疫苗的制作方法

专利名称：疫苗的制作方法
技术领域：
本发明涉及轮状病毒疫苗制剂。本发明涉及来自一种轮状病毒血清型的减毒轮状病毒群体在预防与来自另一种轮状病毒血清型的轮状病毒感染有关的疾病中的用途。具体地讲，本发明涉及来自G1血清型的减毒轮状病毒群体在预防与来自非G1血清型的轮状病毒感染有关的疾病中的用途。
背景技术：
在世界许多地区，急性传染性腹泻是疾病和死亡的主要原因。在发展中国家，腹泻疾病的影响令人吃惊。在亚洲、非洲和拉丁美洲，估计每年的腹泻病例为30-40亿例，这些病例中约500-1000万导致死亡(Walsh，J.A.等N.Engl.J.Med.，301967-974(1979))。
轮状病毒(rotavirus)被认为是婴幼儿及低龄儿童严重腹泻的最主要的原因之一(Estes，M.K.Rotaviruses and Their Replication in FieldsVirology，第三版，Fields等编辑，Raven出版社，Philadelphia，1996)。据估计轮状病毒疾病是每年超过100万例死亡的原因。轮状病毒所引起的疾病最普遍影响的是6-24个月大的儿童，在温带，该病的流行高峰期一般发生在较冷的月份，而在热带，则全年保持不变。轮状病毒通常以粪-口途径，通过人传人进行传播，潜伏期约1-3天。与6-24个月龄组的感染不同，新生儿一般无症状或仅出现轻微病症。与低龄儿童通常所发生的严重疾病相比，大多数成年人因曾经感染过轮状病毒而受到保护，因此大多数成年人的感染轻微或无症状(Offit，P.A.等，Comp.Ther.，8(8)21-26，1982)。
轮状病毒一般为球状，其名称源自其独特的外壳和内壳的衣壳结构或者双层壳衣壳结构(double-shelled capsid structure)。通常，轮状病毒双层壳衣壳结构包裹着内层蛋白壳或含有基因组的核心。轮状病毒的基因组由11个节段的双链RNA组成，该RNA编码至少11个不同的病毒蛋白。这些病毒蛋白(viral protein，VP)中被称为VP4和VP7的两种蛋白，排列在双层壳衣壳结构的外层。轮状病毒的内衣壳是一种蛋白，该蛋白是被称为VP6的轮状病毒蛋白。尚不清楚这三种特殊的轮状病毒蛋白，在轮状病毒感染后诱发免疫应答中的相对重要性。但是，VP6蛋白决定组抗原(group antigen)和亚组抗原(subgroup antigen)，而VP4蛋白和VP7蛋白则是血清型(serotype)特异性的决定因素。
迄今为止，已鉴定出至少14种轮状病毒G血清型和11种轮状病毒P血清型(Linhares A.C.& Bresse J.S.，Pan.Am.J.Publ.Health2000，9，305-330)。其中，人轮状病毒中，已鉴定出10种G血清型和6种P血清型。
VP7蛋白是一种分子量(MW)为38,000的糖蛋白(非糖基化时为34,000MW)，为第7、第8或第9基因组节段的翻译产物(因不同的毒株而异)。轮状病毒感染后，该蛋白刺激中和抗体的形成。VP4蛋白是一种分子量约88,000的非糖基化蛋白，为第4基因组节段的翻译产物。在轮状病毒感染后，该蛋白同样刺激中和抗体的形成。
由于VP4蛋白和VP7蛋白均为中和抗体所针对的病毒蛋白，因此相信它们将是开发轮状病毒疫苗的主要候选者，以提供针对轮状病毒疾病的保护作用。
已知在儿童期的早期，天然轮状病毒感染会诱发保护性免疫。因此，十分需要一种减毒轮状病毒活疫苗。优选该疫苗应为口服疫苗，因为这是该病毒的天然感染途径。
发现该病毒后，用于预防轮状病毒感染的早期疫苗开发，始于二十世纪七十年代。最初，对来自动物和人体的减毒株进行了研究，取得了各式各样或令人失望的结果。更多近期的努力集中在较为成功的人-动物重配株(reassortant)上。
Ward描述了被称作89-12的轮状病毒株；参见美国专利号5,474,773和Bernstein，D.L.等，Vaccine，16(4)，381-387，1998。89-12毒株是1988年从采自一个患天然轮状病毒病的14个月大儿童的大便样本中分离出来的。根据美国专利号5,474,773，如Ward在J.Clin.Microbiol.，19，748-753，1984中所述的方法，HRV 89-12人轮状病毒随后在原代非洲绿猴肾(AGMK)细胞中通过2次传代，并在MA-104细胞中通过4次传代，进行培养适应。然后，在MA-104细胞中进行3次噬斑纯化(至第9次传代)，再进行2次传代后使之在这些细胞中生长。再进行一次传代(第12次传代)，将其保藏于ATCC，保藏号为ATCC VR 2272。该保藏毒株称为89-12C2。
Bernstein等人于1998年在Vaccine中的论文在下文称为Vaccine(1998)论文。该论文描述了口服给予候选人轮状病毒活疫苗的安全性和免疫原性。该疫苗得自89-12毒株，通过在原代AGMK细胞中传代26次，但未经过噬斑纯化，然后在所建立的AGMK细胞系中再传代7次(共传代33次)使之减毒。
下文中，经过连续传代26次的上述材料被称为P26，经过连续传代33次的材料被称为P33。一般而言，89-12通过传代n次所得到的轮状病毒被称为Pn。
在P33材料后的样品，在非洲绿猴肾细胞系(Vero)细胞中再传代5次。该材料被称为P38。
Vaccine(1998)论文所述的P26分离株(isolates)和P33分离株没有在培养物保藏中心进行保藏，也没有进行分析以确定其遗传特征。
现已发现，文献中所述的P26群体(population)包括多种变异株(variant)的混合物。这已通过下述遗传特征得到证实(参见实施例)。因此，P26不是用于再传代，尤其不是可靠的用于生产不同批次疫苗的一致性群体。同样地，P33包括多种变异株的混合物，也不是可靠的用于生产不同批次的疫苗的一致性群体。
已经发现，P26材料为至少三种VP4基因变异株的混合物。P33和P38同样为两种变异株的混合物。在评价针对这些变异株而接种P33的婴幼儿血清中的中和抗体效价时，就中和表位而言，这些变异株的抗原性似乎不同于保藏在ATCC的89-12C2毒株。
此外，还发现当给予婴幼儿P33材料时，这两种确定的变异株进行复制并排泄。在100例接种婴幼儿中，仅2例显示出因轮状病毒感染而引起的胃肠炎症状，而安慰剂组中有20％被感染。这些发现提示，所述变异株与消除轮状病毒疾病有关。
WO 0112797公开了轮状病毒变异株的分离方法及从克隆的(均一的)人轮状病毒株获得的改良减毒轮状病毒活疫苗。也公开了一种减毒轮状病毒群体(分离株)，其特征在于它包括单一变异株或基本单一变异株，所述变异株由编码至少一种被称为VP4和VP7的主要病毒蛋白的核苷酸序列限定。在题目为拉丁美洲儿童(Latm Americaninfants)(Perez等，第42届抗微生物药物和化疗的交叉学科会议(Interscience Conference on Antimicrobial Agents and Chemotherapy，ICAAC 2002)，2002年9月27-30日，San Diego)的会议论文上，报告了此类针对G9不均一毒株的口服减毒人轮状病毒疫苗的保护功效。WO 0112797的全部内容通过引用结合到本文中。
附图简述

图1为编码P43的VP4蛋白的核苷酸序列。
图2为编码P43的VP7蛋白的核苷酸序列。
发明详述在本发明中，我们确定了减毒轮状病毒群体(attenuated rotaviruspopulation)，其特征在于它包含单一变异株或基本单一变异株，所述变异株由编码至少一种被称为VP4和VP7的主要病毒蛋白的核苷酸序列限定，可用作疫苗，并提供交叉保护作用以抵抗与疫苗所用血清型不同血清型的轮状病毒感染所引起的疾病。
具体地讲，G1轮状病毒群体[例如按照布达佩斯条约，保藏于欧洲动物细胞培养物保藏中心(European Collection of Animal CellCultures，ECACC)，Vaccine Research and Production Laboratory，PublicHealth Laboratory Service，Centre for Applied Microbiology andResearch，Porton Down，Salisbury，Wiltshire，SP4 0JG，United Kingdom，保藏日为1999年8月13日，保藏号为99081301]的用途，可用于预防由G1轮状病毒血清型和至少一种非G1轮状病毒血清型(例如G2、G3、G4和G9轮状病毒血清型)所引起的疾病。
