从脂肪组织制备干细胞的方法和系统的制作方法

专利名称：从脂肪组织制备干细胞的方法和系统的制作方法
技术领域：
本发明涉及从吸脂所得抽取物制备干细胞的方法或系统，以及用该方法或系统制备的干细胞和所述干细胞的用途。
背景技术：
主要利用干细胞的再生药物近年来取得了可观的进步。以前认为不存在的各种组织干细胞已被发现并在各种组织中得以鉴定。因而使用再生疗法治疗疾病已受到关注。
但是，再生疗法还无法达到常规应用于大量患有器官或组织功能障碍的患者的程度。到目前为止，只有非常有限数目的这类患者曾通过器官移植或使用辅助医疗系统或装置治疗。考虑到供应者缺乏、排斥、感染、耐久性等方面，这些疗法存在问题。具体而言，供应者缺乏引发了严重的问题。就骨髓移植来说，尽管仍然难以为需要的许多患者提供有限数量的样本，骨髓及脐带血库在国内外已经逐步变得更广泛应用。因此，为克服上述的问题，对使用干细胞的疗法及再生药物的需求持续上升。使用外来组织进行器官移植(如心脏、血管等)的主要障碍在于免疫排斥反应。同种异体移植物(或异体移植物)及异种移植物中发生的变化是公知的。
原肠胚形成后受精卵分裂成三个胚层，即内胚层、中胚层和外胚层。来源于外胚层的细胞主要存在于脑内，包括神经干细胞等。来源于中胚层的细胞主要存在于骨髓内，包括血管干细胞、造血干细胞、间充质干细胞等。来源于内胚层的细胞主要存在于器官中，包括肝脏干细胞、胰脏干细胞等。
间充质细胞如脂肪细胞、骨细胞、韧带细胞、心肌细胞等具有形成身体形体或骨骼的重要功能。因此，日益期望将成组的这些细胞或此类细胞的组织应用于再生药物及移植药物。具体而言，已有报道表明骨髓间充质干细胞可以分化成中胚层器官，而且此类干细胞已经主要在再生药物领域引起关注。但是，此类细胞的分化需要特殊的条件，需要含分化诱导剂(如地塞米松等)的特殊培养基(Nakatsuji，ed.，“Kansaibo·Kuron Kenkyu Purotokoru[Stem cell/Clone Research Protocol]”，Yodosha(2001))。
间充质干细胞是一种组织干细胞。只有小量间充质干细胞天然存在(占人类新生儿骨髓中所有细胞的万分之一，之后迅速减少，在老年人中占所有细胞的二百万分之一)。因此难以分离间充质干细胞。由于已有报道表明间充质干细胞可以分化成除中胚层之外的胚层，其应用范围更宽了。但是，此类分化的条件比上述的条件更特殊。间充质干细胞的已知表面抗原是CD105(+)、CD73(+)、CD29(+)、CD44(+)、CD14(-)、CD34(-)和CD45(-)。
分离间充质干细胞需要很高的成本。另外，获取骨髓细胞通常会使供应者痛苦。而且，如果没有必须使用的特别选定批次的诱导分化血清，这些细胞很难培养，从而增加使用此类干细胞的额外成本和劳动。
另一方面，已发现脂肪含有干细胞(WO00/53795、WO03/022988、WO01/62901；Zuk，P.A.，et al.，Tissue Engineering，Vol.7，211-228，2001；Zuk，P.A.，et al.，MolecularBiology of the Cell，Vol.13，4279-4295，2002)。与其他组织(如骨髓等)相比，从脂肪可以获得大量干细胞，而且干细胞的密度看起来也更高。因此，脂肪已受到关注。用于从脂肪组织制备干细胞的现有方法(日本PCT国家阶段公开No.2003-523267及日本PCT国家阶段公开No.2002-537849)在可用性方面比使用骨髓作为细胞来源时有优势，可以获得更多的量。但是，所述方法需要用胶原酶之类的酶对作为细胞来源的脂肪组织进行处理，因而不可能简单而大量地制备干细胞。考虑到干细胞及前体细胞在再生药物中的应用，现在仍然需要一种简单而大量地制备同种干细胞及前体细胞的方法。

发明内容
本发明的一个目的是提供以简单而高效的方式从人(特别是受试者本身)大量制备同种干细胞和/或前体细胞的方法。
本发明的另一目的是提供使用本发明干细胞和/或前体细胞大量制备组织植入物或移植物的方法。
本发明人意外地发现吸脂所得抽取物中含有大量干细胞，并且建立了从此类吸脂所得抽取物制备干细胞的方法，从而实现了上述目的。
因此，本发明提供了下述内容1.一种制备干细胞的方法，包括A)获得吸脂所得抽取物；B)将吸脂所得抽取物离心以获得细胞级分；C)将细胞级分进行比重离心；以及D)收集比重小于红细胞的细胞层。
2.根据第1项的方法，其中所述吸脂所得抽取物用盐水或林格氏溶液制备。
3.根据第1项的方法，其中所述离心以等于或小于800×g的速度进行。
4.根据第1项的方法，其中所述离心以等于或小于400×g的速度进行。
5.根据第1项的方法，其中所述比重离心以370×g-1,100×g范围的速度进行。
6.根据第1项的方法，其中所述比重离心在20摄氏度下使用比重为1.076～1.078g/ml的介质进行。
7.根据第1项的方法，其中所述比重离心的所述介质选自Ficoll、Percoll和蔗糖。
8.根据第7项的方法，其中所述比重离心介质为Ficoll。
9.根据第1项的方法，其中所收集细胞层的比重在1.050～1.075之间。
10.根据第1项的方法，其中所述细胞层的收集用移液器进行。
11.根据第1项的方法，还包括将所述细胞层在培养基中培养的步骤，该培养基含有选自DMEM、M199、MEM、HBSS、Ham’s F12、BME、RPMI1640、MCDB104、MCDB153(KGM)及其混合物的组分。
12.根据第1项的方法，其中所述比重离心包括密度梯度离心。
13.根据第1项的方法，还包括除去血细胞的步骤。
14.一种制备干细胞的方法，包括A)获得吸脂所得材料；和B)将吸脂所得材料离心以获得细胞级分，而不分离脂肪组织。
15.根据第14项的方法，还包括将所述材料置于至少一部分细胞脱离所述材料的条件下。
16.根据第15项的方法，其中所述条件用于细胞外基质的降解。
17.根据第15项的方法，所述细胞外基质降解通过胶原酶实现。
18.根据第14项的方法，还包括除去步骤B)中上清液的步骤。
19.根据第14项的方法，还包括过滤步骤B)所得材料的步骤。
20.根据第14项的方法，还包括除去血细胞的步骤。
21.根据第14项的方法，其中除去血细胞的步骤包括加入降解血细胞的组分。
22.一种制备干细胞的方法，包括i)获得吸脂所得材料；ii)将所述材料置于至少一部分细胞脱离所述材料的条件下，而不分离脂肪组织；iii)将所述材料进行离心；iv)向所述材料加入降解血细胞的组分并搅拌所述材料；v)将所述材料进行离心以获得沉淀；以及vi)从所述沉淀抽取材料的上清液。
23.根据第22项的方法，其中将材料置于所述条件的步骤包括维持吸脂所得抽取物。
24.根据第22项的方法，其中所述吸脂所得材料包含吸脂所得抽取物和脂肪。
25.根据第22项的方法，其中所述步骤ii)中所述条件包括加入胶原酶。
26.根据第22项的方法，其中所述步骤iii)的离心以400～1200×g进行。
27.根据第22项的方法，其中所述降解血细胞的组分包含氯化铵和碳酸氢钾。
28.根据第27项的方法，其中所述氯化铵在组分中的含量为155mM。
29.根据第27项的方法，其中所述碳酸氢钾在组分中的含量为10mM。
30.根据第22项的方法，其中所述步骤v)的所述离心以400～1200×g进行。
31.根据第22项的方法，其中所述沉淀含有干细胞。
32.根据第1～31项中任一项所述方法制备的干细胞。
33.根据第32项的干细胞，其表达选自CD13、CD29、CD34、CD36、CD44、CD49d、CD54、CD58、CD71、CD73、CD90、CD105、CD106、CD151和SH3的至少一种蛋白质。
34.根据第33项的干细胞，其表达CD13、CD29、CD34、CD36、CD44、CD49d、CD54、CD58、CD71、CD73、CD90、CD105、CD106、CD151和SH3。
35.根据第33项的干细胞，还表达选自CD31、CD45、CD117和CD146的至少一种蛋白质。
36.根据第32项的干细胞，不表达CD56。
37.根据第32项的干细胞，不表达选自CD3、CD4、CD14、CD15、CD16、CD19、CD33、CD38、CD56、CD61、CD62e、CD62p、CD69、CD104、CD135和CD144的至少一种蛋白质。
38.根据第37项的干细胞，不表达CD3、CD4、CD14、CD15、CD16、CD19、CD33、CD38、CD56、CD61、CD62e、CD62p、CD69、CD104、CD135和CD144。
39.根据第32项的干细胞，表达CD49d，而不表达CD56。
40.一种制备干细胞的系统，包含A)获得吸脂所得抽取物的装置；B)将吸脂所得抽取物进行离心以获得细胞级分的装置；以及C)将所述细胞级分进行比重离心的装置。
41.根据第40项的系统，其中该系统还包含D)收集比重小于红细胞的细胞层的装置。
42.一种制备干细胞的系统，包含A)获得吸脂所得材料的装置；以及B)将所述吸脂所得材料进行离心以获得细胞级分而不分离脂肪组织的装置。
43.一种制备干细胞的系统，包含i)获得吸脂所得材料的装置；ii)将所述材料置于不分离脂肪组织而使至少一部分细胞脱离所述材料的条件下的装置；iii)将所述材料进行离心的装置；
iv)向所述材料加入降解血细胞的组分并搅拌所述材料；v)将所述材料进行离心以获得沉淀的装置；以及vi)从所述沉淀抽取材料上清液的装置。
44.一种获取外植体的方法，包括A)获得吸脂所得抽取物；B)将所述吸脂所得抽取物进行离心以获得细胞级分；C)将所述细胞级分进行比重离心；D)收集比重小于红细胞的细胞层；E)培养所收集的细胞层以获得外植体。
45.一种制备组织移植物的方法，包括A)获得吸脂所得抽取物；B)将所述吸脂所得抽取物进行离心以获得细胞级分；以及C)培养所收集的细胞层以获得组织移植物。
46.一种制备组织移植物的方法，包括A)获得吸脂所得抽取物；B)将所述吸脂所得抽取物进行离心以获得细胞级分；C)将所述细胞级分进行比重离心；D)收集比重小于红细胞的细胞层；E)培养所收集的细胞层以获得组织移植物。
47.一种移植组织移植物的方法，包括A)获得吸脂所得抽取物；B)将所述吸脂所得抽取物进行离心以获得细胞级分；C)将所述细胞级分进行比重离心；D)收集比重小于红细胞的细胞层；E)培养所收集的细胞层以获得组织移植物；以及F)移植所述组织移植物。
48.吸脂所得抽取物在制备干细胞中的用途。
49.一种制备细胞的方法，所述细胞选自血管内皮前体细胞、脂肪细胞、软骨细胞、骨细胞和肌细胞，该方法包括培养根据第1～31项中任一项所述方法所得干细胞的步骤。
50.一种制备分化细胞的方法，包括A)将下列a)和b)混合得到混合物a)根据第1～31项中任一项所得的干细胞，b)对应于期望部位的分化细胞；以及B)将所述混合物在使得脂肪组织来源的前体细胞分化的充分条件下培养。
51.根据第50项的方法，其中所述分化细胞为间充质细胞。
52.根据第50项的方法，其中所述分化细胞选自脂肪细胞、骨髓细胞、成骨细胞、软骨细胞、成纤维细胞、成肌纤维细胞、神经细胞、骨骼肌细胞、心肌细胞、血管内皮细胞、血管平滑肌细胞、肝细胞、肾细胞和胰细胞。
53.根据第50项的方法，还包括向所述分化细胞提供促进分化的因子的步骤。
54.根据第50项的方法，其中所述混合物在培养基中培养，所述培养基含有选自下列的至少一种成分肾上腺皮质类固醇、胰岛素、葡萄糖、吲哚美辛、异丁基-甲基黄嘌呤(IBMX)、抗坏血酸及其衍生物、甘油磷酸、雌激素及其衍生物、孕酮及其衍生物、雄激素及其衍生物、生长因子、垂体腺提取物、松果体提取物、视黄酸、维生素D、甲状腺激素、胎牛血清、马血清、人血清、肝素、碳酸氢钠、HEPES、白蛋白、转铁蛋白、硒酸盐、亚油酸、3-异丁基-1-甲基黄嘌呤、去甲基试剂、组蛋白去乙酰基试剂、活化素、细胞因子、六亚甲基双乙酰胺(HMBA)、二甲基乙酰胺(DMA)、二丁基cAMP(dbcAMP)、二甲基亚砜(DMSO)、碘脱氧尿苷(IdU)、羟基脲(hyroxyurea，HU)、阿糖胞苷(AraC)、丝裂霉素C(MMC)、丁酸钠(NaBu)、凝聚胺(polybrene)及硒。
55.一种细胞混合物，包括根据第1～31项中任一项所得的干细胞和对应于期望部位的分化细胞。
56.根据第55项的细胞混合物，其中所述细胞混合物置于足以诱导所述干细胞分化的条件下。
57.一种用于细胞移植的组合物，包含a)根据第1～31项中任一项所得的干细胞；和b)对应于期望部位的分化细胞。
58.根据第57项的组合物，其中所述移植在期望部位进行。
59.根据第57项的组合物，其中所述干细胞和所述分化细胞的比例为约1∶10～约10∶1。
60.根据第57项的组合物，其中所述干细胞和所述分化细胞的比例为约1∶2～约2∶1。
61.根据第57项的组合物，其中所述干细胞和所述分化细胞的比例基本相同。
62.根据第57项的组合物，其中所述分化细胞包括间充质细胞。
63.根据第57项的组合物，其中所述分化细胞选自脂肪细胞、骨髓细胞、成骨细胞、软骨细胞、成纤维细胞、成肌纤维细胞、神经细胞、骨骼肌细胞、心肌细胞、血管内皮细胞、血管平滑肌细胞、肝细胞、肾细胞和胰细胞。
64.根据第57项的组合物，还包含选自下列成分的至少一种成分肾上腺皮质类固醇、胰岛素、葡萄糖、吲哚美辛、异丁基-甲基黄嘌呤(IBMX)、抗坏血酸及其衍生物、甘油磷酸、雌激素及其衍生物、孕酮及其衍生物、雄激素及其衍生物、生长因子、垂体腺提取物、松果体提取物、视黄酸、维生素D、甲状腺激素、胎牛血清、马血清、人血清、肝素、碳酸氢钠、HEPES、白蛋白、转铁蛋白、硒酸盐、亚油酸、3-异丁基-1-甲基黄嘌呤、去甲基试剂、组蛋白去乙酰基试剂、活化素、细胞因子、六亚甲基双乙酰胺(HMBA)、二甲基乙酰胺(DMA)、二丁基cAMP(dbcAMP)、二甲基亚砜(DMSO)、碘脱氧尿苷(IdU)、羟基脲(HU)、阿糖胞苷(AraC)、丝裂霉素C(MMC)、丁酸钠(NaBu)、凝聚胺及硒。
65.根据第57项的组合物，其中所述干细胞和分化细胞是同种异体的。
66.根据第57项的组合物，其中所述干细胞和分化细胞是同基因的。
67.一种治疗或预防与分化细胞衰竭相关的疾病、障碍或异常状况的方法，包括A)提供一种组合物，其包含a)根据第1～31项中任一项所得的干细胞；和b)对应于期望部位的分化细胞；以及
B)将该组合物施用于受试者。
68.一种治疗或预防因分化细胞缺陷所致疾病、障碍或异常状况的药物，其包含a)根据第1～31项中任一项所得的干细胞；b)对应于期望部位的分化细胞；和c)药学上可接受的载体。
