专利名称：表达MEGSIN/RAGE/iNOS的疾病模型动物及借助于该动物评估化合物的方法
技术领域：
本发明涉及疾病模型动物，特别是，用于高血糖症的伴肾机能障碍(例如糖尿病性肾病)的模型动物，以及肾小球障碍症的伴肾机能障碍的模型动物。本发明也涉及利用该疾病模型动物评估化合物对肾机能障碍疗效的方法。
背景技术：
最近几年中，由于生活方式和饮食逐渐西化，糖尿病患者数量稳步增加。糖尿病是一种疾病，其中持续性高血糖症引起遍及全身的各种组织病症(称为并发症)。除所谓的诸如冠状动脉硬化症和脑血管障碍的大血管并发症外，糖尿病特有的病理症状出现视网膜病变、神经病和肾病，统称为“三种主要并发症”。特别是，在发达国家肾病是糖尿病患者的一种致命并发症，而且还是终末期肾病(ESRD)的主要起因(非专利文献1)。
因为大约30％的胰岛素依赖性糖尿病(IDDM)患者发展为糖尿病性肾病，且需要透析或肾移植等，最终其生活质量(QOL)严重受损(非专利文献1和2)。此外，与普通人群相比，男女糖尿病患者的平均预期寿命缩短了10或更多年。持续性蛋白尿、肾机能渐进性病损以及组织病理学的肾小球系膜细胞增生是糖尿病性肾病的特有症状。
因此，糖尿病并发症发病和进展的分子机制的阐明以及预防和治疗方法的发现被认为是医学和社会的重要目标。
阐明糖尿病性肾病发病机制和开发治疗和预防方法需要模型动物。许多研究正旨在创建这样的模型动物。但是，除仅有的一些模型，例如糖尿病动物模型，一种发展为限制性障碍(如轻度肾小球系膜细胞硬化症)的自发性非肥胖糖尿病(NOD)小鼠(非专利文献4)，以及用化学方法诱导糖尿病的啮齿模型动物(非专利文献5)之外，没有已知的动物模型能显示出如在人类糖尿病性肾病中观察到的那些改变(非专利文献3)。此外，就其再现性和病理检查结果，这些已知的动物模型都不能满足需要。具体地说，肾小球系膜基质轻度增生以及所产生的肾小球肥大是一些在常规糖尿病性肾病模型也可见的病理检查结果。但是，没有已知的动物模型具有所有类似于人类糖尿病性肾病那些的表型(生化和病理检查结果)。此外。没有显示出在晚期病理症状中所观察到的结节性肾小球硬化的模型。因此，糖尿病性肾病的研究变得困难。在上述情况下，重要的是要创建具有类似于人类糖尿病性肾病那些表型的动物模型，以便了解糖尿病性肾病的病理生理学。
如上所述，糖尿病性肾病是一种糖尿病并发症，并且认为下列体内反应与其发病机制有关。
当蛋白质暴露于还原糖(如葡萄糖)时，诱导了非酶糖基化反应，并产生诸如可逆的希夫碱(Schiff base)及阿马多尔(Amadori)重排化合物的糖基化产物(非专利文献6)。该过程称为“早期反应”。然后，通过诸如缩合、裂解以及交联的复杂分子内重排反应产生了不可逆的晚期糖基化终产物(AGE)(非专利文献6)。这一系列反应称为“糖基化”。AGE是通过上述方法所产生的这样结构的类名。在糖尿病中，长期持续的高血糖状态加速了该反应，并且在循环血和各种组织中沉积了AGE(非专利文献6)。AGE的产生被认为是引起糖尿病并发症的原因之一。
同时，利用细胞应答的机制吸引了人们的注意力，该应答是通过识别AGE作为特异性配体的细胞表面受体(晚期糖基化终产物受体RAGE；以下简称为“RAGE”)所诱导的。
RAGE是一种具有约35kDa分子量的膜蛋白质，属于1992年自牛肺中分离并鉴定的免疫球蛋白总类。RAGE是一种识别AGE的细胞表面受体(非专利文献7和8)。近来，发现全长的糖基化的人类RAGE分子量为55kDa(非专利文献9)。RAGE是一种具有三个免疫球蛋白样胞外结构域的单次跨膜受体(single-transmembrane receptor)，还具有一个预计对于信号转导不可缺少的短胞内结构域。已发现RAGE的AGE配体结合结构域位于上述三个免疫球蛋白样结构域的大多数N-末端中。另外，已发现RAGE在许多类型细胞中表达，包括巨噬细胞和构成血管的细胞，例如血管内皮细胞、平滑肌细胞、周细胞(pericyte)和肾小球系膜细胞(非专利文献7和8)。也已揭示了在上列细胞之一的内皮细胞中，AGE配体自身在转录水平上诱导了RAGE基因的表达(非专利文献10)。
为研究AGE-RAGE系统对糖尿病血管并发症的体内影响，特别是对肾病和视网膜病变的影响，本发明人事先创建并分析了其血管细胞过表达RAGE的转基因小鼠(RAGE-Tg)(非专利文献11)。具体地说，使用转基因来创建RAGE-Tg，其中人类RAGE基因业已连接到血管内皮细胞特异性小鼠flk-1启动子的下游。然后，为诱导糖尿病，将该小鼠与不同品系转基因(Tg)小鼠(非专利文献12)杂交，其中诱导型一氧化氮合酶(iNOS；以下简称“iNOS”)以一种胰β细胞特异性方式过表达，创建了在出生后初期发展为胰岛素依赖性糖尿病的双Tg(RAGE/iNOS-Tg)小鼠。
该RAGE/iNOS-Tg发展为类似于人类糖尿病性肾病中所发现的肾衰竭和进行性肾小球硬化症。具体地说，当肾病进展程度在患有糖尿病的RAGE-Tg同窝出生仔和患有糖尿病的非Tg雄性小鼠(对照)之间进行比较时，在RAGE/iNOS-Tg中肾障碍已明显加剧了，尽管就诸如血糖水平、HbAic水平和血AGE水平的指标而言在这两组之间没有明显差异。也就是说，尿白蛋白和肌酸酐之比(蛋白尿的一个指示物)在RAGE/iNOS-Tg中提高了；血清肌酸酐水平和肾/身体的重量比也提高了；并在组织学上观察到明显的肾小球肥大和肾小球硬化。
因此，首次证实了RAGE过表达在个体水平上能增强糖尿病性肾病的发病和进展。RAGE被确定为一种肾病易感基因，并已确认RAGE/iNOS-Tg能作为用于了解致糖尿病肾病理的ESRD-介导过程的首选动物模型。因此，对于糖尿病并发症预防和治疗方法而言，AGE-RAGE系统可能是一种有前途的靶。
因此，RAGE/iNOS-Tg是一种用于糖尿病并发症的极好动物模型。但是，如果能获得发展为更明显的肾机能障碍且发病需时较短的动物模型，该模型应当更有助于了解如糖尿病性肾病的糖尿病并发症的病理生理学，且对于开发用于糖尿病并发症的治疗药等非常有用。
同时，本发明人分离了megsin，一种在肾小球系膜细胞中特异表达的基因(专利文献1)，并创建了导入megsin的转基因小鼠(megsin-Tg)。在约35-40周龄的megsin-Tg的肾小球组织中，观察到明显的细胞增生(主要为膜细胞增生，增加的膜基质，和由补体和免疫球蛋白组成的免疫复合物沉积)，和肾小球系膜增生(如节段性硬化)的病理检测结果(非专利文献13)。基于上述发现，可以证明megsin-Tg可用作一种系膜增生性肾小球肾炎动物模型。但是，megsin-Tg的肾机能是正常的，且未检测到尿蛋白或类似指标。此外，其在出生后35-40周之久才发展为系膜增生性肾小球肾炎。因此，megsin-Tg无法满足上述糖尿病并发症动物模型的需要。
专利文献1国际公布号WO 99/15652非专利文献1Bojestig，M.，等，N.Engl.J.Med.，33015-18(1994)非专利文献2Krolewski，M.，等，Kidney Int.，502041-2046(1996)非专利文献3Velasquez，M.T.，等，FASEB J.，42850-2859(1990)非专利文献4Doi，T.，等，Lab.Invest.，63204-212(1990)非专利文献5Williamson，J.R.，等，Diabetes.，36813-821(1987)非专利文献6Brownlee，M.，等，N.Engl.J.Med.，3181315-1321(1988)非专利文献7Schmidt，A.M.，等，J.Biol.Chem.，26714987-14997(1992)非专利文献8Neeper，M.，等，J.Biol.Chem.，26714998-15004(1992)非专利文献9Yonekura，H.，等，Biochem.J.，3701097-1109(2003)非专利文献10Tanaka，N.，等，J.Biol.Chem.，27525781-25790(2000)非专利文献11Yamamoto，Y.，等，J.Clin.Invest.，108261-268(2001)非专利文献12Takamura，T.，等，J.Biol.Chem.，2732493-2496(1998)非专利文献13Miyata，T.，等，J.Clin.Invest.，109585-593(2002)发明内容本发明的一个目的是提供较常规糖尿病性肾病动物模型更有效的疾病动物模型。本发明的另一个目的是提供用于评估具有治疗糖尿病性肾病用途化合物的方法。
本发明人从其研究中发现系膜增生性肾小球肾炎可通过在肾小球中强迫表达megsin而诱导，且RAGE/iNOS-Tg可作为一种极好的糖尿病并发症的动物模型。基于这些发现，本发明人进一步对肾机能障碍发病机制进行了专门研究，特别是对糖尿病性肾病机制。从该研究中，获得了产生本发明的发现。
首先，通过将megsin-Tg和RAGE/iNOS-Tg杂交创建了三Tg(megsin/RAGE/iNOS-Tg)。发现该megsin/RAGE/iNOS-Tg产生了糖尿病肾病理(结节性肾小球硬化)，其并不见于常规模型中，且在早期发病，并同样地观察到诸如肾小球肥大的肾病理。
更具体地说，在所创建的三Tg小鼠中，肾小球肥大和肾小球细胞增生在早期被检测到(例如，在8周或16周的小鼠中)，并加速了相关的肾小球系膜基质扩张。该早期形态学上肾小球异常引起了肾小球障碍(肾小球系膜细胞活化)、重度肾小管间质性障碍(纤维变性)、巨噬细胞间质性浸润、增强的氧化应激等。该三Tg小鼠在16周的极早期就显示出晚期糖尿病性肾病的病理症状(结节性损伤，以及肾小球簇与肾小囊的黏附)。
因此，三Tg的所有表型(生化和病理检测结果)都类似于在人类糖尿病性肾病中所见的那些。特别是，迄今还没有任何模型在早期能有效显示出在更晚期的病理学图像中所观察到的结节性肾小球硬化。因此，本发明的动物模型作为糖尿病性肾病动物模型是有用的。
此外，因为本发明的模型通过肾小球系膜细胞障碍(megsin过表达)可加速形成，所以该模型具有能在病理进行阶段这一很宽范围内更详细地比较和分析糖尿病性肾病中megsin病理生理学和肾小球系膜细胞病理生理学差异的特点。因此，本发明的模型动物可用作评估开发在晚期病理出现前抑制肾障碍进展的新型诊断方法和药物的模型。
本发明是基于上述发现完成的，具体描述如下。
一种疾病模型动物，其表达megsin基因、编码晚期糖基化终产物受体的基因以及诱导型一氧化氮合酶基因，其中该模型动物包括非人类哺乳动物。
[1]的疾病模型动物，其导入有megsin基因、编码晚期糖基化终产物受体的基因以及诱导型一氧化氮合酶基因。
[1]或[2]的疾病模型动物，表现出至少一种选自下列表型(a)-(f)的表型(a)肾/身体重量比增加；(b)尿白蛋白水平增加；(c)血甘油三酯水平增加；(d)体重过轻(发育不全)；(e)高血糖症；和(f)低胰岛素血症。
[1]-[3]中任一个的疾病模型动物，其在肾小球系膜基质中表现出至少一种下列表型(a)肾小球系膜基质扩张；(b)免疫球蛋白和/或补体沉积的增强；和(c)胶原蛋白、层粘连蛋白和/或纤连蛋白的增加。
[1]或[2]的疾病模型动物，其在肾小管间质组织中表现出表型(a)纤维变性；和/或(b)炎性细胞浸润。
[1]-[5]中任一个的疾病模型动物，其中megsin基因、编码晚期糖基化终产物受体的基因以及诱导型一氧化氮合酶基因来自人类。
[1]-[6]中任一个的疾病模型动物，其中疾病是糖尿病性肾病。
一种创建疾病模型动物的方法，包括将megsin基因、编码晚期糖基化终产物受体的基因以及诱导型一氧化氮合酶基因导入非人类哺乳动物受精卵的步骤，其中所述疾病模型动物包括非人类哺乳动物，在该非人类哺乳动物中所述megsin基因、编码晚期糖基化终产物受体的基因以及诱导型一氧化氮合酶基因的表达业已进行。
一种评估测试化合物对肾机能障碍疗效的方法，包括步骤(1)对[1]-[7]中任一个的疾病模型动物给服测试化合物；和(2)检测被给服测试化合物的该疾病模型动物肾机能障碍的缓解效果。
一种评估测试化合物对肾机能障碍疗效的方法，包括步骤(1)对[1]-[7]中任一个的疾病模型动物给服测试化合物；和(2)在给服所述测试化合物后，测定该疾病模型动物中肾/身体重量比、尿白蛋白水平、血甘油三酯水平和尿8-OHdG水平中的至少任一个。
一种评估测试化合物对肾机能障碍疗效的方法，包括步骤(1)对[1]-[7]中任一个的疾病模型动物给服测试化合物；和(2)在给服所述测试化合物后测定该疾病模型动物的肾小球系膜基质是否改变或该改变是否减小。
[11]的方法，其中肾小球系膜基质的改变至少是以下之一(a)肾小球系膜基质扩张；(b)免疫球蛋白和/或补体沉积的增强；和(c)胶原蛋白、层粘连蛋白和/或纤连蛋白的增加。
一种评估测试化合物对肾机能障碍疗效的方法，包括步骤(1)对[1]-[7]中任一个的疾病模型动物给服测试化合物；和(2)在给服测试化合物后测定该疾病模型动物的肾小管间质组织是否改变或该改变是否减小。
[13]的方法，其中肾小管间质组织的改变是(a)纤维变性；和/或(b)炎性细胞浸润。
[9]-[14]中任一个的方法，其中肾机能障碍是伴发高血糖症的肾机能障碍。
