus)(TMV)、烟草蚀纹病毒(Tobacco Etch Virus)(TEV)、豇豆花叶病毒(Cowpea Mosaic virus)(CMV)，及源自雀麦草花叶病毒组(Brome mosaicvirus group)的病毒、诸如雀麦草花叶病毒(BMV)、蚕豆花叶病毒(broad bean mottle virus)及豇豆褪绿花叶病毒(cowpea chlorotic mottle virus)。另外合适的病毒包括水稻坏死病毒(Rice Necrosis virus)(RNV)及诸如番茄金色花叶病毒(tomato golden mosaic virus)(TGMV)的双生病毒(geminivirus)、木薯潜隐病毒(Cassava latent virus)(CLV)及玉米条纹病毒(maize streak virus)(MSV)。这些合适病毒组的每一组受到充分表征并且为所属领域技术人员熟知。所属领域技术人员已使用大量重组病毒载体在植物体内瞬时表达不同多肽。举例而言，参看美国专利第5,316,931号与第6,042,832号；及PCT国际公开案WO 00/46350、WO 96/12028及WO 00/25574，这些专利内容均以引用的方式并入本文中。因此，可用所属领域已知的方法来指导研制本发明重组病毒载体以用于传递反式作用因子(transacting factor)。
本发明中使用的重组病毒载体可为异源病毒载体。本文所指的异源病毒载体为具有一给定类病毒(例如TMV)的重组基因组成分的病毒载体，其具有编码所述给定类病毒核酸序列的移动蛋白，但具有不同类病毒(例如A1MV)的包被蛋白(全长或者截短但具功能性)核酸序列替代所述给定类病毒的原生包被蛋白核酸序列。同样，由来自另一类病毒的异源(意即非原生)移动蛋白代替原生移动蛋白核酸序列而非包被蛋白序列。举例而言，具有A1MV包被蛋白的TMV基因组成分是一种所述异源载体。与之相似，具有TMV包被蛋白的A1MV基因组成分是另一种所述异源载体。所述载体经设计使得这些载体经感染后能够在宿主细胞内复制并在宿主细胞内瞬时表达载体蛋白。
在本发明另一方面，通过利用所提供的转活化(transactivation)体系把病毒载体与转基因植物都用于在宿主植物细胞内表达本发明的载体蛋白。转活化体系具有两种成分(i)转基因植物与(ii)重组病毒载体。宿主植物的遗传转化细胞具有整合至其核基因组内的灭活或沉默载体蛋白编码核酸序列，所述细胞仅在激活沉默序列后才能够编码载体蛋白。为激活此沉默序列，使用一个重组RNA病毒载体，它能够感染宿主植物的细胞且在其中编码一个用于激活灭活或沉默载体蛋白核酸序列表达的因子。编码载体蛋白的核酸序列可通过在启动子序列与编码载体蛋白的核酸序列之间安置一个阻隔序列而变为沉默。所述阻隔序列(例如可选性标记元件或任何其它核酸序列(填充片段))应足以阻隔启动子驱动基因表达的能力。所述阻隔序列必须由重组酶目标位点(例如“FRT”位点)以界定的5′至3′方向侧接于每一边。FRT是指一种核酸序列，在所述序列之处FLP基因的产物、即FLP重组酶可催化该位点特异性重组作用。除感染、复制、移动及分布所述病毒载体所需的基因组元件外，该等载体还含有编码重组酶(例如FLP)或其它因子(例如GAL4-VPl6)的序列以用于活化沉默编码载体蛋白的核酸序列。
根据本发明，本发明范畴中所包括的宿主植物为植物界所有种类的较高等和较低等植物。本发明范畴包括成熟植物、幼苗及种子。成熟植物包括在幼苗之后处于任何发育阶段的植物。幼苗是处于发育早期阶段的很小、不成熟的植物。特定而言，可用作宿主以产生外源序列和多肽的植物包括(但不限于)被子植物、诸如苔纲(Hepaticae)(苔类(liverwort)和藓纲(Musci)(藓类(moss))的苔藓植物(Bryophyte)；蕨类植物(Pteridophyte)，诸如蕨属(fern)、木贼属(horsetail)和石松属(lycopod)；裸子植物(Gymnosperm)，诸如松柏类(conifer)、苏铁类(cycad)、银杏(Ginkgo)和买麻藤(Gnetale)；以及藻类(Algae)，包括绿藻纲(Chlorophyceae)、褐藻纲(Phaeophpyceae)、红藻纲(Rhodophyceae)、蓝藻纲(Myxophyceae)、黄藻纲(Xanthophyceae)和裸藻纲(Euglenophyceae)。
视所选植物的类型和地理位置而定，用于产生载体蛋白的宿主植物可在活体内及/或活体外生长。重要的是所选植物易于在适当野外条件及/或活体外条件下进行培养，包括细胞培养。
