专利名称：编码α 1，6－甘露糖基转移酶的新的多形汉逊氏酵母基因和用同一基因有缺陷的多形汉 ...的制作方法
技术领域：
本发明涉及编码起始外链延伸的α-1，6-甘露糖基转移酶的多形汉逊氏酵母(Hansenula polymorpha)新基因、该基因有缺陷的多形汉逊氏酵母突变株、和使用这种突变株生产重组糖蛋白的方法。
背景技术：
在大规模表达治疗性蛋白时，根据宿主细胞或靶蛋白的特征，靶蛋白在表达水平、水溶性、表达部位、修饰等方面可能有差异。因此，必须选择靶蛋白的最适表达系统，以建立有效生产系统。
大多数治疗性蛋白是在通过内质网(ER)和高尔基体时，其中寡糖与天冬酰胺残基共价连接的糖蛋白(Jenkins et al.，Nat.Biotechnol.，14，975-9，1996)。糖部分的结构和类型大大影响糖蛋白的折叠、生物活性和在血清中的稳定性。因此，迄今为止，对于生产具有野生型糖部分和治疗活性的治疗性重组糖蛋白来说，最常使用的方法是使用动物细胞表达系统。然而，动物细胞培养系统有缺点，包括产量低、由于培养基昂贵造成的成本高、逆转录病毒污染和建立稳定细胞系所需时间长。因此，动物细胞培养系统在生产重组糖蛋白中应用有限。在这方面，已进行了许多尝试，使用酵母表达系.统作为动物细胞表达系统的替代选择来生产医学重要的重组糖蛋白，该系统是真核生物并共享高等动物细胞N-联糖基化途径的早期步骤。
真核生物如酵母具有高产量蛋白生产迅速、利用灭菌和生产条件很好控制、易于基因工程改造、没有被人或动物病原体感染的风险、和确保蛋白回收容易的优点。然而，在酵母中合成的完全型具有与靶生物如哺乳动物不同的糖部分，并因此可能在动物细胞中引起免疫反应。而且，这种高甘露糖型的酵母特异性外链糖基化，也表示为超糖基化，引起重组蛋白质产物的异质性，可能使蛋白纯化复杂或困难。此外，由于碳水化合物水平增加，酶的比活性可能降低(Bekkers et al.，Biochem.Biophy.Acta.1089，345-351，1991)。
为解决上述问题，需要将能产生糖蛋白的动物细胞糖基化途径导入酵母的糖工程(glycotechnology)，所述糖蛋白具有与来源于哺乳动物的糖蛋白相同的生物活性。
当重组糖蛋白在传统酵母—酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中表达时，一系列50至200个甘露糖残基添加至核心寡糖导致高甘露糖化(hypermannosylation)，以及在体内被视为抗原的α-1，3联末端(linked terminal)甘露糖的存在被视为使用酵母作为宿主生产糖蛋白的巨大限制(Dean，Biochim.Biophys.Acta.，1426，309-322，1999；Ballou，Methods Enzymol.，185，440-444，(1990))。相比之下，当重组糖蛋白在甲基营养酵母—多形汉逊氏酵母和巴斯德毕赤氏酵母(Pichia pastoris)中表达时，与天然形式相比，它们以高甘露糖化形式表达，但是甘露糖外链全长比酿酒酵母中表达的稍短(Kang et al.，Yeast 14，371-381，1998；Kim et al.，Glycobioloby，in press，2004；Bretthauer and Castellino，Biotechnol.Appl.Biochem.30，193-200，1999)。特别是，由于甲基营养酵母-多形汉逊氏酵母和巴斯德毕赤氏酵母中合成的糖链不含强免疫原性的α-1，3-联末端甘露糖(Kim et al.，Glycobioloby，in press，2004；Montesino et al.，Protein Expr.Purif.14，197-207，1998)，因此对于对人类具有治疗价值的糖蛋白的生产，认为甲基营养酵母是优于传统酵母-酿酒酵母的宿主系统。
在糖工程领域中进行了很多尝试，使用巴斯德毕赤氏酵母和酿酒酵母开发能够生产含人相容糖链的治疗性重组糖蛋白的宿主(Chiba et al.，J.Biol.Chem.，273，26298-26304，1998；Callewaert et al.，FEBS Lett.，503，173-178，2001；Choi etal.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，100，5022-5027，2003；Hamilton et al.，Science，301，1244-1246，2003)。例如，尝试了使用重组酿酒酵母生产糖蛋白，该糖蛋白中结合了包括人甘露糖型Man5GlcNAc2N-聚糖的中间体，该酵母是通过进一步基因操作三联酵母突变株(och1Δmnn1Δmnn4Δ)以在ER中表达哺乳动物α-1，2-甘露糖苷酶而获得的(Chiba et al.，J.Biol.Chem.，273，26298-26304，1998)。三联突变株剔除了三个基因在外链起始中起决定性作用的OCH1(Nakanishi-Shindo et al.，J.Biol.Chem.268，26338-26345，1993；美国专利5,705,616；美国专利5,798,226)；介导添加免疫原性的α-1，3-联末端甘露糖的MNN1(Gopal and Ballou，Proc.Natl.Acad.Sci.USA84，8824，(1987)；美国专利5,135,854)；和将磷酸酯添加至糖链的MNN4(Jigami andOdani，Biochim.Biophys.Acta.，1426，335-345，1999)。此外，根据最近的研究，(Choi et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，100，5022-5027，2003；Hamilton etal.，Science，301，1244-1246，2003)，为了将人糖基化途径导入已剔除介导外链起始的OCH1基因的突变株中(日本专利07145005；日本专利07150780；国际专利出版物WO 0200856 A2；国际专利出版物WO 0200879 A2)，在巴斯德毕赤氏酵母中进行宿主开发，通过将来源于真核生物的五种不同的酶导入分泌途径，以生产具有人复合型N-聚糖GlcNAc2Man3GlcNAc2的重组糖蛋白。然而，迄今为止，从糖工程的观点来看，很少尝试在甲基营养酵母-多形汉逊氏酵母中生产具有人型糖链的重组糖蛋白，该酵母作为表达治疗性重组蛋白的宿主得到普及，因为它已经用于生产肝炎疫苗。