一种评估测试化合物对高血糖症疗效的方法，包括步骤(1)对[1]-[7]中任一个的疾病模型动物给服测试化合物；和(2)在给服测试化合物后测定该疾病模型动物中葡萄糖或/胰岛素水平。
本发明提供了导入了megsin、RAGE和iNOS基因的疾病模型动物。在本发明的模型动物中观察到明显的肾小球病(结节性硬化损伤)。该发现支持了本发明的疾病模型动物的病理学状态更接近类似于人类糖尿病性肾病。此外，与常规模型小鼠(40周龄)相比，本发明模型动物在早期(16周龄)就产生了疾病，并且所观察到包括肾小球肥大的多种病理症状是相同的。因此，预计本发明的模型动物对于糖尿病性肾病病因的阐明特别有用。本发明的模型动物不仅可用于分析糖尿病性肾病的发病机制和病理状态，还可用于开发和筛选糖尿病性肾病治疗药、药剂及其他目的。
本发明也提供了具有高血糖症症状的疾病模型动物。尽管具有高血糖症的模型动物是已知的，但在短时间内就确定无疑地发展为高血糖症的动物是未知的，例如上述本发明的megsin/RAGE/iNOS表达的疾病模型动物。本发明的疾病模型动物用于分析和探究高血糖症所引起的各种病变的治疗方法，以及发现高血糖症的治疗方法。已揭示了高血糖症所引起的各种病症。因此，其中由高血糖症所引起的各种病变可被观察到的模型被用于分析上述病理状态。
可使用转基因动物创建本发明表达megsin/RAGE/iNOS的疾病模型动物。可大规模提供高度一致的模型动物的转基因动物使得实验能高度精确地进行。此外，在本发明的疾病模型动物中，观察到接近类似于人类病理状态的结节性硬化损伤和糖尿病性肾病。如上所述，其重要意义在于提供了真实模拟实际病变的模型动物。
图1显示了通过PCR证实三Tg小鼠中三种导入基因(RAGE、megsin和iNOS基因)存在的结果。
图2是一组显示实施例2中所述的megsin/RAGE/iNOS-Tg小鼠和对照小鼠肾小球组织PAS或PAM染色结果的显微照片。上megsin/RAGE/iNOS-Tg小鼠；中RAGE/iNOS-Tg小鼠；下megsin-Tg小鼠。肾组织收集自均为16周龄的小鼠。
图3是一组显示使用荧光抗体法检测肾小球系膜基质中免疫球蛋白沉积结果的荧光显微照片。左来自对照RAGE/iNOS-Tg小鼠；右来自实施例megsin/RAGE/iNOS-Tg小鼠。
图4是一组显示使用荧光抗体法检测肾小球系膜基质中补体沉积结果的荧光显微照片。左来自对照RAGE/iNOS-Tg小鼠；右来自实施例的megsin/RAGE/iNOS-Tg小鼠。
图5是一组显示通过使用抗IV型胶原蛋白抗体进行免疫组织学染色，存在于肾小球系膜基质中的IV型胶原蛋白染色结果的显微照片。左来自实施例的megsin/RAGE/iNOS-Tg小鼠；右来自对照megsin-Tg小鼠。
图6是一组显示通过使用抗-纤连蛋白抗体进行免疫组织学染色，存在于肾小球系膜基质中的纤连蛋白染色结果的显微照片。左来自实施例的megsin/RAGE/iNOS-Tg小鼠；右来自对照megsin-Tg小鼠。
图7是一组显示通过使用抗-层粘连蛋白抗体进行免疫组织学染色，存在于肾小球系膜基质中的层粘连蛋白染色结果的显微照片。左来自实施例的megsin/RAGE/iNOS-Tg小鼠；右来自对照megsin-Tg小鼠。
图8是一组显示megsin/RAGE/iNOS-Tg小鼠肾组织病理分析结果的电子显微照片。来自正常小鼠(非转基因小鼠)的肾组织作为对照示于左边用于比较。
图9是一组显示megsin/RAGE/iNOS-Tg(三Tg)小鼠(16周龄)中肾小球肥大的图。在三Tg和比较对照的实验动物中，显示了(a)肾小球簇区的尺寸，(b)肾小球系膜基质/肾小球簇区的比率，和(c)在每一实验动物中用于肾小球细胞计数的细胞核的数目。
图10是一组显示megsin/RAGE/iNOS-Tg(三Tg)小鼠(8周龄)中肾小球肥大的图。在三Tg和比较对照的实验动物中，显示了(a)肾小球簇区的尺寸，(b)肾小球系膜基质/肾小球簇区的比率，和(c)在每一实验动物中用于肾小球细胞计数的细胞核的数目。
图11是一组显示megsin/RAGE/iNOS-Tg(三Tg)小鼠中肾小球和肾小管间质性损伤的免疫组织学染色图像。(a)利用“α-SMA”(一种肾小球系膜基质活化和肾小管间质性损伤标记物)的免疫染色图像；(b)利用F4/80的巨噬细胞浸润的免疫染色图像。
图12是一张显示通过利用8-OHdG(一种氧化应激标记物)测定megsin/RAGE/iNOS-Tg小鼠中氧化应激增加所得到结果的图。
具体实施例方式
本发明的疾病模型动物包括表达至少三种基因megsin基因、编码晚期糖基化终产物受体(RAGE)的基因以及诱导型一氧化氮合酶基因(iNOS)的非人类哺乳动物。通过表达这三种基因，与常规模型动物相比在早期就能诱导出明显的肾障碍症状。上述症状包括具有增加的肾/身体重量比(较megsin Tg小鼠大1.5-2倍以上或较正常小鼠大1.5倍以上)的明显肾肥大、升高的尿白蛋白水平(较RAGE/iNOS-Tg小鼠大2倍以上)以及升高的血甘油三酯水平(较megsin Tg小鼠高2倍以上)。此外，与常规的megsin Tg小鼠和RAGE/iNOS-Tg小鼠相比，通过改变肾小球系膜基质，例如肾小球系膜基质扩张，免疫球蛋白和/或补体的沉积的增加以及胶原蛋白、层粘连蛋白和/或纤连蛋白的增加，还有肾小管间质性纤维变性，炎性细胞浸润等，这三种基因能在更早期诱导肾小管间质性障碍。此外，当与正常动物比较时，本发明表达megsin/RAGE/iNOS的疾病模型动物也显示出低体重(发育不全)、高血糖症和低胰岛素血症。
本发明表达megsin/RAGE/iNOS的疾病模型动物可通过例如给服对动物每种内源基因(megsin、RAGE或iNOS基因)启动子起作用的物质而获得。更可取地，该模型动物可通过创建导入上述三种基因的三转基因动物而获得。
在此megsin基因指一种基因，即如上所述在肾小球系膜细胞中特异表达且例如，如果其被单独导入小鼠的话，可诱导诸如系膜增生性肾小球肾炎的肾衰竭病理症状的基因。作为megsin基因的例子，人类megsin cDNA如SEQ ID NO1所示。本发明的megsin基因可以是包含与上述SEQ ID NO1中所示的人类megsin基因类似的序列的megsin基因、非人类megsin基因等，只要其能诱导如上所述类型的肾炎。例如，大鼠和小鼠的megsins描述于国际专利申请公布号WO 99/15652中。
RAGE是一种特异性识别血液或组织中通过糖基化形成的不可逆晚期糖基化终产物(AGE)的细胞表面受体。编码RAGE的人类RAGE cDNA如SEQ ID NO2所示。但是，本发明的RAGE基因并不限于SEQ ID NO2所示的人类RAGE基因，并且可以是编码能识别AGE的受体蛋白质的类似序列，不同于SEQ ID NO2序列的人类基因，非人类RAGE基因等。
iNOS基因编码诱导型一氧化氮合酶。小鼠cDNA已存储于GeneBank/EMBL数据库M84373内，在此该序列作为SEQ ID NO3包括在内。但是，该序列并不限于本发明的SEQ ID NO3，其可以是不同于该序列的但编码诱导型一氧化氮合酶的类似序列、功能上等价的小鼠基因、和来自其它物种(如人类)的iNOS基因等。
基于上述各自的核苷酸序列，通过常规方法可获得上述相应的基因。例如，就megsin基因而论，可通过使用包含SEQ ID NO1所示核苷酸序列的DNA作为探针筛选肾小球系膜细胞的cDNA文库来分离编码megsin基因的cDNA。或者，可通过使用cDNA文库作为模板和基于SEQ ID NO1所示的核苷酸序列所设计的引物，通过PCR扩增megsin基因获得megsin cDNA。
RAGE基因在许多细胞类型中表达，例如血管内皮细胞、平滑肌细胞、周细胞以及肾系膜细胞。因此，可通过使用包含SEQ IDNO2所示核苷酸序列的DNA作为探针筛选这些细胞任一的cDNA文库来分离编码RAGE基因的cDNA。或者，可使用cDNA文库作为模板和基于SEQ ID NO2所示的核苷酸序列所设计的引物，通过PCR扩增RAGE基因获得RAGE cDNA。
就iNOS基因来说，可通过使用包含SEQ ID NO3序列或其一部分的DNA作为探针筛选例如IL-1β-刺激的胰β细胞或活化的巨噬细胞的cDNA文库来分离编码iNOS基因的cDNA。或者，可使用cDNA文库作为模板和基于SEQ ID NO3序列设计的引物，通过PCR扩增iNOS基因获得iNOS cDNA。
可通过选择能在严格条件下与上述相应序列杂交的序列，以获得具有不同于上述SEQ ID NO1序列的序列的功能等价megsin基因、具有不同于SEQ ID NO2序列的序列的功能等价RAGE基因以及具有不同于SEQ ID NO3序列的序列的功能等价iNOS基因。对于洗涤，严格条件包括“1×SSC，0.1％SDS和37℃”的标准条件；“0.5×SSC，0.1％SDS和42℃”的更严格条件；以及“0.1×SSC，0.1％SDS和55℃”的最严格条件。
在创建转基因动物中，将上述各种基因与能表达被导入动物细胞中的该基因的启动子连接是有利的。可以使用能在包括小鼠和大鼠在内的多种脊椎动物中表达外源基因的鸡β肌动蛋白启动子。或者，当基因要在特定组织中表达时，可以使用组织特异性启动子。例如，小鼠flk-1是一种血管内皮细胞-特异性启动子。如果需要，可结合使用增强子以增强外源基因表达。可以使用包含增强子和启动子及其下游用于插入外源基因的多克隆位点的常规载体(例如，pCAGGS等)。在这些载体中，兔β珠蛋白终止子置于多克隆位点下游，其改善了所插入外源基因的表达效率。
利用上述连接有启动子的各种基因创建转基因动物。本发明的疾病模型动物包括导入上述三种基因(megsin、RAGE和iNOS基因)的三转基因动物。该三转基因动物可通过将这三种基因导入到一个生殖细胞中并强烈表达这三种基因而得到创建。或者，各种基因可单独导入不同的生殖细胞中，接着将各自产生的转基因动物相继杂交创建具有这三种外源基因的三Tg动物。用于创建本发明转基因动物的方法并不限于特定的方法，可以使用本领域公知用于创建转基因动物的方法(参见，例如，“Hassei Kohgaku JikkenManyuaru(Manual for Experiments in Development Engineering)”，编辑M.Katsuki(Japan，Kodansha)，1989；“Shin Seikagaku Jikken Kohza，DoubutsuJikkenhou(New series，Lecture for Biochemical ExperimentsMethods ofAnimal Experiments)”编辑The Japanese Biochemical Society，(Japan，TokyoKagakudojin)1991)。制备转基因动物的常规方案简要描述如下。
可通过将基因导入例如包含未受精卵、受精卵、精子及其原基细胞的生殖细胞中创建转基因动物。作为要被导入基因的细胞，使用在胚胎形成阶段的细胞，更具体地说，在非人类哺乳动物发育中的单细胞阶段或受精卵阶段，以及通常在8细胞阶段或更早的细胞。作为用于导入上述基因的方法，磷酸钙法、电脉冲法、脂质转染法、凝集(agglutination)法、微量注射法、基因枪法、DEAE-葡聚糖法等是公知的，并且可以使用这些方法的任一种。当对各种基因创建转基因动物时，将基因单独导入不同的受精卵等中。或者，当这三种基因共同导入时，通过任一上述方法将包含这三种基因的溶液导入受精卵中。
这里，要被导入基因的细胞可以是来源自任何容许创建转基因动物的非人类哺乳动物的细胞。具体地说，可以使用来自小鼠、大鼠、仓鼠、豚鼠、兔、山羊、绵羊、猪、牛、狗、猫等的细胞。例如，就大鼠来说，可导入基因的受精卵可通过将正常的雄性大鼠与给服排卵诱导剂的雌性大鼠杂交而收集获得。一般而言，当使用大鼠受精卵时，可通过微量注射将基因(或多种基因)导入雄性生殖核中。将已导入基因(或多种基因)的细胞在体外培养约一夜。接着，将一些预计已成功导入基因的细胞移植到代理母亲的输卵管中，然后生出转基因嵌合动物。将与输精管已切断的雄性动物交配制备的假孕雌性动物用作为代理母亲。
通过分析新生转基因嵌合动物体细胞中的基因，对它们进行检验以确定外源基因(或多种外源基因)是否已整合入基因组中。该转基因嵌合动物与正常动物杂交生出F1动物。当杂交时，最好选择携有更高基因拷贝数的个体。一般地，作为基因要被导入的外源DNA以多拷贝串联排列方式整合入在同一位点的基因组中。一般而言，随着整合基因的拷贝数增多，该基因的表达水平就更高且可预期获得更多独特的表达类型。此外，通过使用斑点印迹法可以实现拷贝数的相对比较。
在由杂交出生的F1动物中，在它们体细胞中携有外源基因(或多种外源基因)的动物是杂合转基因动物且能将外源基因(或多种外源基因)传递至生殖细胞上。因此，通过从亲本F1动物中选择在它们体细胞中携有外源基因(或多种外源基因)的动物，并容许所选择的动物生出F2动物，通过同型结合保留外源基因(或多种外源基因)的纯合动物可作为F2动物获得。