在被子植物中，特别涵盖使用作物及/或与作物相关性科的成员。在本发明方法中使用的植物成员也包括种间及/或属间杂种，经突变产生及/或遗传工程学改变的植物。这些科包括而不限于豆科Leguminosae(Fabaceae)，包括豌豆、苜蓿和大豆；禾本科Gramineae(Poaceae)，包括水稻、玉米、小麦；茄科(Solanaceae)，尤其是番茄(Lycopersicon)属、尤其是番茄种(esculentum)(番茄)，茄属(Solanum)、尤其是马铃薯种(tuberosum)(马铃薯)和茄种(melongena)(茄子)，辣椒属(Capsicum)、尤其是辣椒种(Capsicum annum)(胡椒)，烟草及其类似植物；伞形科(Umbelliferae)，尤其是胡萝卜属(Daucus)、尤其是胡萝卜种(Daucus carota)(胡萝卜)，和旱芹属(Apium)，尤其是旱芹种(graveolens dulce)(旱芹(celery))及其类似植物；芸香科(Rutaceae)，尤其是柑橘属(Citrus)(柑橘(orange))及其类似植物；菊科(Compositae)，尤其是莴苣属(Lactuca)，和莴苣(Lactuca sativa)(莴苣(lettuce))及其类似植物以及十字花科(Cruciferae)，尤其是芸苔属(Brassica)和白芥属(Sinapis)。十字花科(Brassicaceae)的“蔬菜”作物成员实例包括但不限于双染色体组四倍体(digenomictetraploid)，诸如芥菜型油菜(Brassica juncea(L.)Czern.)(芥菜)、埃塞俄比亚芥(B.carinata Braun)(ethopian mustard)；和单染色体组二倍体(monogenomic diploid)，诸如甘蓝(B.oleracea(L.))(油菜作物(cole crops))、黑芥(B.nigra(L.)Koch)(blackmustard)、白菜型油菜(B.campestris(L.))(芜菁(turnip rape))和萝卜(Raphanus sativus(L.))(萝卜(radish))。十字花科的“含油种子”作物成员实例包括但不限于甘蓝型油菜(B.napus(L.))(油菜籽)、白菜型油菜、芥菜型油菜(B.juncea(L.)Czern.)和B.tournifortii和白芥(Sinapis alba(L.))(white mustard)。也涵盖亚麻植物。
特别优选的宿主植物可以是由A1MV感染的宿主植物。举例而言，所属领域中已知苜蓿花叶病毒具有全宿主范围。已知易感染病毒的其它物种为黄秋葵(Abelmoschusesculentus)、藿香蓟(Ageratum conyzoides)、尾穗苋(Amaranthus caudatus)、反枝苋(Amaranthus retroflexus)、金鱼草(Antirrhinum majus)、旱芹(Apium graveolens)、根芹菜(Apium graveolens var.rapaceum)、花生(Arachis hypogaea)、Astragalus glycyphyllos、甜菜(Beta vulgaris)、小白菜(Brassica campestris ssp.Rapa)、金盏菊(Calendulaofficinalis)、甜椒(Capsicum annuum)、辣椒(Capsicum frutescens)、兰香草(Caryopterisincana)、长春花(Catharanthus roseus)、青葙(Celosia argentea)、桂竹香(Cheiranthuscheiri)、藜(Chenopodium album)、Chenopodium amaranticol、墙生藜(Chenopodiummurale)、白藜(Chenopodium quinoa)、鹰嘴豆(Cicer arietinum)、菊苣(Cichium endiva)、芫荽(Ciandrum sativum)、大托叶猪屎豆(Crotalaria spectabilis)、甜瓜(Cucumis melo)、黄瓜(Cucumis sativus)、西葫芦(Cucurbita pepo)、瓜尔豆(Cyamopsis tetragonoloba)、胡萝卜(Daucus carota(var.sativa))、美国石竹(Dianthus barbatus)、香石竹(Dianthuscaryophyllus)、一点红(Emilia sagittata)、甜荞(Fagopyrum esculentum)、大豆(Glycinemax)、千日红(Gomphrena globosa)、向日葵(Helianthus annuus)、紫花鹊豆(Lablabpurpureus)、莴苣(Lactuca sativa)、Lathyrus odatus、兵豆(Lens