如韩国专利申请号2002-37717中所述，本发明人在本发明前克隆了在多形汉逊氏酵母外链合成中起决定性作用的OCH1基因，建立了剔除OCH1基因的突变株(Hpoch1Δ)，并开发了利用这样一个突变株通过阻止高糖基化制备具有与天然形式接近的糖链结构的重组糖蛋白的方法。然而，在该已剔除OCH1基因的多形汉逊氏酵母的Hpoch1Δ突变株中，α-1，6-甘露糖键仍然起始外链糖基化。因此，需要寻找编码α-1，6-甘露糖基转移酶的基因和阻止上述人不相容糖基化途径。
发明内容
为了克服上述问题和使用甲基营养耐热酵母—广泛用作各种异源基因大量表达的宿主系统的多形汉逊氏酵母开发对人类具有治疗价值的重组糖蛋白的生产系统，本发明人基于已知的多形汉逊氏酵母基因组信息，克隆了多形汉逊氏酵母菌株DL-1中的新基因HpOCH2，确定了该新基因具有负责外链起始的α-1，6-甘露糖基转移酶活性，和开发了已剔除上述基因的突变株。然后，本发明人发现该突变株能阻止人不相容糖基化途径，和当异源糖链修饰的酶在突变株中表达时，能够产生具有人甘露糖型N-聚糖Man5GlcNAc2而不是酵母特异的N-聚糖的重组糖蛋白，因而引出了本发明。
附图简述由下列详细说明书结合附图将更清楚地理解本发明的上述和其它目的、特征和其它优点，其中
图1显示了多形汉逊氏酵母HpOCH2基因的核苷酸序列及其预测的氨基酸序列，其中带下划线的是跨膜区(transmembrane spanning region)，用粗体并带下划线的是相当于DXD元件的氨基酸序列；图2是多形汉逊氏酵母和其它酵母菌株的Och1蛋白类似物氨基酸序列的多重比对(HpOch2p多形汉逊氏酵母Och2蛋白；HpOch1p多形汉逊氏酵母Och1蛋白；CaOch1p白色念珠菌(Candida albicans)Och1蛋白；PpOch1p巴斯德毕赤氏酵母Och1蛋白；ScOch1p酿酒酵母Och1蛋白；和SpOch1p粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomycespombe)Och1蛋白)，其中插入的数字表示多形汉逊氏酵母HpOch2p和其它酵母菌株的Och1p类似物之间的氨基酸同一性；图3是通过体内DNA重组诱导多形汉逊氏酵母HpoCH2基因剔除的图；图4显示了多形汉逊氏酵母Hpoch2Δ突变株的生长特性，其中到达指数期的多形汉逊氏酵母野生型和两个突变株Hpoch1Δand Hpoch2Δ的培养物(OD600＝1)被连续稀释10倍，和3μl每种稀释物点滴在YPD培养基上并培养两天(AYPD培养基，在37℃；BYPD培养基，在45℃；C补充40μg/ml潮霉素B的YPD培养基；D补充0.4％脱氧胆酸钠的YPD培养基；和E补充7μg/ml荧光增白剂(Calcofluor white)的YPD培养基)；图5显示了与多形汉逊氏酵母Hpoch2Δ突变株中表达的葡萄糖氧化酶(GOD)结合的糖链大小分布和结构的HPLC分析结果，其中左组(A、B和C)和右组(D、E和F)代表分别在多形汉逊氏酵母野生型和Hpoch2Δ突变体中表达的GOD结合的糖链的结果(A和D与GOD结合的糖链谱；B和Eα-1，2-甘露糖苷酶处理后的糖链谱；和C和Fα-1，6-甘露糖苷酶随后处理后的糖链谱)，和用箭头指出已知大小和结构的标准寡糖的保留时间(M5Man5GlcNAc2-PA；M6Man6GlcNAc2-PA；M8Man8GlcNAc2-PA；和M11Man11GlcNAc2-PA)；图6显示了通过导入HpOCH2基因，酿酒酵母och1Δ突变体功能代偿的试验结果(1对照载体YEp352GAPII转化的野生型酿酒酵母；2对照载体转化的酿酒酵母och1Δ突变株(Scoch1Δ)；和3、4和5分别用HpOCH1基因表达载体YEp352GAPII-HpOCH1(3)、HpOCH2基因表达载体YEp352GAPII-HpOCH2(4)和ScOCH1基因表达载体YEp352GAPII-ScOCH1(5)转化的Soch1Δ突变株，其中到达指数期的酵母培养物(OD600＝1)被连续稀释10倍，和3μl每种稀释物点滴在YPD板上并在25℃和30℃培养三天(图6的A)和通过活性染色检测每个转化体中表达的转化酶的糖基化(图6的B)；图7显示了测定HpOch2蛋白的α-1，6-甘露糖基转移酶活性的试验结果，其中酿酒酵母och1Δmnn1Δmnn4Δ突变株被对照载体YEp352GAPII(A)、HpOCH2基因表达载体YEp352GAPII-HpOCH2(B)或ScOCH1基因表达载体YEp352GAPII-ScOCH1(C)转化，和从突变株获得的膜部分与Man8GlcNAc2-PA在30℃反应两小时，接着用HPLC分析；图8显示了与多形汉逊氏酵母菌株中表达的GOD结合的糖链大小分布和结构的HPLC分析结果(A和D分别在多形汉逊氏酵母野生型和Hpoch2Δ突变株中以分泌形式表达的GOD的糖链谱；B和E分别在多形汉逊氏酵母野生型和Hpoch2Δ突变株中表达的GOD的糖链谱，其中Hpoch2Δ突变株被基因改造以表达来自斋藤曲霉(Aspergillussaitoi)的α-1，2-甘露糖苷酶；和C和F用α-1，2-甘露糖苷酶处理分别来自重组野生型和突变株的糖链后的糖链谱)；和图9显示了酿酒酵母和多形汉逊氏酵母的Och1蛋白同源物之间的氨基酸序列同一性和相似性。
发明最佳实施方式在真核生物中，蛋白N-糖基化发生于内质网(ER)，在那里，N-联寡糖(Glc3Man9GlcNAc2，)转移至新生蛋白的合适天冬酰胺残基。从Glc3Man9GlcNAc2，三个葡萄糖残基和一个特异的α-1，2-联甘露糖残基被ER中的特异的葡糖苷酶和α-1，2-甘露糖苷酶除去，产生核心寡糖结构-Man8GlcNAc2。具有这个核心糖结构的蛋白被转运到高尔基体，在那里糖部分经历各种特异酶的各种修饰。在酵母中，高尔基体中糖链的修饰包括由不同甘露糖基转移酶催化的一系列甘露糖残基的添加。外链糖基化作用的结构对于生物是特异性的，典型地在酿酒酵母中具有50个以上的甘露糖残基。
本发明人基于已知的多形汉逊氏酵母基因组信息，在多形汉逊氏酵母DL-1菌株中克隆了HpOCH2基因，并鉴定了上述基因具有负责外链起始的α-1，6-甘露糖基转移酶活性。被鉴定的基因具有表示为SEQ ID NO.1的核苷酸序列和其相应表示为SEQ ID NO.2的氨基酸序列。
在一个方面，本发明提供了编码表示为SEQ ID NO.2的蛋白的DNA基因。此外，本发明提供了编码与前述DNA具有75％或更高同源性的蛋白质且编码具有α-1，6-甘露糖基转移酶活性的蛋白的DNA基因。优选，本发明提供了具有表示为SEQ ID NO.1的DNA序列的基因、其类似物或其片段。