因此，本发明涉及来自一种轮状病毒血清型的减毒轮状病毒群体在预防与来自另一种轮状病毒血清型的轮状病毒感染有关的疾病中的用途，其中所述血清型优选由轮状病毒G蛋白的序列所限定。
优选所述轮状病毒群体的特征在于它包括单一变异株或基本单一变异株，所述变异株由编码至少一种被称为VP4和VP7的主要病毒蛋白的核苷酸序列所限定。
优选所述轮状病毒群体包括VP4病毒蛋白和/或VP7病毒蛋白，所述VP4病毒蛋白和/或VP7病毒蛋白得自ECACC保藏材料99081301，适合于提供交叉保护作用。
优选所述减毒轮状病毒血清型为G1，能够针对由G1轮状病毒血清型和非G1轮状病毒血清型所引起的疾病提供交叉保护作用，所述非G1轮状病毒血清型选自诸如以下的血清型G2、G3、G4、G5、G6、G7、G8、G9、G10、G11、G12、G13和G14。
具体地讲，G1减毒轮状病毒群体[例如按照布达佩斯条约，保藏于欧洲动物细胞培养物保藏中心(European Collection of Animal CellCultures，ECACC)，Vaccine Research and Production Laboratory，PublicHealth Laboratory Service，Centre for Applied Microbiology andResearch，Porton Down，Salisbury，Wiltshire，SP4 0JG，United Kingdom，保藏日为1999年8月13日，保藏号为99081301]的用途，可用于预防由G1轮状病毒血清型和至少一种、优选至少两种、更优选至少三种、最优选至少四种非G1轮状病毒血清型所引起的疾病，所述非G1轮状病毒血清型选自G2、G3、G4、G5、G6、G7、G8、G9、G10、G11、G12、G13和G14。在一个特别优选的方面，免疫应答是针对两种以上轮状病毒非G1血清型而诱导的，尤其是针对任何选自以下的血清型而诱导的G2、G3、G4、G5、G6、G7、G8、G9、G10、G11、G12、G13和G14。优选具有针对这些血清型中至少两种、至少三种、至少四种、更优选至少五种或更多种的异型保护，这些血清型不同于疫苗组合物的血清型。除同型(G1)保护外，最优选免疫应答是针对至少一种、优选至少两种、更优选至少三种、最优选至少四种以下非G1血清型所诱导的G2、G3、G4和G9。
具体地讲，本发明提供来自G1血清型的减毒轮状病毒株在制备用于诱导针对不是G1或G9的轮状病毒的免疫应答的疫苗组合物中的用途。在一个优选的方面，免疫应答还是针对因G9血清型和/或G1血清型的轮状病毒感染所诱导的。在一个特别优选的方面，免疫应答是针对两种以上轮状病毒血清型所诱导的，这些血清型不是G1或G9。除了G1或G9血清型外，通常其它任何血清型选自G2、G3、G4、G5、G6、G7、G8、G10、G11、G12、G13和G14。优选具有针对这些血清型中至少两种、至少三种、至少四种、更优选至少五种或更多种的异型保护，这些血清型不同于疫苗组合物的血清型。最优选免疫应答是针对所有以下非G1血清型所诱导的G2、G3、G4和G9。
本发明还涉及诱导针对来自轮状病毒血清型的轮状病毒感染的免疫应答的方法，所述方法包括给予受试者包含来自不同血清型的减毒轮状病毒疫苗的组合物。
优选所述方法是诱导针对轮状病毒非G9血清型的免疫应答的方法，所述方法包括给予受试者包含轮状病毒G1血清型疫苗的组合物，所述疫苗包含本文所定义的单一变异株或基本单一变异株。
优选所述疫苗组合物中的轮状病毒群体具G1P1A P[8]特异性。更优选所述轮状病毒群体包括VP4病毒蛋白和/或VP7病毒蛋白，来自ECACC保藏材料99081301，适合于诱发免疫应答，一般提供交叉保护作用。优选所用轮状病毒疫苗为ECACC保藏材料99081301，或来源于该保藏材料。
在一个实施方案中，本发明不包括对应于ECACC 99081301的轮状病毒株在上述用于诱导针对单独的G9血清型的免疫应答的方法或用途中的应用，尽管总的来讲不排除用于诱导针对G9的免疫应答的该G1毒株与诱导针对其它G血清型的免疫应答的联合应用。
本发明适当地涉及在上述方法或用途中的G1P8轮状病毒株。
优选所述疫苗按两剂方案使用。
优选所述疫苗提供针对胃肠炎的交叉保护作用。因此，另一方面，本发明提供一种方法，其中在接种个体的群体中，所用组合物针对由与该组合物中存在的减毒轮状病毒型别不同的轮状病毒感染所引起的腹泻的保护率高达60％。另一方面，本发明提供一种方法，其中所述组合物针对由与该组合物中存在的减毒轮状病毒型别不同的轮状病毒感染所引起的胃肠炎的保护率高达81％。又一方面，本发明提供一种方法，其中所述组合物包含G1轮状病毒株，在接种个体的群体中，针对由至少两种非G1血清型轮状病毒感染所引起的严重胃肠炎的保护率高达83％。
在接种个体的群体中，优选针对由与该组合物中存在的减毒轮状病毒型别不同的轮状病毒感染所引起的腹泻和/或胃肠炎和/或严重胃肠炎的保护率为10-90％，更优选20-80％，最优选至少50％。
提供交叉保护作用所用的轮状病毒疫苗具有以下优选的特征优选本发明的轮状病毒群体为克隆变异株。
所谓包括单一变异株或基本单一变异株的群体，是指含有不超过10％、优选小于5％、最优选小于1％的一种或多种不同变异株的轮状病毒群体。可通过在合适的细胞类型中传代，或者通过进行一系列的一个或多个克隆步骤，使病毒群体纯化至均一或基本均一。
本发明的一个优势是包括单一变异株的群体更适于制备批次一致的疫苗。由编码主要病毒蛋白的核苷酸序列所限定的具体变异株，在预防轮状病毒感染时也可能与功效提高有关。
在一个优选的方面，本发明轮状病毒群体中的单一变异株或基本单一变异株，是VP4基因的核苷酸序列中包含至少一个以下碱基的变异株从起始密码子起788位的腺嘌呤碱基(A)、802位的腺嘌呤碱基(A)和501位的胸腺嘧啶碱基(T)。
在又一个方面，本发明群体中的单一变异株或基本单一变异株，是VP7基因的核苷酸序列中包含至少一个以下碱基的变异株从起始密码子起605位的胸腺嘧啶(T)、897位的腺嘌呤(A)或897位的鸟嘌呤(G)。优选897位具有腺嘌呤(A)。
在一个优选的方面，本发明群体中的单一变异株，在VP4基因序列中，从起始密码子起788位和802位具有腺嘌呤(A)，501位具有胸腺嘧啶(T)。
在另一个优选的方面，本发明群体中的单一变异株，在VP7基因序列中，从起始密码子起605位具有胸腺嘧啶(T)，897位具有腺嘌呤/鸟嘌呤(A/G)。最优选在VP7序列中，897位具有腺嘌呤(A)。
在一个特别优选的方面，本发明群体中的单一变异株，在VP4基因序列中，从起始密码子起788位和802位具有腺嘌呤(A)，501位具有胸腺嘧啶(T)，在VP7序列中，从起始密码子起605位具有胸腺嘧啶(T)，897位具有腺嘌呤/鸟嘌呤(A/G)。最优选在VP7序列中，897位具有腺嘌呤(A)。
在另一个方面，所述单一变异株包括编码VP4蛋白的核苷酸序列(其中核苷酸序列如图1所示)和/或编码VP7蛋白的核苷酸序列(其中核苷酸序列如图2所示)。
本发明所用优选的轮状病毒群体可通过包括下述步骤的方法得到轮状病毒制备物在合适的细胞类型中传代；任选用下述步骤之一选择均一培养物a)有限稀释；或
b)单个噬菌斑分离；和通过对VP4和/或VP7基因序列的合适区进行序列测定，检查存在的基本单一变异株。
优选所述群体来源于如上所述的P33毒株或P26毒株。
可通过定量或半定量杂交技术，例如狭线印迹杂交或噬菌斑杂交，适当地进行序列测定。
优选所选变异株是在起始轮状病毒制剂给予人类受试者，特别是儿童时，进行复制和排泄的变异株。
用本发明方法所得到的克隆病毒群体，可通过在合适的细胞系中进一步传代进行扩增。