culinaris)、亚麻(Linumusitatissimum)、白羽扇豆(Lupinus albus)、番茄(Lycopersicon esculentum)、大翼豆(Macroptilium lathyroides)、Malva parvifla、紫罗兰(Matthiola incana)、南苜蓿(Medicagohispida)、紫花苜蓿(Medicago sativa)、白花草木樨(Melilotus albus)、Nicotiana bigelovii、克利夫兰烟(Nicotiana clevelandii)、德伯纳依烟(Nicotiana debneyi)、心叶烟(Nicotianaglutinosa)、麦格隆熄丰烟(Nicotiana megalosiphon)、黄花烟(Nicotiana rustica)、林烟草(Nicotiana sylvestris)、红花烟草(Nicotiana tabacum)、罗勒(Ocimum basilicum)、矮牵牛(Petunia x hybrida)、利马豆(Phaseolus lunatus)、菜豆(Phaseolus vulgaris)、山梅花属(Philadelphus)、Physalis flidana、好望角醋栗(Physalis peruviana)、美洲商陆(Phytolacca americana)、豌豆(Pisum sativum)、马铃薯野生种(Solanum demissum)、茄子(Solanum melongena)、龙葵(Solanum nigrum)、Solanum nodiflum、刺萼龙葵(Solanumrostratum)、马铃薯(Solanum tuberosum)、苦苣菜(Sonchus oleraceus)、菠菜(Spinaciaoleracea)、繁缕(Stellaria media)、番杏(Tetragonia tetragonioides)、小蛇麻三叶草(Trifolium dubium)、杂种三叶草(Trifolium hybridum)、绛三叶(Trifolium incarnatum)、红三叶(Trifolium pratense)、白三叶(Trifolium repens)、地三叶(Trifolium subterraneum)、金莲花(Tropaeolum majus)、欧洲绣球荚蒾(Viburnum opulus)、蚕豆(Vicia faba)、绿豆(Vigna radiata)、豇豆(Vigna unguiculata)、长豇豆(Vigna unguiculata ssp.Sesquipedalis)和百日菊(Zinnia elegans)。
在一方面，本发明也包括在动物体内激发免疫应答的方法。本发明载体蛋白激发免疫应答的用途将在以下的实例部分更详细描述。特定而言，这些实验证明(例如)在载体融合蛋白中含B细胞及T细胞抗原决定基的免疫原性异源多肽激发了抗原特异性免疫应答。令人吃惊的是，与本发明载体分子融合的抗原决定子的目标特异性免疫原性显著优于无载体分子单独投与的抗原决定子的目标特异性免疫原性。另外，实验证明有可能对内部插入的含抗原决定基的多肽节段产生体液免疫应答。尽管本文报导的活体内数据是在采用生成抗载体蛋白抗体的鼠科分析的实验中产生的，但是基本原理适用于人类及其它动物，如兔、猪、羊、猴以及黑猩猩。鉴于本专利申请案的揭示内容和所属领域技术人员的普通知识，选择所讨论异源多肽并将所讨论的这些多肽结合入载体分子中以用作免疫原是常规实验的问题。所属领域技术人员可鉴别出具有B细胞抗原决定部位的异源多肽，它们能够在投与动物之后驱动强体液免疫应答。所选择的B细胞抗原决定基将视载体蛋白的期望用途而定。举例而言，如果所述载体蛋白要用作疫苗，那么所述异源多肽可源自由病毒、细菌或其它与引起疾病相关的感染性生物体所表达的蛋白。所选择的异源多肽应为一种含有显现强免疫应答的抗原决定基的异源多肽。一般而言，此异源多肽应包括在感染性生物体表面上发现的蛋白，此类蛋白涉及结合且抗体对其高度接近。
免疫原性异源多肽的选择并不限于与感染性生物体相关的蛋白。举例而言，可使用含有源自前列腺特异性抗原的内部(或在N或C端)插入多肽来诱导强免疫应答。所属领域技术人员应认识到可将能够驱动体液免疫应答的含有一个或一个以上B细胞或T细胞抗原决定基的任何异源多肽包括在内，作为本发明载体蛋白的一部分。已知许多所述异源多肽且其它可通过常规实验来确定。
在某些实例中，希望刺激细胞毒素T细胞作为一部分细胞免疫应答。在这些实例中，具T细胞抗原决定基的异源多肽与载体分子融合，优选内部插入于载体中。细胞毒素T细胞在例如病毒感染、细菌感染、寄生感染和癌症的监视与控制中发挥重要作用。T细胞活化的试验方案允许激发选择性更大的细胞毒素T细胞应答，其具有更大治疗效力。