69.由a)根据第1～31项中任一项所得的干细胞和b)对应于期望部位的分化细胞所组成的混合物用于制备药物的用途，所述药物用于治疗或预防因分化细胞缺陷所致的疾病、障碍或异常状况。
70.一种治疗或改善美容状况的方法，包括A)提供一种组合物，其包含a)根据第1～26项中任一项所得的干细胞；和b)对应于期望部位的分化细胞；以及B)将该组合物施用于受试者。
71.一种治疗或改善美容状况的药物，其包含a)根据第1～31项中任一项所得的干细胞；b)对应于期望部位的分化细胞；和c)药学上可接受的载体。
72.由a)根据第1～31项中任一项所得的干细胞和b)对应于期望部位的分化细胞所组成的混合物用于制备药物的用途，所述药物用于治疗或改善美容状况。
发明效果本发明提供了以简单而高效的方式从人(特别是受试者本身)大量制备同种干细胞和/或前体细胞的方法。
本发明还提供了使用本发明干细胞和/或前体细胞大量制备组织植入物或移植物的方法。
本发明还提供了干细胞、前体细胞、使用所述细胞制备的组织、器官。
本发明提供了以比常规方法更简单而高效的方式从脂肪制备干细胞的新方法。本发明的方法通过利用来自脂肪组织的抽取物而获得了提供大体积/量干细胞的显著效果。
下文中本发明将以优选实施例进行说明。本领域的技术人员将可以理解，根据本说明书的说明及本领域内的常用技术，本发明的实施例可以适当进行或实施。本领域的技术人员可以很容易地认识到本发明的作用和效果。


图1为显示根据本发明制备、来源于吸脂所得抽取物液体部分的干细胞的照片。
图2为显示通过培养干细胞而诱导的分化细胞的照片，所述干细胞根据本发明制备并在脂肪形成DMEM培养基中培养。
图3为显示通过培养干细胞而诱导的分化细胞经油红-O(OilRed-O)染色后的照片，所述干细胞根据本发明制备并在脂肪形成DMEM培养基中培养。
图4为显示通过培养干细胞而诱导的分化细胞的照片，所述干细胞根据本发明制备并在软骨形成DMEM培养基中培养。
图5为显示通过培养干细胞而诱导的分化细胞经阿辛蓝(Alcian blue)染色后的照片，所述干细胞根据本发明制备并在软骨形成DMEM培养基中培养。
图6显示干细胞的生长曲线，所述干细胞由吸脂所得材料未经除去红细胞而制备。
图7～图10为显示干细胞在DMEM培养基(图7＝第一轮，第6、8、10和第12天；图8＝第二轮，第3、5、7和第9天)和M199培养基(图9＝第一轮，第6、8、10和第12天；图10＝第二轮，第3、5、7和第9天)中生长的照片，所述干细胞由吸脂所得材料不经除去红细胞而制备。
图11～图26显示不同培养条件下的照片。下表列出了培养条件、培养天数、放大倍数、诱导/对照和培养/种植。最右一栏中，术语“诱导”指细胞置于分化条件下，术语“对照”指细胞置于非分化条件下。在第5栏中，术语“培养”指种植后培养10天才开始诱导的条件，而术语“种植”指开始诱导前不进行培养的条件。
表附例

根据本发明制备的细胞种植于60mm培养皿上，种植密度为1.8×107细胞/皿。在两组中进行诱导。其中一组在培养10天后用各分化诱导培养基(脂肪细胞分化、软骨细胞分化及骨细胞分化培养基)替换掉原始培养基(此处也称“培养”)。另外一组在开始诱导前不进行培养(此处也称“种植”)。诱导后用油红O评估脂肪细胞，用阿辛蓝评估软骨细胞，用冯科萨(von Kossa)染色剂评估骨细胞。
从这些附图及阅读其详细说明将使本发明的这些优势及其他优势显而易见。
本发明的最佳实施方式本发明将在下文加以说明。应该理解，除非明确地特别指出，单数形式的冠词(如英文“a”、“an”、“the”等等)包括其复数含义。也应该理解，除非另外特指，本文所用术语具有本领域内常规使用的定义。同样地，本文中术语“一个”、“一个或多个”及“至少一个”可以互换使用。同样应注意的是术语“包含”、“包括”及“具有”可以互换使用。而且，“选自...”的化合物指随后列举的一种或多种化合物，包括两种或多种这些化合物的混合物(即组合)。同样也应该理解，除非另外特指，本文所用术语具有本领域内常规使用的定义。因此，本文所用的技术及科学术语具有与相关领域技术人员常规所理解相同的含义。否则，以本申请(包括定义)为准。
(术语定义)本文所用具体术语定义如下。
本文中术语“细胞”采用本领域内的最宽的含义，指多细胞生物的组织的结构单位，其可以自我复制，含有遗传信息及表达该信息的机构，而且外面包有一层膜结构将活体如细胞与外界隔离开来。本发明的方法中任意细胞均可用作受试物。本发明所用的细胞数量可以用光学显微镜计数。使用光学显微镜计数时，计数细胞核的个数。将组织切成组织切片，然后用苏木精-伊红(HE)染色，以区分核与细胞外基质(如弹性蛋白或胶原)。将这些组织切片置光学显微镜下观察，可以用一特定区域(如200μm×200μm)内的胞核数来估计细胞的数量。本文所用的细胞可以是天然存在的细胞或是人工修饰的细胞(如融合细胞、遗传修饰细胞等)。细胞来源的实例包括但不限于单细胞培养物；正常生长转基因动物的胚胎、血液或身体组织(如脂肪或脂肪组织)；来源于正常生长细胞系的细胞的细胞混合物，等等。此类供应来源本身可用作细胞。
本发明中所用的脂肪细胞及其相应材料可来源于任意生物(如盲鳗目、Petronyzoniformes、软骨鱼纲、硬骨鱼纲、两栖纲、爬行纲、鸟纲、哺乳纲等)，更优选哺乳动物(如单孔目、有袋目、贫齿目、皮翼目、翼手目、食肉目、食虫目、长鼻目、奇蹄目、偶蹄目、管齿目、鳞甲目、海牛目、鲸目、灵长目、啮齿目、兔形目等)，只要该生物含有脂肪细胞或与其相应细胞即可。在一个实施方案中，使用来源于灵长类(如猩猩、日本猴、人类等)的细胞。最优选使用来源于人的细胞，但本发明不局限于此。
本文中术语“干细胞”指分化细胞的前体(或祖先)，其具有单潜能性、多潜能性或全能性。干细胞可对特定刺激进行应答而分化。典型地，干细胞可以再生受损伤的组织。本文中所用干细胞可以是但不限于胚胎干细胞(ES)、组织干细胞(也称为组织的干细胞、组织特异性干细胞或躯体干细胞)或其他前体细胞。干细胞可以是人工产生的细胞(如本文所使用的融合细胞、重编程的细胞(reprogrammed cell)等)，只要其具有上述的能力即可。胚胎干细胞是来源于早期胚胎的多潜能干细胞。胚胎干细胞最早于1981年建立，自1989年以来已应用于敲除小鼠的制备。1998年建立了人胚胎干细胞，目前正变得可用于再生药物。与胚胎干细胞不同，组织干细胞的分化水平相对有限。组织干细胞存在于组织中，具有未分化的细胞内结构。组织干细胞具有更高的核/胞浆比率和更少的细胞内细胞器。大部分组织干细胞具有多潜能性、长细胞周期及超过个体生命期的增殖能力。本文中干细胞可优选为胚胎干细胞，但根据具体情况也可以使用组织干细胞。
组织干细胞根据其来源的部位如皮肤系统、消化系统、骨髓系统、神经系统等可以分成不同类别。皮肤系统中的组织干细胞包括表皮干细胞、毛囊干细胞等。消化系统中的组织干细胞包括胰脏(普通)干细胞、肝脏干细胞等。骨髓系统中的组织干细胞包括造血干细胞、间充质干细胞等。神经系统中的组织干细胞包括神经干细胞、视网膜干细胞等。
本文中“前体细胞”指对应于不具有分化特性的未分化亲代细胞的细胞，其后代细胞已知具有特定的分化特性，不仅包括多潜能未分化细胞，也包括单潜能未分化细胞。例如，当后代细胞为血管内皮细胞时，前体细胞为血管内皮前体细胞。本文中术语“干细胞”包括前体细胞。但是，干细胞分化得到的前体细胞对于所述干细胞来说对应于“分化细胞”。术语“PLA(处理后的脂肪抽取物细胞(processed lipoaspiratecell))”指从吸脂所得抽取物脂肪部分(脂肪抽取物)所得到的前体细胞。来源于吸脂所得抽取物液体部分的前体细胞可称为“液体抽取物细胞”或“LAF”。脂肪来源的前体细胞包括PLA细胞和液体抽取物细胞。
本文中术语“脂肪来源前体细胞”指通过吸脂获得的干细胞及其他前体细胞，如来源于外周血的干细胞或血管基质细胞(前脂肪细胞)。脂肪来源前体细胞指来源于脂肪组织或通过吸脂过程获得的任意多潜能或单潜能细胞群。这样的细胞包括脂肪来源血管基质细胞(＝前脂肪细胞、脂肪来源间质细胞)、脂肪来源干细胞、脂肪干细胞、内皮祖细胞、造血干细胞，等等。分离此类干细胞的一些技术是已知的，例如可见Nakatsuji，ed.，“Kansaibo Kuron Kenkyu Purotokoru[Stem cell/Clone researchProtocol]”，Yodosha(2001)；WO00/53795；WO03/022988和WO01/62901所述。在此将这些文献相关部分引入作为参考。本文中术语“脂肪来源前体细胞”指所有脂肪来源的干细胞，包括用已知分离方法得到的脂肪组织来源干细胞。本文中术语“前体细胞”不仅包括多潜能未分化细胞，也包括单潜能未分化细胞。本文中术语“干细胞”包括前体细胞。术语“PLA(处理后的脂肪抽取物细胞)”指从吸脂所得抽取物脂肪部分(脂肪抽取物)所得到的前体细胞。来源于吸脂所得抽取物液体部分的前体细胞可称为“液体抽取物细胞”或“LAF”。脂肪来源的前体细胞包括PLA细胞和液体抽取物细胞。
本文中术语“体细胞”指除生殖细胞如卵细胞、精子等以外的任意细胞，其不将DNA传给下一代。典型地，体细胞没有多潜能性或潜能性有限。本文所用体细胞可以是天然存在或遗传修饰的细胞，只要其能达到预期治疗目的即可。
本文中术语“分化细胞”指具有特化功能和形态的细胞(如肌细胞、神经元等)。与干细胞不同，分化细胞没有或只有很少多潜能性。分化细胞的实例包括表皮细胞、胰腺实质细胞、胰管细胞、肝细胞、血细胞、心肌细胞、骨骼肌细胞、成骨细胞、骨骼肌成肌细胞、神经元、血管内皮细胞、色素细胞、平滑肌细胞、脂肪细胞、骨细胞、软骨细胞，等等。本发明中所用的分化细胞可以是细胞群或组织的形式。
细胞的起源分为外胚层、内胚层或中胚层。外胚层起源的干细胞大部分存在于脑内，包括神经干细胞。内胚层起源的干细胞大部分存在于骨髓内，包括血管干细胞及其分化细胞、造血干细胞及其分化细胞、间充质干细胞及其分化细胞等。中胚层起源的干细胞大部分存在于器官内，包括肝脏干细胞及其分化细胞、胰脏干细胞及其分化细胞等。本文中体细胞可来源于任意胚层。优选的是采用间充质体细胞。
本文中术语“间充质干细胞”指在间充质中发现的干细胞。术语“间充质干细胞”在本文可缩写成“MSC”。间充质指一群游离细胞，其呈星形或具有不规则突起，桥接上皮组织间的间隙，在多细胞动物的每一发育阶段均可以看到。间充质也指与所述细胞相关的细胞内结合物(cement)一起形成的组织。间充质干细胞具有增殖能力，并有分化成骨细胞、软骨细胞、肌细胞、基质细胞、腱细胞和脂肪细胞的能力。间充质干细胞用于培养或生长从患者收集的骨髓细胞等，或是分化为软骨细胞或成骨细胞。间充质干细胞也用作重构材料如牙槽骨，用于关节病等的骨骼、软骨或关节，等等。间充质干细胞有着大量的需求。同样间充质干细胞可分化成血细胞及淋巴样细胞。因此，对间充质干细胞的需求仍在上升。
短语“吸脂所得材料”指进行吸脂时所产生的任意材料。典型地，此类吸脂所得材料包含脂肪组织和吸脂所得抽取物。
短语“吸脂所得抽取物”指进行吸脂时所产生的液体。此类吸脂所得抽取物可以是但不限于(1)进行吸脂时抽吸出来的液体(如包括Tumecent溶液和血液)或(2)用溶液如盐水洗涤抽吸出的脂肪时产生的液体。
本文中术语“体细胞”指除生殖细胞如卵细胞、精子等以外的任意细胞，其不将DNA传给下一代。典型地，体细胞没有多潜能性或潜能性有限。本文所用体细胞可以是天然存在或遗传修饰的细胞，只要其能达到预期治疗目的即可。
本文中术语“分化细胞”指具有特化功能和形态的细胞(如肌细胞、神经元等)。与干细胞不同，分化细胞没有或只有很少多潜能性。分化细胞的实例包括表皮细胞、胰腺实质细胞、胰管细胞、肝细胞、血细胞、心肌细胞、骨骼肌细胞、成骨细胞、骨骼肌成肌细胞、神经元、血管内皮细胞、色素细胞、平滑肌细胞、脂肪细胞、骨细胞、软骨细胞，等等。本发明中所用的分化细胞可以是细胞群或组织的形式。
干细胞的起源分为外胚层、内胚层或中胚层。外胚层起源的干细胞大部分存在于脑内，包括神经干细胞。内胚层起源的干细胞大部分存在于骨髓内，包括血管干细胞及其分化细胞、造血干细胞及其分化细胞、间充质干细胞及其分化细胞等。中胚层起源的干细胞大部分存在于器官内，包括肝脏干细胞及其分化细胞、胰脏干细胞及其分化细胞等。本文中体细胞可来源于任意胚层。优选的是采用间充质体细胞。
本文中术语“脂肪细胞”指位于组织之间或形成脂肪组织作为蜂窝组织或一群沿毛细血管的细胞，脂肪细胞含有大量脂质。脂肪细胞包括黄脂肪细胞和褐脂肪细胞。这些细胞在此处可以同等地使用。细胞内脂肪可以容易地用苏丹III(Sudan III)或四氧化锇检测。
本文中术语“期望部位”指受试者期望进行治疗的任意部分。本发明中，可以理解的是此类目标部位可选自受试者的任意器官或组织。
本文中术语“组织”指多细胞生物中具有基本相同的功能和/或形态的细胞聚集体。“组织”通常是相同起源细胞的聚集体，但也可以是不同起源细胞的聚集体，只要其具有相同的功能和/或形态即可。因此本发明的干细胞用于再生组织时，组织可以由两种或多种不同起源的细胞聚集体组成。典型地，组织构成器官的一部分。动物组织从形态、功能或发育方面分成上皮组织、结缔组织、肌肉组织、神经组织等。植物组织根据构成组织的细胞的发育阶段大致分成分生组织和永久组织。另外，根据构成组织的细胞类型可以将组织分成简单组织和复合组织。这样组织就分成不同的类别。任意组织均可作为本文所要治疗的靶点。
本发明可以任意器官作为靶点。本发明的靶组织或细胞可来源于任意器官。本文中术语“器官”指生物个体中形态学独立的结构，其位于生物体的特定部分，行使某种功能。多细胞生物(如动物、植物)中器官通常由数种组织以特定的空间排列形式构成，每一组织由许多细胞组成。这样的器官实例包括与血管系统相关的器官。在一个实施方案中，本发明的靶器官包括但不限于皮肤、血管、角膜、肾、心脏、肝脏、脐带、肠、神经、肺、胎盘、胰脏、脑、外周肢体、视网膜等。本文中任意器官均可作为靶点。优选的是，可靶向间充质组织(如脂肪、骨骼韧带等)，但不限于此。
本文中术语“分化的充分条件”指引起分化的时间、介质、温度、湿度等。从来源于吸脂所得抽取物的干细胞制备分化细胞的方法包括(1)向培养基中加入分化诱导剂的方法；及(2)将本发明细胞与对应于期望部位的分化细胞一起培养的方法。