当通过上述方法创建各种基因的转基因动物时，首先，将这些转基因动物中的两种杂交以创建双转基因动物。通过将所产生的转基因动物与未杂交的转基因动物杂交创建三转基因动物。本发明的疾病模型动物可以是任何一代的转基因动物，只要该动物表达上述三种基因即可。杂合携带三个DNA的F1代以及杂合携带该DNA的F2代或后代也包括在本发明中。
如上所述创建的三Tg动物在早期有效地显示出高血糖症和肾衰竭的病理症状(特别是，高血糖症肾病)。例如，当本发明的三转基因小鼠与常规RAGE/iNOS转基因小鼠相比时，本发明的小鼠在约16周可发展为糖尿病性肾病，而常规小鼠在约40周才发展为糖尿病性肾病。正如上述小鼠例子所看到的，依照本发明疾病的发病可被加速，因此本发明使得疾病模型动物能快速地得到提供。因此，当本发明的三转基因小鼠为14周或更大时，更适宜地为16周或更大时，其可用作为糖尿病性肾病模型。此外，鉴于常规RAGE/iNOS转基因小鼠在约40周龄前不能发展为糖尿病性肾病这一事实，本发明的三转基因小鼠特征在于其能在14-40周，更适宜地在16-40周就可作为糖尿病性肾病模型。
此外，当与常规RAGE/iNOS-Tg和megsin Tg相比时，本发明的三转基因动物表现出同种表型，例如肾机能障碍，因此可提供在质量上更有效的模型动物。具体地说，肾肥大、尿白蛋白水平的增加、血甘油三酯水平的增加以及为一种氧化应激标记物的8-OHdG尿水平的增加，在本发明的三转基因动物中都检测到了。此外，除肾小球系膜基质增生和结节性肾小球硬化症状之外，在肾小球系膜基质中，IV型胶原蛋白、层粘连蛋白和纤连蛋白增加了，且免疫球蛋白和补体的沉积也增加。还观察到肾小管间质性纤维变性和炎性细胞浸润。这样的表型使该糖尿病性肾病模型非常有用。
本发明肾机能障碍的临床和病理学特征描述如下。表达megsin/RAGE/iNOS的本发明疾病模型动物表现出肾肥大。基于肾/体重比(KW/BW)的增加可评估肾肥大。测量体重和肾重，基于这些值计算KW/BW。当KW/BW值大于正常动物时，肾将被判断为肥大。
蛋白尿也是表达megsin/RAGE/iNOS的本发明疾病模型动物的显著特征。在糖尿病性肾病中，在肾病早期检测到痕量的白蛋白尿，随着疾病进展，检测到持续性的蛋白尿。本发明的动物也显示出上述蛋白尿的显著特征。蛋白尿是指一种症状，其排泄到尿中的蛋白质的水平高于该动物正常水平。测定尿蛋白质的方法为本领域公知。例如，生物化学法(如蛋白质误差法和染料结合法)广泛地用作为测定尿蛋白质的半定量法。基于这些测定原理的尿试纸在市场上可买到。基于免疫学原理的测定业已作为测定尿蛋白质的更敏感和更特异性方法用于实践中。在免疫学测定中，例如，使用抗血清白蛋白的抗体检测排泄到尿中的白蛋白。正常地，仅有痕量蛋白质排泄到尿中。例如，在大鼠中，尿中蛋白质正常水平被认为是0-40mg/dl。因此，当蛋白质以高于上述值的水平持续排泄到尿中时，大鼠被评定为具有蛋白尿。在本发明中，对于排泄到尿中的蛋白质类型没有限制。一般而言，尿蛋白质主要包含重要的血液蛋白质白蛋白和球蛋白。
在本发明的megsin/RAGE/iNOS表达动物中血甘油三酯水平升高。已知在糖尿病或肾障碍患者中血甘油三酯水平继发性升高。这样的情况在本发明的动物中也观察到了。血甘油三酯水平增加指超出了该动物正常范围的水平。测定血甘油三酯的方法为本领域公知。例如，可以使用LPL/GK/GPDH-心肌黄酶/甲 (formazan)染料法。
在本发明的megsin/RAGE/iNOS表达的动物中出现了肾小球系膜基质扩张和结节性肾小球硬化。肾小球基底膜增厚、肾小球系膜基质扩张以及肾小球中结节性硬化损伤是糖尿病性肾病的特征。这些显著特征也出现在本发明的模型动物中。此外，基于扩张过程中所产生的胶原蛋白、层粘连蛋白、纤连蛋白等的增加，可以观察到肾小球系膜基质扩张。使用相应的抗体可以对病理组织进行免疫组织学分析。如果与其正常的免疫组织学图像相比，该动物的免疫组织学图像具有更大的染色面积和/或更强的染色强度，则确定胶原蛋白、层粘连蛋白、纤连蛋白等已增加。同时，通过利用电子显微镜的病理学分析可以检测到肾小球基底膜的增厚。基底膜增厚的主要原因是基质新陈代谢的高血糖症-相关的异常性(产物增加和代谢减退)，业已清楚其潜在机制与肾小球系膜基质增生是一样的。
本发明表达megsin/RAGE/iNOS的模型动物也具有在肾小球系膜基质中免疫球蛋白和补体沉积增加的特征。在人类糖尿病性肾病中，在肾小球毛细血管壁和肾小球系膜基质存在的肾小球系膜区中检测到免疫球蛋白和补体的沉积。这样的病变也出现在本发明的模型动物中。利用对免疫球蛋白和补体具有特异性的抗体通过免疫组织学染色可以检测到免疫球蛋白和补体。如果染色面积或强度较该动物正常组织的免疫组织学染色图像中的那些更大或更强，则免疫球蛋白和补体的沉积被判断为增加了。
本发明的megsin/RAGE/iNOS表达模型动物也可具有肾小管间质性纤维变性和炎性细胞浸润的特征。肾小管和间质组织这样的检测结果也被在晚期人类糖尿病性肾病的晚期病理症状中观察到。这样的病理也出现在本发明的模型动物中。利用抗α-SMA的特异性抗体通过免疫组织学染色可以检测肾小管间质性纤维变性。通过利用抗α-SMA的特异性抗体对在肾小管或间质组织中具有阳性反应的细胞显色可以检测纤维变性细胞。或者，在显微镜下通过对肾小管或间质组织中损伤程度直接评分可以半定量纤维变性。同时，在肾小管间质组织中诸如巨噬细胞的炎性细胞浸润可利用特异于该炎性细胞的抗体等通过免疫组织学染色来检测。例如，实施例中描述的F4/80可用作为检测巨噬细胞的抗体。
本发明megsin/RAGE/iNOS表达的模型动物也可具有氧化应激增加的特征。近来对人类糖尿病性肾病病理状态的分析提出糖尿病性肾病发病是由氧化应激引起的。在上述人类糖尿病性肾病病理状态中所观察到的氧化应激的增加也在模型动物中观察到了。氧化应激可通过例如使用动物尿或血进行测定。例如，一种氧化应激标记物8-OHdG可利用动物尿作为样品以及在市场上可买到的ELISA试剂盒等容易地进行测定。
如上所述，本发明的模型动物具有诸如糖尿病性肾病、肾小球障碍(结节性硬化损害)和肾小管间质性障碍的肾机能障碍的显著特征，因此可作为这些疾病有用的模型动物。此外，本发明的模型动物在早期表现出高血糖症和低胰岛素血症，因此用作为糖尿病的模型动物。因此，本发明的模型动物可用于研究以阐明糖尿病及其并发症(包括糖尿病性肾病和结节性肾小球硬化)的发病机制，以及用于其他目的。同样地，它们可作为开发高血糖症和肾机能障碍的治疗方法、治疗药等的评估系统。
本发明也提供了用于评估抗高血糖症或肾机能障碍的治疗药的方法，其使用了上述疾病模型动物。第一种评估方法包括下列步骤(1)对上述包含非人类哺乳动物的megsin/RAGE/iNOS表达的疾病模型动物给服测试化合物；和(2)测试上述已给服测试化合物的疾病模型动物的肾机能。
在上述评估方法中，首先，对本发明的megsin/RAGE/iNOS表达的模型动物给服测试化合物。对于给药途径并不限制。可以选择口服、静脉注射、腹膜内给药等，或任何适合于测试化合物的可供选择方法。通过给药处理的疾病模型动物，以及对照动物(其是一种事先没有给服测试化合物的等同的疾病模型动物)，使用肾机能标记物对它们的肾机能进行测试。例如，下列肾机能标记物是公知的且可用于该评估方法中。肾机能标记物血肌酸酐和尿素氮、尿血红蛋白、白蛋白、β2-微球蛋白以及α1-酸性糖蛋白。测定肾机能标记物的方法也为本领域公知。
因此，可通过在测试化合物给服前后观察这些指示物并比较所获得的结果，以评估作为治疗药的测试化合物的有效性。或者，当使用来源自同一品系的转基因动物时，通过观察动物中的这些指示物并比较所获得的结果，也可比较测试化合物之间的有效性。
第二种评估方法使用了与肾小球障碍(如糖尿病性肾病)的相关的作为指示物的临床标记物，包括步骤对上述megsin/RAGE/iNOS表达的疾病模型动物给服测试化合物并在该测试化合物给服后测定该疾病模型动物中肾/身体重量比、蛋白尿水平和血甘油三酯的至少任一种。具体地说，在该方法中，对肾机能障碍疗效的评估是基于增加的肾/身体重量比、蛋白尿和血甘油三酯的一种或多种指示物。
在上述第二种评估方法中，首先，对本发明的megsin/RAGE/iNOS表达的模型动物给服测试化合物。如上所述，对于给药途径并不限制。基于上述指示物，对通过给药处理的疾病模型动物以及没有事先给服测试化合物的对照模型动物的肾机能进行比较。此外，模型动物可与健康动物对象进行比较。用于测定肾/身体重量比、蛋白尿和血甘油三酯增加的方法同上所述。与未处理组比较，当给服一种测试化合物时，该化合物可缓解肾障碍或恢复肾机能至正常动物水平，此化合物可作为肾小球衰竭的伴发肾机能障碍(例如糖尿病性肾病)的治疗药。
第三种评估方法包括步骤对本发明的megsin/RAGE/iNOS表达的疾病模型动物给服测试化合物，评估通过给服测试化合物该肾小球系膜基质是否已改变，或改变程度是否已减小。在该评估方法中，通过对肾小球系膜基质组织学检查来评估对肾机能障碍的缓解效果。特别是，在肾小球衰竭的伴发肾机能障碍中，如糖尿病性肾病中，可观测到肾小球系膜基质扩张、免疫球蛋白和/或补体的沉积的增加、胶原蛋白、层粘连蛋白和/或纤连蛋白的增加。因此，基于任一这些症状的缓解或恢复，完成了评估。
更具体地说，对本发明的megsin/RAGE/iNOS表达的模型动物给服测试化合物。给药方法并不特别受限制。根据测试化合物，该方法可作适当选择。对通过给药处理的疾病模型动物和事先没有给服测试化合物的对照模型动物的肾小球系膜基质进行组织学比较。例如，通过测量PAS染色的肾小球系膜基质的面积以评估肾小球系膜基质扩张是否得到缓解。与未处理组比较，如果在给服该测试化合物组中肾小球系膜基质面积减小或恢复到正常动物水平，则该测试化合物被评估为对肾小球衰竭的伴肾机能障碍(如糖尿病性肾病)具有疗效。同样地，利用抗免疫球蛋白或补体的特异性抗体对肾小球系膜基质免疫染色以测定沉积的免疫球蛋白或补体的量。当给服测试化合物组的该数值小于未处理组的该数值时，该测试化合物被评估为对肾小球衰竭的伴肾机能障碍具有疗效。或者，利用抗胶原蛋白、层粘连蛋白和/或纤连蛋白的特异性抗体对肾小球系膜基质免疫染色以测定它们的含量。如果给服测试化合物组的该数值小于未处理组的该数值，则该测试化合物被评估为对肾小球衰竭的伴肾机能障碍具有疗效。
第四种评估方法包括步骤对本发明的megsin/RAGE/iNOS表达的疾病模型动物给服测试化合物，并评估在给服该测验化合物后该疾病模型动物的肾小管间质组织是否已改变或改变程度是否已减小。在该评估方法中，通过肾小管间质组织的组织学检查对肾机能障碍的缓解效果进行评估。基于在晚期人类糖尿病性肾病的晚期病理症状中所观察到的肾小管间质组织病理学状态，该评估方法检查该病理状态是否已缓解或恢复。
具体地说，对本发明的megsin/RAGE/iNOS表达的模型动物给服测试化合物。对通过给药处理的该疾病模型动物和事先没有给服测试化合物的对照模型动物的肾小管间质组织进行组织学比较。例如，利用上述抗α-SMA的抗体通过组织学染色或直接通过显微镜检查可定量肾小管间质性纤维变性。接着，如果与未处理组相比在给服测试化合物组中肾小管间质性纤维变性程度减小，或如果如同在正常动物体内一样纤维变性变得检测不到，则该测试化合物被评估为对肾小球衰竭的伴肾机能障碍(例如糖尿病性肾病)具有疗效。同样地，利用抗炎性细胞(如巨噬细胞)的特异性抗体对肾小管间质组织免疫染色，以测定所存在的炎性细胞的比例。如果给服测试化合物组的测定值小于未处理组的测定值，则该测试化合物被评估为对肾小球衰竭的伴肾机能障碍具有疗效。
本发明也提供了用于评估对糖尿病疗效的方法。该方法包括步骤(1)对上述megsin/RAGE/iNOS表达的疾病模型动物给服测试化合物；和(2)在给服测试化合物后测定该疾病模型动物的葡萄糖水平和/或胰岛素水平。
在本发明的评估方法中，作用于糖尿病的疗效程度可使用糖尿病标记物(如葡萄糖或胰岛素水平)作为指示物进行评估。葡萄糖水平测定的对象可以是任何类型的体液，包括血、尿和汗。当要测定胰岛素水平时，优选的样品是血。或者，血红蛋白Hcl、糖化白蛋白、果糖胺、尿酮体等可用作为评估对糖尿病症状疗效的指标。对糖尿病疗效可通过在一段时间内监测这些诊断指示物的改变而得到评估。因此，通过在给服测试化合物前后观测这些指标并比较所获得结果，可以评估测试化合物作为治疗药的疗效。或者，当使用来源自同一品系的转基因动物时，也可通过观测不同动物之间的该指标并比较所获得结果以比较不同测试化合物之间的疗效。
所有本文引证的现有技术文献在此都引入作为参考。
在下文中，本发明根据实施例将得到具体描述，但不应理解为受之所限。