通常，肽与载体分子C端的融合其间具有一个切割位点，该融合可产生所要的构筑体，其可通过重组载体蛋白特异性切割试剂在活体内裂开。所述载体蛋白特异性切割试剂(例如蛋白酶)在C端残基之后切割载体蛋白融合，从而释放出C端肽。
因此，视与载体蛋白融合的异源多肽类型而定，基于该载体蛋白的疫苗可用于驱动细胞及/或体液免疫应答。给予一个动物物种的载体蛋白的治疗剂量将按被认为有效显现所要免疫应答的剂量而决定。在医药学上可接受或相容的载体或佐剂中投与载体蛋白。因此，本发明也涵盖用于投与载体蛋白的医药组合物。可以这种方式处理的特定疾病实例包括(例如)HIV感染、癌症、胃肠疾病、呼吸道感染等。由所属领域技术人员已知的方法制备所述医药组合物。一般而言，载体蛋白与载剂及其它所属领域中已知的必需性稀释剂混合，以辅助生产稳定并可投药的产品。可通过所属领域技术人员已知的若干方法来完成该医药组合物的投用。这些方法包括腹腔注射(i.p.)、口服、皮内、皮下、鼻内、静脉内或肌肉内。通常待治疗的患者接受载体蛋白的皮下注射每周一次，持续几周。然而，也可以在相似长度的时间内采用口腔或鼻内给药。其结果为过敏及/或自体免疫应答下降。
除了习知的接种方法之外，本发明还可用于DNA接种。在此方法中，把编码适当载体蛋白的DNA引入生物体的细胞内。在这些细胞中，直接表达含有抗原决定基的载体蛋白。经接种动物的内生细胞直接表达本发明的载体蛋白，这允许在延长的时段内连续激发体液和细胞免疫应答。通过向动物细胞内引入编码所要载体蛋白的DNA构筑体可以完成直接表达。这些构筑体通常含有启动子元件和其它引导载体蛋白表达的转录控制元件。可由任何习知的方法来引入DNA构筑体，包括直接注射。优选的投药部位是肌肉组织。与标准免疫试验方案不同，这种直接表达将疫苗在一单个部位注射一次或一次以上。注射之后，疫苗散布于淋巴器官内，在这些淋巴器官中发生单一免疫应答。
实例提供以下实例向所属领域技术人员提供进一步指导，而并不应理解为以任何方式限制本发明。
实例1构筑载体分子与载体蛋白此实例是针对构筑用于在原核和真核细胞中表达的载体蛋白表达载体。
图1展示工程学改变重组载体分子LicKM和recLicB的示意图。字母“l”表示环状结构，A表示环状结构的上游区域(结构域)且C表示环状结构的下游区域(结构域)。为了产生LicKM，在环区分裂并如图所示组装编码成熟Lic B的基因。在工程学改变过程中产生单一克隆位点。图1的B部分展示经改造基因(LicKM)序列。
在2步骤PCR克隆中产生LicKM。使用5和3′引物将lic B基因扩增成2个片段，命名为A(159个核苷酸的lic B基因，364至522)和C(486个核苷酸的lic B基因，523至1009)。在最终克隆中，将片段A克隆到片段C的下游，保留原始氨基酸的组成。
以下是所使用的特异性引物片段C5′引物5′gga tcc ATG GGC GGT TCA TAT CCG TAT-3′(SEQ ID NO10)3′引物5′g cag aga TCT ATA TTC CCT GTC AAG GGT-3′(SEQ ID NO11)片段A5′引物5′aga tcc ATG GTG GTA AAT ACG CCT TTT-3′(SEQ ID NO12)3′引物5′g cac aga TCT ACC GTT AGG ATA GTA TTT TAC-3′(SEQ ID NO13)图1C展示来自野生型LicB构筑rec LicB示意图。
实例2使用recLic B克隆和表达GFP如图2所示，象征性地将recLic B划分为3个区域；l为环状结构。该环状结构上游区域(结构域)表示为A且环状结构的下游表示为C。为了使用recLic B作为载体分子，在所述基因的环区中引入单一克隆位点(BamHI及和Bgll)。将编码GFP(绿色荧光蛋白)的基因克隆到recLic B的环区内以获得recLic B-GFP(图2)。使用大肠杆菌(Esherichiacoli)及和酵母两种表达体系统来表达重组蛋白(图3)。目标多肽不仅可以插入按这个实施例所示将目标多肽的插入环状结构内，而且也可使目标多肽与载体蛋白的N或C端融合。
实例3发酵和载体蛋白的回收通过在LB培养基中隔夜培养处理培养或发酵了经recLic B-GFP构筑体转化的大肠杆菌(E.coli)dH5alpha细胞。发酵连续进行12小时并在细胞浓度为104时进行收集。将两升细胞培养物或发酵液(broth)分为每个容器/瓶中1升，并在10,000rpm下离心30分钟。弃去上清液并用球粒(pellet)来回收载体蛋白。