向培养基中加入分化诱导剂(如地塞米松)的方法包括向干细胞培养基中加入常规公知的分化诱导剂的方法，所述分化诱导剂如肾上腺皮质类固醇如地塞米松，胰岛素，葡萄糖，吲哚美辛，异丁基-甲基黄嘌呤(IBMX)，抗坏血酸2-磷酸，抗坏血酸及其衍生物，甘油磷酸，雌激素及其衍生物，孕酮及其衍生物，雄激素及其衍生物，生长因子如αFGF、βFGF、EGF、IGF、TGF-β、ECGF、BMP、PDGF，垂体腺提取物，松果体提取物，视黄酸，维生素D，甲状腺激素，胎牛血清，马血清，人血清，肝素，碳酸氢钠，HEPES，白蛋白，转铁蛋白，硒酸盐(如亚硒酸钠)，亚油酸，3-异丁基-1-甲基黄嘌呤，去甲基试剂如5-氮杂胞苷，组蛋白去乙酰基试剂如制滴菌素(trichostatin)，活化素，细胞因子如LIF、IL-2、IL-6，六亚甲基二乙酰胺(HMBA)，二甲基乙酰胺(DMA)，二丁基cAMP(dbcAMP)，二甲基亚砜(DMSO)，碘脱氧尿苷(IdU)，羟基脲(HU)，阿糖胞苷(AraC)，丝裂霉素C(MMC)，丁酸钠(NaBu)，凝聚胺及硒。
在与对应于期望部位的分化细胞一起培养干细胞的方法(2)中，根据本文公开内容，使脂肪来源前体细胞与分化细胞混合，从而使脂肪来源前体细胞注定变成所述分化细胞。根据本说明书，可以理解的是这样的条件与单独维持脂肪来源前体细胞或分化细胞的条件是重叠的。因此，可以将条件适当的加以改变。优选的是所述条件可以根据本发明脂肪来源前体细胞和待与之组合的分化细胞及其混合物的组成来加以改变。这样的优选条件一旦建立，该条件即可随后用于类似混合物处理。本发明中，此类分化的条件可在体外、体内或离体环境中使用。在体内环境的情况时，使用身体植入部位本身所提供的条件。本发明中，干细胞与分化细胞混合后，混合物可立即植入体内环境中，或可在体外进行共培养。自体移植可称为离体移植。
本文中术语“体内”指在生物体内。在特定情况下，“体内”指受试组织或器官放置的位置(如本文中所用的期望部位)。
本文中术语“体外”表示出于各种研究目的将生物体的一部分从生物体取出来或释放出来(如在试管内)。术语体外与术语体内相对。
本文中术语“离体”指下列一系列操作将要导入基因的靶细胞从受试者中取出来，将治疗基因在体外导入所述细胞，然后将所述细胞重新回到同一受试者中。
分化条件的实例可独立选自下述条件培养5小时或更长时间，pH5～10，温度为20℃～45℃(如37℃)，湿度80％或更高(如100％)，使用M199培养基，添加5mg/500ml的肝素，添加2μg/500ml的酸性FGF，添加FBS(15％)，添加NaHCO3，氧浓度为10～30％(如20％)，CO2浓度为2～10％(如5％)，使用明胶包被的培养皿，有饲养细胞存在，等等。作为实例之一，条件如下培养5小时，使用M199培养基(每500ml添加2.2g NaHCO3、FBS(15％)、2μg酸性FGF及5mg肝素)，于37℃、20％氧气、5％碳酸气及100％湿度下在明胶包被的培养皿中培养。本发明并不局限于此。
上述条件可用于分化细胞(如脂肪细胞)及脂肪来源前体细胞的维持。本发明并不局限于此。
对于脂肪来源前体细胞的分化来说，可以使用含有细胞分化促进剂的任意培养基进行培养。例如这样的培养基可以是但不限于添加10％FBS、0.5mM异丁基甲基黄嘌呤(IBMX)、1μM地塞米松、10μM胰岛素和200μM吲哚美辛的DMEM。该培养基可在37℃、20％氧气、5％碳酸气及100％湿度下使用。
本文中所用术语“促进分化成分化细胞的因子”或“分化促进剂”指已知可促进分化成分化细胞的任意因子(如化学物质、温度等)。此类因子的实例包括但不限于各种环境因素如温度、湿度、pH、盐浓度、养分、金属、气体、有机溶剂、压力、化学物质(如类固醇、抗生素等)等等，或其任意组合。此类因子的代表性实例包括但不限于DNA去甲基试剂(如5-氮杂胞苷等)、组蛋白去乙酰基试剂(如制滴菌素等)、核内受体配体(如视黄酸(ATRA)、维生素D3、T3等)、细胞生长因子(如活化素、IGF-1、FGF、PDGF、TGF-β、BMP2/4等)、细胞因子(如LIF、IL-2、IL-6等)、六亚甲基二乙酰胺、二甲乙酰胺、二丁基cAMPs、二甲基亚砜、碘脱氧尿苷、羟基脲、阿糖胞苷、丝裂霉素C、丁酸钠、芽栖菌素(aphidicholine)、氟脱氧尿苷、凝聚胺、硒，等等。但是分化细胞通常并不考虑用作分化促进剂。这是因为分化细胞会释放抑制分化的因子。
对于根据本发明将要用于移植或再生的细胞、组织、器官等来说，文中术语“对应于期望部位”表示所述细胞等从所述期望部位获得(如心脏来源的细胞等)，或者所述细胞等具有与期望部位处存在细胞相同的性质(如分化成心脏细胞的细胞等)。因此，如果细胞具有与期望部位处细胞基本相同的特性(如细胞表面标记等)，则可以证实对应于期望部位。
用于确定对应于期望部位的此类细胞的标志实例包括但不限于(1)脂肪胞浆内有甘油三酯存在，油红O染色，甘油磷酸脱氢酶(GPDH)活性，胞浆内GLUT4，Ap2(脂肪酸结合蛋白)，LPL(脂蛋白脂酶)，PPARγ1，2(过氧化物酶体生长活化受体γ1，2)和瘦素的表达；(2)骨细胞、骨组织碱性磷酸酶的存在，骨钙化(钙沉淀)程度确定，以及骨钙蛋白、骨桥蛋白(osteopontin)或骨粘连蛋白(osteonectin)的表达；(3)软骨细胞、软骨组织粘多糖的存在，II型胶原和4-硫酸软骨素的表达和存在；(4)骨骼肌细胞胞浆内存在大量肌球蛋白；等等。
本文中术语“植入”和“移植”可以互换使用，指将本发明的细胞、组合物、药物等单独置入或与其他治疗剂一起置入体内。本发明中下列方法、形式和用量可用于导入治疗部位(如骨等)将本发明的药物直接注射入受伤部位、粘附并缝合到受伤部位、插入受伤部位，等等。本发明的脂肪来源前体细胞与分化细胞的组合可以相伴施用，如以混合物施用，也可分别但同时或先后施用。这包括组合因子作为治疗混合物一起施用的情况，也包括组合的试剂(如分化促进剂等)分开但同时施用的方法。“组合”施用还包括分别地先施用第一种化合物或因子，然后施用第二种。
对于实体来说，本文中术语“自体”或“自身”指同一实体的整体或一部分(如细胞、组织、器官等)。本文中术语“自体”或“自身”广义上可包括来自遗传相同个体(如同卵双胞胎)的移植物。
本文中术语“同种异体的”指被移植的实体的整体或一部分(如细胞、组织、器官等)来自物种相同、但遗传上不同的另一个实体。由于同种异体的实体遗传上不同，同种异体的实体可在实体(接受者)中激发针对植入的异体实体(allo-entity)的免疫反应。例如，此类细胞包括但不限于来源于其亲代的细胞。
本文中术语“异种”指被移植的材料如细胞或组织来自另一不同物种实体。因此，例如人作为接受者时，猪来源移植物称为异种移植物。
本文中“接受者”(受体)指接受植入细胞等的实体，也称为“宿主”。与此相对，提供植入细胞等的实体称为“供应者”(供体)。供应者可与接受者相同或不同。
本发明中使用的细胞可以来源于自体来源(同基因起源)、同种异体起源(非自身起源)或异种起源。从排斥反应的角度看，优选同基因起源的细胞。如果排斥反应不引发问题，可采用同种异体细胞。
本文中术语“分化细胞缺陷所致疾病、障碍或异常状况”指涉及分化细胞的任意疾病、障碍或异常状况。此类分化细胞可以优选但不限于间充质细胞。
在一个实施方案中，本发明针对的疾病及障碍可以是循环系统(血细胞等)的。所述疾病及障碍的实例包括但不限于贫血(如再生障碍性贫血(特别是重度再生障碍性贫血)、肾性贫血、癌性贫血、继发性贫血、顽固性贫血等)，癌症或肿瘤(如白血病)、化疗后的造血不能、血小板减少、急性髓细胞性白血病(特别是首次缓解期(高危群体)、第二次缓解及以后)、急性淋巴细胞性白血病(特别是首次缓解期、第二次缓解及以后)、慢性髓细胞性白血病(特别是慢性期、转移期(transmigrationperiod))、恶性淋巴瘤(特别是首次缓解期(高危群体)、第二次缓解及以后)、多发性骨髓瘤(特别是发病后早期)等，心力衰竭、心绞痛、心肌梗塞、心律失常、心瓣炎、心肌/心包膜疾病、先天性心脏病(如房间隔缺损、动脉导管未闭、法洛氏(Fallot)四联症等)、动脉疾病(如动脉硬化、动脉瘤)、静脉疾病(如phlebeurysm等)、淋巴管疾病(如淋巴水肿等)，等等。
在另一实施方案中，本发明针对的疾病及障碍可以是神经系统的。所述疾病及障碍的实例包括但不限于痴呆、脑卒中及其后遗症、脑肿瘤、脊髓损伤等。
在另一实施方案中，本发明针对的疾病及障碍可以是免疫系统的。所述疾病及障碍的实例包括但不限于T细胞缺陷综合症、白血病等。
在另一实施方案中，本发明针对的疾病及障碍可以是运动器官及骨骼系统的。所述疾病及障碍的实例包括但不限于骨折、骨质疏松、关节脱臼、不全脱位、扭伤、韧带损伤、骨关节炎、骨肉瘤、尤因氏肉瘤、肌营养不良、成骨不全、骨软骨发育不良，等等。
在另一实施方案中，本发明针对的疾病及障碍可以是皮肤系统的。所述疾病及障碍的实例包括但不限于无毛症、黑素瘤、皮肤恶性淋巴瘤、血管肉瘤、组织细胞增多症、水疱病、脓疱病、皮炎、湿疹，等等。
在另一实施方案中，本发明针对的疾病及障碍可以是内分泌系统的。所述疾病及障碍的实例包括但不限于下丘脑/下垂体疾病、甲状腺疾病、副甲状腺(甲状旁腺)疾病、肾上腺皮质/髓质疾病、糖代谢异常、脂代谢异常、蛋白质代谢异常、核酸代谢异常、先天性代谢缺陷(苯酮尿症、半乳糖血症、高胱氨酸尿症、枫糖尿症)、无白蛋白血症、抗坏血酸合成能力不足、高胆红素血症、高胆红素尿症、激肽释放酶缺陷、肥大细胞缺陷、尿崩症、血管加压素分泌异常、侏儒症、沃耳曼氏(Wolman′s)病(酸性脂酶缺陷))、VI型粘多糖增多症，等等。
在另一实施方案中，本发明针对的疾病及障碍可以是呼吸系统的。所述疾病及障碍的实例包括但不限于肺部疾病(如肺炎、肺癌等)、支气管疾病等。
在另一实施方案中，本发明针对的疾病及障碍可以是消化系统的。所述疾病及障碍的实例包括但不限于食管疾病(如食管癌等)、胃/十二指肠疾病(如胃癌、十二指肠癌等)、小肠疾病/大肠疾病(如结肠息肉、结肠癌、直肠癌等)、胆管疾病、肝脏疾病(如肝硬化、肝炎(甲型、乙型、丙型、丁型、戊型等)、暴发性肝炎、慢性肝炎、原发性肝癌、酒精性肝病、药源性肝病等)、胰脏疾病(急性胰腺炎、慢性胰腺炎、胰癌、囊性胰脏疾病等)、腹膜/腹壁/隔膜疾病(疝气等)、赫希施普龙氏(Hisrschsprung′s)病，等等。
在另一实施方案中，本发明针对的疾病及障碍可以是泌尿系统的。所述疾病及障碍的实例包括但不限于肾脏疾病(如肾衰竭、原发性肾小球疾病、肾血管障碍、肾小管功能异常、间质性肾病、全身性疾病导致的肾障碍、肾癌等)、膀胱疾病(如膀胱炎、膀胱癌等)，等等。
在另一实施方案中，本发明针对的疾病及障碍可以是生殖系统的。所述疾病及障碍的实例包括但不限于雄性生殖器官疾病(如雄性不育、前列腺肥大、前列腺癌、睾丸癌等)、雌性生殖器官疾病(如雌性不育、卵巢功能障碍、子宫肌瘤、子宫腺肌病、子宫癌、子宫内膜异位、卵巢癌、绒毛疾病等)，等等。
本文中术语“诊断、预防、治疗或预后的有效量”指诊断、预防、之后或预后的公认的治疗有效用量。本领域技术人员可使用公知技术参考各种参数来确定此类用量。
在另一实施方案中，本发明可在美容用途的治疗、处理或改善中使用。此类美容用途包括手术后或创伤后变形及先天性畸形的美容治疗，以及健康状态下的纯美容目的。例如，本发明可应用于但不限于增加乳房组织(隆乳)的技术，增加颊部或上眼睑及下眼睑以补偿凹陷的技术，以及增加组织以补充单侧颜面萎缩或面瘫后组织萎缩或漏斗胸的技术。而且，例如，本发明可应用于但不限于诸如鼻成形术、鼻缩小造型术(reduction rhinoplasty)、颏成形术(组织扩增)、额成形手术(组织扩增)、外耳变形/畸形如小耳畸形的外耳软骨成形术，等等。
当本发明用作药物时，所述药物可进一步包括药学上可接受的载体。本发明的药物可使用本领域内已知的药学上可接受的任意载体。
药学上可接受的载体或适当制剂材料的实例包括但不限于抗氧化剂、防腐剂、着色剂、香味剂、稀释剂、乳化剂、助悬剂、溶剂、填充剂、膨化剂、缓冲剂、递送载体以和/或药用佐剂。代表性的是本发明的药物以组合物的形式施用，所述组合物包括本发明的细胞和其他活性成分，以及至少一种生理学可接受载体、赋形剂或稀释剂。例如合适的载体可以是注射溶液、生理溶液或人工脑脊液，其可以添加常用于胃肠外递送组合物的其他物质。
本文中所用可接受载体、赋形剂或稳定剂优选对接受者无毒，并且优选在采用的剂量及浓度下为惰性，优选包括磷酸盐、柠檬酸盐或其他有机酸；抗坏血酸、α-生育酚；低分子量多肽，蛋白质(如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白)；亲水聚合物(如聚乙烯吡咯烷酮)，氨基酸(如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、精氨酸或赖氨酸)，单糖、二糖及其他碳水化合物(葡萄糖、甘露糖或糊精)，螯合剂(如EDTA)，糖醇(如甘露糖醇或山梨糖醇)，成盐反离子(如钠)，和/或非离子型表面活性剂(如吐温、普郎尼克(pluronics)或聚乙二醇(PEG))。
适当载体的实例包括中性缓冲盐水或混有血清白蛋白的盐水。优选的是将产品用适当赋形剂(如蔗糖)配制成冻干剂。也可根据期望包括其他标准载体、稀释剂及赋形剂。其他示范性组合物包括pH约7.0-8.5的Tris缓冲剂或pH约4.0～5.5的乙酸缓冲剂，还可进一步包括山梨糖醇或其适当的替代品。
下面将说明制备本发明药物组合物的通用技术。应注意可用已知技术生产动物药物组合物、准药物组合物、海洋药物组合物、食品组合物、美容组合物等。
本发明的细胞等可任选地与药学上可接受的载体混合，并可以液体制剂(如注射剂、混悬剂、溶液、喷雾剂等)经肠胃外途径施用。药学上可接受的载体的实例包括赋形剂、润滑剂、粘合剂、崩解剂、崩解抑制剂、吸收促进剂、吸附剂、湿润剂、溶剂、助溶剂、助悬剂、等渗剂、缓冲剂、舒缓剂等。可任选地使用制剂添加剂，如防腐剂、抗氧化剂、着色剂、甜味剂等。本发明的组合物可任选地与除本发明的多聚核苷酸及多肽等之外的其他物质混合。肠胃外施用途径的实例包括但不限于静脉内、肌内、皮下、皮内、粘膜内、直肠内、阴道内、局部及透皮途径等。全身施用时，本发明所用药物可以是无热原、药学可接受的水性溶液形式。根据pH、等渗性、稳定性等等制备此类药学可接受组合物属于本领域的技术。
液体制剂所用溶剂的优选实例包括注射溶液、醇类、丙二醇、聚乙二醇、芝麻油、玉米油，等等。
液体制剂所用助溶剂的优选实例包括但不限于聚乙二醇、丙二醇、D-甘露糖醇、苯甲酸苄酯、乙醇、三氨基甲烷、胆固醇、三乙醇胺、碳酸钠、柠檬酸钠等。
液体制剂所用助悬剂的优选实例包括表面活性剂(如硬脂酰三乙醇胺、十二烷基硫酸钠、十二烷基氨基丙酸、卵磷脂、苯扎氯铵、氯化苄乙氧铵、单硬脂酸甘油酯等)，亲水大分子(如聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、羟甲基纤维素、羟乙基纤维素、羟乙基纤维素、羟丙基纤维素等)，等等。
液体制剂所用等渗剂的优选实例包括但不限于氯化钠、甘油、D-甘露糖醇等。
液体制剂所用缓冲剂的优选实例包括但不限于磷酸盐、醋酸盐、碳酸盐、柠檬酸盐等。