制备megsin/RAGE/iNOS-Tg将RAGE/iNOS-Tg小鼠(Yamamoto，Y.，等，J.Clin.Invest.，108261-268(2001))与megsin-Tg小鼠(Miyata，T.，等，J.Clin.Invest.，109585-593(2002))杂交以获得megsin/RAGE/iNOS-Tg小鼠。从尾部组织提取基因组DNA，并依照描述于文献(Yamamoto，Y.，等，J.Clin.Invest.，108261-268(2001)；Miyata，T.，等，J.Clin.Invest.，109585-593(2002))中的方法通过PCR证实RAGE、iNOS和megsin的表达。具体地说，在出生4周或更迟后切下Tg小鼠尾巴的一部分，利用DNA抽提试剂盒(Qiagen组织试剂盒；Qiagen)提取基因组DNA。使用该基因组DNA作为模板，通过PCR扩增导入基因的片段以证实每种导入基因的存在。对于megsin的PCR检测，使用了β-gl-3引物(5’-CTT CTG GCG TGT GAC CGG CG-3’/SEQ ID NO4)和hM2-2引物(5’-ATC GAA TTC TGA GAT CAT AAT CCC TGT GGG ATGC-3’，SEQ ID NO5)，以及选用通过利用这些引物获得其PCR扩增产物(400bp)的个体(图1)。对于RAGE基因的测定，使用了flk-1启动子引物(5’-AGG GAC GGA GAA GGA GT-3’/SEQ ID NO6；Ronicke，V.等，Circ.Res.，79277-285(1996))和人类RAGE基因引物(5’-TCACCCCACAGACTGAG-3’/SEQ ID NO7；Sugaya，K.等，Genomics，23408-419(1994))，并检测到354bp的扩增产物(图1)。对于iNOS基因的检测，使用了F-引物(5’-GTGGGCTATGGGTTTGTGGAAGGAGA-3’，SEQ ID NO8)和R-引物(5’-CGATGTCACATGCAGCTTGT-3’/SEQ ID NO9)，并检测到800bp的扩增产物(图1)。将所获得的megsin/RAGE/iNOS-Tg小鼠与非转基因CD1小鼠(Charles River Japan，Inc.)回交以拥有CD-1遗传背景。
megsin/RAGE/iNOS-Tg中病理检查结果从16周龄megsin/RAGE/iNOS-Tg小鼠上切下肾，依照常规方法及描述于WO 01/24628中的方法进行肾小球的PAS染色和PAM染色。将卡诺伊氏(Carnoy′s)固定液固定的组织包埋于石蜡中并切成4微米切片，用于PAM染色。PAS染色(高碘酸希夫反应)一般将多糖染为红色。在肾病理中，肾小球系膜基质增生和基底膜增厚可通过将糖蛋白染为红色而观察到，该糖蛋白是肾小球系膜基质和基底膜的组成成分。同时，在PAM染色(高碘酸-六亚甲基四胺银盐染色法)中，基底膜和结缔组织的组成成分通常染为黑色(银浸渍)。在肾病理中，肾小球系膜基质硬化(纤维变性)和基底膜增厚被染为黑色。
PAS染色和PAM染色结果示于图2中。依照PAS染色结果，在9只megsin/RAGE/iNOS-Tg小鼠中高血糖症组(6只小鼠；500mg/dl或更高的血糖水平)的所有病例中均发现有严重的肾小球障碍(结节性硬化损伤)。在野生型小鼠中没有发现异常。具体地说，发现在该区域中到处散布着明显的肾小球系膜基质扩张，也检测到了肾小球肥大。同时，显示了严重减少的肾小球细胞计数和伴发肾小球细胞死亡的肾小球硬化的图像。此外，也通过PAM染色证实了扩张的肾小球系膜基质的硬化。
在对照RAGE/iNOS-Tg小鼠(11只小鼠；其中10只来自高血糖症组(400mg/dl或更高))中局部发现了具有整体(global)或节段性肾小球系膜基质扩张的肾小球。肾小球细胞计数保持不变。几乎没有发现肾小管间质性改变。通过PAM染色检测的硬化较RAGE/iNOS/megsin-Tg小鼠为轻。此外，在16周的megsin-Tg小鼠中没有检测到特定的病理检查结果(图2)。
megsin/RAGE/iNOS-Tg中肾重及尿和血的生化检验测定16周龄megsin/RAGE/iNOS-Tg小鼠中肾重及尿和血的生化参数(表1)。其它Tg小鼠(iNOS-Tg、RAGE/iNOS-Tg、megsin/iNOS-Tg、megsin/RAGE-Tg、megsin-Tg和RAGE-Tg)以及野生型小鼠(CD-1)作为对照用于比较。所要测定的项目如下体重(BW)；肾重(KW)；血清总蛋白(TP双缩脲法)；甘油三酯(TGLPL/GK/GPDH-心肌黄酶/甲 染色法)；总胆固醇(Tcho酶法)；尿素氮(BUN脲酶-紫外光法)；肌酸酐(Cr碱性苦味酸盐法)；胰岛素(胰岛素ELISA)；血糖水平(GLUGOD/POD法)；GOT；和GPT；尿白蛋白(HbA1c乳胶凝集反应抑制法)；总蛋白(TP邻苯三酚红法)；尿素氮(BUN脲酶-紫外光法)；以及肌酸酐(Cr碱性苦味酸盐测定法)。所显示的TP、CRE和GLU的结果是使用尿(一次收集的单泡尿(spot urine))作为样品测定的。
如表1所示，megsin/RAGE/iNOS-Tg小鼠的KW/BW高于RAGE/iNOS-Tg小鼠和megsin-Tg小鼠，并且在megsin/RAGE/iNOS-Tg小鼠中可见肾肥大。此外，在megsin/RAGE/iNOS-Tg小鼠中也可见白蛋白尿和增加的血甘油三酯水平。此外，与非转基因小鼠相比，megsin/RAGE/iNOS-Tg小鼠也表现出体重过轻、高血糖症和低胰岛素血症。
表1三Tg生化数据信息16周龄，CD-1(F4)
*1P＜0.001，vs CD-1注释1通过DRI CEHM 3500V(FUJIFILM MEDICAL CO.，LTD.)测定。
*2P＜0.05，VS CD-1 注释2由于大量的溶血样品，胰岛素数据是参考值。
*3P＜0.01，vs CD-1 注释3由于样品不足，无法测定meg组的“ALB/CRE比”。
nonNS 通过免疫荧光显微法沉积免疫复合物使用免疫荧光显微法检查免疫复合物沉积。将收集自megsin/RAGE/iNOS-Tg小鼠的肾组织包埋于冷冻组织包埋剂(OCT化合物；Tissue Tek Miles，Elkhart，IN)中，并在干冰/丙酮中快速冻结。自该冻结的包埋组织制备4μm冷冻切片。在室温下于4％脱脂乳中封闭处理这些冷冻切片60分钟，然后与1∶200稀释的异硫氰酸荧光素(FITC)-标记的山羊抗-小鼠IgG、IgA、IgM和C3抗体(CappelResearch Products)的任一个在4℃恒温培育过夜。反应后，用PB S洗涤切片并用甘油-PBS制成标本，然后在荧光显微镜下检查。
结果显示与RAGE/iNOS-Tg小鼠相比，在megsin/RAGE/iNOS-Tg小鼠肾小球系膜基质中免疫球蛋白和补体的沉积增加了(图3和4)。
肾小球系膜基质改变通过免疫组织化学染色检查16周Tg小鼠肾小球系膜基质的改变。为鉴定肾小球系膜基质组成成分，利用下列所示的抗体通过免疫组织学染色方法(Nangaku，M.等，J.Am.Soc.Nephrol.10，2323-2331，1999)处理冷冻切片。利用山羊抗-IV型胶原蛋白多克隆抗体(Southern Biotechnology)鉴定IV型胶原蛋白；利用兔抗-纤连蛋白抗体(Chemicon)鉴定纤连蛋白；以及利用兔抗-层粘连蛋白抗体(Chemicon)鉴定层粘连蛋白。
当与RAGE/iNOS-Tg和megsin-Tg对照小鼠比较时，发现在megsin/RAGE/iNOS-Tg小鼠扩张的肾小球系膜基质中IV型胶原蛋白、层粘连蛋白和纤连蛋白增加了(图5、6和7)。已知在人类糖尿病性肾病中也检测到这样的现象。
在本发明的转基因动物中，由于megsin过表达而扩张的基质重塑迅速削弱了，由此加剧了肾小球障碍并缩短了硬化发病前的时间。还推测megsin/RAGE/iNOS-Tg动物的肾小球是由暴露于诸如高度megsin表达和高血糖症的负荷下的肾小球系膜细胞和在氧化应激下的内皮细胞组成。当仅有肾小球系膜细胞暴露于megsin过表达和高血糖症的负荷下时，肾小球障碍十分轻微(megsin/iNOS-Tg)。但是，如果内皮细胞也暴露于如AGE-RAGE途径激活，具体地说，在强氧化应激和内皮细胞产生的多种细胞因子的负荷下，临床状况变得愈加严重。这由在其葡萄糖水平是正常的megsin/RAGE/iNOS-Tg小鼠(Tg小鼠中的内皮细胞没有处在AGE-RAGE途径激活的负荷下)中临床状况十分轻微的事实所支持。该megsin/RAGE/iNOS-Tg小鼠模型表明肾小球系膜细胞和内皮细胞之间的相互干扰影响了病理学发展。
megsin/RAGE/iNOS-Tg小鼠病理学分析利用电子显微镜进行megsin/RAGE/iNOS-Tg小鼠肾组织的病理学分析。将取自16周龄megsin/RAGE/iNOS-Tg小鼠的肾组织通过先在含有2％戊二醛的0.1M磷酸钠缓冲液中浸没2小时，然后在2％四氧化锇中浸没来固定。用乙醇对固定的肾组织脱水并在脱水后将其包埋在Epon 812(TAAB；England)中。用乙酸双氧铀对从样品上切下的超薄切片染色并用丙酮处理，然后利用透射电子显微镜(在20,000倍放大率；JEM-1200EX，JEOL LTD.，Japan)进行分析。
分析结果示于图8中。足突损失和肾小球上皮细胞中高密度沉淀物、以及肾小球内皮细胞中透明斑损失见于megsin/RAGE/iNOS-Tg小鼠中(A)。此外，不规则分层的肾小球基底膜(B)、肾小球系膜基质增生以及结节(C)、还有在肾小球上皮细胞中泡状结构(D)见于megsin/RAGE/iNOS-Tg小鼠中。这些检测结果表明在构成megsin/RAGE/iNOS-Tg小鼠肾小球(上皮细胞、内皮细胞以及肾小球系膜细胞)和基底膜的细胞中出现了形态异常。
由于高megsin表达加速了肾小球系膜基质扩张通过计算机图像分析检查8周龄和16周龄megsin/RAGE/iNOS-Tg小鼠肾小球损伤。同龄的野生型小鼠、megsin-Tg小鼠和RAGE/iNOS-Tg小鼠也通过同一程序分析。具体地说，制备每种测试小鼠的PAS-染色的肾切片。使用3CCD照相机(Olympus Optical Co.，Tokyo，Japan)对每张染色图像进行扫描，并利用Image Grabber PCI软件(Fuji Photo Film Co.，Tokyo Japan)和MacAspect(Mitani Co.，Tokyo，Japan)检查肾小球簇区和肾小球系膜区(肾小球簇区的一部分)并通过单盲法分析测定肾小球细胞计数。检查了中皮质(midcortex)中的20个连续肾小球单位。将仅含有少量肾小球簇的肾小球横切片(在一个横切片中含有20个或更少的独立管状节段)排除在实验对象之外。此外，为避免实验者偏差，将最大和最小的肾小球从20个肾小球测试对象中排除。测试每个切片中剩下的18个肾小球并将平均水平表示为“平均值+/-标准偏差”。使用16周龄小鼠获得的分析结果示于图9中，使用8周龄小鼠的结果示于图10中。
与野生型和megsin-Tg小鼠比较，肾小球肥大均见于16周龄的RAGE/iNOS-Tg小鼠和megsin/RAGE/iNOS-Tg小鼠中(图9(a))。在RAGE/iNOS-Tg小鼠中高megsin表达并不能加速肾小球肥大。在16周龄时，野生型小鼠、megsin-Tg小鼠和RAGE/iNOS-Tg小鼠显示出在其肾小球系膜基质尺寸上的差异。但是，megsin/RAGE/iNOS-Tg小鼠中高megsin表达显著地加速了肾小球系膜基质的扩张(图9(b))。与RAGE/iNOS-Tg小鼠相比，megsin/RAGE/iNOS-Tg小鼠中这些检测结果与重度肾小球系膜基质扩张以及结节性损伤相关。
同时，在8周的早期Tg小鼠中检测到肾小球簇区肥大，而在megsin/RAGE/iNOS-Tg小鼠中肥大程度愈加严重(图10(a))。在同龄野生型、RAGE/iNOS-Tg和megsin/RAGE/iNOS-Tg小鼠之间的肾小球系膜基质/肾小球簇区比值没有统计学上的显著性差异，但在转基因小鼠中存在着比值增加的趋向(图10(b))。
高megsin表达引起的肾小球细胞早期增生描述于实施例7中的肾小球细胞计数图像分析结果显示了在8周的早期megsin/RAGE/iNOS-Tg小鼠中细胞计数的增加(图10(c))。同时，与16周龄RAGE/iNOS-Tg小鼠中的细胞计数相比，megsin/RAGE/iNOS-Tg小鼠中细胞计数在统计学上显著减少了(图9(c))。此外，任一16周龄转基因小鼠中肾小球细胞计数大于同龄野生型小鼠中的肾小球细胞计数。
megsin/RAGE/iNOS-Tg小鼠中肾小球或肾小管间质性障碍进行免疫组织学染色用于检测肾小球病和巨噬细胞浸润。用抗α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)的小鼠单克隆抗体(400倍稀释；Boehringer Mannheim；Mannheim，Germany)和抗F4/80的大鼠单克隆抗体(400倍稀释；Caltag laboratories；Burlingame，CA，USA)染色甲基Carnoy固定的4μm切片，该α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)是肾小球系膜细胞活化和肾小管间质性纤维变性的标记物，该F4/80是小鼠巨噬细胞的细胞表面标记物。通过间接免疫过氧化物酶法使一级抗体的位置可见(Miyata T，Inagi R，等，Overexpression of the serpin megsininduces progressive mesangial cell proliferation and expansion，JCI 109，2002)。