实例4使用经改造LicKM来克隆和表达多种目标多肽此实例阐述了使用经改造LicKM克隆与表达以下三个目标多肽a.源自呼吸道合胞病毒G蛋白的肽(24a.a.)b.GFP(27kD)c.IFNα.(19kD)为证明经改造LicKM作为载体分子的能力，制造了3个构筑体，其中目标序列多肽(a)编码源自呼吸道合胞病毒G蛋白的24个氨基酸肽的DNA片段、(b)GFP的开放阅读框或(c)人类干扰素α的开放阅读框如图4所示经PCR扩增且克隆到经改造LicKM的开放阅读框中。这三个经改造目标多肽如图5所示在大肠杆菌中表达并在酵母中(未显示数据)表达。图5A显示在0.1％地衣多糖作为底物存在下所检测的细菌提取物中地衣多糖酶活性的酶谱。在12％PAGE中分离蛋白质。向凝胶中装载从大肠杆菌菌株XL-1blue中提取的蛋白。C为阴性对照。LicKM是经改造载体分子。LicKM-RSV、LicKM-GFP和LicKM-IFNα是含有各自目标多肽的经改造蛋白。图5B展示西方印迹分析结果。在12％PAGE中分离蛋白，将其电印迹到尼龙膜上且使它与对来自RSV G蛋白的肽具有特异性的单克隆抗体进行反应。抗体与LicKM-RSV、RSV阳性对照(RSV(C+))和含有相同肽的植物病毒包被蛋白(RSV(植物))反应。不含有目标肽的LicKM提取物对RSV抗体不具有特异性。
实例5用含有源自RSV G蛋白的24个氨基酸肽的LicKM-RSV对小鼠免疫使用每剂量200μg的重组LicKM-RSV对八周龄雌性balB/c小鼠进行免疫，该重组LicKM-RSV经改造以用于表达RSV G蛋白的24个氨基酸(G蛋白的171-191)(Johnson等人，2004，J Virol.2004年6月；78(11)6024-32)。
在腹腔内三次投与0.1ml来进行免疫，每次间隔两星期(第一给药使用体积比为1∶1的弗氏(Freund)完全佐剂(CFA)，第二给药使用体积比为1∶1的弗氏不完全佐剂(CFA)，第三给药不使用任何佐剂)。使用等量的LicKM作为对照。在第一抗原给药的前一天收集预免疫血清样本。每一次免疫作用十二(12)天后从独立小鼠中收集血清样本并评估RSV特异性抗体的滴度。使用固相酶联免疫吸附检测(ELISA)来执行血清的抗原特异性抗体分析。以每孔100μl(每孔1.0微克)含有相同源自RSV G蛋白(磷酸缓冲盐水中10μg/ml)肽的重组A1MV来包被ELISA板(丹麦Nunc Polysorp)，在室温下隔夜(RT，约25℃)。将经包被的板用PBS-Tween(0.05％)洗涤3次且接着以PBS-Tween中的0.5％I-block(Tropix)在室温下封闭至少1小时。在室温下向板中加入一系列血清稀释液(每孔30μl)，历时2至4小时。然后用PBS-Tween(0.05％)对板洗涤3次且在室温下以溶于PBS-Tween中1∶10,000的最终稀释度添加(每孔100微升)与过氧化物酶共轭的次级抗体(羊抗鼠IgG，或者全分子或者特异性γ链)，历时一小时。接着以PBS-Tween对板洗涤5次且在暗处于室温下加入在含尿素的磷酸盐-柠檬酸盐缓冲液中的OPD(Sigma FastTM)底物(100μl每孔)，历时30分钟。以2M H2SO4(每孔50微升)中止反应且由ELISA读板器(ELISA plate-reader)(Spectramax Plus384)在490nM处测量由所结合特异性抗体导致的颜色变化。图6展示以O.D.单位表示的结果。
实例6使用含有RSV F蛋白200氨基酸部分的LicKM-F200来对小鼠进行工程学改变和实验性免疫作用LicKM-F200的工程学改变执行如下使用含有RSV的F、G和M基因的cDNA的质粒DNA作为模板DNA，该质粒DNA从美国国家卫生研究院(National Institute ofHealth)获得(Johnson等人，2004，J Virol.2004年6月；78(11)6024-32)。
使用5′-GCACAGATCTGGGTCCAACATCTGTTTAAC-3′(SEQ ID NO14)和5′-GCACAAGCTTATTTGTGGTGGATTTACCA-3′(SEQ ID NO15)作为5′和3′引物来扩增编码氨基酸324至524的F基因的一部分以供克隆。使用在PCR反应过程中引入的单一限制位点(分别为5′端的BglII位点与3′端的HindIII)来消化经PCR扩增的片段并将其克隆到最终载体中。目标DNA被克隆到E.coli、土壤杆菌和植物病毒表达载体中。使用LicKM-F200获得本实例所描述的结果，其中将目标基因克隆到植物病毒载体D4中并表达于其中。
为了进行表达，将活体外合成的LicKM-F200转录体接种到植物上。使用现有技术已知的程序来进行植物接种。关于感染性RNA转录体和病毒感染程序的指南参看PCT国际公开案WO 00/46350。在接种两星期后，收集样本以用于分析目标蛋白的表达和回收。重组蛋白保持了酶活性(图7A)而且由对LicKM特异性的抗体识别(图7B)。