上述方法中，用于轮状病毒群体传代的合适细胞类型包括非洲绿猴肾(AGMK)细胞，其可以是已建立的细胞系或原代AGMK细胞。合适的AGMK细胞系包括例如Vero(ATCC CCL-81)、DBS-FRhL-2(ATCC CL-160)、BSC-1(ECACC 85011422)和CV-1(ATCC CCL-70)。合适的还有MA-104(猕猴)和MRC-5(人-ATCC CCL-171)细胞系。Vero细胞特别优选用于扩增目的。Vero细胞中的传代得到高的病毒产率。
检测用所述方法得到的病毒群体是否是单一变异株的技术，以及测定该单一变异株性质的技术，包括本领域已知的标准测序方法或标准杂交方法，将在下文中进行说明。
在一个优选的方面，使用合适的轮状病毒，特别是使用具有89-12毒株特征的轮状病毒及其传代衍生物，来实施本发明的方法。
一个特别优选的单一变异株群体为P43，P43是从P33(一种在合适细胞类型中培养传代33次的分离的人轮状病毒)通过一系列终点稀释克隆步骤，再将克隆材料在Vero细胞中传代进行扩增而获得的。
按照布达佩斯条约，将P43群体保藏于欧洲动物细胞培养物保藏中心(European Collection of Animal Cell Cultures，ECACC)，VaccineResearch and Production Laboratory，Public Health Laboratory Service，Centre for Applied Microbiology and Research，Porton Down，Salisbury，Wiltshire，SP4 0JG，United Kingdom，保藏日为1999年8月13日，保藏号为99081301。
虽然该所示的公众获取途径是得到人轮状病毒P43最简单的方法，但也可通过本发明所给出的方法或其它方法得到类似的和功能基本相同的轮状病毒。此类功能基本相同的轮状病毒被视为在生物学上等同于本发明的人轮状病毒P43，因此包括在本发明的总的范围内。因此，应该理解，本发明包括具有本文所述P43变异株特征的轮状病毒群体。
另外，还应该理解，本发明包括通过对保藏的P43 ECACC99081301作进一步处理而得到的材料，所述处理例如用该活病毒经再传代、克隆或其它方法进行繁殖，或者用包括遗传工程技术或重配技术(reassortant technique)的方式对P43进行修饰。这些步骤和技术是本领域众所周知的。
本发明所包括的来源于保藏的P43的材料，包括蛋白材料和基因材料。尤其令人感兴趣的是，包含至少一种P43抗原或至少一种P43节段的重配轮状病毒，例如包含轮状病毒强毒株的重配子(reassortant)，该重配子所包含的轮状病毒强毒株的11个基因组节段中有1个基因组节段或其部分，被P43的基因组节段或其部分所置换。准确地讲，轮状病毒重配可具有许多有用的特性，该轮状病毒重配子中编码NSP4的节段或部分节段是P43节段或P43的部分节段。重配轮状病毒及其制备技术是众所周知的(Foster，R.H.和Wagstaff，A.J.Tetravalent Rotavirus Vacine，a review.ADIS drug evaluation(四价轮状病毒疫苗，综述。受滋病药物评价)，BioDrugs，Gev，9(2)，155-178，1998)。
尤其令人感兴趣的材料是P43的子代和P43的免疫活性衍生物。免疫活性衍生物，是指从P43病毒或用P43病毒所得到的材料，特别是所述病毒的抗原，当将所述材料注射到宿主动物体内时，能够诱发针对轮状病毒发生反应的免疫应答。
在使轮状病毒适应合适的细胞系，例如Vero细胞时，可能需要对病毒进行处理以便除去任何潜在的污染物，例如任何可能存在的外来因子，否则就会引起污染。就乙醚敏感性外来病毒而论，可使用下文所述的乙醚处理方法进行处理。本发明还涉及在整个方法中将此类乙醚处理作为任选步骤，以得到减毒活轮状病毒或用所述减毒活轮状病毒所配制的疫苗的内容。
优选包含有单一轮状病毒变异株或基本单一轮状病毒变异株的疫苗，然而，使用单一变异株或基本单一变异株并不是必需的。本发明的交叉保护性轮状病毒株可与其它轮状病毒株联合应用，以提供针对轮状病毒感染或轮状病毒疾病的额外保护作用或交叉保护作用。
因此，P43与其它轮状病毒变异株(例如其它克隆变异株，或其它病毒，特别是其它减毒病毒)的混合物也在本发明的范围内。此类混合物用于下文所述的本发明的疫苗中。
本发明还提供能够提供交叉保护作用的减毒轮状病毒活疫苗，优选所述疫苗包含基本单一变异株的群体、合适的佐剂或药用载体，并将其混合在一起。
优选本发明的轮状病毒疫苗为含有单一轮状病毒株的单价轮状病毒疫苗。
本发明的特别优势在于提供轮状病毒活疫苗，所述疫苗中活的减毒轮状病毒是人轮状病毒，因而不会引起肠套叠。
按照本发明，与减毒轮状病毒株一起使用的合适药用载体包括本领域已知的适合于口服给药，特别是适合于婴幼儿的药用载体。此类载体包括但不限于糖类、多元醇、氨基酸、氢氧化铝、氢氧化镁、羟基磷灰石、滑石粉、二氧化钛、氢氧化铁、硬脂酸镁、羧甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、微晶纤维素、明胶、植物胨、黄原胶、caraghenane、阿拉伯树胶、β-环糊精。
本发明还提供制备轮状病毒疫苗的方法，例如在合适稳定剂存在下，将该病毒冷冻干燥，或者将本发明的病毒与合适的佐剂或药用载体混合在一起。
将本发明病毒配制在病毒体或脂质体等脂质型载体中，配制在水包油型乳液中，或者与载体颗粒配制在一起，可能也会有优势。另一方面，或者另外，所述制剂中也可包括免疫刺激剂，例如本领域已知的用于口服疫苗的免疫刺激剂。此类免疫刺激剂包括细菌毒素，特别是以全毒素(完整分子)形式或仅B链(CTB)形式的霍乱毒素(CT)和大肠杆菌(E.coli)的热不稳定肠毒素(LT)。在WO 96/06627、WO 93/13202和US 5,182,109中，描述了比天然LT难转化为它们的活性形式的突变型LT(mLT)。
可有利地包括在内的另外的免疫刺激剂为皂苷衍生物，例如QS21和单磷酰脂质A，特别是3-脱-O-酰化单磷酰脂质A(3D-MPL)。WO 98/56415中描述了作为口服佐剂的纯化皂苷。皂苷和单磷酰脂质A可以单用或者联用(例如WO 94/00153)，并且可以与其它药剂一起制成佐剂系统。3D-MPL为众所周知的佐剂，由Montana的RibiImmunochem公司生产，GB 2122204中描述了它的制备方法。
有关口服免疫用载体和佐剂的概述可参见Vaccine Design，TheSubunit and Adjuvant Approach，Powell和Newman编辑，Plenum出版社，纽约，1995。
本发明还提供给人类受试者、尤其是婴幼儿接种疫苗的方法，所述方法包括给予需要接种的受试者有效量的本发明疫苗组合物。优选所述减毒活疫苗是通过口服给药途径给予的。
在一个优选的方面，本发明的减毒轮状病毒株与抗酸剂一起配制，以使因胃酸所引起的疫苗失活降为最低。合适的抗酸组分包括无机抗酸剂，例如氢氧化铝Al(OH)3和氢氧化镁Mg(OH)2。适用于本发明的市售抗酸剂包括Mylanta(商品名)，其中包含氢氧化铝和氢氧化镁。这些抗酸剂不溶于水，以混悬剂出售。
氢氧化铝为本发明疫苗组合物中特别优选的组分，因为它不仅提供抗酸作用，而且提供佐剂作用。
同样适于用作本发明疫苗抗酸剂的是有机抗酸剂，例如有机酸羧酸盐。本发明疫苗组合物中优选的抗酸剂包括有机酸羧酸盐，优选柠檬酸盐，例如柠檬酸钠或柠檬酸钾。
可用于本发明疫苗组合物中特别优选的抗酸剂为不溶性无机盐——碳酸钙(CaCO3)。碳酸钙能够与轮状病毒缔合，并在与碳酸钙缔合的过程中保持轮状病毒的活性。
在灌装步骤中，为了防止碳酸钙沉淀，制剂中优选含有粘性剂(viscous agent)。
可使用的可行的粘性剂包括假塑性赋形剂。假塑性溶液，是指与其搅拌时的粘度相比，静置时粘度较高的溶液。该类型的赋形剂为天然聚合物，例如阿拉伯树胶、黄耆树胶、琼脂、藻酸盐、果胶或半合成聚合物例如羧甲基纤维素(Tyloses C)、甲基纤维素(Methocels A、Viscotrans MC、Tylose MH和MB)、羟丙基纤维素(Klucels)和羟丙基甲基纤维素(Methocels E和K、ViscontransMPHC)。通常，该假塑性赋形剂与触变剂一起使用。或者可用的粘性剂为具低流动能力的假塑性赋形剂。在足够浓度下，此类聚合物产生结构流体排列，导致静置时具低流动能力的高粘性溶液。该系统需给予一定的能量才能使之流动和移动。需要外部能量(搅拌)暂时破坏结构流体排列以得到流体溶液。