如α-SMA免疫染色所示，megsin/RAGE/iNOS-Tg小鼠的肾小球障碍与肾小球系膜细胞活化相关(图11(a))。在megsin/RAGE/iNOS-Tg小鼠肾小管和间质细胞的某些部分中检测到α-SMA的重新表达，这表明出现了肾小管间质性纤维变性(图11(a))。通过F4/80染色在megsin/RAGE/iNOS-Tg小鼠中检测到炎性细胞浸润到肾小管间质组织中(图11(b))。
在megsin/RAGE/iNOS-Tg小鼠中氧化应激增加近来研究已表明在糖尿病性肾病中氧化应激扮演着病原的角色。因此，本发明人比较了RAGE/iNOS-Tg和megsin/RAGE/iNOS-Tg小鼠之间的氧化应激状态。对这些小鼠对象进行尿8-OHdG测试，该8-OHdG为一种氧化应激标记物。利用ELISA试剂盒(8-OHdG Check(高灵敏的)；Japan Aging Controllaboratories；Shizuoka，Japan)检测8-OHdG。利用Vivaspin(＞10,000截留分子量；Vivascience AG；Hannover，Germany)通过超滤处理该测试中使用的尿，然后测定尿中的8-OHdG水平。使用尿肌酸对测定值规范化。结果示于图12中。
megsin/RAGE/iNOS-Tg小鼠中平均尿8-OHdG水平较野生型小鼠高2倍或更多。该差异是统计学上显著的。当与RAGE/iNOS-Tg小鼠比较时，megsin/RAGE/iNOS-Tg小鼠中尿8-OHdG的增加也是相当高的(图12)。
工业实用性本发明的模型动物表现出伴严重肾机能障碍(白蛋白尿)和肾小球病理(肾小球系膜基质增生，基底膜增厚以及结节性硬化损伤)的高血糖症，特别是，表现出非常类似于人类糖尿病性肾病的临床状况。糖尿病性肾病的常规模型动物仅表现出很少的病理特征。相反，本发明的模型动物在早期就表现出慢性渐进性病理。
具体地说，在本发明8周或16周的早期megsin/RAGE/iNOS表达的Tg小鼠中观察到肾小球肥大和肾小球细胞增生，这表明肾小球系膜基质扩张的加速。
上述肾小球早期形态异常引起了肾小球障碍(肾小球系膜细胞活化)、加剧了肾小管间质性障碍(纤维变性)、间质中巨噬细胞浸润、氧化应激增加等，且16周龄三Tg小鼠表现出糖尿病性肾病的晚期病理症状(结节性损伤，以及肾小球簇和肾小囊的黏附)。
相比较的16周龄RAGE/iNOS-Tg还保留着早期病理(肾小球系膜基质扩张)的病理症状，没有观察到上述晚期病理。但是，在16周龄megsin/RAGE/iNOS-Tg小鼠中观察到的结节性损伤最终在36周龄的RAGE/iNOS-Tg中检测到。
如上所述，本发明的早期megsin/RAGE/iNOS-Tg能显示出晚期病理，因此预计该megsin/RAGE/iNOS-Tg小鼠对于贫乏的晚期发病机理分子病理学深入研究是有帮助的。
此外，megsin过表达加速了本发明疾病模型动物中肾小球系膜细胞损伤，使之可以更详细且在更宽范围的损伤阶段中比较并分析糖尿病性肾病中megsin病理生理学和肾小球系膜细胞病理生理学之间的差异。因此，本发明的megsin/RAGE/iNOS-Tg小鼠可用作开发抑制进展至晚期病理的肾障碍的新型诊断方法和药物的评估模型。
此外，因为晚期病理的发病率高，因此该小鼠对于阐明糖尿病性肾病的发病/进展机制以及药物开发是有用的。此外，该模型动物对于开发治疗上述肾小球衰竭的伴肾机能障碍的药物是有用的。本申请不仅提供了疾病模型动物，也提供了利用该模型动物评估肾机能障碍治疗药物的系统。因此，在对伴发肾机能障碍的疾病的临床研究和药物开发中，本发明是非常有用的。此外，本发明的疾病模型动物表现出高血糖症，因此在糖尿病临床研究和开发治疗和预防药物中预计也是非常有用的。
序列表<110>独立行政法人科学技术振兴机构株式会社基因课题<120>表达MEGSIN/RAGE/iNOS的疾病模型动物及借助于该动物评估化合物的方法<130>F2-A0302P<150>JP 2003-415779<151>2003-12-12<160>9<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>1143<212>DNA<213>现代人(Homo sapiens)<220>
<221>CDS<222>(1)..(1140)<223>
<400>1atg gcc tcc ctt gct gca gca aat gca gag ttt tgc ttc aac ctg ttc 48Met Ala Ser Leu Ala Ala Ala Asn Ala Glu Phe Cys Phe Asn Leu Phe1 5 10 15aga gag atg gat gac aat caa gga aat gga aat gtg ttc ttt tcc tct 96Arg Glu Met Asp Asp Asn Gln Gly Asn Gly Asn Val Phe Phe Ser Ser20 25 30ctg agc ctc ttc gct gcc ctg gcc ctg gtc cgc ttg ggc gct caa gat144Leu Ser Leu Phe Ala Ala Leu Ala Leu Val Arg Leu Gly Ala Gln Asp35 40 45gac tcc ctc tct cag att gat aag ttg ctt cat gtt aac act gcc tca192Asp Ser Leu Ser Gln Ile Asp Lys Leu Leu His Val Asn Thr Ala Ser50 55 60
gga tat gga aac tct tct aat agt cag tca ggg ctc cag tct caa ctg240Gly Tyr Gly Asn Ser Ser Asn Ser Gln Ser Gly Leu Gln Ser Gln Leu65 70 75 80aaa aga gtt ttt tct gat ata aat gca tcc cac aag gat tat gat ctc288Lys Arg Val Phe Ser Asp Ile Asn Ala Ser His Lys Asp Tyr Asp Leu85 90 95agc att gtg aat ggg ctt ttt gct gaa aaa gtg tat ggc ttt cat aag336Ser Ile Val Asn Gly Leu Phe Ala Glu Lys Val Tyr Gly Phe His Lys100 105 110gac tac att gag tgt gcc gaa aaa tta tac gat gcc aaa gtg gag cga384Asp Tyr Ile Glu Cys Ala Glu Lys Leu Tyr Asp Ala Lys Val Glu Arg115 120 125gtt gac ttt acg aat cat tta gaa gac act aga cgt aat att aat aag432Val Asp Phe Thr Asn His Leu Glu Asp Thr Arg Arg Asn Ile Asn Lys130 135 140tgg gtt gaa aat gaa aca cat ggc aaa atc aag aac gtg att ggt gaa480Trp Val Glu Asn Glu Thr His Gly Lys Ile Lys Asn Val Ile Gly Glu145 150 155 160ggt ggc ata agc tca tct gct gta atg gtg ctg gtg aat gct gtg tac528Gly Gly Ile Ser Ser Ser Ala Val Met Val Leu Val Asn Ala Val Tyr165 170 175ttc aaa ggc aag tgg caa tca gcc ttc acc aag agc gaa acc ata aat576Phe Lys Gly Lys Trp Gln Ser Ala Phe Thr Lys Ser Glu Thr Ile Asn180 185 190tgc cat ttc aaa tct ccc aag tgc tct ggg aag gca gtc gcc atg atg624Cys His Phe Lys Ser Pro Lys Cys Ser Gly Lys Ala Val Ala Met Met195 200 205cat cag gaa cgg aag ttc aat ttg tct gtt att gag gac cca tca atg672His Gln Glu Arg Lys Phe Asn Leu Ser Val Ile Glu Asp Pro Ser Met210 215 220
aag att ctt gag ctc aga tac aat ggt ggc ata aac atg tac gtt ctg 720Lys Ile Leu Glu Leu Arg Tyr Asn Gly Gly Ile Asn Met Tyr Val Leu225 230 235 240ctg cct gag aat gac ctc tct gaa att gaa aac aaa ctg acc ttt cag 768Leu Pro Glu Asn Asp Leu Ser Glu Ile Glu Asn Lys Leu Thr Phe Gln245 250 255aat cta atg gaa tgg acc aat cca agg cga atg acc tct aag tat gtt 816Asn Leu Met Glu Trp Thr Asn Pro Arg Arg Met Thr Ser Lys Tyr Val260 265 270gag gta ttt ttt cct cag ttc aag ata gag aag aat tat gaa atg aaa 864Glu Val Phe Phe Pro Gln Phe Lys Ile Glu Lys Asn Tyr Glu Met Lys275 280 285caa tat ttg aga gcc cta ggg ctg aaa gat atc ttt gat gaa tcc aaa 912Gln Tyr Leu Arg Ala Leu Gly Leu Lys Asp Ile Phe Asp Glu Ser Lys290 295 300gca gat ctc tct ggg att gct tcg ggg ggt cgt ctg tat ata tca agg 960Ala Asp Leu Ser Gly Ile Ala Ser Gly Gly Arg Leu Tyr Ile Ser Arg305 310 315 320atg atg cac aaa tct tac ata gag gtc act gag gag ggc acc gag gct1008Met Met His Lys Ser Tyr Ile Glu Val Thr Glu Glu Gly Thr Glu Ala325 330 335act gct gcc aca gga agt aat att gta gaa aag caa ctc cct cag tcc1056Thr Ala Ala Thr Gly Ser Asn Ile Val Glu Lys Gln Leu Pro Gln Ser340 345 350acg ctg ttt aga gct gac cac cca ttc cta ttt gtt atc agg aag gat1104Thr Leu Phe Arg Ala Asp His Pro Phe Leu Phe Val Ile Arg Lys Asp355 360 365gac atc atc tta ttc agt ggc aaa gtt tct tgc cct tga1143Asp Ile Ile Leu Phe Ser Gly Lys Val Ser Cys Pro370 375 380<210>2
<211>1391<212>DNA<213>现代人(Homo sapiens)<220>
<221>CDS<222>(1)..(1215)<223>