液体制剂所用舒缓剂(soothing agent)的优选实例包括但不限于苯甲醇、苯扎氯铵、盐酸普鲁卡因，等等。
液体制剂所用防腐剂的优选实例包括但不限于对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯甲醇、2-苯乙醇、脱氢醋酸、山梨酸，等等。
液体制剂所用抗氧化剂的优选实例包括但不限于亚硫酸盐、抗坏血酸、α-生育酚、半胱氨酸，等等。
当液体制剂和悬浮液制备成注射剂时，将其灭菌，并优选与血液等渗或与注射部位其他用途的介质等渗。通常这些试剂经过细菌截留滤器等的过滤、与杀菌剂混合或辐射等而变得无菌。这样处理后，可通过冻干等将这些试剂制成固体。在临用前可加入无菌水或无菌注射稀释剂(盐酸利多卡因水溶液、生理盐水、葡萄糖水溶液、乙醇或其混合物等)。
本发明的药物组合物还可包括着色剂、防腐剂、芳香化学品、香料、调味剂、甜味剂或其他药物。
参考使用目的、目标疾病(类型、严重程度等)、患者的年龄、体重、性别、病史、细胞形态或类型、等等，本领域技术人员可容易地确定组合物用于本发明治疗方法中的用量。本领域技术人员也可根据使用目的、目标疾病(类型、严重程度等)、患者的年龄、体重、性别、病史或治疗进展等确定本发明治疗方法施用于受试者(或患者)的频率。频率的实例包括但不限于每天一次到数月一次(如每周一次到每月一次)。优选的是根据进展情况每周到每月进行一次。可通过估计所要治疗部位的需用量来确定剂量。
本文中术语“使用说明”向本发明药物的施用者或施用对象或是诊断者或诊断对象(如医生、患者等)说明本发明药物的施用方法、诊断方法等。该说明含有描述了施用本发明诊断、药物等的恰当方法的说明。使用说明根据本发明所应用国家当局(如日本的厚生劳动省(Health，Labor and Welfare Ministry)，美国的食品和药品管理局(FDA)等)定义的格式制备，明确地说明该说明由当局批准。所述说明也是所谓的包装插页，通常以纸介质的形式提供。使用说明不受此限制，也可以电子媒介的形式(如因特网上的网站、电子邮件等)提供。
本发明治疗方法终止可根据下述支持来判断用商品测试或仪器的标准临床试验室检查结果，或所治疗相关疾病(如骨病、心脏病、神经疾病等)特征性临床症状的消失，或是美容状态的恢复(如外观恢复等)。与分化细胞缺陷等相关的疾病(如神经疾病)复发或美容状态破坏时可重启治疗。
本发明也提供包括一个或多个容器的药物包装或药盒，所述容器装有一种或多种药物组合物。这样的一个容器可以随意地贴上由管理药品或生物制品的生产、使用或销售的政府机构所规定的公告，表明其施用于人的生产、使用或销售已得到该政府机构的批准。该药盒可包括注射装置。
可使用各种动物模型(如小鼠、兔、非啮齿类动物)进行毒性研究。在这些动物模型中观察一般状况、体重、进食量、饮水量，并进行血液学检查、血生化检查、尿液检查及眼科检查等。已知本领域内有各种检查，包括但不限下述检查血液学检查测定红细胞数、白细胞数、血小板数、血红蛋白、血细胞比容、血像(白细胞类型的百分比)、其他网织红细胞数、凝血酶原时间、活化部分凝血激酶时间等。例如血细胞组成可按下述进行测定(1)向小鼠(未处理的对照小鼠也应测定)施用药剂；(2)通过尾静脉定期从各处理小鼠组的每只鼠取血样；以及(3)分析上述血样的红细胞数及白细胞数、血细胞组成以及淋巴细胞与多形核细胞的比值。各剂量方案及对照的结果显示是否有毒性。
血生化检查测定血清(血浆)蛋白、白蛋白、A/C比、蛋白级分、葡萄糖、胆固醇、甘油三酯、胆红素、尿素氮、肌酐、转氨酶(ASAT(GOT)、ALAT(GPT))、碱性磷酸酶、电解质(钠、钾、氯、钙、无机磷等)。
尿液检查测定尿体积、pH、蛋白质、碳水化合物、酮体、胆红素、潜血、血沉、比重或渗透压、电解质(钠、钾等)。
眼科检查用肉眼及检眼镜分析前房(anterior eye)、透光介质(optic media)和眼底。
在每一毒性研究结束时，还进一步将动物处死进行研究(优选地按照美国兽医协会的美国兽医协会指南报告。Panel on Euthanasia，(1993)J.Am.Vet.Med.Assoc.202229～249)。之后，可对各处理组的代表性动物进行检查，观察全身是否有变化、异常疾病或毒性的直接迹象。描述组织中整体异常并对该组织进行组织学检查。不优选使体重下降或血液组分减少的化合物，因为这是对主要器官有副作用的药物。通常药物的副作用越大则越不优选。
(优选实施方案说明)下文将说明本发明的优选实施方案。提供下述实施方案是为了更好地理解本发明，本发明的范围不应受下述说明限制。本领域技术人员将清楚地理解，参考本说明书可以作出变更和修改而不偏离本发明的范围。
(从吸脂所得抽取物制备干细胞的方法)在本发明的一方面中，本发明提供了从吸脂所得抽取物制备干细胞的方法，该方法包括A)获得吸脂所得抽取物；B)将吸脂所得抽取物离心以获得细胞级分；C)将细胞级分通过比重离心如密度梯度离心使细胞分离开来；以及D)收集比重小于红细胞的细胞层。在发明方法中所用的吸脂所得抽取物包括但不限于吸脂过程中与脂肪一起抽吸出来的液体(例如，包括但不限于Tumescent溶液及血液)、用液体洗涤抽吸出来的脂肪所产生的废液。
脂肪来源前体细胞可按下述方法或对其加以变更从吸脂所得抽取物(脂肪抽取物)的脂肪部分分离(如WO00/53795、WO03/022988、WO01/62901；Zuk，P.A.，etal.，Tissue Engineering，Vol.7，211-228，2001；Zuk，P.A.，et al.，Molecular Biology ofthe Cell，Vol.13，4279-4295，2002)。例如，具体地说，(1)通过1升分液漏斗用生理盐水充分洗涤抽吸出来的脂肪；(2)确认上层中的抽吸脂肪与下层生理盐水充分分离之后弃去下层。重复此过程，直到生理盐水用肉眼观察基本透明为止；(3)加入与抽吸脂肪等量的0.075％胶原酶/PBS，然后在充分搅拌的同时于37℃孵育30分钟；(4)上述样品中加入等量的补充有10％血清的DMEM；(5)样品以1200×g离心10分钟；(6)将所得沉淀悬浮于0.16M NH4Cl/PBS中，然后室温孵育10分钟；(7)样品用直径100μm的筛网抽滤；以及(8)将所得滤液以1200×g离心5分钟。本领域的技术人员可根据制剂量对上述方案放大或缩小。
另一方面，举例来说，脂肪来源前体细胞可按照下述方法从吸脂所得抽取物(脂肪抽取物)的液体部分(液体抽取物)分离(1)制备吸脂所得抽取物的液体部分；(2)将所述液体部分离心以获得细胞级分；(3)将该细胞级分进行密度梯度离心，按比重使细胞分离；及(4)从比重小于红细胞的细胞层收集细胞。抽取物的液体部分可以用生理盐水或林格氏注射液制备。离心可以约800×g或更低的速度进行，或是以约400×g或更高的速度离心。密度梯度离心以约370×g～1,100×g的速度进行。密度梯度离心使用比重(20℃)约1.076～约1.078的介质进行。密度梯度离心中所用介质可以是FicollTM、PercollTM或蔗糖。所收集细胞层的比重可为约1.050～1.075。所述细胞层可用移液器收集。
抽吸脂肪的方法可用本领域内技术人员公知的技术进行。抽吸脂肪方法中所用装置包括但不限于Keisei SAL泵(SAL 76-A、Keisei Ika-Kogyo、Hongo 3-19-6、Bunkyo，Tokyo，Japan)。在人类情况下，将含0.0001％肾上腺素的液体如盐水注入等量的待抽吸脂肪组织中，使该组织的体积加倍，然后用内径为2～3mm的插管(金属制成的抽吸管)在约-250～900mmHg的负压下抽吸。
用于洗涤抽吸出来的脂肪细胞的液体通常是盐水。但是，也可使用盐水之外的其他任意液体，只要其对将要分离的干细胞没有副作用即可。具体地说，例如本发明中可使用任意等渗液如林格氏溶液及哺乳动物细胞培养基(如DMEM、MEM、M199和MCDB153等)。
从吸脂所得抽取物制备干细胞时，可以任选地将所述吸脂所得抽取物用酶进行处理，如用胶原酶处理。但是吸脂所得抽取物用作制备干细胞的来源时，吸脂所得抽取物中的胶原量与脂肪组织相比要低，胶原酶处理时间和/或酶处理所需酶用量相对低于脂肪组织所需用量。
通过离心吸脂所得抽取物获得细胞级分的步骤中，可使用任何条件，只要此细胞级分与其他组分(如血浆、操作中污染的盐水、麻醉剂、止血剂、从破裂脂肪细胞排出的脂质组分)分离开来即可。例如，可以在400～800×g离心约5～15分钟。
通过比重分离细胞的步骤中，例如分离的细胞级分可进行密度梯度离心。任何可用于密度梯度离心的可用介质均可用作这样的介质。优选的介质比重可为1.076～1.078g/ml。而且优选介质的pH介于4.5和7.5之间。优选介质的内毒素含量可为0.12EU/ml或更低。典型的介质包括蔗糖、Ficoll(蔗糖和表氯醇的共聚物)和Percoll(具有聚乙烯吡咯烷酮膜的硅胶产品)。Ficoll是商用产品，如Ficoll-Paque PLUS(Pharmacia Biotech Japan，Tokyo，Japan)，Histopaque-1077(SIGMA-AldrichJapan，Tokyo，Japan)等。Percoll是以Percoll为商品名的商用产品(SIGMA-AldrichJapan，Tokyo，Japan)。
比重离心的条件可如下所述当使用Ficoll-Paque PLUS作为介质时，以400×g离心30～40分钟；当使用Histopaque-1077作为介质时，以370×g离心约30分钟。当使用Lymphoprep作为介质时，条件包括但不限于以800×g离心约20分钟及以1,100×g离心约10分钟等。
比重离心时最多的细胞通常是红细胞，这可通过观察到红细胞层来证实。干细胞的比重小于红细胞，分离干细胞时收集比重小于红细胞的细胞层。优选的是收集比重为1.050～1.075的细胞层。
细胞的大致比重可以这样检查制备密度梯度离心介质如Percoll，Readygrad的氯化钠溶液或蔗糖溶液，将收集的细胞与densitimer marker珠一起离心，在分成5～10层的梯层中证实哪一层含有细胞。
可进一步收集分层的细胞，如用移液器收集。
比重离心时可使用细胞分离器如血液组分分离装置(ASTEC204，Amco)。
本发明的另一方面中，本发明干细胞的制备方法包括A)获得吸脂所得材料；以及B)将所述吸脂所得材料进行离心以获得细胞级分而不分离脂肪组织。该方法还可包括过滤所述细胞级分以获得干细胞。该方法还可包括使所述材料处于至少一部分细胞脱离所述材料的条件下。
吸脂所得材料可以是进行吸脂手术时可获得的任意材料。此类材料包含脂肪、脂肪细胞、液体、细胞外基质如胶原，等等。本发明中发现，除了吸脂所得抽取物外，此类吸脂所得材料通常也含有大量的干细胞或前体细胞。因此，吸脂所得材料通常是制备干细胞的好来源。本领域中从未预料到这样的结果。
脂肪组织与细胞分离的条件可以是任意条件，只要脂肪组织与细胞分开并有助于细胞的分离即可。此类条件包括但不限于降解细胞外基质，例如加入胶原酶如可从Wako获得的胶原酶(用于分散细胞的胶原酶，032-10534)。将这种胶原酶溶于PBS中，浓度为0.075％，将溶液加温至37℃然后加到等体积的脂肪中。样品用搅拌器于37℃以80rpm搅拌30分钟。
在本发明采用的离心步骤中，本发明还可包括除去上清液以获得细胞层。
优选的是该方法还可包括除去步骤B)中上清液或过滤步骤B)所得材料的步骤，以除去残余的脂肪团。任意滤器均可用于此目的，只要不引起阻塞即可。
优选的是该方法还可包括除去血细胞这一步骤，以使干细胞的纯度更高。但是，这些血细胞可随后在培养皿中培养时通过细胞传代除去，使所得细胞中含多于80％、优选多于90％的干细胞。这也是意外的结果，是现有技术未预期到的。这些血细胞可以通过除去血细胞的步骤除去，该步骤包括加入降解血细胞的组分。
在本发明的一个优选实施方案中，本发明提供了制备干细胞的方法，该方法包括i)获得吸脂所得材料；ii)将所述材料置于细胞与脂肪组织分开的条件下，优选不分离脂肪组织；iii)将所述材料进行离心；iv)向所述材料加入降解血细胞的组分并加以搅拌；v)将所述材料离心以获得沉淀；vi)从所述沉淀抽取材料的上清液。
本发明中使用的吸脂所得材料通常包括吸脂所得抽取物和脂肪，但是已经发现按照本发明进行处理时，所述材料含有的干细胞比抽取物中所含干细胞多得多。
优选的是步骤ii)所述条件包括加入胶原酶。
优选的是该方法还包括将所述材料置于包括维持吸脂所得抽取物的所述条件的步骤。
优选的是本发明中所用的吸脂所得材料还可包含吸脂所得抽取物以及脂肪。
另一实施方案中，所述步骤iii)中的离心以400～1200×g进行。通常使用400×g或800×g。
另一实施方案中，所述降解血细胞的组分包含氯化铵和碳酸氢钾。
另一实施方案中，所述氯化铵在该组分中的浓度为100mM～200mM，优选约155mM。另一实施方案中，所述碳酸氢钾在该组分中的浓度为5mM～20mM，优选约10mM。优选的是有利地使用两者的组合。
另一实施方案中，所述步骤v)中的所述离心以400～1200×g进行。
本发明获得的沉淀包括大量干细胞或前体细胞。这些细胞已经证明具有分化成大量分化细胞如骨、软骨、脂肪等的能力。
本发明中优选将红细胞除去，但是这并不是必须的。因为不经过此除去步骤制备的本发明干细胞也展现出明显的分化和增殖活性。
用于培养这些收集的细胞的培养基包括但不限于如DMEM、M199、MEM、HBSS、Ham’s F12、BME、RPMI1640、MCDB104、MCDB153(KGM)等。优选培养基包括DMEM和M199。
收集的细胞为异源细胞群，包括表达CD13、CD29、CD44、CD49d、CD71、CD73、CD90、CD105、CD106、CD151的干细胞，还可包括表达CD31或CD34或二者均表达的干细胞。
本发明的一方面中，收集的细胞在多种条件下培养以获得各种细胞，如血管内皮细胞、神经细胞、平滑肌细胞、心肌细胞、骨骼肌细胞、软骨细胞、骨细胞、脂肪细胞、韧带细胞和基底细胞等。
这些条件在本领域内已知，包括将所得细胞种植到含DMEM培养基的60mm培养皿上，浓度为1.8×106细胞。
一周到两周的培养使细胞达到近汇合状态，之后将细胞置于脂肪分化诱导培养基、软骨分化诱导培养基或骨分化诱导培养基中并继续培养约2～4周。
示范性脂肪发生培养基可以是补充有10％FBS、含有0.5mM的IBMX、1μM地塞米松、10μM胰岛素、200μM吲哚美辛和1％AMAM的DMEM。
示范性骨发生培养基可以是补充有10％FBS和5％马血清、含有1μM地塞米松、50μM抗坏血酸-2-磷酸、10mMβ-甘油磷酸和1％ABAM的DMEM。