此类聚合物的实例为卡波普(Carbopols)和黄原胶。
触变性赋形剂静置时呈凝胶结构，而搅拌时则形成流体溶液。触变性赋形剂的实例为Veegum(硅酸镁铝)和Avicel RC(约89％微晶纤维素和11％羧甲基纤维素钠)。
本发明的疫苗组合物优选包括选自黄原胶或淀粉的粘性剂。
因此，本发明的疫苗组合物优选与碳酸钙和黄原胶联合配制。
适用于本发明组合物的其它组分包括糖，例如蔗糖和/或乳糖。
本发明的疫苗组合物可包含另外的组分，包括例如矫味剂(特别用于口服疫苗)和抑菌剂。
可以设计本发明疫苗组合物的不同包装规格。
在一个优选的实施方案中，所述疫苗作为液体制剂给予。优选液体制剂在给药前用至少下列两种组分重建i)病毒组分；ii)液体组分。
在该实施方案中，所述病毒组分和液体组分通常存放在独立的容器中，此容器可方便地为一个容器中独立的隔室，或为可以某种方式连接的独立的容器，使得重建最终疫苗组合物时，所述疫苗组合物不会暴露在空气中。
重建前，病毒可为干的形式或液体形式。优选病毒组分是冻干的。冻干病毒比水溶液中的病毒更为稳定。冻干病毒可用液体抗酸组合物适当地重建，以配制液体疫苗制剂。或者，冻干病毒可用水或水溶液重建，在这种情况下，冻干病毒组合物优选包含抗酸组分。
优选所述疫苗制剂包含病毒组分、碳酸钙和黄原胶，其中各组分配制在一起并存放在第一个隔室或容器内，临用前该疫苗制剂用存放在第二个隔室或容器中的水或水溶液进行重建。
在另一个优选的实施方案中，所述疫苗组合物为固体制剂，优选为放入口中时适于立即溶解的冻干块。冻干制剂可方便地以装入药物泡罩包装中的片剂形式提供。
另一方面，本发明提供用于口服给药的速溶片剂形式的轮状病毒疫苗。
另一方面，本发明提供包含活的减毒轮状病毒株、特别是人轮状病毒株的组合物，其中所述组合物为放入口中能够立即溶解的冻干固体制剂。
优选本发明的速溶片剂在受试者的口中足够快地溶解，以防止吞下未溶解的片剂。该方法对于儿童用轮状病毒疫苗特别有利。
优选所述病毒是活的减毒人轮状病毒，其中该病毒与无机抗酸剂(例如碳酸钙)和粘性剂(例如黄原胶)配制在一起。
本发明的又一个方面是提供冻干制剂，其中病毒组分为任何轮状病毒株，该病毒与碳酸钙和黄原胶配制在一起。
可按照已知技术，使用适量的活病毒，配制并给予本发明的疫苗，在一般接种者中提供针对轮状病毒感染的有效保护作用而没有显著的毒副作用。适量的活病毒通常是每剂104-107病灶形成单位(focus forming units，ffu)。典型的疫苗剂量可包括105-106ffu/剂，可在一段时间内分几剂给予，例如两个月间隔内给予两剂。然而通过给予两剂以上的剂量，例如3剂方案或4剂方案也可获益，特别在发展中国家。剂量间隔时间可超过两个月或者在两个月以内。对于单剂方案或多剂方案，活病毒的最佳量，以及给药的最佳时间，可通过包括观察受试者的抗体效价和其它反应等标准研究予以确定。
本发明的疫苗还可包含针对其它疾病有保护作用的其它合适的活病毒，例如脊髓灰质炎病毒(poliovirus)。或者，其它合适的口服给药用活病毒疫苗，可以分剂，但与本发明的轮状病毒疫苗组合物同时给予。
对接种Vaccine(1998)论文中所述P33材料的12名4-6个月大的婴儿的血清，进行了P33、P38、P43和P89-12C2的中和试验。
对于P33、P38和P43，所有所测血清的中和滴度范围相似。统计分析表明，针对所有这三种病毒的总的中和滴度无显著性差异。这提示P33、P38和P43的构象中和表位和非构象中和表位一样很好地被接种P33的婴儿的抗P33血清所识别。该观察结果间接提示，该体外试验所观测到的中和表位在P33、P38和P43之间并没有改变。
然而，P89-12C2的中和滴度范围与P33、P38和P43的中和滴度范围显著不同。这一观察结果提示，P33、P38和P43的构象中和表位和非构象中和表位不是一样很好地被接种P33的婴儿的抗P33血清所识别。这一观察结果间接提示，该体外试验所观测到的中和表位在89-12C2与P33、P38和P43之间有所改变。
本发明非常优选的实施方案包括1.来自G1血清型的减毒轮状病毒株在制备用于诱导针对不是G1轮状病毒或G9轮状病毒的免疫应答的疫苗组合物中的用途。
2.第1项的用途，其中免疫应答是针对由G9血清型和/或G1血清型引起的轮状病毒感染所额外诱导的。
3.第1项或第2项的用途，其中所述免疫应答是针对两种以上轮状病毒血清型所诱导的，这些血清型不是G1或G9。
4.第1-3项中任一项所要求保护的用途，其中除G1血清型或G9血清型外的血清型选自G2、G3、G4、G5、G6、G7、G8、G10、G11、G12、G13和G14。
5.第1-4项中任一项的用途，其中免疫应答是针对所有以下非G1血清型所诱导的G2、G3、G4和G9。
6.第1-5项中任一项的用途，其中所述G1轮状病毒疫苗组合物包含单一轮状病毒变异株或基本单一轮状病毒变异株，所述变异株由编码至少一种被称为VP4和VP7的主要病毒蛋白的核苷酸序列限定。
7.第6项的用途，其中所述组合物包含具有VP4基因的轮状病毒，所述VP4基因在其核苷酸序列中包含至少一个以下碱基从起始密码子起788位的腺嘌呤碱基(A)、802位的腺嘌呤碱基(A)和501位的胸腺嘧啶碱基(T)。
8.第7项的用途，其中所述VP4基因的核苷酸序列中包含以下核苷酸从起始密码子起788位和802位的腺嘌呤碱基(A)和501位的胸腺嘧啶碱基(T)。
9.第6项的用途，其中所述组合物包含具有VP7基因的轮状病毒，所述VP7基因在其核苷酸序列中包含至少一个以下碱基从起始密码子起605位的胸腺嘧啶(T)、897位的腺嘌呤(A)和897位的鸟嘌呤(G)。
10.第7项的用途，其中所述VP7基因的核苷酸序列中包含以下核苷酸从起始密码子起605位的胸腺嘧啶(T)和897位的腺嘌呤(A)或鸟嘌呤(G)。
11.第1-10项中任一项的用途，其中所述组合物包含具有VP4基因的轮状病毒，所述VP4基因在其核苷酸序列中包含从起始密码子起788位和802位的腺嘌呤(A)和501位的胸腺嘧啶(T)；并且其中所述VP7基因在其核苷酸序列中包含从起始密码子起605位的胸腺嘧啶(T)和897位的腺嘌呤(A)。
12.第1-11项中任一项的用途，其中所述组合物能够对轮状病毒感染所引起的胃肠炎和/或腹泻提供保护作用，所述轮状病毒的血清型不同于所述组合物中存在的减毒轮状病毒的G1血清型。
13.第12项的用途，其中在接种个体的群体中，所述组合物针对由至少两种血清型的轮状病毒感染所引起的严重胃肠炎的保护率高达83％，这些血清型不同于所述组合物中存在的减毒轮状病毒的G1血清型。
14.第13项的用途，其中所述严重胃肠炎是由至少四种非G1血清型的轮状病毒感染所引起的。
15.第14项的用途，其中所述非G1血清型为G2、G3、G4和G9血清型。
16.第1-15项中任一项的用途，其中所述轮状病毒株为ECACC保藏材料99081301，或者可得自或来源于ECACC保藏材料99081301。
17第1-16项中任一项的用途，其中所述疫苗按两剂方案使用。
以下非限制性的实施例用于举例说明本发明。
实施例实施例1证明第26次传代(P26)的89-12毒株是多种变异株的混合物对来自不同传代批次的VP4基因和VP7基因进行测序对VP4基因和VP7基因进行测序，该基因来自传代病毒P26(原代AGMK细胞)、传代病毒P33(建立的(与原代相反)AGMK细胞系)、传代病毒P41和传代病毒P43。在一支试管/一个步骤中，对总RNA提取物进行反转录和PCR扩增。
引物Rota 5bis和引物Rota 29bis扩增完整的VP4基因，引物Rota1和引物Rota 2bis扩增完整的VP7基因。用不同引物测定PCR材料的序列(参见表1)。