为激发免疫应答，使用每剂量200μg重组LicKM-F200对八周龄的雌balB/c小鼠进行免疫，所述重组LicKM-F200经工程学改变以供表达RSV F蛋白的200个氨基酸(F蛋白的氨基酸324至524)。在腹腔内投与抗原三次剂量(0.1毫升/剂量)，每次间隔两星期(第一给药使用体积比为1∶1的弗氏完全佐剂(CFA)，第二给药使用体积比为1∶1的弗氏不完全佐剂(CFA)，第三给药不使用任何佐剂)。使用等量的LicKM作为对照。在第一次抗原给药的前一天收集预免疫血清样本。每次免疫十二(12)天后从独立小鼠中获得血清样本并评估RSV特异性抗体滴度。利用固相酶联免疫吸附检测(ELISA)分析血清的抗原特异性抗体。以每孔100μl(每孔1.0微克)的灭活RSV长链(Hy Test，磷酸盐缓冲盐水中10μg/ml)包被ELISA板(丹麦Nunc Polysorp)，在室温下隔夜(RT，约25℃)。经包被的板用PBS-Tween(0.05％)洗涤3次然后用PBS-Tween中的0.5％I-block(Tropix)在室温下封闭至少1小时。在RT下向该等板中加入一系列血清稀释液(30微升/孔)，历时2至4小时。接着用PBS-Tween(0.05％)对板洗涤3次且在室温下以PBS-Tween中1∶10,000的最终稀释度添加(100微升/孔)过氧化物酶共轭次级抗体(羊抗鼠IgG，全分子或γ链特异性)，历时1小时。接着以PBS-Tween洗涤板5次且在暗处于室温下添加(100微升/孔)含尿素的磷酸盐-柠檬酸盐缓冲液中的OPD(Sigma FastTM)底物，历时30分钟。以2M H2SO4(每孔50微升)中止反应且由ELISA读板器(ELISAplate-reader)(Spectramax Plus384)在490nM处测量所结合特异性抗体导致的颜色变化。图8展示以O.D.单位表示的结果。
实例7以含有炭疽热PA蛋白的145氨基酸结构域4的LicKM-PAD4，对小鼠进行工程学改变与实验免疫作用LicKM-PAD4的工程学改变执行如下从NMRC获得含有炭疽热保护性抗原全结构域4(氨基酸621至760)的E.coli质粒DNA作为模板DNA(Moayeri等人，2004，Curr Opin Microbiol.，7(1)19-24)。
使用5′GCACAGATCTAATATTTTAATAAGAGATAAACG3′(SEQ ID NO16)与5′GCACAAGCTTTCCTATCTCATAGCCTTTTT3′(SEQ ID NO17)作为5′和3′引物扩增编码氨基酸621至760的结构域4以供克隆。将经PCR扩增的片段消化并利用在PCR反应过程中引入的单一限制位点(分别为5′端的BglII位点及3′端的HindIII)克隆至最终载体中。将目标DNA克隆到E.coli、土壤杆菌及植物病毒表达载体中。使用LicKM-PAD4获得本实例所描述的结果，其中目标基因被克隆且表达于植物病毒载体D4中。
将活体外合成的LicKM-PAD4转录体接种到烟草植株上以进行表达。植株接种程序与上述实例相同。在接种两星期后，收集组织样本以供分析目标蛋白的表达和回收。由对炭疽热保护性抗原具有特异性的抗体识别出重组蛋白(图9)。
为了诱发免疫应答，使用每剂量200μg的重组LicKM-PAD4对八周龄的balB/c雌小鼠进行免疫，该重组LicKM-PAD4经工程学改变以表达炭疽热PA蛋白的145氨基酸(PA蛋白氨基酸621至760)。腹腔投药0.1ml进行免疫三次，每次间隔两星期(第一剂量使用体积比为1∶1的弗氏完全佐剂(CFA)，第二剂量使用体积比为1∶1的弗氏不完全佐剂(CFA)，而第三剂量不使用任何佐剂)。使用等量的LicKM作为对照。在抗原第一次给药的前一天收集预免疫血清样本。每次免疫十二(12)天后从独立小鼠中收集血清样本并评估RSV特异性抗体滴度。利用固相酶联免疫吸附检测(ELISA)分析血清的抗原特异性抗体。以每孔100μl(每孔1.0μg)的重组PA(10μg/ml在磷酸盐缓冲盐水中10μg/ml)包被ELISA板(丹麦Nunc Polysorp)，室温下隔夜(RT；约25℃)。将经包被的板用PBS-Tween(0.05％)洗涤3次然后用PBS-Tween中的0.5％I-block(Tropix)在室温下封闭至少1小时。在RT下，向该等板中加入一系列血清稀释液(30μl微升/孔)，历时2至4小时。随后用PBS-Tween(0.05％)洗脱洗涤该等板3次且在室温下以PBS-Tween中1∶10,000的最终稀释度添加(每孔100μl)过氧化物酶共轭次级抗体(羊抗鼠IgG，全分子或γ链特异性)，历时1小时。板随后经5x PBS-Tween洗脱洗涤5次且在暗处于室温下历时30分钟加入添加含尿素的磷酸盐-柠檬酸盐缓冲液中的OPD(Sigma FastTM)底物(100μl微升/孔)，历时30分钟。以2M H2SO4(每孔50μl/孔)终中止反应且结合特异抗体导致的颜色变化由ELISA读板器(ELISA plate-reader)(Spectramax Plus384)在490nM中处测量所结合特异性抗体导致的颜色变化。图10展示了以O.D.单位表示的结果。