<400>2ggg gca gcc gga aca gca gtt gga gcc tgg gtg ctg gtc ctc agt ctg 48Gly Ala Ala Gly Thr Ala Val Gly Ala Trp Val Leu Val Leu Ser Leu1 5 10 15tgg ggg gca gta gta ggt gct caa aac atc aca gcc cgg att ggc gag 96Trp Gly Ala Val Val Gly Ala Gln Asn Ile Thr Ala Arg Ile Gly Glu20 25 30cca ctg gtg ctg aag tgt aag ggg gcc ccc aag aaa cca ccc cag cgg144Pro Leu Val Leu Lys Cys Lys Gly Ala Pro Lys Lys Pro Pro Gln Arg35 40 45ctg gaa tgg aaa ctg aac aca ggc cgg aca gaa gct tgg aag gtc ctg192Leu Glu Trp Lys Leu Asn Thr Gly Arg Thr Glu Ala Trp Lys Val Leu50 55 60tct ccc cag gga gga ggc ccc tgg gac agt gtg gct cgt gtc ctt ccc240Ser Pro Gln Gly Gly Gly Pro Trp Asp Ser Val Ala Arg Val Leu Pro65 70 75 80aac ggc tcc ctc ttc ctt ccg gct gtc ggg atc cag gat gag ggg att288Asn Gly Ser Leu Phe Leu Pro Ala Val Gly Ile Gln Asp Glu Gly Ile85 90 95ttc cgg tgc agg gca atg aac agg aat gga aag gag acc aag tcc aac336Phe Arg Cys Arg Ala Met Asn Arg Asn Gly Lys Glu Thr Lys Ser Asn100 105 110tac cga gtc cgt gtc tac cag att cct ggg aag cca gaa att gta gat384Tyr Arg Val Arg Val Tyr Gln Ile Pro Gly Lys Pro Glu Ile Val Asp115 120 125
tct gcc tct gaa ctc acg gct ggt gtt ccc aat aag gtg ggg aca tgt432Ser Ala Ser Glu Leu Thr Ala Gly Val Pro Asn Lys Val Gly Thr Cys130 135 140gtg tca gag gga agc tac cct gca ggg act ctt agc tgg cac ttg gat480Val Ser Glu Gly Ser Tyr Pro Ala Gly Thr Leu Ser Trp His Leu Asp145 150 155 160ggg aag ccc ctg gtg cct aat gag aag gga gta tct gtg aag gaa cag528Gly Lys Pro Leu Val Pro Asn Glu Lys Gly Val Ser Val Lys Glu Gln165 170 175acc agg aga cac cct gag aca ggg ctc ttc aca ctg cag tcg gag cta576Thr Arg Arg His Pro Glu Thr Gly Leu Phe Thr Leu Gln Ser Glu Leu180 185 190atg gtg acc cca gcc cgg gga gga gat ccc cgt ccc acc ttc tcc tgt624Met Val Thr Pro Ala Arg Gly Gly Asp Pro Arg Pro Thr Phe Ser Cys195 200 205agc ttc agc cca ggc ctt ccc cga cac cgg gcc ttg cgc aca gcc ccc672Ser Phe Ser Pro Gly Leu Pro Arg His Arg Ala Leu Arg Thr Ala Pro210 215 220atc cag ccc cgt gtc tgg gag cct gtg cct ctg gag gag gtc caa ttg720Ile Gln Pro Arg Val Trp Glu Pro Val Pro Leu Glu Glu Val Gln Leu225 230 235 240gtg gtg gag cca gaa ggt gga gca gta gct cct ggt gga acc gta acc768Val Val Glu Pro Glu Gly Gly Ala Val Ala Pro Gly Gly Thr Val Thr245 250 255ctg acc tgt gaa gtc cct gcc cag ccc tct cct caa atc cac tgg atg816Leu Thr Cys Glu Val Pro Ala Gln Pro Ser Pro Gln Ile His Trp Met260 265 270aag gat ggt gtg ccc ttg ccc ctt ccc ccc agc cct gtg ctg atc ctc864Lys Asp Gly Val Pro Leu Pro Leu Pro Pro Ser Pro Val Leu Ile Leu275 280 285
cct gag ata ggg cct cag gac cag gga acc tac agc tgt gtg gcc acc 912Pro Glu Ile Gly Pro Gln Asp Gln Gly Thr Tyr Ser Cys Val Ala Thr290 295 300cat tcc agc cac ggg ccc cag gaa agc cgt gct gtc agc atc agc atc 960His Ser Ser His Gly Pro Gln Glu Ser Arg Ala Val Ser Ile Ser Ile305 310 315 320atc gaa cca ggc gag gag ggg cca act gca ggc tct gtg gga gga tca 1008Ile Glu Pro Gly Glu Glu Gly Pro Thr Ala Gly Ser Val Gly Gly Ser325 330 335ggg ctg gga act cta gcc ctg gcc ctg ggg atc ctg gga ggc ctg ggg 1056Gly Leu Gly Thr Leu Ala Leu Ala Leu Gly Ile Leu Gly Gly Leu Gly340 345 350aca gcc gcc ctg ctc att ggg gtc atc ttg tgg caa agg cgg caa cgc 1104Thr Ala Ala Leu Leu Ile Gly Val Ile Leu Trp Gln Arg Arg Gln Arg355 360 365cga gga gag gag agg aag gcc cca gaa aac cag gag gaa gag gag gag 1152Arg Gly Glu Glu Arg Lys Ala Pro Glu Asn Gln Glu Glu Glu Glu Glu370 375 380cgt gca gaa ctg aat cag tcg gag gaa cct gag gca ggc gag agt agt 1200Arg Ala Glu Leu Asn Gln Ser Glu Glu Pro Glu Ala Gly Glu Ser Ser385 390 395 400act gga ggg cct tga ggggcccaca gacagatccc atccatcagc tcccttttct 1255Thr Gly Gly Prottttcccttg aactgttctg gcctcagacc aactctctcc tgtataatct ctctcctgta1315taaccccacc ttgccaagct ttcttctaca accagagccc cccacaatga tgattaaaca1375cctgacacat cttgca1391<210>3<211>3991<212>DNA
<213>小鼠(Mus musculus)<220>
<221>CDS<222>(185)..(3619)<223>
<400>3aggccccacg ggacacagtg tcactggttt gaaacttctc agccaccttg gtgaagggac 60tgagctgtta gagacacttc tgaggctcct cacgcttggg tcttgttcac tccacggagt120agcctagtca actgcaagag aacggagaac gttggatttg gagcagaagt gcaaagtctc180agac atg gct tgc ccc tgg aag ttt ctc ttc aaa gtc aaa tcc tac caa 229Met Ala Cys Pro Trp Lys Phe Leu Phe Lys Val Lys Ser Tyr Gln1 5 10 15agt gac ctg aaa gag gaa aag gac att aac aac aac gtg aag aaa acc 277Ser Asp Leu Lys Glu Glu Lys Asp Ile Asn Asn Asn Val Lys Lys Thr20 25 30cct tgt gct gtt ctc agc cca aca ata caa gat gac cct aag agt cac 325Pro Cys Ala Val Leu Ser Pro Thr Ile Gln Asp Asp Pro Lys Ser His35 40 45caa aat ggc tcc ccg cag ctc ctc act ggg aca gca cag aat gtt cca 373Gln Asn Gly Ser Pro Gln Leu Leu Thr Gly Thr Ala Gln Asn Val Pro50 55 60gaa tcc ctg gac aag ctg cat gtg aca tcg acc cgt cca cag tat gtg 421Glu Ser Leu Asp Lys Leu His Val Thr Ser Thr Arg Pro Gln Tyr Val65 70 75agg atc aaa aac tgg ggc agt gga gag att ttg cat gac act ctt cac 469Arg Ile Lys Asn Trp Gly Ser Gly Glu Ile Leu His Asp Thr Leu His80 85 90 95cac aag gcc aca tcg gat ttc act tgc aag tcc aag tct tgc ttg ggg 517His Lys Ala Thr Ser Asp Phe Thr Cys Lys Ser Lys Ser Cys Leu Gly100 105 110
tcc atc atg aac ccc aag agt ttg acc aga gga ccc aga gac aag cct565Ser Ile Met Asn Pro Lys Ser Leu Thr Arg Gly Pro Arg Asp Lys Pro115 120 125acc cct ctg gag gag ctc ctg cct cat gcc att gag ttc atc aac cag613Thr Pro Leu Glu Glu Leu Leu Pro His Ala Ile Glu Phe Ile Asn Gln130 135 140tat tat ggc tcc ttt aaa gag gca aaa ata gag gaa cat ctg gcc agg661Tyr Tyr Gly Ser Phe Lys Glu Ala Lys Ile Glu Glu His Leu Ala Arg145 150 155ctg gaa gct gta aca aag gaa ata gaa aca aca gga acc tac cag ctc709Leu Glu Ala Val Thr Lys Glu Ile Glu Thr Thr Gly Thr Tyr Gln Leu160 165 170 175act ctg gat gag ctc atc ttt gcc acc aag atg gcc tgg agg aat gcc757Thr Leu Asp Glu Leu Ile Phe Ala Thr Lys Met Ala Trp Arg Asn Ala180 185 190cct cgc tgc atc ggc agg atc cag tgg tcc aac ctg cag gtc ttt gac805Pro Arg Cys Ile Gly Arg Ile Gln Trp Ser Asn Leu Gln Val Phe Asp195 200 205gct cgg aac tgt agc aca gca cag gaa atg ttt cag cac atc tgc aga853Ala Arg Asn Cys Ser Thr Ala Gln Glu Met Phe Gln His Ile Cys Arg210 215 220cac ata ctt tat gcc acc aac aat ggc aac atc agg tcg gcc atc act901His Ile Leu Tyr Ala Thr Asn Asn Gly Asn Ile Arg Ser Ala Ile Thr225 230 235gtg ttc ccc cag cgg agt gac ggc aaa cat gac ttc agg ctc tgg aat949Val Phe Pro Gln Arg Ser Asp Gly Lys His Asp Phe Arg Leu Trp Asn240 245 250 255tca cag ctc atc cgg tac gct ggc tac cag atg ccc gat ggc acc atc997Ser Gln Leu Ile Arg Tyr Ala Gly Tyr Gln Met Pro Asp Gly Thr Ile260 265 270