本发明中用于来源于多形汉逊氏酵母的α-1，6-甘露糖基转移酶基因的术语“同源性”是用来指出与野生型核苷酸序列的相似度，并包括与编码α-1，6-甘露糖基转移酶的DNA序列具有优选75％或更高、更优选85％或更高、和最优选90％或更高同一性的DNA序列。这种同源性比较可以人工或通过使用市场上可买到的比较程序来进行。市场上可买到的计算机程序可以用百分比表示两个或更多序列之间的同源性，和计算邻近序列的同源性(％)。
本发明人在GenBank中登记了上述基因，登录号为AY502025，并保藏了含有该基因的重组载体pBS-HpOCH2/大肠杆菌DH5@，于2004年1月15日保藏在KCTC(韩国典型培养物保藏中心(Korean Collection for Type Cultures)；KRIBB，韩国大田宇松区欧洞52，Oun-dong，Yusong-ku，Taejon，Korea)，保藏号为KCTC 10583BP。
因此，在另一个方面，本发明提供了包含基因的重组载体，该基因是编码表示为SEQ ID NO.2的蛋白的DNA或与前述DNA具有90％或更高同源性且编码具有α-1，6-甘露糖基转移酶活性的蛋白的DNA。重组载体优选包含表示为SEQ ID NO.1的DNA基因。在又一方面，本发明提供了该重组载体转化的宿主细胞，和优选，提供了以保藏号KCTC 10583BP保藏的转化宿主细胞。
为了在酵母中生产具有哺乳动物型糖链的糖蛋白，应当建立一种酵母突变株，该酵母突变株缺乏在酵母外链生物合成中所涉及的酶家族。这种突变株可以通过基因突变，如使用试剂、紫外线照射或自发突变或通过人工剔除目标基因而获得。在本发明中，通过基因工程方法，也就是说通过聚合酶链式反应和体内DNA重组联合剔除编码在外链起始中起决定性作用的α-1，6-甘露糖基转移酶的基因(Och2)。
本发明人确立了一种多形汉逊氏酵母Hpoch2Δ突变株(多形汉逊氏酵母DL-1och2Δ)，其中如上所述鉴定的α-1，6-甘露糖基转移酶基因缺失，并发现在该突变株中，α-1，6-甘露糖残基的酵母特异的连续添加被阻止，因此高糖基化作用显著减少。该突变株于2004年1月15日保藏在KCTC(韩国典型培养物保藏中心；KRIBB，韩国大田宇松区欧洞52)，保藏号为KCTC 10584BP。
因此，在又一个方面，本发明提供了以保藏号KCTC 10584BP保藏的多形汉逊氏酵母Hpoch2Δ突变株(多形汉逊氏酵母DL-1och2Δ)。
从ER转运来的糖蛋白上大多数N-聚糖具有Man8GlcNAc2糖链结构。蛋白从ER转运至高尔基体之后，另外的甘露糖残基被不同的甘露糖基转移酶添加至蛋白，产生具有很多甘露糖糖链的糖蛋白。高糖基化作用在重组糖蛋白中是不合需要的。使用本发明制备的多形汉逊氏酵母突变株作为表达重组蛋白的宿主细胞可以减少这种高糖基化作用。此外，当用能够表达具有在糖链修饰中所涉及的酶活性的一个或多个蛋白的表达载体转化多形汉逊氏酵母突变株时，可以更有效抑制高糖基化作用或被转化为具有不同结构的糖链。在减少这种高糖基化作用中所涉及到的糖链修饰酶包括α-1，2-甘露糖苷酶、甘露糖苷酶IA、甘露糖苷酶IB、甘露糖苷酶IC、甘露糖苷酶II、N-乙酰葡萄糖胺转移酶I、N-乙酰葡萄糖胺转移酶II、半乳糖转移酶、唾液酸转移酶和岩藻糖基转移酶。然而，本发明不限于上述实例，并且也可以使用能够导致重组糖蛋白高糖基化减少和修饰的各种基因。在本发明的一个实施方案中，当α-1，2-甘露糖苷酶在多形汉逊氏酵母Hpoch2Δ突变株中表达时，产生了阻止酵母型N-聚糖形成并将其修饰为人型N-聚糖的重组糖蛋白。α-1，2-甘露糖苷酶除去了Man8GlcNAc2非还原末端的α-1，2联甘露糖残基并将这个糖蛋白上的核心糖链转变为Man5GlcNAc2。Man5GlcNAc2结构是位于高尔基体甘露糖基转移酶的次级底物，产生甘露糖含量减少的糖蛋白。转化中使用的表达载体中包含的糖链修饰酶基因可以是编码这种酶的全基因序列或编码该酶功能区的片段序列。该表达载体包括整合型(integrative)或诱导型启动子和3’终止序列，和可以是整合型或复制型载体。
因此，仍在另一个方面，本发明提供了进一步包含表达糖链修饰酶的表达载体的多形汉逊氏酵母突变株。优选，糖链修饰酶选自包括α-1，2-甘露糖苷酶、甘露糖苷酶IA、甘露糖苷酶IB、甘露糖苷酶IC、甘露糖苷酶II、N-乙酰葡萄糖胺转移酶I、N-乙酰葡萄糖胺转移酶II、半乳糖转移酶、唾液酸转移酶和岩藻糖基转移酶。
仍在另一个方面，本发明提供了使用以保藏号KCTC10584BP保藏的多形汉逊氏酵母突变株生产糖基化作用减少的重组糖蛋白的方法。
根据如上所述的方法，可以以阻止酵母型N-聚糖形成和将酵母型N-聚糖修饰为人型N-聚糖的方式生产重组糖蛋白。
在此使用的术语“糖蛋白”是指当在甲基营养酵母，尤其是多形汉逊氏酵母中表达时，在一个或多个天冬酰胺或一个或多个丝氨酸或苏氨酸残基上被糖基化，或在天冬酰胺和丝氨酸或苏氨酸残基上被糖基化的蛋白。在此使用的术语“糖基化减少”意思是当糖蛋白在甲基营养酵母菌株中表达时，与在野生型甲基营养酵母中表达的情况相比，它的碳水化合物部分大小减少，尤其是甘露糖残基减少。
在上述方法中，导入多形汉逊氏酵母Hpcho2Δ的突变株的糖蛋白表达载体优选表达糖链修饰酶如α-1，2-甘露糖苷酶和糖蛋白。
可以用本领域常用的方法纯化产生的糖蛋白，和可以根据待纯化特定蛋白的性质决定纯化方案。认为这种决定是本领域技术人员的普通技能。例如，可以用典型的分离技术纯化目标蛋白，如沉淀、免疫吸附、分馏或各种层析法。
根据本发明能够生产的糖蛋白可以示例如下细胞因子(例如干扰素-α、干扰素-β、干扰素-γ、G-CSF等)、凝血因子(例如因子VIII、因子IX、人C蛋白)、内皮生长因子、生长激素释放因子、青霉菌属(Penicillium minioluteum)葡聚糖酶、解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)α-淀粉酶、酿酒酵母天冬氨酸蛋白酶、酿酒酵母转化酶、克氏锥虫(Typanosoma cruzi)唾液酸转移酶(trans-sialidase)、HIV包膜蛋白、流感病毒A血细胞凝集素、流感神经氨酸苷酶、牛肠激酶活化剂、牛疱疹病毒1型糖蛋白D、人血管抑制素、人B7-1、B7-2和B-7受体CTLA-4、人组织因子、生长因子(例如血小板衍生生长因子)、人α-抗胰蛋白酶、人红细胞生成素、组织纤溶酶原激活物、纤溶酶原激活物抑制剂-1、尿激酶、α-半乳糖苷酶、纤溶酶原、凝血酶和免疫球蛋白。