在VP4中，传代病毒P26序列与传代病毒P33序列有3个碱基不同(从起始密码子起501位bp、788位bp和802位bp)，而在VP7中，也有3个碱基不同(从起始密码子起108位bp、605位bp和897位bp)。
对传代病毒P26的VP4和VP7序列扫描显示，在突变位置，存在作为背景的传代病毒P33序列。由此可见，传代病毒P26是至少两种变异株的混合物。
传代病毒P33序列扫描在VP4中似乎为均一的，对于VP7则是不均一的(参见表2)。
传代病毒P38(得自传代病毒33)在Vero细胞中传代5次，表现出与传代病毒P33(AGMK细胞系)相同的VP4序列和VP7序列。因此，P33和P38群体间无重大改变。
表1用于RT-PCR和测序的寡核苷酸
表2用于杂交的寡核苷酸
表2中黑体字所示碱基为VP4和VP7中具体序列变异的位点。
表3VP4基因和VP7基因的序列变异3.1
注意在来自开发至产品批次水平的三个克隆的第二个克隆中，VP7 897bp位置的核苷酸为G，而不是P43所选克隆的A。这导致在氨基酸序列中，甲硫氨酸取代异亮氨酸。从接种P33材料的婴幼儿大便中排泄出相应所选的P43克隆的变异株，及在VP7中从起始密码子起897bp为G的克隆的变异株。
在表3.1中，在某一特定位置上有两个可选择的碱基，其中第一个表示出现在主要群体中的碱基，而第二个为出现在次要群体中的碱基。主要变异群体和次要变异群体是通过测序中信号的强度而判断的。
3.2
表3.2显示变异株间核苷酸差异所引起的氨基酸变化。
表4
狭线印迹杂交AGMK细胞中传代病毒P26和传代病毒P33间群体的改变，通过狭线印迹杂交得到进一步的证实。使经RT/PCR所产生的VP4基因片段和VP7基因片段与对各变异株专一的寡核苷酸探针杂交(参见表3.1和表3.2)。与用Rota 16、Rota 35和Rota 36而不是Rota 15杂交的P26对比，P33材料VP4的PCR片段，在788位和802位上仅与Rota 16杂交，而不与Rota 15或Rota 35或Rota 36杂交。这些结果证实P26中存在至少三种变异株(参见表4)。
对于P33材料VP7的PCR片段，897位与Rota 41和Rota 42杂交。这些结果证实P33材料中存在至少两种变异株。
实施例2P43克隆的分离与表征为了将P33组分分离成均一的病毒群体，在Vero细胞中对P33/AGMK进行了3次终点稀释，所得病毒用于感染Vero细胞。
用两个标准选择阳性孔根据常规方法，从各孔中所检测的最大量的病灶，以及各板上最多所分离的阳性孔证实了病毒的生长。在96孔微量滴定板中，经3次终点稀释传代后，10个阳性孔在Vero细胞中成功扩增，并对其产率进行评价。
根据产率，将这三个克隆开发成产品批次的传代水平。通过多克隆抗体的免疫识别，在这三个克隆间和这些克隆与P33间表现出相似性。通过狭线印迹杂交对克隆的均一性进行评价。单个克隆的最终选择以产率和序列为基础。
所选克隆在Vero细胞中，通过连续传代进行扩增，以得到母种(Master seed)，工作种(Working seed)和最终的产品批次。
通过对PCR扩增材料的VP4和VP7的测序(结构特征)，以及通过PCR扩增材料的VP4和VP7特异性狭线印迹杂交(均一性)，表征所选克隆不同传代水平的遗传特征。图1和图2分别表示P43材料的VP4基因序列和VP7基因序列，与P41相同。
通过用寡核苷酸探针进行选择性杂交，对所选克隆的均一性进行评价，所述寡核苷酸探针在P26/原代AGMK的序列测定中，用于区别确定的各变异株中VP4区和/或VP7区的核苷酸变化(参见表4)。
VP4片段与Rota 16杂交，而不与Rota 15、Rota 35或Rota 36杂交。
VP7片段与Rota 41杂交，而不与Rota 42杂交。
这些结果证实P43为均一群体。
实施例3潜在外源病毒的去除向P33(生长于AGMK)中加入乙醚，使终浓度为20％，为时1小时。然后向乙醚中通入氮气35分钟。观察到对P33种子(seed)的滴度无影响。
实施例4减毒活疫苗的制备通过以下方法制备用于婴幼儿口服给药的上述产品批次。
1.冻干病毒用标准技术制备不同剂量的病毒。将冷冻纯化病毒块解冻，用合适的培养基组合物(本案为Dulbecco改进的Eagle培养基(Dulbecco′smodified eagle Medium，DMEM)稀释至所需的标准病毒浓度，本案为106.2ffu/ml。然后，将经稀释的病毒用冻干稳定剂(4％蔗糖、8％葡聚糖、6％山梨糖醇、4％氨基酸)进一步稀释至目标病毒滴度，本案为105.6ffu/剂。将0.5ml等量的稳定病毒组合物无菌条件下分装到3ml小瓶中。然后用橡皮塞子不完全地盖上各小瓶，真空下冻干样品，然后，将小瓶完全盖好，用铝盖在小瓶四周卷边以固定塞子。
使用时，用以下抗酸重建剂之一重建病毒(a)柠檬酸盐重建剂将柠檬酸钠溶于水中，过滤除菌，无菌条件下按1.5ml的量分装到重建容器中，浓度为每1.5ml剂量544mg柠檬酸钠·2H2O。重建容器可为例如3ml小瓶，或4ml小瓶，或2ml注射器、或用于口服给药的软塑料挤管。作为使无菌组分保持在无菌条件下的一个备选方法，最终容器可进行高压灭菌。
(b)Al(OH)3重建剂将无菌氢氧化铝混悬剂(Mylanta-商品名)在无菌条件下用无菌水进行稀释，按2ml的量在无菌条件下分装到重建容器(例如2ml注射器，或软塑料挤管)中，各含有48mg Al(OH)3。无菌条件下使用无菌组分的一个备选方法是用γ射线照射氢氧化铝混悬剂(优选在稀释后阶段)。
可包括防止混悬剂沉淀的标准成分。此类标准成分包括例如硬脂酸镁、羧甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、微晶纤维素和硅氧烷聚合物。还可包括对羟基苯甲酸丁酯、对羟基苯甲酸丙酯等抑菌剂或用于食品的其它标准抑菌剂以及矫味剂。
2.液体制剂中的冻干病毒与Al(OH)3用标准技术制备不同剂量的病毒。将冷冻纯化病毒块解冻，用合适的培养基组合物(本案为Dulbecco改进的Eagle培养基(DMEM))稀释至所需的标准病毒浓度，本案为106.2ffu/ml。加入氢氧化铝混悬剂，达到最终量为48mg/剂，病毒组合物用冻干稳定剂(4％蔗糖、8％葡聚糖、6％山梨糖醇、4％氨基酸)稀释至目标病毒滴度，本案为105.6ffu/剂。将0.5ml等量的稳定病毒组合物在无菌条件下分装到3ml小瓶中。然后，按第1部分所述方法，对小瓶进行冻干和密封。
3.用于泡罩包装中的冻干病毒与Al(OH)3用标准技术制备不同剂量的病毒。将冷冻纯化病毒块解冻，用合适的培养基组合物(本案为Dulbecco改进的Eagle培养基(DMEM))稀释至所需的标准病毒浓度，本案为106.2ffu/ml。加入氢氧化铝混悬剂，达到最终量为48mg/剂，病毒组合物用冻干稳定剂稀释至105.6ffu/剂的目标病毒滴度，所述冻干稳定剂可为4％蔗糖、4％葡聚糖或4％氨基酸，或为明胶，或为植物胨，或为黄原胶。使用无菌灌装操作，将0.5ml剂量或优选更少剂量分装到泡罩腔中。将所述组合物冻干，通过热封装密封泡罩腔。
任选包括防止氢氧化铝混悬剂沉淀的标准成分。此类标准成分包括例如硬脂酸镁、羧甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、微晶纤维素和硅氧烷聚合物。还可包括矫味剂。
实施例5不同制剂中轮状病毒的病毒滴定5.1含乳糖制剂和含蔗糖制剂的比较表5
如上表所示，P43轮状病毒或与蔗糖或与乳糖一起配制。
冻干前的病毒滴定是在完全液体制剂(含有蔗糖、葡聚糖、山梨糖醇、氨基酸)中未经冻干步骤的病毒滴度。
良好结果冻干步骤所得减少＜0.5log，以及在“37℃1周后”(加速稳定性试验)所得减少＜0.5log。病毒滴定的精确度约为±0.2log。
结果表明可用蔗糖代替乳糖。
5.2精氨酸的作用和用麦芽糖醇代替山梨糖醇表6
结果表明，加入精氨酸(已知精氨酸在冻干期间能增强病毒的稳定性，并可提供碱性介质以抵消胃酸)后，病毒滴度维持不变。
山梨糖醇趋于使冻干块的玻璃化转变温度大幅度降低。如上所示，这可用麦芽糖醇代替山梨糖醇加以克服，病毒滴度依然维持不变。
5.3各种制剂组合物本实验说明多种制剂都是可行的。
表7