示范性软骨发生培养基可以是补充有1％FBS、含有6.25μg/ml胰岛素、6.25μg/ml转铁蛋白、10ng/ml的TGF β1、50nM抗坏血酸-2-磷酸和1％ABAM的DMEM。ABAM抗菌抗霉菌溶液可从Gibco获得(ABAM；Cat.No.600-5240)。
这些细胞诱导后用油红O评估脂肪组织，用阿辛蓝评估软骨组织，用冯科萨染料评价骨组织。
本发明中还可进一步地使用下述方法从收集的细胞群分离和收集血管内皮前体细胞。
例如，将收集的细胞群置于1％明胶包被的培养皿上使用培养血管内皮细胞的培养基培养约4～5天。培养后用0.25％胰蛋白酶使细胞脱落下来，并通过MACS(磁性细胞分离系统)或FACS(流式细胞仪)与抗-PECAM-1磁珠反应从而分离只与该抗体反应的细胞。将分离的细胞置于1％明胶包被的培养皿上用培养血管内皮细胞的培养基进行培养。为了除去污染的成纤维细胞等，利用血管内皮细胞比其他细胞更容易脱落的性质，使细胞与0.25％胰蛋白酶反应约30～40秒，仅收集脱落的细胞并在另外的培养皿中培养，使分化的血管内皮前体细胞得以分离(例如参见，Hutley LJ，etalHuman adipose tissue endothelial cells promote preadipocyte proliferation.Am.J.Physiol.Endocrinol.Metab.2001 Nov；281(5)E1037-44)。
本发明的进一步方面中，本发明提供了制备干细胞的系统，该系统包括A)获得吸脂所得抽取物的装置；B)分离吸脂所得抽取物以获得细胞级分的装置；以及C)将所述细胞级分通过比重分离如用于细胞分离的密度梯度离心加以分离的装置。该系统可以简单、大量并可自动化的方式制备干细胞。
在一个不同方面中，本发明提供了制备干细胞的系统，该系统包括A)获得吸脂所得材料的装置；以及B)将所述吸脂所得材料进行离心以获得细胞级分而不分离脂肪组织的装置。
在另一个不同方面中，本发明提供了制备干细胞的系统，该系统包括i)获得吸脂所得材料的装置；ii)将所述材料置于不分离脂肪组织而使至少一部分细胞脱离所述材料的条件下的装置；iii)将所述材料进行离心的装置；iv)向所述材料加入降解血细胞的组分并加以搅拌；v)将所述材料离心以获得沉淀的装置；以及vi)从所述沉淀抽取材料上清液的装置。
通过吸脂获取抽取物的装置包括使用真空从身体抽吸脂肪的装置。例如，此类装置包括但不限于脂肪抽吸手术(使用手动真空注射器以及真空抽吸器等的抽吸手术)和切开皮肤的脱脂手术。
分离吸脂所得抽取物获得细胞级分的装置以及将该细胞级分按比重分离如用于细胞分离的的密度梯度离心进行分离的方法包括但不限于离心。通过离心吸脂所得抽取物获取细胞级分时，所用条件包括200～1200×g离心30～60分钟，优选260～900×g离心3～30分钟，更优选400～800×g离心3～15分钟，最优选400×g离心5～10分钟。Ficoll用于密度梯度离心来按比重进行细胞分离时，所用条件可以是200～1200×g离心10～60分钟，优选260～900×g离心10～60分钟，更优选400～800×g离心10～40分钟，最优选400×g离心30～40分钟。而且本发明可选地包括收集感兴趣比重的细胞层的装置。优选的是所收集细胞层的比重小于红细胞。此类装置包括但不限于手动吸液器、手动抽吸器、自动吸液器及自动抽吸器等。
本发明的干细胞可用于获取多种分化细胞和/或前体细胞。具体方法如下所述。(制备分化细胞的方法)一方面本发明提供了从干细胞制备分化细胞的方法。此类可从干细胞得到的分化细胞可以是最终的分化细胞，也可以是前体细胞。
从来源于吸脂所得抽取物的干细胞制备分化细胞的方法包括(1)向培养基中加入分化诱导剂如地塞米松的方法；以及(2)将干细胞和对应于期望部位的分化细胞一起培养的方法。
(向培养基中加入分化诱导剂来诱导干细胞分化的方法)本发明的细胞混合物还可进一步包括促进分化成对应于期望部位的分化细胞的因子。此类因子可以是已知或已证实可促进分化成对应于期望部位的分化细胞的任意因子。优选分化促进因子的实例包括但不限于肾上腺皮质类固醇(如地塞米松等)、胰岛素、葡萄糖、吲哚美辛、异丁基-甲基黄嘌呤(IBMX)、抗坏血酸-2-磷酸(抗坏血酸-2-磷酸盐)、抗坏血酸及其衍生物、甘油磷酸、雌激素及其衍生物、孕酮及其衍生物、雄激素及其衍生物、生长因子(如αFGF、βFGF、EGF、IGF、TGF-β、ECGF、BMP、PDGF等)、垂体腺提取物、松果体提取物、视黄酸、维生素D、甲状腺激素、胎牛血清、马血清、人血清、肝素、碳酸氢钠、HEPES、白蛋白、转铁蛋白、硒酸(如亚硒酸钠等)、亚油酸、3-异丁基-1-甲基黄嘌呤、去甲基试剂(如5-氮杂胞苷等)、组蛋白去乙酰基试剂(如制滴菌素等)、活化素、细胞因子(如LIF、IL-2、IL-6等)、六亚甲基二乙酰胺(HMBA)、二甲基乙酰胺(DMA)、二丁基cAMP(dbcAMP)、二甲基亚砜(DMSO)、碘脱氧尿苷(IdU)、羟基脲(HU)、阿糖胞苷(AraC)、丝裂霉素C(MMC)、丁酸钠(NaBu)、凝聚胺及硒等。
对于本发明的细胞混合物来说，可以使用任意培养基，只要混合细胞可以维持而且分化成对应于期望部位的分化细胞的分化过程可以维持即可。此类培养基的实例包括但不限于DMEM、M199、MEM、HBSS(Hank’s平衡盐溶液)、Ham’s F12、BME、RPMI1640、MCDB104、MCDB153(KGM)等。这些培养基可以添加肾上腺皮质类固醇(如地塞米松等)、胰岛素、葡萄糖、吲哚美辛、异丁基-甲基黄嘌呤(IBMX)、抗坏血酸-2-磷酸(抗坏血酸-2-磷酸盐)、抗坏血酸及其衍生物、甘油磷酸、雌激素及其衍生物、孕酮及其衍生物、雄激素及其衍生物、生长因子(如αFGF、βFGF、EGF、IGF、TGF-β、ECGF、BMP、PDGF等)、垂体腺提取物、松果体提取物、视黄酸、维生素D、甲状腺激素、胎牛血清、马血清、人血清、肝素、碳酸氢钠、HEPES、白蛋白、转铁蛋白、硒酸(如亚硒酸钠等)、亚油酸、3-异丁基-1-甲基黄嘌呤、去甲基试剂(如5-氮杂胞苷等)、组蛋白去乙酰基试剂(如制滴菌素等)、活化素、细胞因子(如LIF、IL-2、IL-6等)、六亚甲基二乙酰胺(HMBA)、二甲基乙酰胺(DMA)、二丁基cAMP(dbcAMP)、二甲基亚砜(DMSO)、碘脱氧尿苷(IdU)、羟基脲(HU)、阿糖胞苷(AraC)、丝裂霉素C(MMC)、丁酸钠(NaBu)、凝聚胺及硒等，可单独加入或联合加入。
从来源于吸脂所得抽取物的干细胞诱导分化为脂肪细胞的条件包括但不限于，例如在添加异丁基-甲基黄嘌呤、地塞米松、胰岛素和吲哚美辛的DMEM中培养干细胞。
从来源于吸脂所得抽取物的干细胞诱导分化为软骨细胞的条件包括但不限于，例如在添加胰岛素、抗坏血酸-2-磷酸和TGF-β1的DMEM中培养干细胞。
从来源于吸脂所得抽取物的干细胞诱导分化为骨细胞的条件包括但不限于，例如在添加地塞米松、抗坏血酸-2-磷酸和β-甘油磷酸的DMEM中培养干细胞。
从来源于吸脂所得抽取物的干细胞诱导分化为肌细胞的条件包括但不限于，例如在补充有10％胎牛血清(FBS)和5％马血清(HS)并添加地塞米松和氢化可的松的DMEM中培养干细胞。
(将干细胞和对应于感兴趣部位的分化细胞一起培养来诱导分化)这种将干细胞和感对应于兴趣部位的分化细胞一起培养可以产生一定数量具有期望性质的分化细胞，优选以均一方式。该方法包括A)将a)脂肪来源前体细胞及b)对应于期望部位的分化细胞加以混合；以及B)将所述混合物在使得脂肪组织来源前体细胞分化的充分条件下进行培养。
对应于期望部位的分化细胞可用本领域公知的技术制备。作为替代方案，这样的分化细胞可从商品细胞系获得(如从ATCC等获得的细胞系等)。这样的分化细胞可从来自需要移植的受试者的原代培养细胞(如肝细胞、肾细胞、脂肪细胞、骨细胞、软骨细胞等)获得。原代培养及细胞系培养的技术在本领域是已知的，例如可见于Hiroshi Hatanaka & Akira Asano，eds.，“AMBO Manuaru Saibo Kenkyuho [AMBOManual of Cell Study Methods]”，TaKaRa；Toshio Watanabe，ed.，“Baio JikkenIrasutoreiteddo(6)Sukusuku Sodate Saibo Baiyo[Illustrated Culture Experiments-Cells grow quickly]”，Shujun sha(1996)等，在此将其引入作为参考。
本发明中可使用任意分化细胞，只要所述细胞与期望部位对应即可，优选间充质细胞，包括但不限于脂肪细胞、骨髓细胞、成骨细胞、软骨细胞、成纤维细胞、成肌纤维细胞、神经细胞、骨骼肌细胞、心肌细胞、血管内皮细胞、血管平滑肌细胞、肝细胞、肾细胞和胰细胞等。这些细胞可以是鉴定过的细胞，但是，即使这些细胞的性质是未知也可用诸如FACS的分离技术将其用于制备对应于期望部位的细胞。
用于确定对应于此类期望部位的细胞的标记实例包括但不限于(1)脂肪胞浆内有甘油三酯存在，油红O染色，甘油磷酸脱氢酶(GPDH)活性，胞浆内GLUT4，Ap2(脂肪酸结合蛋白)，LPL(脂蛋白脂酶)，PPARγ1，2(过氧化物酶体生长活化受体γ1，2)，瘦素的表达；(2)骨细胞、骨组织存在碱性磷酸酶，骨钙化(钙沉积)程度确定，以及骨钙蛋白、骨桥蛋白或骨粘连蛋白的表达；(3)软骨细胞、软骨组织存在粘多糖，II型胶原和软骨素-4-硫酸的表达和存在；(4)骨骼肌细胞胞浆内存在大量肌球蛋白；等等。例如，FACS方案的描述可见于Nakauchi，ed.，“Furosaitometori Jiyujizai [Master of Flow cytometery]”，special Issue，Saibokogaku[Cell Engineering](Shujunsha)，1999等，在此将其引入作为参考。
本发明的细胞混合物还可进一步包含促进分化成对应于期望部位的分化细胞的因子。此类因子可以是已知的，或已证实可促进分化成对应于目标部位的分化细胞的任意因子。优选分化促进因子的实例包括但不限于肾上腺皮质类固醇(如地塞米松等)、胰岛素、葡萄糖、吲哚美辛、异丁基-甲基黄嘌呤(IBMX)、抗坏血酸-2-磷酸(抗坏血酸-2-磷酸盐)、抗坏血酸及其衍生物、甘油磷酸、雌激素及其衍生物、孕酮及其衍生物、雄激素及其衍生物、生长因子(如αFGF、βFGF、EGF、IGF、TGF-β、ECGF、BMP、PDGF等)、垂体腺提取物、松果体提取物、视黄酸、维生素D、甲状腺激素、胎牛血清、马血清、人血清、肝素、碳酸氢钠、HEPES、白蛋白、转铁蛋白、硒酸(如亚硒酸钠等)、亚油酸、3-异丁基-1-甲基黄嘌呤、去甲基试剂(如5-氮杂胞苷等)、组蛋白去乙酰基试剂(如制滴菌素等)、活化素、细胞因子(如LIF、IL-2、IL-6等)、六亚甲基二乙酰胺(HMBA)、二甲基乙酰胺(DMA)、二丁基cAMP(dbcAMP)、二甲基亚砜(DMSO)、碘脱氧尿苷(IdU)、羟基脲(HU)、阿糖胞苷(AraC)、丝裂霉素C(MMC)、丁酸钠(NaBu)、凝聚胺及硒等。
对于本发明的细胞混合物来说，可以使用任意培养基，只要混合物细胞可以维持并分化成对应于期望部位的分化细胞即可。此类培养基的实例包括但不限于DMEM、M199、MEM、HBSS(Hank’s平衡盐溶液)、Ham’s F12、BME、RPMI1640、MCDB104、MCDB153(KGM)等。这些培养基可以添加肾上腺皮质类固醇(如地塞米松等)、胰岛素、葡萄糖、吲哚美辛、异丁基-甲基黄嘌呤(IBMX)、抗坏血酸-2-磷酸(抗坏血酸-2-磷酸盐)、抗坏血酸及其衍生物、甘油磷酸、雌激素及其衍生物、孕酮及其衍生物、雄激素及其衍生物、生长因子(如αFGF、βFGF、EGF、IGF、TGF-β、ECGF、BMP、PDGF等)、垂体腺提取物、松果体提取物、视黄酸、维生素D、甲状腺激素、胎牛血清、马血清、人血清、肝素、碳酸氢钠、HEPES、白蛋白、转铁蛋白、硒酸(如亚硒酸钠等)、亚油酸、3-异丁基-1-甲基黄嘌呤、去甲基试剂(如5-氮杂胞苷等)、组蛋白去乙酰基试剂(如制滴菌素等)、活化素、细胞因子(如LIF、IL-2、IL-6等)、六亚甲基二乙酰胺(HMBA)、二甲基乙酰胺(DMA)、二丁基cAMP(dbcAMP)、二甲基亚砜(DMSO)、碘脱氧尿苷(IdU)、羟基脲(HU)、阿糖胞苷(AraC)、丝裂霉素C(MMC)、丁酸钠(NaBu)、凝聚胺及硒等，可单独添加或联合添加。
因此，本发明在另一方面提供了细胞混合物，该细胞混合物包含来自于吸脂所得抽取物的干细胞和对应于期望部位的分化细胞。此类混合物可用于细胞移植，而且还有这样的优势，如每一组分的需用量少于现有技术中使用单种细胞时的需用量。另外，还有优于现有技术的其他优势，例如包括(1)不需要离体产生再生组织；(2)允许以更确定的方式繁殖更大的组织；(3)有可能以简单的方式在更短的时间内实施该方法；(4)不需要进行切开器官如皮肤的手术，有可能只使用针头来施用(移植)细胞和/或组织。
本发明的细胞混合物优选为在足以诱导干细胞分化成脂肪的条件下处理过的混合物，但是本发明并不限于此。细胞混合物置于分化条件以后，可用于直接移植或分化成组织或器官。
(细胞移植组合物)另一方面本发明提供了用于细胞移植的组合物(如组织外植体，外植体和含这些外植体与组合物)。此移植可用于任何目的，只要其用于治疗或预防与期望部位所对应分化细胞缺陷或退化相关的疾病、障碍或异常状况，或是治疗或改善美容状况即可。此类移植优选包括但不限于移植入期望部位，并且本发明的含细胞的组合物可施用于或移植到任意期望部位，只要最终有可能治疗或预防这样的期望部位即可。
得自吸脂抽取物的干细胞与分化细胞的比例可以是任意比，只要期望的分化发生即可，一般为约1∶10～约10∶1，优选约1∶5～约5∶1，更优选1∶2～约2∶1，最优选的是各细胞近似等量存在。该细胞混合物中，用于移植的分化细胞及吸脂所得抽取物来源干细胞可采用如前文所述“制备分化细胞的方法”部分中所述的任意形式和实施方案。