仍在另一个方面，本发明提供了用上述方法生产的糖蛋白。
通过下列实施例可以达到对本发明更好的理解，这些实施例为了阐明而陈述，而不应解释为对本发明的限制。
实施例1多形汉逊氏酵母HpOCH2基因的鉴定和该基因氨基酸序列的分析从新近完成的多形汉逊氏酵母RB11基因组的测序(Ramezani-Rad et al.，FEMSYeast Res.，4，207-215(2003))中，获得了与OCH1基因家族具有高相似性的ORFs(开放阅读框)全序列，其中OCH1基因家族参与酿酒酵母外链的生物合成。图9显示了多形汉逊氏酵母和酿酒酵母Och1蛋白同源物之间的氨基酸序列同一性和相似性，其中ORF168和ScOch1p之间的氨基酸序列同一性和相似性用阴影粗体数字表示。
在本发明中，为了对ORF168基因进行功能分析，使用从多形汉逊氏酵母DL-1提取的DNA(Levine and Cooney，Appl.Microbiol.，26，982-990，(1973))作为模板和一对引物(168Not-N和168Not-C；表1)进行聚合酶链式反应(PCR)，其中ORF168基因与在酿酒酵母外链生物合成早期α-1，6-甘露糖添加中起决定性作用的酿酒酵母OCH1基因(ScOCH1)(Jungman and Munro，Embo J.17，423(1998))具有40％氨基酸同一性和54％氨基酸相似性。结果，获得了含有ORF168的1.35-kb DNA片段，和然后进行氨基酸测序。
本发明人申请的韩国专利申请2002-37717中描述的常规鉴定的多形汉逊氏酵母基因具有的氨基酸序列与酿酒酵母OCH1基因具有22％同一性和36％相似性因而被命名为HpOCH1。在这点上，本发明中鉴定的ORF168被命名为HpOCH2，并且其核苷酸序列登记在GenBank中，登录号为AY502025。HpOCH2长1287bp并预测编码由428个氨基酸组成的蛋白。HpOch2蛋白从29至51位具有潜在的跨膜区，因而被认为是大多数糖基转移酶所属的II型膜蛋白(图1)。而且，观察到HpOch2蛋白具有已知为糖基转移酶活性部位(Lussier et al.，J.Cell.Biol.，131，913-927，(1995))的DXD元件，因而预测具有糖基转移酶活性(图1)。发现除了酿酒酵母OCH1基因产物之外，HpOch2蛋白的氨基酸序列与其它酵母OCH1基因产物具有相对高的相似性，其它酵母为白色念珠菌Thomas et al.，结果未发表，GenBank登录号AY064420)、巴斯德毕赤氏酵母日本专利07145005)、粟酒裂殖酵母Yoko-o et al.，FEBS Lett.，489，75-80，(2001))(图2)。
实施例2多形汉逊氏酵母HpOCH2基因缺陷菌株的建立和该菌株特性的分析为建立多形汉逊氏酵母HpOCH2基因缺陷突变株，通过融合PCR和体内DNA重组(Oldenburg et al.，Nucleic Acid Res.，25，451，(1997))联合剔除基因。使用下面表1所列引物(引物用于克隆和剔除HpOCH2基因的PCR)进行融合PCR。通过初次PCR，获得了URA3基因和HpOCH2基因的5’和3’区。通过第二次融合PCR，HpOCH2基因5’区与URA3基因5’区连接，和URA3基因3’区与HpOCH2基因3’区连接。然后，将这两个DNA片段导入酵母细胞，选择通过体内DNA重组已剔除了HpOCH2基因的转化体(图3)。首先，使用URA3选择标记，选择在缺乏尿嘧啶的基本培养基中生长的转化体。然后，检测PCR扩增的DNA片段以确定它们是否不同于野生型菌株的片段，由此选择具有不同扩增模式的多形汉逊氏酵母突变株Hpoch2Δ(leu2och1∷URA3)。评价获得的Hpoch2Δ菌株的生长特性。发现Hpoch2Δ菌株如同Hpoch1Δ菌株(KCTC 10264BP)具有45℃的温度敏感性，但不同于Hpoch1Δ菌株的是在37℃具有与野生型类似的生长速度。而且，在潮霉素B存在下，大大抑制了生长，并观察到对脱氧胆酸钠的几乎不敏感(图4)。既然生长特性在外链合成具有缺陷的突变株中是共同的，那么认为多形汉逊氏酵母Hpoch2Δ菌株外链糖基化过程具有缺陷。
表1 实施例3多形汉逊氏酵母Hpoch2Δ突变株中合成的糖蛋白上糖链的大小分布和结构分析为分析实施例2制备的多形汉逊氏酵母Hpoch2Δ突变株中合成的糖蛋白上糖链的大小分布和结构，在多形汉逊氏酵母野生型和Hpoch2Δ突变株中以分泌形式表达来源于黑曲霉(Aspergillus niger)的糖蛋白葡萄糖氧化酶(GOD)。该糖蛋白GOD具有N-联糖基化的八个推定的氨基酸序列(Frederick et al.，J.Biol.Chem.，265，3793(1990))。用表达具有六个组氨酸标记的GOD的表达载体pDLMOX-GOD(H)逐一转化多形汉逊氏酵母野生型和Hpoch2Δ突变株(Kim et al.，Glycobiology(2004))，并在补充2％甲醇的YPM培养基(1％酵母浸膏、2％蛋白胨、2％甲醇)中生长以表达GOD。分泌到培养基的GOD通过镍柱仅选择分离C末端区被六个组氨酸标记的GOD。用PNGase F处理分离的重组组氨酸-标记的GOD以从GOD中分离结合的糖链。然后，用2-氨基吡啶(2-PA)标记释放的糖链并进行HPLC分析。如图5A和D所示，发现来源于野生型的重组GOD的糖链具有从8至12个甘露糖残基的各种大小分布。相比之下，发现Hpoch2Δ突变株中表达的重组GOD结合的糖链主要具有含8个甘露糖残基的核心糖链。这些结果表明在Hpoch2Δ突变株中，第八个甘露糖残基之后的糖添加被大大抑制。分别地，用α-1，2-甘露糖苷酶和α-1，6-甘露糖苷酶顺序处理从重组GOD释放的糖链以研究糖链谱的改变。野生型合成的糖链转变为相当于五个或六个甘露糖的糖链，和接着它们全部被α-1，6-甘露糖苷酶转变为相当于五个甘露糖的糖链，而Hpoch2Δ突变株的全部糖链仅被α-1，2-甘露糖苷酶转变为相当于五个甘露糖的糖链(图5)。这些结果揭示了由α-1，6-甘露糖键的外链延伸的起始决不发生在Hpoch2Δ突变株中，因此表明HpOCH2基因产物直接或间接参与α-1，6-甘露糖苷酶的活动中。
