专利名称：一种球孢白僵菌的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种球孢白僵菌，尤其防治十字花科蔬菜甲虫类害虫有效。
背景技术：
以往防治十字科蔬菜甲虫类害虫多采取化学防治的方法，在生物农药防治方面未发现用于防治十字花科蔬菜甲虫类害虫的球孢白僵菌。
技术内容为了防治十字花科蔬菜甲虫类害虫，本发明提供一种球孢白僵菌，其特征在于从被虫生真菌自然侵染的小猿叶甲虫体上分离获得球孢白僵菌野生菌株，将野生菌株回接于小猿叶甲复壮获得球孢白僵菌菌株，对该菌株采用稀释纯化法进行单菌丝分离获得纯化菌。本发明的球孢白僵菌对防治十字花科蔬菜甲虫类害虫有效。例如对小猿叶甲、黄曲条跳甲、大猿叶甲。
本发明用于防治小猿叶甲或黄曲条跳甲有明显效果。
实施方案1材料与方法1.1病原菌的分离、鉴定1.1.1材料来源在西洋菜地采集到被一种虫生真菌侵染后的小猿叶甲Phaedon brassicaeBaly虫尸。
马铃薯葡萄糖琼胶培养基(PDA)500g马铃薯+17-20g琼脂+17-20g葡萄糖+1000ml水。
水琼脂15-20g琼脂+水1000ml。
无菌操作条件所有器皿和用具均经高温灭菌锅灭菌(121℃，30min)，接种等操作均在超净工作台内进行。
培养条件置于25℃光照(12L:12D)恒温箱中培养，待菌落形成后，转移到PDA斜面，再转入4℃冰箱贮存。
1.1.2病原菌的分离与纯化分离 从采回的感染虫生真菌的小猿叶甲虫尸分离病原菌。利用5％的次氯酸钠溶液对样品进行表面消毒，消毒后样品置于无菌培养皿中解剖，取小块感病组织，放入PDA平板中，倒置于25℃恒温箱中培养，待菌落形成后，即可转入PDA试管斜面生长7-10d后，在4℃冰箱贮存。
复壮将分离到的菌株在PDA平板上培养10d形成菌落后，加入含吐温-80的无菌水收集孢子，后移入烧杯中，在磁力加热搅拌器搅拌15分钟，得到适当浓度的孢子悬浮液，用小型手动喷雾器均匀喷于小猿叶甲成虫体表和菜心叶片，保持相对湿度90％以上。14d后挑取受感染的小猿叶甲，按前法分离得到A分离株。
纯化 本实验对A菌株采用单菌丝分离法得到B、C、D、E、F5个分离株。首先，将真菌移栽到水琼脂平板上，培养2～3d后在立体显微镜下寻找单根伸长的菌丝。用接种针将菌丝连同琼脂一起切下，移接在PDA上，置于25℃光照恒温箱中培养。
1.1.3病原菌的鉴定根据病原菌的培养性状、菌丝和分生孢子的形态进行鉴定。利用40×10倍的自带光源立体显微镜，镜检菌丝和分生孢子形态。
1.2球孢白僵菌分离株的筛选1.2.1供试菌株经纯化后获得的球孢白僵菌A、B、C、D、E和F共6株分离株，采用PDA平板，于25℃的恒温光照(12L:12D)培养箱中培养。
1.2.2供试虫体与寄主植物从田间采回小猿叶甲成虫作为虫源，将其置于网室内菜心地自然状态下饲养，得到供试小猿叶甲，取小猿叶甲成虫进行实验。用在网室内种植的菜心(品种为新选49)作供试植株。
1.2.3菌落生长速率和产孢量的测定将6个菌株分别配制成分生孢子悬浮液，各取1ml滴入存有PDA的培养皿(直径9cm)内，用三角玻棒涂匀，待4-5d长出菌丝后，用直径为13mm的打孔器钻取新鲜菌落，并接种于PDA平板培养。在培养皿底部标记两点以示其直径，每个菌株重复5次。每2d观测菌落生长情况。具体方法是用直尺以标记的两点作为基准测量菌落直径，第10d记录最后一次数据。用直径为5mm的灭菌打孔器在距培养皿中心相同的位置取菌块，然后放入小烧杯中，加吐温-80和20ml无菌水，在磁力加热搅拌器搅拌15分钟，使孢子充分分散，制成孢子悬浮液，用血球计数板测定产孢量。
