专利名称：一种用于边远山区人类血样的dna提取试剂和方法
技术领域：
本发明涉及一种用于边远山区人类血样的DNA提取的试剂和方法，属生物技术领域。
背景技术：
21世纪是生命科学的世纪，基因研究则是该领域的前沿。在基因研究中，珍稀特有的遗传资源的抢先保护与利用是抢占基因大战的制高点，具有十分重要的战略意义。中国拥有56个民族和一些未识别群体，是世界上人类遗传多样性最丰富的地区之一，而云南却拥有中国最为丰富的人类遗传资源，少数民族25种，其中15个特有民族，加之地理环境十分特殊，又由于交通落后闭塞，各民族之间长期隔离便形成了云南民族的遗传多样性及每个民族遗传背景单一性的显著特点。这些为研究人类群体遗传和医学遗传提供了不可多得的珍贵遗传资源。特别是同一民族不同地区某些疾病发病率和疾病特征上的差异是研究遗传病基因的一条非常有价值的技术路线。同时也是研究环境对基因作用的理想人群，对进一步研究基因的结构与功能具有重要价值。然而，随着经济的迅速发展、交通条件的改善、生活方式的变迁、婚姻观念的更新，这一宝贵资源正面临迅速消失的危险，尽快对这一宝贵遗传资源进行保护利用已刻不容缓。加强中国人群基因资源的保护和利用是实施可持续发展的国家战略的需要。
提取和保存隔离人群的血样基因组DNA是上述工作的基础，常规的血样DNA提取保存方法(《分子克隆》中的几种标准方法)都需要较为严格的实验室条件，如必须有冰冻离心机、水浴锅、冰箱等体积较大的设备才能完成提取和保存任务，而中国目前少数民族隔离人群居住地大多位于远离公路的大山深处。采集血样往往需要在野外非实验室条件下连续工作几天甚至几周。携带这些大型设备翻山越岭进入不通公路的山区采集血样标本几乎是不可能的。因此发展一种只需个别小型便携仪器、常温下进行血样采集、常温下较长时间保存标本的方法是至关重要的。
发明内容
本发明是通过改进常规血样DNA提取过程中冷冻离心去除红细胞的过程，代之以常温下加入红细胞裂解液，常温下低速短时间离心去除红细胞，再将白细胞裂解液加入含有DNA的白细胞后，常温下保存这种混合物最长可达4周，待收集任务完成后，在各地收集的这种混合物可以一并带回实验室用NaCl抽提DNA后进入常规流程。这样，实现了仅需简单的小型台式离心机一种设备就可在常温下完成血样的采集、前期处理并较长时间保存中间样品的方法。
本发明是这样实现的
本发明的试剂包括DNA保存液、蛋白酶K，ACD抗凝剂(acidic citratedextrose)、红细胞裂解液(RCLB，red cell lysis buffer)、白细胞裂解液(WCLB，white cell lysis buffer)；其中ACD抗凝剂为柠檬酸0.48g、柠檬酸钠1.32g、葡萄糖1.47g，加水至1000ml，灭菌后备用；红细胞裂解液(RCLB，red cell lysis buffer)为1mM NH4HCO3(碳酸氢氨)0.079g和115mM NH4Cl(氯化铵)6.15g，加水至1000ml，灭菌后备用；白细胞裂解液(WCLB，white cell lysis buffer)为100MmTris-Cl(三(羟甲基)氨基甲烷-盐酸)、其PH为7.6，40mM EDTA(乙二胺四乙酸二钠)、其PH为8.0，50mM NaCl(氯化钠)，0.2％SDS(十二烷基磺酸钠)和0.05％Sodium azide(叠氮化钠)，加水至1000ml，SDS在灭菌后加入。