实施例4多形汉逊氏酵母HpOCH2蛋白的功能分析为确定多形汉逊氏酵母HpOCH2基因产物是否是在外链合成起始过程中将α-1，6甘露糖添加至核心糖链的酿酒酵母Och1蛋白的功能性同源物，将携带HpOCH2基因的表达载体YEp352GAPII-HpOCH2导入已剔除了酿酒酵母OCH1基因的突变株Scoch1Δ中，和评价Scoch1Δ突变株克服温度敏感性的能力(图6的A)。HpOCH2、HpOCH1和ScOCH1基因逐一插入导入酿酒酵母表达载体YEp352的甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAP)启动子和终止子之间(Hill et al.，Yeast，2，163-167，(1986))，因而分别产生表达载体YEp352GAPII-HpOCH2、YEp352GAPII-HpOCH1和YEp352GAPII-ScOCH1。当HpOCH2基因表达载体(YEp352GAPII-HpOCH2)转化酿酒酵母Scoch1Δ突变株时，该突变株恢复了其在高温下生长的能力。相比之下，当用携带与HpOCH2基因具有核苷酸序列相似性的HpOCH1基因的表达载体(YEp352GAPII-HpOCH1)转化时，Scoch1Δ突变株没有克服温度敏感性(图6的A)。此外，评价Scoch1Δ突变株在高糖基化中具有缺陷的另一个特征。当HpOCH2表达载体导入Scoch1Δ突变株时，如图6中的B所示，糖蛋白转化酶的糖基化恢复至与其中导入OCH1表达载体(YEp352GAPII-ScOCH1)时相同的水平。相比之下，当HpOCH2表达载体导入Scoch1Δ突变株时，转化酶的糖基化没有变化。酿酒酵母och1Δ突变株克服了温度敏感性和通过多形汉逊氏酵母HpOCH2基因的表达恢复高糖基化的结果证明HpOCH2基因产物是酿酒酵母Och1蛋白的功能性类似物，其中酿酒酵母Och1蛋白在外链合成第一步中起决定性作用。
进行体外试验确定多形汉逊氏酵母HpOch2蛋白事实上是否如同酿酒酵母Och1蛋白具有α-1，6-甘露糖基转移酶活性，将α-1，6-甘露糖添加至核心糖链。三个基因OCH1、MNN1和MNN4都被剔除的突变株(och1Δmnn1Δmnn4Δ)完全丧失外链合成能力(Chiba et al.，J.Biol.Chem.，273，26298-26304，(1998))。用多形汉逊氏酵母HpOCH2基因表达载体转化och1Δmnn1Δmnn4Δ突变株，和制备膜部分。膜部分用作测定α-1，6-甘露糖基转移酶的酶源和与具有核心糖链结构的底物Man8GlcNAc2-PA反应。用HPLC分析产生的反应溶液。当用不含HpOCH2基因的Yep352GAPII载体转化och1Δmnn1Δmnn4Δ突变株时，膜部分中底物Man8GlcNAc2-PA的浓度没有改变。相比之下，当分别用多形汉逊氏酵母HpOCH2基因表达载体和酿酒酵母OCH1基因表达载体转化och1Δmnn1Δmnn4Δ突变株时，在膜部分中观察到相当于Man9GlcNAc2-PA(单一甘露糖添加至Man8GlcNAc2-PA形成的结构)的峰(图7)。这些结果表明多形汉逊氏酵母HpOch2蛋白如同酿酒酵母Och1蛋白具有参与外链延伸起始的α-1，6-甘露糖基转移酶活性。
实施例5使用多形汉逊氏酵母Hpoch2Δ突变株的糖工程能够产生具有人甘露糖型N-联聚糖的重组糖蛋白的多形汉逊氏酵母菌株建立如下。如以前研究中所述用传统酵母—酿酒酵母进行的(Chiba et al.，J.Biol.Chem.，273，26298-26304，(1998))，为了在多形汉逊氏酵母ER中表达斋藤曲霉(Aspergillussaitoi)α-1，2-甘露糖苷酶，用应用于多形汉逊氏酵母的α-1，2-甘露糖苷酶表达载体pDUMOX-MsdS(HA-HDEL)转染多形汉逊氏酵母Hpoch2Δ突变株，由此开发糖工程改造的重组菌株Hpoch2Δ-MsdSp。为构建α-1，2-甘露糖苷酶表达载体pDUMOX-MsdS(HA-HDEL)，使用含有斋藤曲霉(Aspergillus saitoi)α-1，2-甘露糖苷酶的质粒pGAMH1(Chiba et al.，J.Biol.Chem.，273，26298-26304，(1998))作为模板，和含有EcoRI位点的正向引物(5′-GGGGAATTCAAAAAAATGGTGGTCTTCAGCAAA-3′SEQ ID.NO.13)和含有决定蛋白表达水平的HA序列、HEDL(His-Asp-Glu-Leu)序列作为内质网保留/回收标记和NcoI位点的反向引物(5′-GGGCCATGGTCACAATTCATCATGCGCATAGTCAGGAACATCGTATGGGTATGTACTACTCACCCGCAC-3′SEQ ID.NO.14)，进行PCR。结果，扩增了斋藤曲霉(A.saitoi)α-1，2-甘露糖苷酶，由此产生1.5-kb片段。用EcoRI和NcoI消化1.55-kb片段并取代GOD表达载体pDLMOX-GOD(H)的GOD基因(Kim et al..Glycobiology，in press，(2003))。然后，在所产生的GOD表达载体中，用多形汉逊氏酵母URA3选择标记取代多形汉逊氏酵母LEU2选择标记，由此最后产生α-1，2-甘露糖苷酶表达载体pDUMOX-MsdS(HA-HDEL)。使用抗HA抗体(Sigma)的Western印迹检测斋藤曲霉(A.saitoi)α-1，2-甘露糖苷酶在多形汉逊氏酵母中的表达。
为确定糖工程改造的多形汉逊氏酵母菌株Hpoch2Δ-MsdSp是否合成人甘露糖型N-聚糖，分析以分泌形式表达的与GOD结合的糖链结构。在由异源α-1，2-甘露糖苷酶转化的HpOCH2-MsdSp重组野生型菌株中，具有8个或更多甘露糖残基的糖链急剧减少，而具有5个或6个甘露糖残基的糖链增加(图8的A和B)。在由异源α-1，2-甘露糖苷酶转化Hpoch2Δ菌株而制备的重组Hpoch2Δ-MsdSp菌株中，具有7个以上甘露糖残基的糖链与重组野生型菌株HpOCH2-MsdSp相比减少(图8的B和E)。当用α-1，2-甘露糖苷酶处理从重组野生型菌株和Hpoch2Δ突变株分离的糖链时，α-1，2-甘露糖苷酶将HpOCH2-MsdSp菌株的糖链转变为具有5个和6个甘露糖残基的糖链，而Hpoch2Δ-MsdSp菌株转变为具有5个甘露糖残基的糖链(图8的C和F)。这些结果揭示了当异源α-1，2-甘露糖苷酶导入多形汉逊氏酵母时，野生型菌株仍然由多形汉逊氏酵母HpOch2蛋白形成酵母特异的α-1，6-甘露糖键，因此表明为合成人型N-聚糖，应该基本上剔除了多形汉逊氏酵母HpOCH2基因。因此，本发明开发的具有缺陷HpOCH2基因的Hpoch2Δ突变株能有效作为生产具有人相容糖链的治疗性重组糖蛋白的宿主。此外，当各种糖链修饰酶在Hpoch2Δ突变株中表达时，它们复原具有在人体中无免疫原性的各种糖部分。因此，Hpoch2Δ突变株对开发生产生理活性增加和具有无免疫原性糖部分的新糖蛋白宿主的糖工程非常有用。