1.2.4孢子萌发率的测定将6个菌株培养10d后，分别用无菌水收集分生孢子，制成悬浮液(每视野100个左右分生孢子)，用载玻片法测定孢子萌发率。将孢子悬浮液直接滴在无菌载玻片上，置于底铺滤纸的培养皿内，皿内滴加3-4滴无菌水以保持100％RH，培养24小时后镜检，每个处理重复3次。
1.2.5菌株对小猿叶甲成虫的致病力的测定各菌株培养10d后，按以上方法配制成5×107孢子/ml悬浮液。在灭菌培养皿上放3片大小一致未受农药污染的新鲜菜心叶片，每皿放入6头小猿叶甲供试成虫。用小型手动喷雾器将各菌株的孢子悬浮液均匀喷洒在菜叶和小猿叶甲体表，设置喷洒加吐温-80无菌水作为对照，每个处理重复5次。用保鲜膜将培养皿皿口封好，在薄膜上扎若干小孔通气，然后置于25℃光照培养箱(相对湿度90％)以上培养。每日观察并记录供试成虫的死亡数，连续观测14d，每2d更换新鲜菜叶一次。
1.2.6统计分析试验数据处理均用数据处理系统DPS完成。
2.1分离菌株的获得从被虫生真菌自然侵染的小猿叶甲虫体上分离获得野生菌株，将野生菌株回接于小猿叶甲复壮获得A菌株，对A菌株采用稀释纯化法进行单菌丝分离获得B菌株、C菌株、D菌株、E菌株、F菌株。
2.2菌株的鉴定2.2.1菌落形态描述将获得的6株虫生真菌接种到PDA平板上，于25℃条件下培养。3-5d可以长出白色菌丝，菌落绒状，白色，中部隆起，第6d产生淡黄色粉末状孢子。稍后菌落变成淡黄色，背面黄色。
2.2.2菌丝与孢子形态描述通过显微镜观察，可以看到分生孢子梗着生在营养菌丝上。用测微尺测得分生孢子梗粗1-2um，产孢细胞簇生于菌丝、分生孢子梗或膨大的孢囊上，瓶形，颈部明显延长成粗1um，长达20um的产孢轴，轴上具有小齿突，呈“之”字形弯曲。产孢细胞和孢囊常增生，在分生孢子梗或菌丝上聚成球形至卵形的相当密实的孢子头。分生孢子球形或近球形，透明光滑，2-3×2-2.5um。
根据观察到的菌落形态、菌丝和分生孢子形态，与《昆虫真菌学》上的有关球孢白僵菌的形态特征描述和图谱进行对比分析，鉴定为球孢白僵菌。
2.3球孢白僵菌分离株的筛选虫生真菌在遗传、生态及生物学特性等方面具有多样性，同种真菌的不同菌株对目标害虫的致病力有着显著的差异，不同菌株的LT50可相差数倍，而LC50可相差数十倍。获得产孢高、孢子萌发率高和致病力好的优良菌株是达到较高防治效果和取得应用成功的首要保证。菌株筛选主要考虑4个指标，即菌株对靶标害虫致病力、菌株产孢量、孢子萌发率以及菌落生长速率。本研究采取这些性状为指标，筛选优良的球孢白僵菌菌株。
2.3.1菌落生长速率和产孢量表1说明，6个分离株菌落的生长都很平均，在观察的10d内的生长趋势基本一致，各菌落直径平均每天都有2mm以上的增长，属于生长比较迅速的类型。其中D分离株生长最快，第10d观察其菌落直径达到35.67mm，增长22.67mm，但是，6个分离株的菌落生长速率均无明显差异。而不同菌株间产孢量有显著差异，生长10d后C、D、E菌株产孢量分为5.15×107、4.71×107、5.56×107孢子/ml，明显高于A、F菌株(2.99×107、2.52×107孢子/ml)，其中E菌株产孢量最大。
表1 培养10d后球孢白僵菌6菌株的菌落直径扩展和产孢量
注表中同列中具相同字母者表示在0.05水平上差异不显著(DMRT法)2.3.2分生孢子萌发率6个菌株间分生孢子萌发率差异显著(表2)。E菌株的平均萌发率为86.70％，为6个菌株中最高，A菌株的平均萌发率只有46.22％，是6株中的最低值。