也将LicKM-HbsAg表达于植物中。使用烟草植株来产生作为与载体蛋白融合的目标抗体。
本说明书所提及的所有公开案、专利和专利申请案代表了本发明所属领域技术人员的水平。本文所涉及的所有申请案、专利和专利申请案以引用的方式并入本文中，该引用程度就如同以引用的方式特定地及个别地并入各个公开案或专利申请案全部内容一般。虽然参考特定实施例对本发明进行了描述，但是对于所属领域技术人员来说显然可使用这些方法的变型和组合，而且预期还可以用本文所作特定描述之外的方式进行实践。因此，本发明包括由权利要求书所界定的本发明精神和范畴内涵盖的所有修改。
权利要求
1.一种重组载体分子，其包含(a)一缺少一个或一个以上氨基酸节段的热稳定酶的经修饰成熟多肽，其中所述经修饰成熟多肽保持其热稳定性；或(b)所述热稳定酶的一实质上完全成熟多肽，其适于在所述成熟多肽的各N端和C端、且视情况在环区中与异源多肽融合。
2.根据权利要求1所述的重组载体分子，其中(a)中的所述成熟多肽经修饰以使其缺少一环区或具有一受破坏环区，或者在所述环区中具有非自然存在于其中的至少一个单一限制位点。
3.根据权利要求1所述的重组载体分子，其中所述热稳定酶选自由下列酶组成的群组地衣多糖酶B(lichenase B)、木聚糖酶(xylanase)、木糖苷酶(xylosidase)、甲酰基转移酶(formiltransferase)、Taq聚合酶、α-淀粉酶、β-葡糖苷酶和β-葡聚糖酶。
4.根据权利要求3所述的重组载体分子，其中所述热稳定酶是地衣多糖酶B。
5.根据权利要求4所述的重组载体分子，其中所述经修饰的成熟多肽或实质上完全成熟的多肽具有一受破坏环区。
6.根据权利要求5所述的重组载体分子，其中所述受破坏环区含有至少一个单一限制位点。
7.根据权利要求5所述的重组载体分子，其中所述成熟多肽具有两个可由所述环区勾绘的可识别区域，其中所述两个可识别区域的方向或位置与野生型成熟多肽中可识别区域的方向或位置不同。
8.根据权利要求1所述的重组载体分子，其中所述重组载体分子是一由SEQ ID NO1或SEQ ID NO2编码的重组载体分子。
9.一种载体蛋白，其包含与至少一个异源多肽融合的重组载体分子，其中所述重组载体分子具有(a)一缺少一个或一个以上氨基酸节段的热稳定酶的经修饰成熟多肽，其中所述经修饰成熟多肽保持其酶活性或热稳定性；或(b)所述热稳定酶的一完全或实质上完全成熟多肽，其适于载有一在所述成熟多肽的各N端和C端、且视情况在环区中融合的异源多肽。
10.根据权利要求9所述的重组载体分子，其中(a)中的所述成熟多肽经修饰以使其缺少一环区或具有一受破坏环区，或在所述环区中具有非自然存在于其中的至少一个单一限制位点。
11.根据权利要求9所述的载体蛋白，其中所述异源多肽是包含两个或更多个相同或不同抗原决定部位的含抗原决定部位节段，而且所述载体蛋白具有刺激对其中所含异源多肽的免疫应答的能力。
12.根据权利要求11所述的载体蛋白，其中所述异源多肽与所述重组载体分子在选自由N端、C端和一内部融合位点的至少一个融合位点处融合。
13.根据权利要求11所述的载体蛋白，其中所述抗原决定部位是B细胞抗原决定部位或T细胞抗原决定部位或者是这两者。
14.根据权利要求11所述的载体蛋白，其中所述相同的抗原决定部位是微生物抗原决定部位。
15.根据权利要求11所述的载体蛋白，其中所述异源多肽在一内部融合位点与所述载体分子融合，所述内部融合位点位于连接所述成熟多肽两个结构域的区域。
16.根据权利要求9所述的载体蛋白，其中所述异源多肽是选自由人类干扰素、GFP、B型肝炎表面抗原、肠毒素、狂犬病病毒糖蛋白、狂犬病病毒核蛋白、诺沃克(Norwalk)病毒衣壳蛋白、胃肠癌抗原、呼吸道合胞病毒G蛋白、呼吸道合胞病毒F蛋白、炭疽热PA蛋白、善宁(Sandostatin)和结肠直肠癌抗原所组成的群组。
17.根据权利要求9所述的载体蛋白，其中所述蛋白进一步包含一由用作分离和纯化用标签的氨基酸残基所组成的序列。
18.根据权利要求9所述的载体蛋白，其中所述标签是His6。
19.一种载体蛋白，其包含一具有来自地衣多糖酶B蛋白的序列的重组载体分子；以及一个或一个以上连接至所述载体分子作为N端、C端或内部融合体的异源多肽，其中所述载体蛋白是热稳定的。
20.根据权利要求19所述的载体蛋白，其中所述载体分子由SEQ ID NO1或2中所给出的序列编码。