工业实用性由于多形汉逊氏酵母已在世界范围内被批准作为大量生产重组肝炎疫苗的宿主系统，待在多形汉逊氏酵母中表达的重组蛋白具有被开发为生物制剂的高潜力。如上面实施例所述，在本发明中开发的多形汉逊氏酵母Hpoch2基因具有缺陷的Hpoch2Δ突变株中，外链延伸的起始被阻止，从而阻止酵母特异性α-1，6-甘露糖连续添加。因此，多形汉逊氏酵母突变株可以用作生产目标糖蛋白的宿主，其中目标糖蛋白具有与通过分泌途径生产的人糖蛋白接近的糖链结构形式。而且，如上所述，Hpoch2Δ突变株成为开发可以用作大量生产治疗价值重组糖蛋白宿主的各种多形汉逊氏酵母菌株的糖工程中的基础。因此，该Hpoch2Δ突变株在在相关工业领域中非常有用。
序列表<110>韩国生命工学研究院<120>编码α1，6-甘露糖基转移酶的新的多形汉逊氏酵母基因和用同一基因有缺陷的多形汉逊氏酵母突变株生产重组糖蛋白的方法<160>14<170>KopatentIn 1.71<210>1<211>1351<212>DNA<213>Hansenula polymorpha<220>
<221>CDS<222>(10)..(1293)<400>1cggtgaaga atg gtg tat ttt tta aat ttc atg tca ata acc aat gtc ccg51Met Val Tyr Phe Leu Asn Phe Met Ser Ile Thr Asn Val Pro1 5 10gtg ctg aag cgc gcg cga ctc tac atg gcg acg aat cgc cgg ctg gtg 99Val Leu Lys Arg Ala Arg Leu Tyr Met Ala Thr Asn Arg Arg Leu Val15 20 25 30gtt gtt ctt gtg gtg ctg ctg tac tgg gtg gtc cag aac gtt tgg acg 147Val Val Leu Val Val Leu Leu Tyr Trp Val Val Gln Asn Val Trp Thr35 40 45tgg agc cct ggg acg cgc gat ttg gcc caa gtg gac gcg aag atc gag 195Trp Ser Pro Gly Thr Arg Asp Leu Ala Gln Val Asp Ala Lys Ile Glu50 55 60gcc gag cta aac tcg aat cta cat act ttt gga gcg cat ttg cgc cac 243Ala Glu Leu Asn Ser Asn Leu His Thr Phe Gly Ala His Leu Arg His65 70 75tta aac cgg ctt ccg gca gag tcg gcc acc ctg cgt gaa aaa ctc acc 291Leu Asn Arg Leu Pro Ala Glu Ser Ala Thr Leu Arg Glu Lys Leu Thr80 85 90ttc tat ttc cca tat tat cct gaa aag ccc gtg ccg aac cag atc tgg 339Phe Tyr Phe Pro Tyr Tyr Pro Glu Lys Pro Val Pro Asn Gln Ile Trp95 100 105 110cag aca tgg aag gtc gat ctc gaa gac gac aac ttc ccc aag cag tac 387Gln Thr Trp Lys Val Asp Leu Glu Asp Asp Asn Phe Pro Lys Gln Tyr115 120 125aga cgg ttt cag aag acg tgg gtc gag aaa aat cca gac tac gtg tac 435Arg Arg Phe Gln Lys Thr Trp Val Glu Lys Asn Pro Asp Tyr Val Tyr130 135 140cac ctg att ccg gac tct gtg att gag gac ttt gtg gcg agt ttg tac 483His Leu Ile Pro Asp Ser Val Ile Glu Asp Phe Val Ala Ser Leu Tyr145 150 155gcg aac gtg ccg gag gtg gtc aga gcg tac cag ctg ctt ccg aaa aat 531Ala Asn Val Pro Glu Val Val Arg Ala Tyr Gln Leu Leu Pro Lys Asn160 165 170atc atg aag gcg gat ttt ttc cgg tat ttg gtg atc tac gcg cgc gga 579Ile Met Lys Ala Asp Phe Phe Arg Tyr Leu Val Ile Tyr Ala Arg Gly175 180 185 190ggc acc tac tca gac atg gac acg gtg tgt tta aag ccg atc aag gac 627Gly Thr Tyr Ser Asp Met Asp Thr Val Cys Leu Lys Pro Ile Lys Asp195 200 205