相对于将要植入的宿主来说，分化细胞和脂肪来源前体细胞可以彼此是异种、同种异体或同基因的。优选的是同种异体或同基因的，更优选的是同基因的。本发明并不局限于此。然而不希望受任何理论约束，因为有可能抑制免疫排斥反应。但是，如果预计会有排斥反应，本发明还可包括避免排斥反应。避免排斥反应的方法在本领域内是公知的(例如，参见“Shin Gekagaku Taikei，Dai 12 Kan，Zoki Ishoku(ShinzoIshoku·Hai Ishoku Gijutsuteki Rinriteki Seibi kara Jisshi ni Mukete[New WholeSurgery，Vol.12，Organ Transplantation(Heart Transplantation·LungTransplantation From Technical and Ethical Improvements to Practice)])”(修订第3版)，Nakayama Shoten))。此类方法的实例包括但不限于使用免疫抑制剂或甾体类药物的方法，等等。例如，目前有下述用于预防排斥反应的免疫抑制剂“环胞菌素”(SANDIMMUNE/NEORAL)、“他克莫司(tacrolimus)”(PROGRAF)、“硫唑嘌呤”(IMURAN)、“甾体激素”(强的松龙，甲基强的松龙)和“T-细胞抗体”(OKT3、ATG等)。许多情况下作为预防性免疫抑制治疗的全球广泛使用的方法是同时使用环孢菌素、硫唑嘌呤和甾体激素这三种药物。理想的是免疫抑制剂与本发明的药物制剂同时使用。本发明并不局限于此。免疫抑制剂可以在本发明的再生/治疗方法实施之前或之后使用，只要可以达到免疫抑制的效果即可。
分化细胞和脂肪来源前体细胞可以彼此是异种、同种异体或同基因的。优选的是同种异体或同基因的，更优选的是同基因的。然而不希望受任何理论约束，这是因为同种异体或同基因(自体)(优选同基因)的分化细胞和脂肪来源前体细胞很有可能形成均一的细胞群。
上述细胞混合物或组合物可作为药物提供。这样的药物可用于期望部位所对应分化细胞缺陷或退化相关的疾病、障碍或异常状况的治疗或预防，或是治疗或改善美容状况。除了包含所述细胞混合物或含细胞混合物的组合物外，本发明的药物可包括药学上可接受的载体。本领域的技术人员可以根据目的选择和使用本文中所述任意载体作为这样的载体。本领域的技术人员将可以更改本发明中所含的组分。
(使用细胞混合物进行治疗和预防)另一方面本发明提供了分化细胞缺陷所致疾病、障碍或异常状况的治疗或预防方法，以及美容状况的治疗或改善方法，这些方法包括以下步骤A)提供一种组合物，其包含a)脂肪来源前体细胞及b)对应于期望部位的分化细胞；以及B)将该组合物施用于受试者。在该方法中，用于移植的分化细胞及吸脂所得抽取物来源干细胞可采用如前文所述“制备分化细胞的方法”部分中所述的任意形式和实施方案。
本发明中可使用任意施用方法，包括本领域内已知的方法。例如但不限于使用注射器、导管、管等注射所述组合物。优选的是，示范性施用途径包括但不限于局部注射(皮下注射、器官内注射(如肌肉、脂肪等))、静脉注射、动脉注射、施用于组织上等。与常规技术相比，本发明通过植入进行治疗或预防的方法具有但不限于下列优点(1)不需要在体外(离体)产生再生组织；(2)可更可靠地再生更大的组织；(3)可简单、迅速地完成再生；(4)不需要进行切开器官如皮肤的手术，可通过针穿刺来施用(植入或移植)细胞和/或组织。
(用途)另一方面，本发明提供了由a)脂肪来源前体细胞和b)对应于期望部位的分化细胞所组成的混合物用于细胞移植的用途，其用于治疗或预防与期望部位所对应分化细胞缺陷或退化相关的疾病、障碍或异常状况，或是治疗或改善美容状况。用于移植的分化细胞及脂肪来源前体细胞可采用如前文所述“制备分化细胞的方法”部分中所述的任意形式。
下文将以实施例的方式说明本发明。下文所述的实施例仅用于示范目的。因此，本发明的范围仅受所附的权利要求书限制，而不受上文所述实施方案或下文所述实施例限制。
实施例如无特别说明则下文实施例中所用试剂从Wako Pure Chemical Industries或Sigma获得。动物的护理根据动物保护的精神遵照国家医学研究协会制定的“实验室动物护理原则”及由实验动物资源学会制定并由国立卫生研究院发布的“实验动物护理和使用指南”(NIH出版物，No.86-23，1985年修订)。人类受试者在进行任何试验之前均获得其知情同意。
(实施例1吸脂所得抽取物的制备)将过量Tumescent溶液(含0.0001％肾上腺素的盐水)注入皮下脂肪层(Tumescent方法)，所述过量超过吸脂手术前待抽吸的吸脂量；然后将内径为2～3mm的插管(金属制成，带抽吸器)用于吸脂手术。吸脂手术在本领域是公知的，例如可参考BiyoSeikei Shujutsu Practice 2(Cosmetic Operation Practice 2)，ed.Masanari ICHIDA，Ryusaburo TANINO，and Yoshiaki HOSAKA，BUNKODO出版，pp.429-469，将其整体引入作为参考。
抽吸出来的脂肪用盐水洗涤。约可以产生5到10升的洗涤抽取物，其中起始的1到2升含有丰富的细胞材料，用于下列操作。
(实施例2从吸脂所得抽取物制备干细胞悬液)使用两种干细胞制备方法中的任一种将所得抽取物如下所述进行处理。下述两种方法不需要使用酶如胶原酶处理，这些方法与常规方法以及用常规技术从脂肪组织制备的干细胞的不同之处在于不含酶如胶原酶污染。
(I)制备方法11)吸脂所得抽取物(通常约2～4升)的液体部分于400×g离心10分钟。
2)弃上清。应注意沉淀的细胞有可能浮起来，因此用抽吸器小心地进行抽吸而不破坏细胞。
3)沉淀的细胞(大部分为红细胞)转移到数个50ml聚丙烯管中，然后离心(400×g，5分钟)。
4)吸出上清。获得总体积为15～20ml的沉淀细胞。当其中含有大量基质组分时，用100μm的滤器将其过滤掉。之后可根据需要进行离心。
5)在50ml的管中加入Ficoll(注册商标)(15ml)。之后缓慢加入15～20ml的细胞溶液以在上面形成一层。
6)将该管于400×g离心30分钟(18～20℃)。
7)离心后，细胞溶液分成4层从最顶层开始分别为A层(无细胞层，透明)，B层(单核细胞层，淡红色)，C层(Ficoll层，透明)，以及D层(红细胞层，深红色)。包括干细胞的粘附细胞位于B层和C层中。将A层吸去。将B层和C层(约3ml)回收为细胞悬液，然后转移到50ml的管中。
8)回收的细胞悬液中加入补充了血清的PBS(补充有10％FBS或10％人血清的PBS)至体积50ml。通过吹吸使混合物混合，然后离心(400×g，5分钟)。
9)抽取上清。再加入补充了血清的PBS至体积50ml。通过吹吸使混合物混合，然后离心(400×g，5分钟)。
10)抽取上清。回收含干细胞的沉淀细胞。
(II)制备方法21)吸脂所得抽取物的液体部分在洁净台内用抽吸管抽吸并经滤器(孔径大小120μm)进入储蓄器。所得滤液用密封分离袋封装。
2)用细胞分离器(血液组分分离装置可从日本东京AMCO，Inc获得的ASTEC204)离心三次以尽可能地除去比重更小的血小板、比重更大的红细胞以及粒细胞。
3)收集含高浓度干细胞的级分(约30～40ml)。分离细胞的比重为1.050～1.075。
细胞的比重可以如下所述粗略确定。将密度梯度离心介质如PercollTM，ReadyGradTM等用氯化钠溶液或蔗糖溶液进行配制。将收集的细胞与密度标记珠加入混合物中，然后进行离心。混合物分成5～10层(取决于珠)。含细胞的梯层显示细胞的比重。
图1显示了分离细胞的照片。
(实施例3回收干细胞的表征)实施例2中回收的干细胞用FACS按下述方法进行表征。
约5ml细胞悬液用染色介质(SM；补充了0.5％牛血清白蛋白及0.05％NaN3的PBS)洗涤两次。根据需要可进行细胞计数。
加入标记抗体(标记藻红蛋白(PE)、allophycocyannin(APC)和/或荧光素异硫氰酸酯(FITC))到约1～10×106细胞/ml的细胞悬液中，使其终浓度为0.001～0.1μg/ml。
将混合物置冰上孵育30分钟，然后洗涤细胞。细胞悬浮液的浓度用SM调到约5×105细胞/ml。
使用FACS Vantage(Becton Dickinson)。抗体标记用作分析所分离干细胞中各CD蛋白表达的标志物。结果发现来源于吸脂所得抽取物液体部分的干细胞表达CD90和CD49d，如表1所示。
分离的干细胞在DMEM中传代培养(subculture)两次。传代培养于80％汇合时进行。第二次传代培养后细胞用FACS如上所述进行分析。结果如表1所示。
(表1两次传代培养后各CD在干细胞中的表达)CD 表达水平3 -4 -11c-
13++14-15-16-19-29++31+33-34+36++38-44+45+49d ++54+56-58+61-62E -62P -69-71++73++90++104 -105 ++106 -117 +135 -144 -146 +151 ++235a -SH3 +STRO-1+“-”＝未检测到表达+和++表示20％
“+”＝在20％或更少的细胞中检测到，“++”＝在20％或更多细胞中检测到。
根据上述结果，尽管从吸脂所得抽取物液体部分制备的干细胞包括与间充质干细胞对应的细胞群，但这些干细胞包括CD31和CD34阳性细胞，这是常规技术所制备脂肪来源干细胞所不包含的。因此，可以理解的是本发明方法制备的干细胞可容易、高效地分化成血管内皮(血管形成)。另外，本文中用作标记的CD表达在两次传代培养后得到证实。因此，可以理解的是本发明的干细胞在经过约两次传代培养后基本不改变表型。
(实施例4表征从得自多个受试者的吸脂所得抽取物液体部分回收的干细胞)进一步从得自多个受试者的吸脂所得抽取物的液体部分回收干细胞，然后加以表征。结果如下所示。
(表2回收于得自多个受试者吸脂所得抽取物的液体部分的干细胞表征结果)

数字表示在细胞群中表达各种蛋白的干细胞的比例(％)，“-”＝未检测到表达，“+”＝检测到表达，而N.T.＝未检测。
大部分收集到的干细胞对CD13、CD29、CD34、CD36、CD44、CD49d、CD54、CD58、CD71、CD73、CD90、CD105、CD106、CD151和SH3呈阳性。因此本发明的脂肪来源前体细胞是表达选自下组的至少一种蛋白质的细胞CD13、CD29、CD34、CD36、CD44、CD49d、CD54、CD58、CD71、CD73、CD90、CD105、CD106、CD151和SH3。表达CD106的干细胞是本发明中所用脂肪来源前体细胞的特性之一。干细胞群的一部分对于CD31、CD45、CD117和CD146呈阳性，而另一部分呈阴性。
干细胞群对CD3、CD4、CD14、CD15、CD16、CD19、CD33、CD38、CD56、CD61、CD62e、CD62p、CD69、CD104、CD135和CD144呈阴性。因此，本发明的脂肪来源前体细胞是不表达选自下组的至少一种蛋白质的细胞CD3、CD4、CD14、CD15、CD16、CD19、CD33、CD38、CD56、CD61、CD62e、CD62p、CD69、CD104、CD135和CD144。
当干细胞群在分化诱导培养基中培养时，器官特异性如骨特异性、软骨特异性、脂肪特异性等的蛋白表达在2～3周后可以识别。所述干细胞群不表达大部分成纤维细胞表达的CD56，这不同于人真皮来源的培养成纤维细胞。相反，干细胞群中的CD105表达在成纤维细胞中通常观察不到。干细胞群所表现出来的CD49d表达在骨髓来源的间充质干细胞中通常观察不到。
另外，对于CD31、CD34、CD36、CD45、CD106和CD117来说，当培养时间长的时侯，这些CD的表达倾向于消失。因此，如果继续传代培养，所观察到的CD106表达可能就观察不到了。
(实施例5将来自于吸脂所得抽取物的干细胞诱导分化为脂肪细胞)如下所述将来源于吸脂所得抽取物的干细胞置于脂肪发生DMEM培养基中培养，使其诱导分化为脂肪细胞。
所用脂肪发生DMEM具有如下组成DMEM(补充有10％FBS) 100ml异丁基-甲基黄嘌呤(0.5M) 100μl(终浓度为0.5mM)地塞米松(10-4M) 1ml(终浓度为1μM)胰岛素(10-3M) 1ml(终浓度为10μM)吲哚美辛 100μl(终浓度为200μM)
按实施例2制备的约三十万干细胞进行不传代培养约4周。结果如图2所示，干细胞分化成细胞内含有贮存脂肪样物质的细胞。
将分化细胞按如下方法用油红染色，证实贮存脂肪样物质为脂肪，而该分化细胞实际上是脂肪细胞。
如下所述进行油红染色1)弃培养基，用PBS洗涤；2)细胞用10％福尔马林固定约10分钟；3)用蒸馏水洗涤；4)加入60％异丙醇约1分钟；5)将细胞转移到油红O染色液*中15分钟；6)加入60％异丙醇约1分钟；7)用蒸馏水洗涤；8)加入苏木精两分钟使细胞核染色；9)用蒸馏水洗涤；10)加入碳酸锂**数秒，进行着色；11)用蒸馏水洗涤。
*油红O染色液如下制备将0.3g油红O(SIGMAO-0625)溶于100ml的99％异丙醇中。使用时，将此溶液和蒸馏水以6∶4的比例混合并用力振摇。混合3分钟后，将所得溶液加以过滤，备用。
**碳酸锂如下制备将3mg碳酸锂溶夜(1.54g溶于100ml蒸馏水中；Sigma-Aldrich)加到100ml蒸馏水中。
染色细胞的照片见图3。如图3所示，实施例2中制备的干细胞在上述脂肪发生DMEM培养基中进行培养，以证实贮存于细胞细胞内的物质为脂肪，因此从干细胞分化而来的细胞实际上是脂肪细胞。
(实施例6将来自于吸脂所得抽取物的干细胞诱导分化为软骨细胞)如下所述将来源于吸脂所得抽取物的干细胞置于软骨发生DMEM培养基中培养，使其诱导分化为软骨细胞。
如下所述制备软骨发生DMEM1)将DMEM(不加血清，加入合适的抗生素)100ml、胰岛素(6.25mg/ml)100μl(加入量625μl)、抗坏血酸-2-磷酸(5μM)1ml(终浓度为50nM)以及胎牛血清1mL(终浓度1％)混合。
2)所得混合物用0.22μm的滤器过滤后，加入1ml TGF-β1(1μg/ml)，吹吸后于4℃储存。
按实施例2制备的约三十万干细胞进行不传代培养约4周。结果如图4所示，干细胞分化为软骨样细胞，这些细胞形成微细胞团。
分化细胞用阿辛蓝染色以证实该分化细胞为软骨细胞。
如下所述进行阿辛蓝染色1)弃培养基，用PBS洗涤；2)细胞用10％福尔马林固定约10分钟；3)加入3％醋酸溶液3分钟；4)加入阿辛蓝染色溶液*约1小时；5)加入3％醋酸溶液3分钟；6)用蒸馏水洗涤2两分钟；7)加入核坚牢红(Nulcear Fast Red)(Kernechtrot)**2分钟；8)用蒸馏水洗涤。
*将1g阿辛蓝8GX溶于3％醋酸水溶液100ml，过滤备用。
**核坚牢红溶液如下所述制备0.1g核坚牢红(核酸酶固红(nuclease fast red))加入100ml蒸馏水中，加入5g硫酸铝，煮沸溶液。过滤备用。
用阿辛蓝红染色的细胞照片见图5。如图5所示，证实了在上述软骨发生DMEM培养基中培养的干细胞实际上是软骨细胞。