DNA保存液1×TE蛋白酶K(德国Merck KgaA公司)本方法包括在非实验室和常温条件下对所采集血样进行初步处理和保存、和在实验室条件下将收集保存的样品集中提取、纯化后得到DNA的步骤。具体如下NaCl抽提DNA步骤1、在抽取的5ml静脉血液中加入0.8ml ACD抗凝剂并摇匀，并将样本放置于阴凉处待用；2、将置于阴凉处的血液转到15ml的离心管中，加入RCLB 13ml-14ml，轻摇10Min；随即在2000rpm的速度下离心5Min，然后弃上清，3、加入RCLB 13ml-14ml，轻摇10Min；2000rpm的速度下离心5Min，弃上清，再加入RCLB 13ml-14ml，轻摇10Min；2000rpm的速度下离心5Min，弃上清；4、加入1.8ml WCLB，用移液枪将白细胞沉淀和DNA混合物吹打均匀；5、将混合均匀的白细胞和DNA混合物移到冻存管中，这样可以在室温下保存四个星期；6、将白细胞和DNA混合物分装到1.5ml的离心管中，每600ul的白细胞混合物需加入5ul 20mg/ml的蛋白酶K，摇均匀后放到50℃的水浴中消化8小时；7、消化后每个管中加入300ul NaCl，轻摇10Min分钟，12000rpm离心5Min；8、将上清液分装到1.5ml的离心管中，再加入1.2ml冰冻的无水乙醇，轻微摇均匀后放到-20℃下10Min；9、12000rpm下离心5Min，弃上清；10、用1ml 70％7醇洗盐，在干燥的DNA中加入100ul-200ul的1×TE；11、加入TE后溶解1-2个小时就可以放到冰箱中保存或标化。
酚-氯仿抽提DNA的步骤
1.1-6的步骤和饱和NaCl溶液抽提DNA的步骤是一致的；2.在消化好的DNA样品中加入等体积的TE饱和酚，轻微摇10Min分钟，12000rpm离心5Min；3.将上清转入另一个离心管中，再加入等体积的TE饱和酚，轻微摇10Min分钟，12000rpm离心5Min；4.将上清转入另一个离心管中，再加入等体积的TE饱和酚，轻微摇10Min分钟，12000rpm离心5Min；5.取上清液，用等体积的氯仿抽提一次，12000rpm离心5Min；6.将上清液分装到1.5ml的离心管中，加入1ul的3M的NaAc，再加入1.2ml冰冻的无水乙醇，轻微摇匀后放到-20℃下10Min；7.12000rpm下离心5Min，弃上清；8.用1ml 70％乙醇洗盐，在干燥的DNA中加入100ul-200ul的1×TE，加入TE后溶解1-2个小时就可以放到冰箱中保存或标化。
本发明具有方法简便、成本低、效果佳、有广泛的应用领域等优点，特别适用于边远山区人类血样的DNA提取。
具体实施例方式以下是本发明的实施例，但本发明的内容并不局限于此。
以下实施例采用发明内容所述的试剂和按照发明内容所述的步骤进行，其中加入到15ml的离心管中的RCLB分别为13ml、13.5ml和14ml；用1ml 70％乙醇洗盐时，在干燥的DNA中加的1×TE分别为100ul、150ul和200ul；加入TE后溶解时间分别为1、1.5和2小时。
实施例一1999年开始，项目组历经3年，行程1.5万公里，深入云南的14个地州(怒江州、德宏州、宝山地区、大理州、丽江地区、迪庆州、楚雄往往州、玉溪地区、红河州、文山州、曲靖地区、西双版纳州、临沧地区)20多个县的近50所中小学校及村庄，收集到了人口在5000人以上遗传背景单一的云南25个少数民族共1250份基因样本，其中每个民族采集50份父母三代均系本民族的血样，每份5毫升静脉血，提取基因组DNA，保存于-86度的超低温冰箱，同时建立相应数据库，完成云南少数民族遗传信息资源库建设。之后于2002至2004年的3年间，项目组分成7个样品采集小组，分赴15个省份，行程数万公里，收集了除云南外的其他32个少数民族群体共计1650份样本，建立了DNA资源全、样品量大、收集民族全、采样标准的一个专业中国少数民族DNA库(见表1)，已收存了全国55个民族的3000余份DNA样本(仅缺台湾高山族)。
表1、中国54个少数民族DNA库