tgg gcc acg ttt gat cgc gac ctg atc cac gct gcc gac aat aag gcc 675Trp Ala Thr Phe Asp Arg Asp Leu Ile His Ala Ala Asp Asn Lys Ala210 215 220gat ctc tcc cag ata gat cca gaa gca aga acc acg cct gtg ggg ctg 723Asp Leu Ser Gln Ile Asp Pro Glu Ala Arg Thr Thr Pro Val Gly Leu225 230 235gtg att ggc att gag gcc gac ccg gac agg ccc gac tgg cac gag tgg 771Val Ile Gly Ile Glu Ala Asp Pro Asp Arg Pro Asp Trp His Glu Trp240 245 250ttc tcg cgc aga ctg cag ttc tgc cag tgg acg atc cag gcg aag ccg 819Phe Ser Arg Arg Leu Gln Phe Cys Gln Trp Thr Ile Gln Ala Lys Pro255 260 265 270gga cac ccg ctg ctg cgc gag ctg atc atc cgg atc gtg gag gag acg 867Gly His Pro Leu Leu Arg Glu Leu Ile Ile Arg Ile Val Glu Glu Thr275 280 285ttc cgc aaa cag cac atg ggc gtt ttg aaa aga gtg gaa ggc aag gac 915Phe Arg Lys Gln His Met Gly Val Leu Lys Arg Val Glu Gly Lys Asp290 295 300tcg ggc gca gat atc atg cag tgg aca gga ccg ggg ata ttt aca gac 963Ser Gly Ala Asp Ile Met Gln Trp Thr Gly Pro Gly Ile Phe Thr Asp305 310 315act ctg ttt gat tat ctg aac aat gtg gcg agc gac ggc aag ttg ggc1011Thr Leu Phe Asp Tyr Leu Asn Asn Val Ala Ser Asp Gly Lys Leu Gly320 325 330gac ggg tac ggc gtg ggg tcg ttg tat tgg cgc aag cac ggc aaa tat1059Asp Gly Tyr Gly Val Gly Ser Leu Tyr Trp Arg Lys His Gly Lys Tyr335 340 345 350aag ctg aaa aag aca gaa att aac aag aat aac gag cca ttg cat tct1107Lys Leu Lys Lys Thr Glu Ile Asn Lys Asn Asn Glu Pro Leu His Ser355 360 365gag gac cag ctt atc aac tgg agg tcg ctg acc aac atg gac aag cca1155Glu Asp Gln Leu Ile Asn Trp Arg Ser Leu Thr Asn Met Asp Lys Pro370 375 380aag atc atg ggg gac gta atg gtg tta cca atc acg agc ttt agt ccg1203Lys Ile Met Gly Asp Val Met Val Leu Pro Ile Thr Ser Phe Ser Pro385 390 395aac gtg ggg cac atg ggc tca aag agc agc tca gat agg ctg gca ttt1251Asn Val Gly His Met Gly Ser Lys Ser Ser Ser Asp Arg Leu Ala Phe400 405 410gtg gag cat tta ttt tct ggc agc tgg aag cca aaa aac aaa taggaaa1300Val Glu His Leu Phe Ser Gly Ser Trp Lys Pro Lys Asn Lys415 420 425aataaataat tagctgcatt ttagataatt ctcatgagca ggcacagaac g 1351<210>2<211>428<212>PRT<213>Hansenula polymorpha<400>2Met Val Tyr Phe Leu Asn Phe Met Ser Ile Thr Asn Val Pro Val Leu1 5 10 15Lys Arg Ala Arg Leu Tyr Met Ala Thr Asn Arg Arg Leu Val Val Val20 25 30Leu Val Val Leu Leu Tyr Trp Val Val Gln Asn Val Trp Thr Trp Ser35 40 45
Pro Gly Thr Arg Asp Leu Ala Gln Val Asp Ala Lys Ile Glu Ala Glu50 55 60Leu Asn Ser Asn Leu His Thr Phe Gly Ala His Leu Arg His Leu Asn65 70 75 80Arg Leu Pro Ala Glu Ser Ala Thr Leu Arg Glu Lys Leu Thr Phe Tyr85 90 95Phe Pro Tyr Tyr Pro Glu Lys Pro Val Pro Asn Gln Ile Trp Gln Thr100 105 110Trp Lys Val Asp Leu Glu Asp Asp Asn Phe Pro Lys Gln Tyr Arg Arg115 120 125Phe Gln Lys Thr Trp Val Glu Lys Asn Pro Asp Tyr Val Tyr His Leu130 135 140Ile Pro Asp Ser Val Ile Glu Asp Phe Val Ala Ser Leu Tyr Ala Asn145 150 155 160Val Pro Glu Val Val Arg Ala Tyr Gln Leu Leu Pro Lys Asn Ile Met165 170 175Lys Ala Asp Phe Phe Arg Tyr Leu Val Ile Tyr Ala Arg Gly Gly Thr180 185 190Tyr Ser Asp Met Asp Thr Val Cys Leu Lys Pro Ile Lys Asp Trp Ala195 200 205Thr Phe Asp Arg Asp Leu Ile His Ala Ala Asp Asn Lys Ala Asp Leu210 215 220Ser Gln Ile Asp Pro Glu Ala Arg Thr Thr Pro Val Gly Leu Val Ile225 230 235 240Gly Ile