21.根据权利要求19所述的载体蛋白，其中所述重组载体分子为约28kD。
22.根据权利要求19所述的载体蛋白，其中所述异源多肽是选自由人类干扰素α、GFP、B型肝炎表面抗原、肠毒素、狂犬病病毒糖蛋白、狂犬病病毒核蛋白、诺沃克病毒衣壳蛋白、胃肠癌抗原、呼吸道合胞病毒G蛋白、呼吸道合胞病毒F蛋白、炭疽热PA蛋白、善宁和结肠直肠癌抗原所组成的群组。
23.一种经分离核酸，其包含一编码一载体蛋白的核酸序列，所述载体蛋白包含一源自地衣多糖酶B、以转译方式与至少一个异源多肽融合的重组载体分子，其中所述核苷酸序列包含SEQ ID NO1或2或一编码一变体载体分子的序列。
24.根据权利要求23所述的经分离核酸，其中所述融合蛋白在N端处进一步包含一信号肽序列。
25.根据权利要求23所述的经分离核酸，其中所述融合蛋白进一步包含一由用作分离和纯化用标签的氨基酸残基所组成的序列。
26.根据权利要求25所述的经分离核酸，其中所述标签是His6。
27.根据权利要求23所述的经分离核酸，其中所述融合蛋白进一步包含一由氨基酸残基组成的序列作为联结子。
28.根据权利要求23所述的经分离核酸，其中编码所述载体蛋白的所述核苷酸序列是由一编码一切割位点的核酸序列而与任何上游序列分离。
29.一种表达载体，其包含根据权利要求23所述的经分离核酸，其中所述经分离核酸是以可操作方式连接以编码所述载体蛋白。
30.一种以根据权利要求29所述的载体转化的宿主细胞。
31.根据权利要求30所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞是植物细胞、细菌、昆虫细胞或酵母细胞。
32.一种用于在植物中产生载体蛋白的方法，其包含(a)提供一植物，所述植物含有一表达序列盒，所述表达序列盒具有一编码一载体蛋白的核苷酸序列，所述载体蛋白包含具有来自成熟热稳定多肽的氨基酸序列的重组载体分子，其中所述核苷酸序列经可操作方式连接以使得所述序列盒的表达可导致所述载体蛋白的转译；(b)使所述植物在可用来表达一核苷酸序列并产生所述载体蛋白的条件下生长；以及(c)视情况回收所述载体蛋白。
33.根据权利要求32所述的方法，其中所述启动子是选自由植物组成性和植物组织特异性启动子所组成的群组。
34.根据权利要求32所述的方法，其中所述载体蛋白表达于所述植物的叶、根或种子中。
35.根据权利要求32所述的方法，其中所述植物是单子叶植物或双子叶植物。
36.根据权利要求32所述的方法，其中所述来自成熟热稳定多肽的氨基酸序列足以向所述载体蛋白提供热稳定性。
37.根据权利要求32所述的方法，其中所述核苷酸序列包含SEQ ID NO1或2或一编码一变体载体分子的序列。
38.一种在原核或真核细胞中表达载体蛋白之后自所述细胞中回收多肽的方法，其中所述载体蛋白包含源自Lic B蛋白的重组载体分子；和一个或一个以上连接至所述载体分子作为N端、C端或内部融合体的异源多肽，所述方法包含(a)溶解所述细胞；(b)将所述溶胞产物加热至足以使非热稳定蛋白变性；(c)在步骤(b)之后由一分离装置将可溶性物质与不溶性物质分离；并且(d)在步骤(c)之后回收所述可溶性物质中的载体蛋白。
39.根据权利要求38所述的方法，其中所述分离装置为一离心装置。
40.根据权利要求38所述的方法，其中分离装置为一过滤装置。
41.一种用于刺激动物中免疫应答的方法，其包含(a)提供一载体蛋白，其包含一与至少一个含抗原决定部位节段以转译方式融合的重组载体分子，其中所述节段包含两个或更多个相同或不同的抗原决定部位；并且(b)在适于刺激免疫应答的条件下对一动物投与步骤(a)的所述载体蛋白。
42.根据权利要求41所述的方法，其中所述重组载体分子与两个或更多个邻接或不邻接的含抗原决定部位节段融合。
43.根据权利要求42所述的方法，其中所述含抗原决定部位的片段与所述重组载体分子在选自由N端、C端和一内部融合位点组成之群组的融合位点处融合。
44.根据权利要求43所述的方法，其中所述重组载体分子是由SEQ ID NO1或2中所给出的核酸序列编码。
全文摘要
本发明提供具有来自热稳定酶的氨基酸序列的重组载体分子和用于表达、回收和传递在活体外或活体内不同体系(细菌、酵母、DNA、细胞培养物，诸如哺乳动物、植物、昆虫细胞培养物、原生质体和全植株)中产生的外源序列(肽和多肽)的方法。还使用来自地衣多糖酶B(Lic B)的序列制备了重组载体分子且将其用作载体蛋白的一部分来表达、回收和传递所讨论的各种目标多肽。
文档编号C12N9/00GK1833030SQ200480020879
公开日2006年9月13日 申请日期2004年5月24日 优先权日2003年5月22日
发明者维达季·尤西波夫, 瓦季姆·梅特, 康斯坦丁·穆西丘克 申请人:美国弗劳恩霍夫股份有限公司