实施例二利用这种方法采集目标人群血样DNA，进行中华民族源流的遗传学研究，例如，云南宁蒗县泸沽湖畔的摩梭人是中国大陆目前惟一的母系社会群体。在第一次民族识别中被定为纳西族，但是大部分摩梭人认为自己与纳西族有本质的区别，后来通过云南省人民代表大会决议，称之为“摩梭人”。将遗传学的方法引入摩梭人的族源研究，对摩梭人以及居住于云南的纳西族、藏族、白族、彝族和普米族6个群体线粒体DNA第一高变区、Y染色体上的13个SNP和8个STR位点进行了基因分型，结果显示摩梭人相对缺乏南方民族特异的Y染色体类型，而mtDNA具有南北双重特征。主成分分析和分子系统学分析进一步表明，摩梭人的父系遗传结构与云南藏族最接近，而母系遗传结构最接近丽江纳西族，提示其父系和母系基因库具有不同的来源。摩梭人特殊的母系社会结构可能是导致其母系、父系遗传结构存在明显差异的原因之一。该结果为摩梭人的族源研究提供了遗传学方面的线索。云南25少数民族Y-DNA遗传多样性研究实施例三通过对云南少数民族隔离人群进行大规模的遗传流行病学调查，应用这种DNA提取方法，完成了用于高血压疾病相关基因研究的彝族和哈尼族各2个隔离人群6000余份样本的采集工作，收集到4个典型的遗传病大家系，相关疾病基因研究工作艺取得阶段性成果。
权利要求
1.一种用于边远山区人类血样的DNA提取的试剂，包括DNA保存液、蛋白酶K，其特征在于该试剂还包括ACD抗凝剂、红细胞裂解液RCLB、白细胞裂解液WCLB；其中ACD抗凝剂为柠檬酸0.48g、柠檬酸钠1.32g、葡萄糖1.47g，加水至1000ml，灭菌后备用；红细胞裂解液为1mM NH4HCO30.079g和115mM NH4Cl 6.15g，加水至1000ml，灭菌后备用；白细胞裂解液为100Mm Tris-Cl、其PH为7.6，40mM EDTA、其PH为8.0，50mM NaCl，0.2％SDS和0.05％Sodium azide，加水至1000ml，SDS在灭菌后加入。
2.一种用于边远山区人类血样的DNA提取的方法，包括在实验室条件下将收集保存的样品集中提取、纯化后得到DNA的步骤，其特征在于该方法还包括在非实验室和常温条件下对所采集血样进行初步处理和保存的步骤；该步骤为(1)在抽取的5ml静脉血液中加入0.8ml ACD抗凝剂并摇匀，并将样本放置于阴凉处待用；(2)将置于阴凉处的血液转到15ml的离心管中，加入RCLB 13ml-14ml，轻摇10Min；(3)随即在2000rpm的速度下离心5Min，然后弃上清，加入RCLB 13ml-14ml，轻摇10Min；2000rpm的速度下离心5Min，弃上清，再加入RCLB 13ml-14ml，轻摇10Min；2000rpm的速度下离心5Min，弃上清；(4)加入1.8ml WCLB，用移液枪将白细胞沉淀和DNA混合物吹打均匀；(5)将混合均匀的白细胞和DNA混合物移到冻存管中，这样可以在室温下保存四个星期；(6)将白细胞和DNA混合物分装到1.5ml的离心管中，每600ul的白细胞混合物需加入5ul 20mg/ml的蛋白酶K，摇均匀后放到50℃的水浴中消化8小时；(7)消化后每个管中加入300ul NaCl，轻摇10Min分钟，12000rpm离心5Min；(8)将上清液分装到1.5ml的离心管中，再加入1.2ml冰冻的无水乙醇，轻微摇均匀后放到-20℃下10Min；(9)12000rpm下离心5Min，弃上清；(10)用1ml 70％乙醇洗盐，在干燥的DNA中加入100ul-200ul的1×TE；(11)加入TE后溶解1-2个小时就可以放到冰箱中保存或标化。
全文摘要
本发明涉及一种用于边远山区人类血样的DNA提取的试剂和方法，属生物技术领域。试剂包括DNA保存液；蛋白酶K；由柠檬酸0.48g、柠檬酸钠1.32g、葡萄糖1.47g，加水至1000ml的ACD抗凝剂；由1mM NH
文档编号C12P19/00GK1706959SQ200510010800
公开日2005年12月14日 申请日期2005年5月11日 优先权日2005年5月11日
发明者肖春杰, 陈穗云, 俞海菁 申请人:云南大学