Glu Ala Asp Pro Asp Arg Pro Asp Trp His Glu Trp Phe Ser245 250 255Arg Arg Leu Gln Phe Cys Gln Trp Thr Ile Gln Ala Lys Pro Gly His260 265 270Pro Leu Leu Arg Glu Leu Ile Ile Arg Ile Val Glu Glu Thr Phe Arg275 280 285Lys Gln His Met Gly Val Leu Lys Arg Val Glu Gly Lys Asp Ser Gly290 295 300Ala Asp Ile Met Gln Trp Thr Gly Pro Gly Ile Phe Thr Asp Thr Leu305 310 315 320Phe Asp Tyr Leu Asn Asn Val Ala Ser Asp Gly Lys Leu Gly Asp Gly325 330 335Tyr Gly Val Gly Ser Leu Tyr Trp Arg Lys His Gly Lys Tyr Lys Leu340 345 350Lys Lys Thr Glu Ile Asn Lys Asn Asn Glu Pro Leu His Ser Glu Asp355 360 365Gln Leu Ile Asn Trp Arg Ser Leu Thr Asn Met Asp Lys Pro Lys Ile370 375 380Met Gly Asp Val Met Val Leu Pro Ile Thr Ser Phe Ser Pro Asn Val385 390 395 400Gly His Met Gly Ser Lys Ser Ser Ser Asp Arg Leu Ala Phe Val Glu405 410 415His Leu Phe Ser Gly Ser Trp Lys Pro Lys Asn Lys420 425<210>3<211>36
<212>DNA<213>Artificial Sequence<220>
<223>primer 168Not-N<400>3aaggaaaaaa gcggccgccg gtgaagaatg gtgtat36<210>4<211>39<212>DNA<213>Artificial Sequence<220>
<223>primer 168Not-C<400>4ttttcctttt gcggccgccg ttctgtgcct gctcatgat 39<210>5<211>20<212>DNA<213>Artificial Sequence<220>
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<223>primer 168Cfor<400>11gcacatcccc ctttcgccag ccgatcacga gcttcagtcc40<210>12<211>20<212>DNA<213>Artificial Sequence<220>
<223>primer 168Crev<400>12cgtcgtccgg gcccagttcg 20<210>13<211>33<212>DNA<213>Artificial Sequence<220>
<223>primer for the amplification of alpha1，2-manosidase inAspergillus saitoi<400>13ggggaattca aaaaaatggt ggtcttcagc aaa 33<210>14<211>69<212>DNA<213>Artificial Sequence<220>
<223>primer for the amplification of alpha1，2-manosidase inAspergillus saitoi
<400>14gggccatggt cacaattcat catgcgcata gtcaggaaca tcgtatgggt atgtactact60cacccgcac69
PCT/RO/134表
关于保藏微生物或其它生物材料的说明
关于保藏微生物或其它生物材料的说明
权利要求
1.一种基因，它是编码表示为SEQ ID NO.2的蛋白的DNA或与前述DNA具有90％或更高同源性且编码具有α-1，6-甘露糖基转移酶活性的蛋白的DNA。
2.根据权利要求1所述的基因，其中该基因是表示为SEQ ID NO.1的DNA。
3.由权利要求1所述的基因编码且具有α-1，6-甘露糖基转移酶活性的蛋白。
4.包含表示为SEQ ID NO.1的DNA基因的重组载体(保藏号KCTC 10583BP所命名的)。
5.以保藏号KCTC 10584BP保藏的多形汉逊氏酵母Hpoch2△突变株。
6.根据权利要求5所述的多形汉逊氏酵母Hpoch2△突变株，包含糖链修饰酶的表达载体。
7.根据权利要求6所述的多形汉逊氏酵母Hpoch2△突变株，其中糖链修饰酶选自包括下列的组α-1，2-甘露糖苷酶、甘露糖苷酶IA、甘露糖苷酶IB、甘露糖苷酶IC、甘露糖苷酶II、N-乙酰葡糖胺转移酶I、N-乙酰葡糖胺转移酶II、半乳糖转移酶、唾液酸转移酶和岩藻糖基转移酶。
8.使用根据权利要求5所述的多形汉逊氏酵母Hpoch2△突变株生产糖基化减少的重组糖蛋白的方法。
9.根据权利要求8所述的方法，其中所述的多形汉逊氏酵母Hpoch2△突变株包含糖链修饰酶的表达载体。
10.根据权利要求8或9所述的方法，其中所述的重组糖蛋白选自包括下列的组细胞因子、凝血因子、内皮生长因子、生长激素释放因子、生长因子、人血管抑制素、组织纤溶酶原激活物、纤溶酶原激活物抑制剂、尿激酶、免疫球蛋白、解淀粉芽孢杆菌α-淀粉酶、酿酒酵母天冬氨酸蛋白酶、酿酒酵母转化酶、克氏锥虫唾液酸转移酶、HIV包膜蛋白、血细胞凝集素、肠激酶、疱疹病毒1型糖蛋白D和免疫球蛋白(immuglobulin)。
11.由权利要求8或9所述的方法生产的糖蛋白。
全文摘要
本发明公开了编码在N－联糖基化起始外链延伸的α－1，6－甘露糖基转移酶的多形汉逊氏酵母的新基因、该基因有缺陷的多形汉逊氏酵母突变株、和使用这种突变株生产重组糖蛋白的方法。
文档编号C12N9/10GK1918297SQ200480041171
公开日2007年2月21日 申请日期2004年7月21日 优先权日2004年1月30日
发明者姜贤雅, 金武雄, 李尚基, 许主衡 申请人:韩国生命工学研究院