aga ggg gat gct gcc acc ttg gag ttc acc cag ttg tgc atc gac cta1045Arg Gly Asp Ala Ala Thr Leu Glu Phe Thr Gln Leu Cys Ile Asp Leu275 280 285ggc tgg aag ccc cgc tat ggc cgc ttt gat gtg ctg cct ctg gtc ttg1093Gly Trp Lys Pro Arg Tyr Gly Arg Phe Asp Val Leu Pro Leu Val Leu290 295 300caa gct gat ggt caa gat cca gag gtc ttt gaa atc cct cct gat ctt1141Gln Ala Asp Gly Gln Asp Pro Glu Val Phe Glu Ile Pro Pro Asp Leu305 310 315gtg ttg gag gtg acc atg gag cat ccc aag tac gag tgg ttc cag gag1189Val Leu Glu Val Thr Met Glu His Pro Lys Tyr Glu Trp Phe Gln Glu320 325 330 335ctc ggg ttg aag tgg tat gca ctg cct gcc gtg gcc aac atg cta ctg1237Leu Gly Leu Lys Trp Tyr Ala Leu Pro Ala Val Ala Asn Met Leu Leu340 345 350gag gtg ggt ggc ctc gaa ttc cca gcc tgc ccc ttc aat ggt tgg tac1285Glu Val Gly Gly Leu Glu Phe Pro Ala Cys Pro Phe Asn Gly Trp Tyr355 360 365atg ggc acc gag att gga gtt cga gac ttc tgt gac aca cag cgc tac1333Met Gly Thr Glu Ile Gly Val Arg Asp Phe Cys Asp Thr Gln Arg Tyr370 375 380aac atc ctg gag gaa gtg ggc cga agg atg ggc ctg gag acc cac aca1381Asn Ile Leu Glu Glu Val Gly Arg Arg Met Gly Leu Glu Thr His Thr385 390 395ctg gcc tcc ctc tgg aaa gac cgg gct gtc acg gag atc aat gtg gct1429Leu Ala Ser Leu Trp Lys Asp Arg Ala Val Thr Glu Ile Asn Val Ala400 405 410 415gtg ctc cat agt ttc cag aag cag aat gtg acc atc atg gac cac cac1477Val Leu His Ser Phe Gln Lys Gln Asn Val Thr Ile Met Asp His His420 425 430
aca gcc tca gag tcc ttc atg aag cac atg cag aat gag tac cgg gcc1525Thr Ala Ser Glu Ser Phe Met Lys His Met Gln Asn Glu Tyr Arg Ala435 440 445cgt gga ggc tgc ccg gca gac tgg att tgg ctg gtc cct cca gtg tct1573Arg Gly Gly Cys Pro Ala Asp Trp Ile Trp Leu Val Pro Pro Val Ser450 455 460ggg agc atc acc cct gtg ttc cac cag gag atg ttg aac tat gtc cta1621Gly Ser Ile Thr Pro Val Phe His Gln Glu Met Leu Asn Tyr Val Leu465 470 475tct cca ttc tac tac tac cag atc gag ccc tgg aag acc cac atc tgg1669Ser Pro Phe Tyr Tyr Tyr Gln Ile Glu Pro Trp Lys Thr His Ile Trp480 485 490 495cag aat gag aag ctg agg ccc agg agg aga gag atc cga ttt aga gtc1717Gln Asn Glu Lys Leu Arg Pro Arg Arg Arg Glu Ile Arg Phe Arg Val500 505 510ttg gtg aaa gtg gtg ttc ttt gct tcc atg cta atg cga aag gtc atg1765Leu Val Lys Val Val Phe Phe Ala Ser Met Leu Met Arg Lys Val Met515 520 525gct tca cgg gtc aga gcc aca gtc ctc ttt gct act gag aca ggg aag1813Ala Ser Arg Val Arg Ala Thr Val Leu Phe Ala Thr Glu Thr Gly Lys530 535 540tct gaa gca cta gcc agg gac ctg gcc acc ttg ttc agc tac gcc ttc1861Ser Glu Ala Leu Ala Arg Asp Leu Ala Thr Leu Phe Ser Tyr Ala Phe545 550 555aac acc aag gtt gtc tgc atg gac cag tat aag gca agc acc ttg gaa1909Asn Thr Lys Val Val Cys Met Asp Gln Tyr Lys Ala Ser Thr Leu Glu560 565 570 575gag gag caa cta ctg ctg gtg gtg aca agc aca ttt ggg aat gga gac1957Glu Glu Gln Leu Leu Leu Val Val Thr Ser Thr Phe Gly Asn Gly Asp580 585 590
tgt ccc agc aat ggg cag act ctg aag aaa tct ctg ttc atg ctt aga2005Cys Pro Ser Asn Gly Gln Thr Leu Lys Lys Ser Leu Phe Met Leu Arg595 600 605gaa ctc aac cac acc ttc agg tat gct gtg ttt ggc ctt ggc tcc agc2053Glu Leu Asn His Thr Phe Arg Tyr Ala Val Phe Gly Leu Gly Ser Ser610 615 620atg tac cct cag ttc tgc gcc ttt gct cat gac atc gac cag aag ctg2101Met Tyr Pro Gln Phe Cys Ala Phe Ala His Asp Ile Asp Gln Lys Leu625 630 635tcc cac ctg gga gcc tct cag ctt gcc cca aca gga gaa ggg gac gaa2149Ser His Leu Gly Ala Ser Gln Leu Ala Pro Thr Gly Glu Gly Asp Glu640 645 650 655ctc agt ggg cag gag gat gcc ttc cgc agc tgg gct gta caa acc ttc2197Leu Ser Gly Gln Glu Asp Ala Phe Arg Ser Trp Ala Val Gln Thr Phe660 665 670cgg gca gcc tgt gag acc ttt gat gtc cga agc aaa cat cac att cag2245Arg Ala Ala Cys Glu Thr Phe Asp Val Arg Ser Lys His His Ile Gln675 680 685atc ccg aaa cgc ttc act tcc aat gca aca tgg gag cca cag caa tat2293Ile Pro Lys Arg Phe Thr Ser Asn Ala Thr Trp Glu Pro Gln Gln Tyr690 695 700agg ctc atc cag agc ccg gag cct tta gac ctc aac aga gcc ctc agc2341Arg Leu Ile Gln Ser Pro Glu Pro Leu Asp Leu Asn Arg Ala Leu Ser705 710 715agc atc cat gca aag aac gtg ttt acc atg agg ctg aaa tcc cag cag2389Ser Ile His Ala Lys Asn Val Phe Thr Met Arg Leu Lys Ser Gln Gln720 725 730 735aat ctg cag agt gaa aag tcc agc cgc acc acc ctc ctc gtt cag ctc2437Asn Leu Gln Ser Glu Lys Ser Ser Arg Thr Thr Leu Leu Val Gln Leu740 745 750