5.4轮状病毒和Al(OH)3抗酸剂之间的缔合表8
用Al(OH)3作为抗酸剂。结果表明，轮状病毒与不溶性无机盐(Al(OH)3)缔合，因为离心时它与Al(OH)3在一起(上清液中的病毒活性减少)。
5.5病毒滴定前用柠檬酸钠溶解Al(OH)3抗酸剂表9
当轮状病毒与Al(OH)3缔合时，有可能冻干每个成分(包括Al(OH)3)。冻干后，通过将Al(OH)3溶解于柠檬酸钠中可能使轮状病毒复原。该步骤不损伤轮状病毒，在溶解步骤后其活性保持不变。
5.6Al(OH)3-轮状病毒缔合释放后轮状病毒的感染性病毒释放(通过载体溶解)的机制可能在体内充分进行。实际上pH6以下，氢氧化铝完全溶解，因此，轮状病毒将在胃中释放。
在胃中，Al+++离子不被吸收(J.J.Powell，R.Jugdaohsingh和R.P.H.Thompson，The regulation of mineral adsorption in the gastrointestinaltrack(矿物质吸收在胃肠道内的调节)，Proceedings of the NutritionSociety(1999)，58，147-153)。
在肠道中，由于pH升高，不溶性形式的铝沉淀出来(Al(OH)3或AlPO4)，并通过自然途径清除。
尚不清楚新形成的Al(OH)3(或AlPO4)沉淀物是否能与游离轮状病毒重新缔合。这提出了Al(OH)3-轮状病毒缔合物本身感染性的问题。
也有可能通过其它机制从Al(OH)3-轮状病毒缔合物中释放出轮状病毒。例如，赖氨酸干扰Al(OH)3上的病毒吸附。
已知如硼酸根、硫酸根、碳酸根和磷酸根等阴离子特异性地吸附在氢氧化铝上，因此，理论上应当有可能从Al(OH)3-轮状病毒缔合物中置换(通过竞争吸附位点)轮状病毒。
因此，轮状病毒可从轮状病毒-Al(OH)3缔合物中释放出来，所释放的轮状病毒保持活性。
该释放或通过在胃中溶解Al(OH)3(经胃中HCl，或经体外柠檬酸钠)，或通过碱性氨基酸(赖氨酸)置换轮状病毒得以实现。
5.7Al(OH)3-轮状病毒缔合物的感染性单剂冻干轮状病毒用水重建，再分成两部分。第一部分作为对照，加入额外体积的水。第二部分加入24mg悬浮于0.240ml水中的Al(OH)3(临床前病毒滴定)。
当存在Al(OH)3时，轮状病毒具活性，与对照样品比较，病毒滴定值较高。
不分开冻干剂量的情况下，加入12mg Al(OH)3或24mg Al(OH)3，重复该实验。
此时，对照样品是用柠檬酸盐-碳酸氢盐缓冲液重建的样品。
因此，在存在Al(OH)3时，病毒滴度再一次较高。
DRVC003A46 DRVC003A46 DRVC003A46+ + +1.5ml WL缓冲液 12mg Al(OH)324mg Al(OH)3/0.120ml/0.240ml+ +1.380ml H2O1.260ml H2O5.34 6.246.055.32 5.956.26
如上述实施例，轮状病毒与Al(OH)3颗粒缔合，因为可通过离心除去病毒。DRVC003A46为冻干轮状病毒制剂(蔗糖2％；葡聚糖4％；山梨糖醇3％；氨基酸2％)。
SDSAA＝2％蔗糖，4％葡聚糖，3％山梨糖醇，2％氨基酸。
根据对上清液所进行的病毒滴定，吸附轮状病毒所需的Al(OH)3量似乎较低(从一剂冻干剂5.7log起，按比例升高病毒滴定)
表10
Al(OH)3上吸附轮状病毒所需时间似乎较短在24mg Al(OH)3存在下，重建一剂冻干轮状病毒，0分钟、15分钟、60分钟和24小时后离心。病毒滴定前，将“沉淀物(culot)”重悬于SDSAA中表11
5.8用CaCO3作为抗酸剂为了避免疫苗中含有铝，使用另一种不溶性无机盐CaCO3(碳酸钙)代替抗酸剂Al(OH)3。
使用CaCO3所观察到的现象与Al(OH)3所述现象类似-轮状病毒与无机盐缔合；-与无机盐缔合时，轮状病毒活性保持；-用酸溶解无机碱有可能从缔合物中释放轮状病毒；-抗酸剂和轮状病毒有可能共冻干。
CaCO3和轮状病毒缔合在第一个试验中，冻干轮状病毒(病毒滴度5.7)用CaCO3水混悬剂(50mg/1.5ml)重建；然后离心，将上清液的病毒滴度与沉淀物的病毒滴度进行比较。

该结果表明，超过90％的轮状病毒与CaCO3缔合。
另外，当病毒缔合时，有可能实现滴定并恢复最初的病毒量。
另外，病毒滴度略高于未加CaCO3所得的病毒滴度。
CaCO3与轮状病毒的缔合量冻干轮状病毒用含水(1.5ml)的CaCO3混悬剂重建10mg50mg100mg然后离心，将上清液的病毒滴度与沉淀物的病毒滴度进行比较。
表12
因此，清楚可见，CaCO3越多，病毒缔合越多，上清液中的病毒越少。
然而，总剂量并不完全恢复(预期总量至少5.3或甚至如之前所得到的5.8——见上)。
Baby Rossett-Rice抗酸滴定中CaCO3对轮状病毒的保护作用用10剂冻干轮状病毒(DRVC003A46)和50mg CaCO3，进行两种baby Rossett-Rice滴定在经典Rossett-Rice滴定中，将抗酸剂与轮状病毒混合，并将HCl加入该介质中。
在“反向(inverse)”baby Rossett-Rice中，情形相反抗酸剂滴加到HCl库(pool)中(正如在体内发生的一样)。
表13
因此，在该体外实验中，在HCl存在下，碳酸钙能够保护约20％的轮状病毒，而氢氧化铝则不能保护。
5.9轮状病毒在CaCO3抗酸剂存在下的冻干表14
这是“整体(all in one)”冻干——轮状病毒和抗酸剂(CaCO3)在同一小瓶中一起冻干。为了防止灌装步骤中CaCO3沉淀，需要粘性剂。此类粘性剂的实例包括黄原胶和淀粉。即使在黄原胶和淀粉存在下，轮状病毒的活性仍然保持不变。
5.10放入口中时迅速崩解的冻干片剂下列制剂证实了″lyoc″概念，即冻干块在口中迅速溶解。
表15
在“lyoc概念”中，可使用黄原胶和淀粉(维持冻干块迅速溶解的特性)。
实施例6碳酸钙作为轮状病毒疫苗组合物中抗酸剂的用途当CaCO3的水混悬剂用作轮状病毒的抗酸剂时，由于碳酸钙粉末密度值接近2.6，平均颗粒粒径为30μm，因此碳酸钙颗粒遇水时存在迅速沉淀的问题。这种沉淀可被下列因素减缓1.增加周围介质的密度；2.增加周围介质的粘度；3.减小颗粒粒径；4.保持颗粒间相互分开。
6.1增加周围介质的密度当将CaCO3-水混悬剂(当置于注射器中)加入到冻干块(含有2％蔗糖、4％葡聚糖、3％山梨糖醇、2％氨基酸)中时，周围介质的密度增加，但CaCO3沉淀的速度与CaCO3-水混悬剂的没有太大区别。
6.2增加周围介质的粘度假塑性赋形剂假塑性溶液是指与其搅拌时的粘度相比，静置时粘度较高的溶液。
该类型的常用赋形剂为天然聚合物，例如阿拉伯树胶黄耆树胶琼脂藻酸盐果胶半合成聚合物，例如羧甲基纤维素(Tyloses C)甲基纤维素(Methocels A、Viscotrans MC、Tylose MH和MB)羟丙基纤维素(Klucels)羟丙基甲基纤维素(Methocels E和K、Viscontrans MPHC)通常这些假塑性赋形剂与触变剂结合使用。
具低流动能力的假塑性赋形剂在足够浓度下，那些聚合物产生结构流体排列，导致高粘性溶液在静置时具有低流动能力。该系统需给予一定的能量才能使之流动和移动。
需要外部能量(搅拌)暂时破坏结构流体排列以得到流体溶液。
此类聚合物的实例为卡波普(Carbopols)和黄原胶。
触变性赋形剂就这些赋形剂来说，静置时得到凝胶结构；而在搅拌时，则得到流体溶液。
触变性赋形剂的实例为Veegum(硅酸镁铝)和Avicel RC(约89％微晶纤维素和11％羧甲基纤维素钠)。
6.3减小颗粒粒径CaCO3颗粒粒径的减小导致化合物抗酸能力的降低。
6.4保持颗粒间相互分开在Veegum和Avicel中情况如此，因其不溶性颗粒(约1μm)比CaCO3颗粒小，为防止聚集而分布在CaCO3颗粒间。
实施例7产品设计下述方案说明可行产品设计的实施例。
7.1注射器中的CaCO3冻干小瓶中已装有临床批号的轮状病毒，可将抗酸剂加入到注射器内的重建液体中。
在该产品包装规格中，不仅在灌装步骤，而且在产品的总保存期(至少二年)内，都必须控制CaCO3的沉淀。