表2 球孢白僵菌6个菌株分生孢子萌发率(24hr)
注表中同列中具相同字母者表示在0.05水平上差异不显著(DMRT法)2.3.3对小猿叶甲成虫的致病力在喷施孢子悬浮液第7d，被处理的成虫开始出现侵染症状，如成虫活动滞缓，取食量明显减少，但虫体上的菌丝长得不太明显，只观察到虫体腹部末端和头部有少量白色菌丝，过2-3d后虫体表面出现明显白色菌丝和淡黄色孢子。结果(表3)表明，第7d，D株的侵染率达40％，显著高于与其它菌株，而其它菌株之间差异不显著。第14d，各菌株的侵染率变化较大，A、B、C、D、E、F菌株的侵染率分别为30％、6.66％、13.33％、86.67％、50％和20％，其中D菌株侵染率达86.67％为6株中最高，比第7d的增加46.67％，而E菌株为50％，比第7d增长40％。
表3 球孢白僵菌6个菌株对小猿叶甲成虫的感染率
注表中同列中具相同字母者表示在0.05水平上差异不显著(DMRT法)2.3.4球孢白僵菌分离株的筛选结果筛选优良菌株时，致病性和产孢量是重要的参考指标，孢子萌发率和菌落平均生长速率次之。在生物学特性测定实验中，6个菌株的菌落都生长得比较快，但菌落生长速率显著差异不明显。6菌株中，C、D、E菌株孢子萌发率(81.89％、83.12％和86.70％)和产孢量(5.15×107、4.71×107和5.56×107孢子/ml)都较其它菌株高，由于它们的萌发率相差不大，所以着重考虑比较菌株的致病性和产孢量。D菌株的侵染率达86.67％，在6个菌株中最高；同时其产孢量为4.71×107孢子/ml，在6个菌株中也较高。综合比较，D菌株具有较高的产孢量和最高的致病率，是6个菌株中的优良菌株，因此本研究其余部分均以D菌株作为研究对象作更深入的研究。
2.3.4球孢白僵菌分离株的筛选结果筛选优良菌株时，致病性和产孢量是重要的参考指标，孢子萌发率和菌落平均生长速率次之。在生物学特性测定实验中，6个菌株的菌落都生长得比较快，但菌落生长速率显著差异不明显。6菌株中，C、D、E菌株孢子萌发率(81.89％、83.12％和86.70％)和产孢量(5.15×107、4.71×107和5.56×107孢子/ml)都较其它菌株高，由于它们的萌发率相差不大，所以着重考虑比较菌株的致病性和产孢量。D菌株的侵染率达86.67％，在6个菌株中最高；同时其产孢量为4.71×107孢子/ml，在6个菌株中也较高。综合比较，D菌株具有较高的产孢量和最高的致病率，是6个菌株中的优良菌株，因此本研究其余部分均以D菌株作为研究对象作更深入的研究。
3球孢白僵菌的致病力测定生物测定是昆虫真菌学和昆虫病理学理论和应用研究中极为重要的技术之一。在利用真菌杀虫剂防治害虫的实际应用中，要设计一个高效而成本低的防治策略必须基于由生测获得的可重复的定量数据。通过对虫生真菌的生物测定，可以了解真菌制备物对目标害虫的致死程度和致死速率，从而综合评价出真菌生物防治的潜力。本研究就球孢白僵菌D菌株对小猿叶甲的致病力进行测定，筛选出白僵菌对小猿叶甲侵染的最佳龄期和浓度，以指导球孢白僵菌的田间应用，进一步评价小猿叶甲作为生物防治因子的潜力。
3.1材料与方法3.1.1供试虫源与寄主植物虫源采用网室内菜心地饲养的小猿叶甲幼虫和成虫。用在实验室内种植的西洋菜作供试植株。
3.1.2供试菌株和孢子悬浮液的制备球孢白僵菌D菌株在PDA平板上25℃恒温光照(12L:12D)培养箱中培养14d，用加吐温-80的无菌水收集分生孢子，经磁力搅拌器搅拌30分钟，待孢子完全被打散均匀后，经医用纱布过滤，弃去杂质和培养基残物，获得孢子悬浮液，用血球计数器确定孢子浓度后，再配成1×105、1×106、5×106、1×107、5×107和1×108孢子/ml等6个浓度梯度，进行球孢白僵菌对小猿叶甲的致病力测定。