(实施例7脂肪组织的制备)接下来，作为分化细胞，从知情同意的人受试者制备脂肪组织。用本领域内公知的技术进行分离。简要地说，从知情同意的人受试者抽吸脂肪组织，并无菌分离出人脂肪组织。组织团保存于用于脂肪细胞的培养基(500ml组成＝Eagle’s培养基4.75g、10％NaHCO310ml、谷氨酰胺0.3g、卡那霉素(20mg/ml)1.5ml、青链霉素5ml、FBS(10％))中。组织团可作为组织团使用，或可以分离成脂肪细胞后使用。
Eagle’s培养基的成分(每9.5g)氯化钠6400mg氯化钾400mg氯化钙(无水) 200mg硫酸镁(无水) 97.7mg磷酸二氢钠(无水) 108mg硝酸汞(九水合物) 0.1mg葡萄糖1000mg丙酮酸钠 110mg琥珀酸106mg琥珀酸钠(六水合物)27mg盐酸L-精氨酸 84mg盐酸L-半胱氨酸(一水合物) 70.3mg甘氨酸30mg盐酸L-组氨酸(一水合物)42mgL-异亮氨酸104.8mgL-亮氨酸 104.8mg盐酸L-赖氨酸 146.2mgL-甲硫氨酸30mgL-苯丙氨酸66mgL-丝氨酸 42mg
L-苏氨酸95.2mgL-色氨酸16mgL-酪氨酸二钠89.5mgL-缬氨酸93.6mg重酒石酸胆碱7.2mg叶酸4mg烟酰胺 4mg泛酸钙 4mg盐酸吡哆醛 4mg核黄素 0.4mg盐酸硫胺素 4mgi-肌醇 7.2mg酚红5mg(实施例8脂肪细胞混合物)接下来实施例2中制备的脂肪来源前体细胞(PLA)不经进一步处理即与实施例6中制备为分化细胞的脂肪组织(脂肪细胞群)混合。确定分化是否被促进而引起再生。
取实施6中制备的脂肪组织团(A)1ml(900mg)或1ml(900mg)该脂肪组织团与10ml实施例2中制备的抽吸脂肪来源的干细胞的混合物(B)皮下注入SCID小鼠(Charles River，日本)的背部。用注射器进行注射。4周后从注射部位收集组织。测定植入脂肪组织的重量并分析该组织。
可以证实来源于吸脂抽取物的干细胞混合物在维持组织重量方面的作用。
(由脂肪细胞混合物再生脂肪组织)混合脂肪来源的干细胞与脂肪组织时，再生脂肪的平均重量比单独的脂肪组织重。这清楚地说明了PLA的影响。当切开SCID小鼠进行检查时可以证实再生的作用。正如看到的一样，当施用含脂肪来源干细胞的混合物时，组织明显更大。
只注射脂肪组织时，4周后脂肪组织的重量约减至原来的一半。这可能是因为脂肪组织发生了坏死。施用含脂肪来源干细胞的混合物时组织重量可以维持的原因被认为是脂肪来源的干细胞被诱导分化成脂肪组织，或者脂肪来源的干细胞可以防止组织破坏，或者两者兼而有之。
(实施例9在DMEM中维持和培养的PLA的作用)实施例2中制备的、来源于吸脂所得抽取物的干细胞维持于DMEM培养基(与实施例7中所用培养基相同)中。所得脂肪来源干细胞用于证实类似的效果。具体地说，此制品用于代替实施例2中制备并在实施例7中使用的脂肪来源干细胞或脂肪来源前体细胞(PLA)。
结果是2.50×108个所述脂肪来源干细胞加到900mg脂肪中时，约40～50％的脂肪组织成功地生长。因此发现可以使用收集并维持于生长培养基中的干细胞。
(实施例10在M199中培养的脂肪来源干细胞的作用)用在M199中培养的脂肪来源干细胞代替实施例2中制备并在实施例7中使用的脂肪来源干细胞或脂肪来源前体细胞(PLA)。M199含有以下成分。
M199(用于血管内皮细胞的培养基)的成分(每升)199培养基 9.5gNaHCO32.2gFBS (15％)酸性FGF 2μg肝素5mg抗菌抗霉菌素10ml(注意)下列成分的单位为mg/mlL-丙氨酸50盐酸L-精氨酸70
L-天冬氨酸60L-半胱氨酸0.1L-胱氨酸 20L-谷氨酸 150(H2O)L-谷氨酰胺100甘氨酸50盐酸L-组氨酸一水合物 20羟基-L-脯氨酸 10L-异亮氨酸40L-亮氨酸 120盐酸L-赖氨酸 70L-甲硫氨酸30L-苯丙氨酸50L-脯氨酸 40L-丝氨酸 50L-苏氨酸 60L-色氨酸 20L-酪氨酸 40L-缬氨酸 50谷胱甘肽(还原型) 0.05CaCl2.2H2O 264.9KCl 400MgSO4.7H2O 97.7(无水形式)NaCl 6800NaHCO32200NaH2PO4140(2H2O)Fe(NO3)3.9H2O 0.72
CH3COONa.3H2O 83酚红 15D-生物素 0.01叶酸 0.01烟酰胺 0.025泛酸钙 0.01盐酸吡哆醛 0.025盐酸吡哆醇 0.025核黄素 0.01盐酸硫胺素 0.01腺嘌呤 10(SO4)氯化胆碱 0.5次黄嘌呤 0.3i-肌醇 0.05对氨基苯甲酸 0.05盐酸鸟嘌呤 0.3黄嘌呤 0.3胸腺嘧啶 0.3尿嘧啶 0.3烟酸 0.025维生素A 0.1钙化醇 0.1甲萘醌 0.01α-生育酚0.05抗坏血酸 20吐温80 20胆固醇 0.2
ATP·2Na1腺苷酸 0.2核糖0.5脱氧核糖0.5结果发现在M199培养基中培养的脂肪来源前体细胞加到脂肪中时，脂肪组织可以生长。因此发现可以使用收集后维持在任意培养基中的干细胞。
(实施例11骨细胞应用)接下来用骨细胞进行类似的本发明细胞混合物的植入试验。对于骨细胞来说，用本领域内公知的技术从小鼠收集骨(骨组织)。将骨组织与实施例2中制备的PLA混合，将混合物植入骨中。此时观察到本发明的混合植入物支持骨的再生。
(实施例12血管形成应用)接下来用血管细胞进行类似的本发明细胞混合物的植入试验。对于血管细胞来说，用本领域内公知的技术从小鼠收集血管(血管组织)。将血管组织与实施例1中制备的PLA混合，将混合物植入血管中。此时观察到本发明的混合移植物支持血管的再生。
(实施例13干细胞制备条件的测定)(实施例2从吸脂所得抽取物制备干细胞悬液)(I)制备方法1中用于细胞层的密度梯度离心条件是用Ficoll于400×g离心30分钟。接下来对此密度梯度离心条件进一步作详细的测定。
(1)所用介质的研究用于密度梯度离心的可用介质除了Ficoll外还包括Percoll、Histopaque及Lymphoprep等。用这些介质进行细胞层的密度梯度离心并将其结果与使用Ficoll的结果进行比较。分离的细胞用FACS测定。表现最高纯度的介质是Ficoll。
(2)离心条件的研究实施例2中离心操作于400×g进行30分钟。下面研究了下述离心条件。
以Ficoll为分离干细胞的介质测试了200×g离心60分钟、400×g离心20分钟、400×g离心30分钟、400×g离心40分钟、600×g离心30分钟以及800×g离心20分钟。用FACS分析细胞纯度。400×g离心30分钟时分离干细胞的纯度和收率最高。
(实施例14从吸脂所得材料制备干细胞)下面为了在分离成抽取物和组织(以下也称“脂肪组织+抽取物”)之前检验吸脂所得材料，我们用分离之前的吸脂材料进行类似的分离试验。
此分离方法如下所述1.向含“脂肪组织+抽取物”(脂肪组织位于“抽取物”之上)的带盖容器中加入胶原酶(7.5％胶原酶，Sigma，加入总样本体积的1/100)，以适当的速度振摇。于37℃振摇30分钟后，脂肪细胞间基质的主要组分——胶原被降解，有助于脂肪细胞的分离。此处使用8个500ml的管或4个1000ml的管。
2.所得样品于800×g离心，从而将脂肪组分和细胞分离，脂肪组分的比重小于细胞的比重。离心后，材料分成4层，包括油层、基质层、液体层和细胞层。
3.吸取油层、基质层和液体层，只取细胞层。将细胞层可选地用500μm和250μm的滤器过滤。看起来500μm的滤器不是必须的。
4.加入10ml裂解液(例如，氯化铵和碳酸氢钾水溶液)，搅拌2～5分钟使红细胞裂解。任选地可略去此裂解步骤。
5.向所得沉淀中加入磷酸盐缓冲液。终止裂解缓冲液反应。裂解样品用100μm滤器过滤。用175ml的圆锥形管离心。
6.所得样品进一步于800×g或400×g离心5分钟。沉淀细胞就是感兴趣的细胞。
7.吸去上清以除去不必要的溶液，得到细胞浓缩物。
对收集到的细胞进行类似分析。
(实施例15来自“脂肪组织+抽取物”的干细胞)按实施例4分析实施例14制备的干细胞。
大部分从“脂肪组织+抽取物”收集的干细胞对CD13、CD29、CD34、CD36、CD44、CD49d、CD54、CD58、CD71、CD73、CD90、CD105、CD106、CD151和SH3呈阳性。因此本发明的脂肪来源前体细胞是表达选自下组的至少一种蛋白质的细胞CD13、CD29、CD34、CD36、CD44、CD49d、CD54、CD58、CD71、CD73、CD90、CD105、CD106、CD151和SH3。表达CD106的干细胞是本发明中所用脂肪来源前体细胞的特性之一。干细胞群的一部分对于CD31、CD45、CD117和CD146呈阳性，而另一部分呈阴性。
来自“脂肪组织+抽取物”的干细胞群对于CD3、CD4、CD14、CD15、CD16、CD19、CD33、CD38、CD56、CD61、CD62e、CD62p、CD69、CD104、CD135和CD144呈阴性。因此，本发明的脂肪来源前体细胞是不表达选自CD3、CD4、CD14、CD15、CD16、CD19、CD33、CD38、CD56、CD61、CD62e、CD62p、CD69、CD104、CD135和CD144的至少一种的细胞。
当来自“脂肪组织+抽取物”的干细胞群在分化诱导培养基中培养时，器官特异性如骨特异性、软骨特异性、脂肪特异性等的蛋白表达在2～3周后可以识别。所述干细胞群不表达大部分成纤维细胞表达的CD56，这不同于人真皮来源的培养成纤维细胞。相反，干细胞群中的CD105表达在成纤维细胞中通常观察不到。干细胞群表现的CD49d表达在骨髓来源的间充质干细胞中通常观察不到。
另外，对于CD31、CD34、CD36、CD45、CD106和CD117来说，当培养时间长的时侯，这些CD的表达倾向于消失。因此，如果继续传代培养，所观察到的CD106表达可能就观察不到了。
如上所述，即使使用“脂肪组织+抽取物”作为干细胞的来源也可得到具有良好质量的干细胞。因此说明分开或分离脂肪组织(脂肪)对于从吸脂材料获得干细胞是不必要的。而且可从所述材料中获得大量干细胞。
(实施例16本发明干细胞的生长)接下来按实施例2(制备方法1)处理吸脂抽取物以得到干细胞，只是省略除去红细胞这一步。
将1.8×107个制备的干细胞置60mm培养皿中培养，培养皿中用M199(使用明胶包被的培养皿)和DMEM(使用未包被培养血)作为培养基。从第6天(或第二轮的第3天)开始进行细胞计数，然后隔天计数一次。
结果如下第1轮

第2轮

如上表所示，可以看出去除红细胞不是高效获得干细胞所必须的，因为细胞生长曲线与从吸脂所得抽取物制备的干细胞类似。生长曲线也如图6所示。图7～图10为显示干细胞在DMEM培养基(图7＝第一轮，第6、8、10和第12天；图8＝第二轮，第3、5、7和第9天)和M199培养基(图9＝第一轮，第6、8、10和第12天；图10＝第二轮，第3、5、7和第9天)中生长的照片，所述干细胞由吸脂所得材料不经除去红细胞而制备。
(实施例17亚汇合条件生长的测定)此实施例证明在亚汇合条件下进行培养导致诱导分化成各种分化细胞。
所用方案如下所述1)分化成骨收集的细胞置60mm培养皿上培养，细胞浓度为1.8×107细胞/皿，培养基为DMEM。培养十天后细胞达到亚汇合，此时现用培养基用分化诱导培养基(组成示例性骨发生培养基可以是DMEM，再添加10％FBS和5％马血清，还含有1μM地塞米松、50μM抗坏血酸-2-磷酸、10mM的β-甘油磷酸和1％ABAM)替换，继续培养22天。通过冯科萨染色观察细胞。
冯科萨染色弃去培养基，取感兴趣的样品用磷酸缓冲盐水(PBS)洗涤。洗涤后的样品用4％多聚甲醛固定10分钟。之后用milliQ水洗涤样品。然后在暗处将样品与2.5％硝酸银接触20分钟。之后用milliQ水洗涤样品。然后将样品置荧光灯下15分钟。将样品与0.5％的氢醌孵育2分钟，随后与5％的硫代硫酸钠孵育2分钟。之后用milliQ水洗涤样品。然后将样品与核坚牢红染色2分钟。之后用milliQ水洗涤样品。然后用MountQuick(Daido Sangyo，日本)对样品计数，并在显微镜下观察。
2)分化为软骨细胞收集的细胞置60mm培养皿上培养，细胞浓度为1.8×107细胞/皿，培养基为DMEM。培养十天后细胞达到亚汇合，此时现用培养基用分化诱导培养基(组成示范性软骨发生培养基可以是补充有1％FBS的DMEM，其中还含有6.25μg/ml胰岛素、6.25μg/ml转铁蛋白、10ng/ml的TGFβ1、50nM抗坏血酸-2-磷酸和1％ABAM)替换，继续培养22天。通过阿辛蓝染色观察细胞。
阿辛蓝染色将培养基从感兴趣样本中弃去。样品用4％多聚甲醛固定10分钟。之后用milliQ水洗涤样品。然后用3％醋酸洗涤样品3分钟。将样品浸入阿辛蓝染色液(组成示范性脂肪发生培养基可以是补充有10％FBS的DMEM，其中含有0.5mM的IBMX、1μM地塞米松、10μM胰岛素、200μM吲哚美辛和1％AMAM)中30分钟。然后用3％醋酸洗涤样品3分钟。之后用milliQ水洗涤样品。然后将样品用核坚牢红染色2分钟。之后用milliQ水洗涤样品。然后用MountQuick(Daido Sangyo，日本)对样品计数，并在显微镜下观察。
3)分化为脂肪收集的细胞置60mm培养皿上培养，细胞浓度为1.8×107细胞/皿，培养基为DMEM。培养十天后细胞达到亚汇合，此时现有培养基用分化诱导培养基(组成示范性脂肪发生培养基可以是补充有10％FBS的DMEM，其中还含有0.5mM的IBMX、1μM地塞米松、10μM胰岛素、200μM吲哚美辛和1％AMAM)替换，继续培养22天。通过油红O染色观察细胞。
油红O染色弃去培养基，取感兴趣的样品用磷酸缓冲盐水(PBS)洗涤。洗涤后的样品用4％多聚甲醛(PFA)固定10分钟。之后用milliQ水洗涤样品。将样品浸入60％异丙醇中1分钟。之后用milliQ水洗涤样品。然后将样品浸入苏木精中10分钟。之后用milliQ水洗涤样品。然后将样品浸入碳酸锂中数秒，之后用milliQ水洗涤样品。然后用MountQuick(Daido Sangyo，日本)对样品计数，并在显微镜下观察。
1)油红O染色液如下制备将0.3g油红O溶于100ml的99％异丙醇中。使用时，将此溶液和MilliQ水以6∶4的比例混合，振摇后放置30分钟。混合溶液在使用前加以过滤。
2)碳酸锂溶液将3ml碳酸锂饱和溶液(1.54g碳酸锂每100ml)加到100ml的milliQ水中。
结果见图11～图20。从图中可见按实施例3或实施例15制备的干细胞具有良好的多潜能性质。
(实施例18亚汇合条件下生长的测定-无红细胞除去步骤)此实施例证明在亚汇合条件下进行培养导致诱导分化成各种分化细胞，即使是制备的原材料不经红细胞去除步骤也是如此。