7.2冻干小瓶中的CaCO3 7.3泡罩中冻干在这一情况下，轮状病毒、CaCO3和黄原胶一起直接在泡罩中冻干。

实施例8不同轮状病毒株的冻干表16
在″Fields″第二版第1361页(Raven出版社(1990))中，DS-1、P和VA70毒株分别被描述为人轮状病毒对照株G2、G3和G4血清型。
在这个实验中，将不同轮状病毒株冻干。
实验显示，对于所有轮状病毒株，冻干期间的病毒滴度和加速稳定(37℃1周)时的病毒滴度均维持不变。
实施例9成人中轮状病毒疫苗一剂口服给药的I期安全性研究在18-45岁健康成人中，进行了I期研究，以评价106.0ffu P43疫苗单次口服剂量的安全性和反应原性。
临床实验为双盲和随机的。实验为安慰剂对照和独立的。研究在比利时一家独立中心进行。
研究群体共招募了33名受试者，11名分在安慰剂组，22名分在疫苗组，所有人都完成了该项研究。所有志愿者皆为白种人。年龄范围介于18-44岁，接种时，他们的平均年龄为35.3岁。试验从一月份开始，刚好在一个月内结束。
材料疫苗根据Good Manufacturing Practices(药品生产管理规范)(GMP)条例，生产、纯化、配制和冻干临床批次的P43疫苗。所述各批次通过质量管理和质量认证(Quality Control and Quality Assurance)获准使用。各疫苗小瓶装有下列组分活性成分P43株最少量105.8ffu赋形剂、稳定剂蔗糖 9mg葡聚糖 18mg山梨糖醇 13.5mg氨基酸 9mg安慰剂制备并使用安慰剂小瓶。各安慰剂小瓶装有下列组分赋形剂、稳定剂蔗糖9mg葡聚糖 18mg山梨糖醇13.5mg氨基酸 9mg稀释剂使用注射用水作为稀释剂以重建疫苗和安慰剂。
给药给予疫苗或安慰剂前约10-15分钟，让这两组受试者口服10mlMylanta。Mylanta是经注册的抗酸药。该抗酸药能升高胃中的pH，以防止轮状病毒经过胃时失活。
两小瓶装有105.8ffu/小瓶的冻干P43，用1.5ml注射用稀释水重建，配制疫苗。该疫苗得到的病毒滴度计算值为106.1ffu/剂。该重建疫苗迅速按一次口服剂量给予。
两小瓶冻干安慰剂用1.5ml注射用水重建以配制安慰剂，以单剂口服给药。
安全性和反应原性采用下述安全性标准和反应原性标准主诉一般症状为发热、腹泻、呕吐、恶心、腹痛和食欲减退。给药后8天内予以记录。
给药后30天内，记录非主诉症状。
在整个研究期间，记录严重的不利事件。
给药后8天内，采集腹泻样品。
结果在各个观察阶段，无主诉症状、无非主诉症状、无严重不利事件的报告。
无腹泻病例的报告。
结论SB生物学P43疫苗当以双盲形式让18-44岁健康成年志愿者口服单剂106.1ffu剂量时，该疫苗相对于安慰剂而言是安全的。
实施例10-两剂单价人轮状病毒疫苗RotarixTM在预防G1轮状病毒和非G1(G9)轮状病毒所引起的胃肠炎中的功效进行随机、双盲、安慰剂对照的II期试验，以评价用于婴幼儿免疫的来自G1P人89-12毒株疫苗的保护功效。
准确地讲，所用的疫苗称为RotarixTM，并包含作为轮状病毒组分的、作为ECACC保藏材料99081301保藏的减毒人G1毒株。
2-4个月大的健康婴儿中，493名接种两剂病毒浓度(106ffu)的RotarixTM，504名接种安慰剂，同时接种DTPw-HBV和Hib疫苗，间隔两周后给予OPV。检测腹泻样品中存在的轮状病毒(ELISA)，并测定阳性样品中的血清型(RT-PCR)。
第二剂后两周起所报告的腹泻发作用于功效分析。用20点等级(Ruuska和Vesikari，1990)确定严重程度。评分≥11定义为严重疾病。
结果在上述组中进行了功效临时性的分析，所分离的血清型为G1和G9，几乎均匀分布。在6个月的观察期间，安慰剂组总发病率从对于G1的4.8％到对于G9的3.6％不等。两剂106ffu RotarixTM保护针对由G1所引起的腹泻的所有型别，功效为83％[95％CI50.4-95.7]，针对严重胃肠炎的功效为92％[95％CI47.6-99.8]。如果腹泻由G9引起，则针对腹泻所有型别的保护率都为60％[95％CI0.2-86.0]，针对严重胃肠炎的保护率为81％[95％CI33.0-96.4]。对于每个功效终点，在HRV组中，腹泻发作与安慰剂组相比，统计学上有显著性降低(p＜0.05，双侧费希尔恰当检验(two-sided Fisher′sexact test))。
结论这些结果非常支持，两剂单价HRV疫苗RotarixTM在保护婴幼儿期抵抗均一G1毒株中的功效，针对G9毒株也有交叉保护作用。
实施例11-两剂单价人轮状病毒疫苗RotarixTM按三种不同的病毒浓度给药时在预防G1轮状病毒和非G1(G2、G3、G4、G9)轮状病毒所引起的胃肠炎中的功效进行随机、双盲、安慰剂对照的II期试验，以评价用于婴幼儿免疫的来自G1P人89-12毒株疫苗的保护性功效，以及对住院期(hospitalization)疫苗的功效。
准确地讲，所用的疫苗称为RotarixTM，并包含作为轮状病毒组分的、作为ECACC保藏材料99081301保藏的减毒人G1毒株。
2-4个月大的健康婴儿接受两剂三种不同病毒浓度的RotarixTM(468名接受104.7ffu；460名接受105.2ffu；464名接受105.8ffu)或安慰剂(454名)，同时接受DTPw-HBV和Hib疫苗，间隔两周后给予OPV。检测腹泻样品中存在的轮状病毒(ELISA)，并测定阳性样品中的血清型(RT-PCR)。
第二剂后两周起直到受试者一周岁，所报告的腹泻发作用于功效分析。用20点等级(Ruuska和Vesikari，1990)测定严重程度，评分≥11定义为严重疾病。
结果结果见下表。疫苗组中婴儿轮状病毒胃肠炎的发作要比安慰剂组儿童的发作显著性减少(p＜0.001，双侧费希尔恰当检验)。根据剂量，针对严重轮状病毒胃肠炎的保护功效达86％(95％CI63％-96％)，针对任何轮状病毒胃肠炎的保护功效达70％(95％CI46％-84％)。对于所述各功效终点，在HRV组中，腹泻发作与安慰剂组的相比，统计学上有显著性减少(p＜0.001，双侧费希尔恰当检验)。从胃肠炎大便中鉴定出多个轮状病毒血清型(G1、G2、G3、G4和G9)(ELISA和RT-PCR)，也用于计算针对非G1血清型的疫苗功效。特别是从表19中可看出，对于非G1血清型(G2、G3、G4和G9)，根据剂量，针对严重轮状病毒胃肠炎的功效达83％(95％CI40％-97％)，为单价基于G1的G1P1A P[8]人轮状病毒疫苗诱导针对异型(即非G1)毒株的交叉保护作用的概念提供了证据。
研究期间所报告的轮状病毒胃肠炎发作的特征表17
两剂RIX4414人轮状病毒疫苗针对轮状病毒胃肠炎的保护功效表18
*p＜0.001，根据双侧费希尔恰当检验，疫苗组和安慰剂组间各组的比较(显著性水平α＝005)p＝0.037，根据双侧费希尔恰当检验，疫苗组和安慰剂组间的比较(显著性水平α＝0.05)p＝0.007，根据双侧费希尔恰当检验，疫苗组和安慰剂组间的比较(显著性水平α＝0.05)N＝受试者人数n/％＝报告至少一次特定轮状病毒胃肠炎发作的受试者人数显示精确95％置信区间。
两剂RIX4414人轮状病毒疫苗针对血清型特定严重轮状病毒胃肠炎的保护功效表19
*双例费希尔恰当检验(显著性水平α＝0.05)，用于疫苗组和安慰剂组间各组的比较。
N＝受试者人数n/％＝报告至少一次特定轮状病毒胃肠炎发作的受试者人数显示精确95％置信区间。
结论这些结果非常支持两剂单价HRV疫苗RotarixTM，在保护婴幼儿抵抗由均一G1毒株所引起的任何轮状病毒胃肠炎及严重轮状病毒胃肠炎中的功效，以及针对不均一毒株，即G2、G3、G4和G9广泛的交叉保护作用。
权利要求
1.一种诱导针对由一种轮状病毒血清型引起的轮状病毒感染的免疫应答的方法，所述方法包括给予受试者包含来自不同血清型的减毒轮状病毒株的组合物。
2.权利要求1的方法，其中所述血清型由轮状病毒G蛋白的序列限定。
3.权利要求1的方法，其中所述减毒轮状病毒能够诱导针对至少两种其它轮状病毒株的免疫应答。
4.权利要求1的方法，其中所述减毒轮状病毒能够诱导针对至少三种其它轮状病毒株的免疫应答。