3.1.3对幼虫和成虫的致病力测定由于小猿叶甲幼虫虫体较小，用喷雾方法不能使菌液均匀的喷于虫体表面，因此采用浸液法。将小猿叶甲各龄幼虫与成虫分别浸于相应浓度的孢子悬浮液中。每浓度处理20头虫，浸渍10-20s后放入灭菌的9mm培养皿中，同时用加吐温-80的无菌水处理小猿叶甲作为对照。各处理5个重复。用保鲜膜纸将培养皿封好，在薄膜上扎小孔通气，置于25℃恒温光照培养箱培养，保持90％以上的相对湿度。每日检查小猿叶甲的死亡虫数，根据虫尸体表长出的菌孢确定死亡原因。幼虫试验连续观察10d，成虫试验连续观察14d。每天更换新鲜菜叶。
3.2结果与分析3.2.1小猿叶甲各龄期的累计死亡率比较接种后第2-3d，各处理中各龄幼虫与成虫均开始出现发病症状，如虫体行动迟缓、食欲不振，随后可观察到虫体腹部末端和头部有少量白色菌丝长出，过几天后虫体表面出现淡黄色孢子并死亡。表4为球孢白僵菌处理后各龄幼虫第10d和成虫第14d的累计死亡率，结果表明，各龄幼虫和成虫均能感病，感病死亡率与龄期相关。在相同浓度处理下，1、2龄幼虫的死亡率较高，3龄幼虫和成虫的死亡率较低。
表4 小猿叶甲各龄期感染球孢白僵菌后的累计死亡率(％)
注表中同列中具相同字母者表示在0.05水平上差异不显著(DMRT法)3.2.2球孢白僵菌的致病力测定结果小猿叶甲各龄幼虫和成虫的逐日累计发病情况见图3.1。接种球孢白僵菌后小猿叶甲各龄幼虫在第5d后出现后发病高峰，而成虫在第9d后出现发病高峰。在此时间后，小猿叶甲的累计死亡率迅速增加，各处理中1～3龄幼虫和成虫的最高累计死亡率分别为94.00％、96.00％、81.00％和84.46％。
4.1材料与方法4.1.1供试虫源与寄主植物黄曲条跳甲成虫采自深圳龙岗生态村田间，一部分用于侵染试验，一部分在实验室内饲养，产卵后用黄曲条跳甲卵分离器分离，待卵孵化为幼虫后用萝卜皮饲养，作供试虫源；用实验室种植的甘蓝作供试植株。
4.1.2供试菌株和孢子悬浮液的制备本实验筛选出的球孢白僵菌D菌株。按3.1.2的方法制备球孢白僵菌的孢子悬浮液，浓度为1×108孢子/ml。
4.1.3对黄曲条跳甲测定处理方法同3.1.3。每处理20头试虫，重复5次。
4.2结果与分析对黄曲条跳甲幼虫和成虫的感染率球孢白僵菌对黄曲条跳甲幼虫和成虫均能侵染，幼虫第10d和成虫第14d的累计死亡率分别为63％和60％。说明球孢白僵菌D菌株对黄曲条跳甲有较好的侵染效果，可作进一步的研究。
权利要求
1.一种球孢白僵菌，其特征在于从被虫生真菌自然侵染的小猿叶甲虫体上分离获得球孢白僵菌野生菌株，将野生菌株回接于小猿叶甲复壮获得球孢白僵菌菌株，对该菌株采用稀释纯化法进行单菌丝分离获得纯化菌。
2.根据权利要求1所述的球孢白僵菌，其特征在于用于防治小猿叶甲或黄曲条跳甲。
全文摘要
本发明涉及一种球孢白僵菌，尤其防治十字花科蔬菜甲虫类害虫有效。其特征在于从被虫生真菌自然侵染的小猿叶甲虫体上分离获得球孢白僵菌野生菌株，将野生菌株回接于小猿叶甲复壮获得球孢白僵菌菌株，对该菌株采用稀释纯化法进行单菌丝分离获得纯化菌。
文档编号C12N1/14GK1683515SQ200510033568
公开日2005年10月19日 申请日期2005年3月16日 优先权日2005年3月16日
发明者吕利华, 冯夏, 何余容, 陈焕瑜 申请人:广东省农业科学院植物保护研究所