acc ttc gag ggc agc cga ggg ccc agc tac ctg cct ggg gaa cac ctg2485Thr Phe Glu Gly Ser Arg Gly Pro Ser Tyr Leu Pro Gly Glu His Leu755 760 765ggg atc ttc cca ggc aac cag acc gcc ctg gtg cag gga atc ttg gag2533Gly Ile Phe Pro Gly Asn Gln Thr Ala Leu Val Gln Gly Ile Leu Glu770 775 780cga gtt gtg gat tgt cct aca cca cac caa act gtg tgc ctg gag gtt2581Arg Val Val Asp Cys Pro Thr Pro His Gln Thr Val Cys Leu Glu Val785 790 795ctg gat gag agc ggc agc tac tgg gtc aaa gac aag agg ctg ccc ccc2629Leu Asp Glu Ser Gly Ser Tyr Trp Val Lys Asp Lys Arg Leu Pro Pro800 805 810 815tgc tca ctc agc caa gcc ctc acc tac ttc ctg gac att acg acc cct2677Cys Ser Leu Ser Gln Ala Leu Thr Tyr Phe Leu Asp Ile Thr Thr Pro820 825 830ccc acc cag ctg cag ctc cac aag ctg gct cgc ttt gcc acg gac gag2725Pro Thr Gln Leu Gln Leu His Lys Leu Ala Arg Phe Ala Thr Asp Glu835 840 845acg gat agg cag aga ttg gag gcc ttg tgt cag ccc tca gag tac aat2773Thr Asp Arg Gln Arg Leu Glu Ala Leu Cys Gln Pro Ser Glu Tyr Asn850 855 860gac tgg aag ttc agc aac aac ccc acg ttc ctg gag gtg ctt gaa gag2821Asp Trp Lys Phe Ser Asn Asn Pro Thr Phe Leu Glu Val Leu Glu Glu865 870 875ttc cct tcc ttg cat gtg ccc gct gcc ttc ctg ctg tcg cag ctc cct2869Phe Pro Ser Leu His Val Pro Ala Ala Phe Leu Leu Ser Gln Leu Pro880 885 890 895atc ttg aag ccc cgc tac tac tcc atc agc tcc tcc cag gac cac acc2917Ile Leu Lys Pro Arg Tyr Tyr Ser Ile Ser Ser Ser Gln Asp His Thr900 905 910
ccc tcg gag gtt cac ctc act gtg gcc gtg gtc acc tac cgc acc cga2965Pro Ser Glu Val His Leu Thr Val Ala Val Val Thr Tyr Arg Thr Arg915 920 925gat ggt cag ggt ccc ctg cac cat ggt gtc tgc agc act tgg atc agg3013Asp Gly Gln Gly Pro Leu His His Gly Val Cys Ser Thr Trp Ile Arg930 935 940aac ctg aag ccc cag gac cca gtg ccc tgc ttt gtg cga agt gtc agt3061Asn Leu Lys Pro Gln Asp Pro Val Pro Cys Phe Val Arg Ser Val Ser945 950 955ggc ttc cag ctc cct gag gac ccc tcc cag cct tgc atc ctc att ggg3109Gly Phe Gln Leu Pro Glu Asp Pro Ser Gln Pro Cys Ile Leu Ile Gly960 965 970 975cct ggt acg ggc att gct ccc ttc cga agt ttc tgg cag cag cgg ctc3157Pro Gly Thr Gly Ile Ala Pro Phe Arg Ser Phe Trp Gln Gln Arg Leu980 985 990cat gac tcc cag cac aaa ggg ctc aaa gga ggc cgc atg agc ttg gtg 3205His Asp Ser Gln His Lys Gly Leu Lys Gly Gly Arg Met Ser Leu Val995 1000 1005ttt ggg tgc cgg cac ccg gag gag gac cac ctc tat cag gaa gaa 3250Phe Gly Cys Arg His Pro Glu Glu Asp His Leu Tyr Gln Glu Glu1010 1015 1020atg cag gag atg gtc cgc aag aga gtg ctg ttc cag gtg cac aca 3295Met Gln Glu Met Val Arg Lys Arg Val Leu Phe Gln Val His Thr1025 1030 1035ggc tac tcc cgg ctg ccc ggc aaa ccc aag gtc tac gtt cag gac 3340Gly Tyr Ser Arg Leu Pro Gly Lys Pro Lys Val Tyr Val Gln Asp1040 1045 1050atc ctg caa aag cag ctg gcc aat gag gta ctc agc gtg ctc cac 3385Ile Leu Gln Lys Gln Leu Ala Asn Glu Val Leu Ser Val Leu His1055 1060 1065
ggg gag cag ggc cac ctc tac att tgc gga gat gtg cgc atg gct 3430Gly Glu Gln Gly His Leu Tyr Ile Cys Gly Asp Val Arg Met Ala1070 1075 1080cgg gat gtg gct acc aca ttg aag aag ctg gtg gcc acc aag ctg 3475Arg Asp Val Ala Thr Thr Leu Lys Lys Leu Val Ala Thr Lys Leu1085 1090 1095aac ttg agc gag gag cag gtg gaa gac tat ttc ttc cag ctc aag 3520Asn Leu Ser Glu Glu Gln Val Glu Asp Tyr Phe Phe Gln Leu Lys1100 1105 1110agc cag aaa cgt tat cat gaa gat atc ttc ggt gca gtc ttt tcc 3565Ser Gln Lys Arg Tyr His Glu Asp Ile Phe Gly Ala Val Phe Ser1115 1120 1125tat ggg gca aaa aag ggc agc gcc ttg gag gag ccc aaa gcc acg 3610Tyr Gly Ala Lys Lys Gly Ser Ala Leu Glu Glu Pro Lys Ala Thr1130 1135 1140agg ctc tga cagcccagag ttccagcttc tggcactgag taaagataat 3659Arg Leuggtgaggggc ttggggagac agcgaaatgc aacccccccc aagcccctca tgtcattccc3719ccctcctcca ccctaccaag tagtattgta ctattgtgga ctactaaatc tctctcctct3779cctccctccc ctctctccct ttcctccctt cttctccact ccccagctcc ctccttctcc3839ttctcctcct ttgcctctca ctcttccttg gagctgagag cagagaaaaa ctcaacctcc3899tgactgaagc actttgggtg accaccagga ggcaccatgc cgccgctcta atacttagct3959gcactatgta cagatattta tacttcatat tt 3991<210>4<211>20<212>DNA<213>人工的
<220>
<223>人工合成引物序列<400>4cttctggcgt gtgaccggcg 20<210>5<211>34<212>DNA<213>人工的<220>
<223>人工合成引物序列<400>5atcgaattct gagatcataa tccctgtggg atgc 34<210>6<211>17<212>DNA<213>人工的<220>
<223>人工合成引物序列<400>6agggacggag aaggagt 17<210>7<211>17<212>DNA<213>人工的<220>
<223>人工合成引物序列<400>7tcaccccaca gactgag 17
<210>8<211>26<212>DNA<213>人工的<220>
<223>人工合成引物序列<400>8gtgggctatg ggtttgtgga aggaga26<210>9<211>20<212>DNA<213>人工的<220>
<223>人工合成引物序列<400>9cgatgtcaca tgcagcttgt 20
权利要求
1.一种疾病模型动物，其表达megsin基因、编码晚期糖基化终产物受体的基因以及诱导型一氧化氮合酶基因，其中该模型动物包括非人类哺乳动物。
2.权利要求1的疾病模型动物，其导入有megsin基因、编码晚期糖基化终产物受体的基因以及诱导型一氧化氮合酶基因。
3.权利要求1或2的疾病模型动物，表现出至少一种选自下列表型(a)-(f)的表型(a)肾/身体重量比增加；(b)尿白蛋白水平增加；(c)血甘油三酯水平增加；(d)体重过轻(发育不全)；(e)高血糖症；(f)低胰岛素血症；和(g)尿8-OHdG水平增加。
4.权利要求1或2的疾病模型动物，其肾小球系膜基质中表现出至少一种下列检测结果(a)肾小球系膜基质扩张；(b)免疫球蛋白和/或补体沉积的增强；和(c)胶原蛋白、层粘连蛋白和/或纤连蛋白的增加。
5.权利要求1或2的疾病模型动物，其在肾小管间质组织中表现出表型(a)纤维变性；和/或(b)炎性细胞浸润。
6.权利要求1-5中任一项的疾病模型动物，其中megsin基因、编码晚期糖基化终产物受体的基因以及诱导型一氧化氮合酶基因来自人类。
7.权利要求1-6中任一项的疾病模型动物，其中所述疾病为糖尿病性肾病。
8.一种创建疾病模型动物的方法，包括将megsin基因、编码晚期糖基化终产物受体的基因以及诱导型一氧化氮合酶基因导入非人类哺乳动物受精卵的步骤，其中该疾病模型动物包括非人类哺乳动物，在该非人类哺乳动物中该megsin基因、编码晚期糖基化终产物受体的基因以及诱导型一氧化氮合酶基因的表达增强了。
9.一种评估测试化合物对肾机能障碍疗效的方法，包括步骤(1)对权利要求1-7中任一项的疾病模型动物给服测试化合物；和(2)检测给服该测试化合物的该疾病模型动物肾机能障碍的缓解效果。
10.一种评估测试化合物对肾机能障碍疗效的方法，包括步骤(1)对权利要求1-7中任一项的疾病模型动物给服测试化合物；和(2)在给服该测试化合物后，测定该疾病模型动物中肾/身体重量比、尿白蛋白水平、血甘油三酯水平和尿8-OHdG水平中的至少任一个。
11.一种评估测试化合物对肾机能障碍疗效的方法，包括步骤(1)对权利要求1-7中任一项的疾病模型动物给服测试化合物；和(2)在给服该测试化合物后测定该疾病模型动物的肾小球系膜基质是否改变或该改变是否减小。
12.权利要求11的方法，其中肾小球系膜基质的改变至少是以下之一(a)肾小球系膜基质扩张；(b)免疫球蛋白和/或补体沉积的增强；和(c)胶原蛋白、层粘连蛋白和/或纤连蛋白的增加。
13.一种评估测试化合物对肾机能障碍疗效的方法，包括步骤(1)对权利要求1-7中任一项的疾病模型动物给服测试化合物；和(2)在给服该测试化合物后测定该疾病模型动物的肾小管间质组织是否改变或该改变是否减小。
14.权利要求13的方法，其中肾小管间质组织的改变是(a)纤维变性；和/或(b)炎性细胞浸润。
15.权利要求9-14中任一项的方法，其中肾机能障碍是伴发高血糖症的肾机能障碍。
16.一种评估测试化合物对高血糖症疗效的方法，包括步骤(1)对权利要求1-7中任一项的疾病模型动物给服测试化合物；和(2)在给服该测试化合物后测定该疾病模型动物中葡萄糖或/胰岛素水平。
全文摘要
本发明通过杂交megsin－Tg和RAGE/iNOS－Tg创建三Tg(megsin/RAGE/iNOS－Tg)。该megsin/RAGE/iNOS－Tg在早期发展为在常规模型中未曾见的显著的糖尿病性肾病病理，并在megsin/RAGE/iNOS－Tg小鼠中同样观察到了多种病理症状(如肾小球肥大)。此外，也发现表现出这些症状的动物可用作糖尿病性肾病的疾病模型动物。具体地说，本发明的疾病模型动物强烈表达megsin基因、编码晚期糖基化终产物受体的基因以及诱导型一氧化氮合酶基因。结果，在早期显现出肾小球衰竭的伴肾机能障碍。
文档编号C12N15/09GK1913774SQ20048004146
公开日2007年2月14日 申请日期2004年12月9日 优先权日2003年12月12日
发明者宫田敏男, 黑川清, 山本博, 冈本宏 申请人:独立行政法人科学技术振兴机构, 株式会社基因课题