5.权利要求1的方法，其中所述减毒轮状病毒能够诱导针对至少四种其它轮状病毒株的免疫应答。
6.权利要求1的方法，其中所述减毒轮状病毒株为单一轮状病毒变异株或基本单一轮状病毒变异株，所述变异株由编码至少一种被称为VP4和VP7、优选VP7的主要病毒蛋白的核苷酸序列限定。
7.权利要求1的方法，其中所述组合物包含具有VP4基因的轮状病毒，所述VP4基因在其核苷酸序列中包含至少一个以下碱基从起始密码子起788位的腺嘌呤碱基(A)、802位的腺嘌呤碱基(A)和501位的胸腺嘧啶碱基(T)。
8.权利要求7的方法，其中所述VP4基因的核苷酸序列中包含从起始密码子起788位和802位的腺嘌呤碱基(A)和501位的胸腺嘧啶碱基(T)。
9.权利要求1的方法，其中所述组合物包含具有VP7基因的轮状病毒，所述VP7基因在其核苷酸序列中包含至少一个以下碱基从起始密码子起605位的胸腺嘧啶(T)、897位的腺嘌呤(A)和897位的鸟嘌呤(G)。
10.权利要求9的方法，其中所述VP7基因的核苷酸序列中包含从起始密码子起605位的胸腺嘧啶(T)和897位的腺嘌呤(A)或鸟嘌呤(G)。
11.权利要求1的方法，其中所述组合物包含具有VP4基因的轮状病毒，所述PV4基因在其核苷酸序列中包含从起始密码子起788位和802位的腺嘌呤(A)和501位的胸腺嘧啶(T)；并且其中所述VP7基因在其核苷酸序列中包含从起始密码子起605位的胸腺嘧啶(T)和897位的腺嘌呤(A)。
12.权利要求1的方法，其中所述组合物包含G1轮状病毒株，并且用于诱导针对G1血清型和至少一种非G1血清型的免疫应答，所述非G1血清型选自G2、G3、G4、G5、G6、G7、G8、G9、G10、G11、G12、G13和G14血清型。
13.权利要求12的方法，其中所述组合物包含G1轮状病毒株，并且用于诱导针对G1血清型和至少两种非G1血清型的免疫应答，所述非G1血清型选自G2、G3、G4、G5、G6、G7、G8、G9、G10、G11、G12、G13和G14血清型。
14.权利要求12或13的方法，其中所述组合物包含G1轮状病毒株，并且用于诱导针对G1血清型以及G2、G3、G4和G9血清型的免疫应答。
15.权利要求1的方法，其中所述组合物在接种个体的群体中，针对与所述组合物中存在的减毒轮状病毒不同型别的轮状病毒感染所引起的腹泻的保护率高达60％。
16.权利要求1的方法，其中所述组合物针对与所述组合物中存在的减毒轮状病毒不同型别的轮状病毒感染所引起的胃肠炎的保护率高达81％。
17.权利要求1的方法，其中所述组合物包含G1轮状病毒株，所述G1轮状病毒株在接种个体的群体中，针对由至少两种非G1血清型轮状病毒感染所引起的严重胃肠炎的保护率高达83％。
18.权利要求17的方法，其中所述胃肠炎由至少四种非G1血清型轮状病毒感染所引起，所述非G1血清型选自G2、G3、G4、G5、G6、G7、G8、G9、G10、G11、G12、G13和G14。
19.权利要求17或18的方法，其中所述胃肠炎由G2、G3、G4和G9血清型感染所引起。
20.权利要求1的方法，其中所述轮状病毒株为欧洲动物细胞培养物保藏中心(ECACC)保藏材料99081301，或者可得自或来源于ECACC保藏材料99081301。
21.权利要求1的方法，其中所述组合物按两剂方案给予。
22.权利要求1的方法，其中所述减毒轮状病毒株与合适的药用载体或与抗酸缓冲液或与它们两者配制在一起。
23.来自一种血清型的减毒轮状病毒株在制备用于诱导针对由不同轮状病毒血清型引起的轮状病毒感染的免疫应答的药物中的用途。
24.权利要求23的用途，其中所述血清型由所述轮状病毒G蛋白的序列限定。
25.权利要求23或24的用途，其中所述减毒轮状病毒能够诱导针对至少两种其它轮状病毒株的免疫应答。
26.权利要求23-25中任一项的用途，其中所述减毒轮状病毒能够诱导针对至少三种其它轮状病毒株的免疫应答。
27.权利要求23-26中任一项的用途，其中所述减毒轮状病毒能够诱导针对至少四种其它轮状病毒株的免疫应答。
28.权利要求23-27中任一项的用途，其中所述减毒轮状病毒株为单一轮状病毒变异株或基本单一轮状病毒变异株，所述变异株由编码至少一种被称为VP4和VP7、优选VP7的主要病毒蛋白的核苷酸序列限定。
29.权利要求23-28中任一项的用途，其中所述组合物包含具有VP4基因的轮状病毒，所述VP4基因在其核苷酸序列中包含至少一个以下碱基从起始密码子起788位的腺嘌呤碱基(A)、802位的腺嘌呤碱基(A)和501位的胸腺嘧啶碱基(T)。
30.权利要求29的用途，其中所述VP4基因的核苷酸序列中包含从起始密码子起788位和802位的腺嘌呤碱基(A)和501位的胸腺嘧啶碱基(T)。
31.权利要求23-28中任一项的用途，其中所述组合物包含具有VP7基因的轮状病毒，所述VP7基因在其核苷酸序列中包含至少一个以下碱基从起始密码子起605位的胸腺嘧啶(T)、897位的腺嘌呤(A)和897位的鸟嘌呤(G)。
32.权利要求31的用途，其中所述VP7基因的核苷酸序列中包含从起始密码子起605位的胸腺嘧啶(T)和897位的腺嘌呤(A)或鸟嘌呤(G)。
33.权利要求30或32的用途，其中所述组合物包含具有VP4基因的轮状病毒，所述VP4基因在其核苷酸序列中包含从起始密码子起788位和802位的腺嘌呤(A)和501位的胸腺嘧啶(T)；其中所述VP7基因在其核苷酸序列中包含从起始密码子起605位的胸腺嘧啶(T)和897位的腺嘌呤(A)。
34.权利要求23-33中任一项的用途，其中所述组合物包含G1轮状病毒株，并且用于诱导针对G1血清型和至少一种非G1血清型的免疫应答，所述非G1血清型选自G2、G3、G4、G5、G6、G7、G8、G9、G10、G11、G12、G13和G14血清型。
35.权利要求34的用途，其中所述组合物包含G1轮状病毒株，并且用于诱导针对G1血清型和至少两种非G1血清型的免疫应答，所述非G1血清型选自G2、G3、G4、G5、G6、G7、G8、G9、G10、G11、G12、G13和G14血清型。
36.权利要求35的用途，其中所述组合物包含G1轮状病毒株，并且用于诱导针对G1以及G2、G3、G4和G9血清型的免疫应答。
37.权利要求23-36中任一项的用途，其中所述组合物在接种个体的群体中，针对与所述组合物中存在的减毒轮状病毒不同型别轮状病毒感染所引起的腹泻的保护率高达60％。
38.权利要求23-37中任一项的用途，其中所述组合物针对与所述组合物中存在的减毒轮状病毒不同型别的轮状病毒感染所引起的胃肠炎的保护率高达81％。
39.权利要求23-38中任一项的用途，其中所述组合物包含G1轮状病毒株，所述G1轮状病毒株在接种个体的群体中，针对由至少两种非G1血清型轮状病毒感染所引起的严重胃肠炎的保护率高达83％。
40.权利要求38或39的用途，其中所述胃肠炎由至少四种非G1血清型轮状病毒的感染所引起，所述非G1血清型选自G2、G3、G4、G5、G6、G7、G8、G9、G10、G11、G12、G13和G14。
41.权利要求38-40中任一项的用途，其中所述胃肠炎由G2、G3、G4和G9血清型的感染所引起。
42.权利要求23-41中任一项的用途，其中所述轮状病毒株为ECACC保藏材料99081301，或者可得自或来源于ECACC保藏材料99081301。
43.权利要求23-42中任一项的用途，其中所述组合物按两剂方案给予。
44.权利要求23-43中任一项的用途，其中所述减毒轮状病毒株与合适的药用载体或与抗酸缓冲液或它们两者配制在一起。
45.前述权利要求中任一项的方法或用途，其中所述轮状病毒株是G1血清型，能够诱导针对不是G9血清型的非G1血清型的免疫应答。
全文摘要
本发明提供诱导针对由一种轮状病毒血清型引起的轮状病毒感染的免疫应答的方法，所述方法包括给予受试者包含来自不同血清型的减毒轮状病毒疫苗的组合物。
文档编号C12N7/00GK1871027SQ200480031559
公开日2006年11月29日 申请日期2004年8月31日 优先权日2003年9月2日
发明者B·D·A·科劳, B·A·V·德沃斯 申请人:葛兰素史密丝克莱恩生物有限公司