所用分化步骤同实施例17。
结果与实施例17类似。结果是不经红细胞去除步骤而制备的干细胞具有良好的多潜能性质。
(实施例19用分化培养基进行分化)此实施例证明用分化培养基进行培养导致诱导分化成各种分化细胞。
所用方案如下所述1)分化为骨收集的细胞种植于60mm培养皿上，细胞浓度为1.8×107细胞/皿，培养基为分化诱导培养基(组成示范性骨发生培养基可以是补充有10％FBS和5％马血清的DMEM，其中还含有1μM地塞米松、50μM抗坏血酸-2-磷酸、10mM的β-甘油磷酸和1％ABAM)。样品培养22天后用冯科萨染色进行评估。冯科萨染色如上述实施例17所述进行。
2)分化为脂肪收集的细胞种植于60mm培养皿上，细胞浓度为1.8×107细胞/皿，培养基为分化诱导培养基(组成示范性脂肪发生培养基可以是补充有10％FBS的DMEM，其中还含有0.5mM的IBMX、1μM地塞米松、10μM胰岛素、200μM吲哚美辛和1％AMAM)。样品培养25天后用油红O染色进行评估。油红O染色如上述实施例17所述进行。
结果见图21-图26。从图中可见按实施例3或实施例15制备的干细胞不经过培养成亚汇合状态即应用分化诱导培养基时具有良好的多潜能性质。
(实施例20分化诱导培养基生长的测定-无红细胞除去步骤)此实施例证明用分化培养基进行培养导致诱导分化成各种分化细胞，即使是制备的原材料不经红细胞去除步骤也是如此。
所用分化步骤同实施例19。
结果与实施例19类似。结果是不经红细胞去除步骤而制备的干细胞具有良好的多潜能性质。
(实施例21定量)本实施例展示了可从吸脂所得材料获得的干细胞数。简单地对每特定体积的细胞样品进行细胞计数来进行定量。
结果见下表。下表包括刚制备后及培养7天后的细胞数。通过培养干细胞样品将血细胞除去，发现干细胞的浓度升高了。

如上所示，吸脂所得抽取物(LFA)含有与单独固体脂肪组织相当量的干细胞。因此，这有利于使用吸脂所得抽取物和/或含有此吸脂所得抽取物和脂肪组织的材料作为制备干细胞的来源。
尽管本文描述了一些优选实施方案，这并不意味着这些实施方案对本发明的范围构成限制，本发明的范围只受所提出的权利要求书限制。本文所引用的所有专利、已公开专利申请及出版物均引入本文作为参考，就像其全文在本说明书中列出一样。
对于本领域的技术人员来说，不脱离本发明范围及实质，各种其它变化是显而易见的，也是容易实施的。因此并不意味着所附权利要求书的范围仅限于本文所提出的说明，而是对所述权利要求书的广义解释。
工业实用性本发明证实了来源于吸脂所得抽取物、可以简单方式获得的干细胞可以应用于再生药物。因此，本领域的技术人员将容易地发现本发明在药物产业等的工业实用性。
权利要求
1.一种制备干细胞的方法，包括A)获得吸脂所得抽取物；B)将吸脂所得抽取物离心以获得细胞级分；C)将细胞级分进行比重离心；以及D)收集比重小于红细胞的细胞层。
2.根据权利要求1的方法，其中所述吸脂所得抽取物用盐水或林格氏溶液制备。
3.根据权利要求1的方法，其中所述离心以等于或小于800×g的速度进行。
4.根据权利要求1的方法，其中所述离心以等于或小于400×g的速度进行。
5.根据权利要求1的方法，其中所述比重离心以370×g-1,100×g的速度进行。
6.根据权利要求1的方法，其中所述比重离心在20摄氏度下使用比重为1.076～1.078g/ml的介质进行。
7.根据权利要求1的方法，其中所述比重离心的所述介质选自Ficoll、Percoll和蔗糖。
8.根据权利要求7的方法，其中所述比重离心介质为Ficoll。
9.根据权利要求1的方法，其中所收集细胞层的比重在1.050～1.075之间。
10.根据权利要求1的方法，其中所述细胞层的收集用移液器进行。
11.根据权利要求1的方法，还包括将所述细胞层在培养基中培养的步骤，该培养基含有选自DMEM、M199、MEM、HBSS、Ham’s F12、BME、RPMl1640、MCDB104、MCDB153(KGM)及其混合物的组分。
12.根据权利要求1的方法，其中所述比重离心包括密度梯度离心。
13.根据权利要求1的方法，还包括除去血细胞的步骤。
14.一种制备干细胞的方法，包括A)获得吸脂所得材料；和B)将吸脂所得材料离心以获得细胞级分，而不分离脂肪组织。
15.根据权利要求14的方法，还包括将所述材料置于至少一部分细胞脱离所述材料的条件下。
16.根据权利要求15的方法，其中所述条件用于细胞外基质的降解。
17.根据权利要求15的方法，所述细胞外基质降解通过胶原酶实现。
18.根据权利要求14的方法，还包括除去步骤B)中上清液的步骤。
19.根据权利要求14的方法，还包括过滤步骤B)所得材料的步骤。
20.根据权利要求14的方法，还包括除去血细胞的步骤。
21.根据权利要求14的方法，其中除去血细胞的步骤包括加入降解血细胞的组分。
22.一种制备干细胞的方法，包括i)获得吸脂所得材料；ii)将所述材料置于至少一部分细胞脱离所述材料的条件下，而不分离脂肪组织；iii)将所述材料进行离心；iv)向所述材料加入降解血细胞的组分并搅拌所述材料；v)将所述材料进行离心以获得沉淀；以及vi)从所述沉淀抽取材料的上清液。
23.根据权利要求22的方法，其中将材料置于所述条件的步骤包括维持吸脂所得抽取物。
24.根据权利要求22的方法，其中所述吸脂所得材料包含吸脂所得抽取物和脂肪。
25.根据权利要求22的方法，其中所述步骤ii)中所述条件包括加入胶原酶。
26.根据权利要求22的方法，其中所述步骤iii)的离心以400～1200×g进行。
27.根据权利要求22的方法，其中所述降解血细胞的组分包含氯化铵和碳酸氢钾。
28.根据权利要求27的方法，其中所述氯化铵在组分中的含量为155mM。
29.根据权利要求27的方法，其中所述碳酸氢钾在组分中的含量为10mM。
30.根据权利要求22的方法，其中所述步骤v)的所述离心以400～1200×g进行。
31.根据权利要求22的方法，其中所述沉淀含有干细胞。
32.根据权利要求1～31中任一项所述方法制备的干细胞。
33.根据权利要求32的干细胞，其表达选自CD13、CD29、CD34、CD36、CD44、CD49d、CD54、CD58、CD71、CD73、CD90、CD105、CD106、CD151和SH3的至少一种蛋白质。
34.根据权利要求33的干细胞，其表达CD13、CD29、CD34、CD36、CD44、CD49d、CD54、CD58、CD71、CD73、CD90、CD105、CD106、CD151和SH3。
35.根据权利要求33的干细胞，还表达选自CD31、CD45、CD117和CD146的至少一种蛋白质。
36.根据权利要求32的干细胞，不表达CD56。
37.根据权利要求32的干细胞，不表达选自CD3、CD4、CD14、CD15、CD16、CD19、CD33、CD38、CD56、CD61、CD62e、CD62p、CD69、CD104、CD135和CD144的至少一种蛋白质。
38.根据权利要求37的干细胞，不表达CD3、CD4、CD14、CD15、CD16、CD19、CD33、CD38、CD56、CD61、CD62e、CD62p、CD69、CD104、CD135和CD144。
39.根据权利要求32的干细胞，表达CD49d，而不表达CD56。
40.一种制备干细胞的系统，包含A)获得吸脂所得抽取物的装置；B)将吸脂所得抽取物进行离心以获得细胞级分的装置；以及C)将所述细胞级分进行比重离心的装置。
41.根据权利要求40的系统，其中该系统还包含D)收集比重小于红细胞的细胞层的装置。
42.一种制备干细胞的系统，包含A)获得吸脂所得材料的装置；以及B)将所述吸脂所得材料进行离心以获得细胞级分而不分离脂肪组织的装置。
43.一种制备干细胞的系统，包含i)获得吸脂所得材料的装置；ii)将所述材料置于不分离脂肪组织而使至少一部分细胞脱离所述材料的条件下的装置；iii)将所述材料进行离心的装置；iv)向所述材料加入降解血细胞的组分并搅拌所述材料；v)将所述材料进行离心以获得沉淀的装置；以及vi)从所述沉淀抽取材料上清液的装置。
44.一种获取外植体的方法，包括A)获得吸脂所得抽取物；B)将所述吸脂所得抽取物进行离心以获得细胞级分；C)将所述细胞级分进行比重离心；D)收集比重小于红细胞的细胞层；E)培养所收集的细胞层以获得外植体。
45.一种制备组织移植物的方法，包括A)获得吸脂所得抽取物；B)将所述吸脂所得抽取物进行离心以获得细胞级分；以及C)培养所收集的细胞层以获得组织移植物。
46.一种制备组织移植物的方法，包括A)获得吸脂所得抽取物；B)将所述吸脂所得抽取物进行离心以获得细胞级分；C)将所述细胞级分进行比重离心；D)收集比重小于红细胞的细胞层；E)培养所收集的细胞层以获得组织移植物。
47.一种移植组织移植物的方法，包括A)获得吸脂所得抽取物；B)将所述吸脂所得抽取物进行离心以获得细胞级分；C)将所述细胞级分进行比重离心；D)收集比重小于红细胞的细胞层；E)培养所收集的细胞层以获得组织移植物；以及F)移植所述组织移植物。
48.吸脂所得抽取物在制备干细胞中的用途。
49.一种制备细胞的方法，所述细胞选自血管内皮前体细胞、脂肪细胞、软骨细胞、骨细胞和肌细胞，该方法包括培养根据权利要求1～31中任一项所述方法所得干细胞的步骤。
50.一种制备分化细胞的方法，包括A)将下列a)和b)混合得到混合物a)根据权利要求1～31中任一项所得的干细胞，b)对应于期望部位的分化细胞；以及B)将所述混合物在使得脂肪组织来源的前体细胞分化的充分条件下培养。
51.根据权利要求50的方法，其中所述分化细胞为间充质细胞。
52.根据权利要求50的方法，其中所述分化细胞选自脂肪细胞、骨髓细胞、成骨细胞、软骨细胞、成纤维细胞、成肌纤维细胞、神经细胞、骨骼肌细胞、心肌细胞、血管内皮细胞、血管平滑肌细胞、肝细胞、肾细胞和胰细胞。
53.根据权利要求50的方法，还包括向所述分化细胞提供促进分化的因子的步骤。
54.根据权利要求50的方法，其中所述混合物在培养基中培养，所述培养基含有选自下列的至少一种成分肾上腺皮质类固醇、胰岛素、葡萄糖、吲哚美辛、异丁基-甲基黄嘌呤(IBMX)、抗坏血酸及其衍生物、甘油磷酸、雌激素及其衍生物、孕酮及其衍生物、雄激素及其衍生物、生长因子、垂体腺提取物、松果体提取物、视黄酸、维生素D、甲状腺激素、胎牛血清、马血清、人血清、肝素、碳酸氢钠、HEPES、白蛋白、转铁蛋白、硒酸盐、亚油酸、3-异丁基-1-甲基黄嘌呤、去甲基试剂、组蛋白去乙酰基试剂、活化素、细胞因子、六亚甲基双乙酰胺(HMBA)、二甲基乙酰胺(DMA)、二丁基cAMP(dbcAMP)、二甲基亚砜(DMSO)、碘脱氧尿苷(IdU)、羟基脲(HU)、阿糖胞苷(AraC)、丝裂霉素C(MMC)、丁酸钠(NaBu)、凝聚胺及硒。
55.一种细胞混合物，包括根据权利要求1～31中任一项所得的干细胞和对应于期望部位的分化细胞。
56.根据权利要求55的细胞混合物，其中所述细胞混合物置于足以诱导所述干细胞分化的条件下。
57.一种用于细胞移植的组合物，包含a)根据权利要求1～31中任一项所得的干细胞；和b)对应于期望部位的分化细胞。
58.根据权利要求57的组合物，其中所述移植在期望部位进行。
59.根据权利要求57的组合物，其中所述干细胞和所述分化细胞的比例为约1∶10～约10∶1。
60.根据权利要求57的组合物，其中所述干细胞和所述分化细胞的比例为约1∶2～约2∶1。
61.根据权利要求57的组合物，其中所述干细胞和所述分化细胞的比例基本相同。
62.根据权利要求57的组合物，其中所述分化细胞包括间充质细胞。
63.根据权利要求57的组合物，其中所述分化细胞选自脂肪细胞、骨髓细胞、成骨细胞、软骨细胞、成纤维细胞、成肌纤维细胞、神经细胞、骨骼肌细胞、心肌细胞、血管内皮细胞、血管平滑肌细胞、肝细胞、肾细胞和胰细胞。
64.根据权利要求57的组合物，还包含选自下列成分的至少一种成分肾上腺皮质类固醇、胰岛素、葡萄糖、吲哚美辛、异丁基-甲基黄嘌呤(IBMX)、抗坏血酸及其衍生物、甘油磷酸、雌激素及其衍生物、孕酮及其衍生物、雄激素及其衍生物、生长因子、垂体腺提取物、松果体提取物、视黄酸、维生素D、甲状腺激素、胎牛血清、马血清、人血清、肝素、碳酸氢钠、HEPES、白蛋白、转铁蛋白、硒酸盐、亚油酸、3-异丁基-1-甲基黄嘌呤、去甲基试剂、组蛋白去乙酰基试剂、活化素、细胞因子、六亚甲基双乙酰胺(HMBA)、二甲基乙酰胺(DMA)、二丁基cAMP(dbcAMP)、二甲基亚砜(DMSO)、碘脱氧尿苷(IdU)、羟基脲(HU)、阿糖胞苷(AraC)、丝裂霉素C(MMC)、丁酸钠(NaBu)、凝聚胺及硒。
65.根据权利要求57的组合物，其中所述干细胞和分化细胞是同种异体的。
66.根据权利要求57的组合物，其中所述干细胞和分化细胞是同基因的。
67.一种治疗或预防与分化细胞衰竭相关的疾病、障碍或异常状况的方法，包括A)提供一种组合物，其包含a)根据权利要求1～31中任一项所得的干细胞；和b)对应于期望部位的分化细胞；以及B)将该组合物施用于受试者。
68.一种治疗或预防因分化细胞缺陷所致疾病、障碍或异常状况的药物，其包含a)根据权利要求1～31中任一项所得的干细胞；b)对应于期望部位的分化细胞；和c)药学上可接受的载体。
69.由a)根据权利要求1～31中任一项所得的干细胞和b)对应于期望部位的分化细胞所组成的混合物用于制备药物的用途，所述药物用于治疗或预防因分化细胞缺陷所致的疾病、障碍或异常状况。
70.一种治疗或改善美容状况的方法，包括下列步骤A)提供一种组合物，其包含a)根据权利要求1～26中任一项所得的干细胞；和b)对应于期望部位的分化细胞；以及B)将该组合物施用于受试者。
71.一种治疗或改善美容状况的药物，其包含a)根据权利要求1～31中任一项所得的干细胞；b)对应于期望部位的分化细胞；和c)药学上可接受的载体。
72.由a)根据权利要求1～31中任一项所得的干细胞和b)对应于期望部位的分化细胞所组成的混合物用于制备药物的用途，所述药物用于治疗或改善美容状况。
全文摘要
本发明提供了以简单而高效的方式从人(特别是受试者本身)大量制备同种干细胞和/或前体细胞的方法。本发明还提供了使用本发明干细胞和/或前体细胞大量制备组织植入物或移植物的方法。本发明人意外地发现吸脂所得抽取物中含有大量干细胞，并且建立了从此类吸脂所得抽取物制备干细胞的方法，从而实现了上述目的。
文档编号C12N5/07GK1871343SQ20048003150
公开日2006年11月29日 申请日期2004年11月4日 优先权日2003年11月4日
发明者吉村浩太郎, 松本大辅 申请人:株式会社宝玛斯特