专利名称：人神经营养素－3受体基因重组腺病毒构建方法
技术领域：
本发明涉及一种重组腺病毒表达载体的构建方法，尤其是一种用人神经营养素-3受体基因(人TrkC基因)重组的腺病毒表达载体的构建方法及其应用。
背景技术：
神经营养因子是能够支持机体神经元存活，促进其生长、分化，及维持其功能的一类化学因子。神经神经营养因子对其靶细胞起细胞学作用之前，首先要与靶细胞上的受体结合。目前已知神经营养因子有两种受体酪氨酸蛋白激酶受体(高亲和力受体)和p75受体(低亲和力受体)。酪氨酸蛋白激酶受体是由原癌基因Trk编码的一种受体，亦称为Trk受体。Trk受体又可分为TrkA、TrkB和TrkC 3种。
神经营养因子包括神经生长因子(NGF)、脑源性神经营养因子(BDNF)、神经营养素-3(NT-3)和神经营养素-4/5(NT-4/5)等，它们分别与不同的神经营养因子受体结合。神经生长因子与TrkA结合可引起细胞学反应包括增强靶细胞的存活和生长。脑源性神经营养因子、神经营养素-4/5和神经营养素-3均能结合和激活TrkB，但神经营养素-3的作用较弱。神经营养素-3主要结合和激活TrkC。所以，Trk受体(TrkA、TrkB和TrkC)是神经营养因子的功能性受体。
应用神经营养因子治疗中枢神经损伤是目前研究的热点之一，所使用的多是神经营养素-3、神经生长因子和脑源性神经营养因子。现已证明，神经生长因子主要作用于感觉神经元，对运动神经元作用不明显，而脑源性神经营养因子作用的神经元类型范围较窄小。许多研究认为，神经营养素-3对神经元的发育和分化及对损伤的中枢神经元存活及其轴突再生有重要作用。还有研究证实，神经营养素-3对脊髓损伤处皮质脊髓束神经纤维的再生有明显的促进作用。已知神经营养素-3可以特异结合和激活其分布在神经元细胞膜上的神经营养素-3受体TrkC，发挥其生物效应作用。
有研究结果表明，神经营养素-3对神经干细胞的分化也有作用。Takahashi等(1999年)和Castellanos等(2002年)研究发现，神经营养因子能使带有TrkC的神经干细胞更多地分化为神经元。因此，我们设计将TrkC基因转染到神经干细胞后移植到脊髓损伤处，让神经干细胞带有神经营养素-3受体；同时一起移植神经营养素-3基因修饰的雪旺细胞，让转基因雪旺细胞过表达神经营养素-3，更好地促进带有神经营养素-3受体的神经干细胞分化为神经元，生长出轴突，在脊髓损伤处形成神经元网络，起上、下行传导神经通路桥梁作用，修复脊髓自主运动功能。我们认为这种治疗策略，可能会更有效地促进损伤脊髓结构和功能的修复，为临床治疗脊髓创伤性疾病乃至大脑创伤性疾病提供新方法。
发明内容
目前，在国内外尚未见有文献资料报道人神经营养素-3受体基因(人TrkC基因)重组腺病毒表达载体的构建方法和技术，本发明的目的是想克服现有临床治疗中枢神经创伤性疾病的方法上的不足，设计一种用人TrkC基因重组的腺病毒表达载体的构建方法，为临床促进受损伤的中枢神经结构和功能修复和基因治疗药物新应用提供指导。
本发明的基本方案包括(1)引物设计合成从GenBank检索人TrkC基因，针对基因全长设计两端引物。
(2)RT-PCR过程取人脑mRNA进行反转录，反应结束后，取反应液5ml于1％琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像系统观察结果。
(3)克隆穿梭载体pShuttle-TrkC的构建及鉴定取RT-PCR反应液，0.8％琼脂糖凝胶电泳后，割胶纯化目的基因(TrkC)片断。连接纯化TrkC基因和线性化的pShuttlc，将产物扩增并提取质粒，再测序鉴定质粒中目的基因的序列。
(4)重组腺病毒载体pAdeno-TrkC的构建及鉴定将pShuttle-TrkC与腺病毒骨架质粒连接，常规方法转化后进行扩增并提取质粒，并测序鉴定。
(5)293细胞包装pAdeno-TrkC用脂质体介导转染HEK293细胞，转染后第10天出现293细胞病变。收集病变细胞于-80℃/37℃反复冻融3次获得病毒粗裂解液，并反复感染293细胞扩增病毒。
(6)重组腺病毒的鉴定①PCR鉴定抽提病毒DNA为模板，以目的基因的上、下游引物进行PCR鉴定。②RT-PCR鉴定Ad-TrkC感染293细胞后收获细胞，用Trizol试剂提取总RNA进行反转录。反应结束后，取反应液5ml于1％琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像系统观察结果。③免疫细胞化学染色将上述粗裂解的病毒液感染体外培养的神经干细胞球，用免疫细胞化学染色证实是否Ad-TrkC转染。④Western blot粗裂解的Ad-TrkC病毒液感染神经干细胞24小时后，裂解细胞做Western blot证实是否有TrkC表达。
(7)人神经营养素-3受体基因重组腺病毒表达载体的生物学活性检测体外培养取自于绿色荧光小鼠海马的神经干细胞，观察神经营养素-3和神经营养素-3受体对体外培养的神经干细胞诱导分化的影响。
所述的神经营养素-3受体在与神经营养素-3特异性结合后，能促进神经元的发育和分化以及受损伤的中枢神经元存活及其轴突再生；也能促进神经干细胞分化为神经元。神经干细胞是指神经系统中相对未分化的、具有增殖和分化潜能的细胞。在一定条件下，它可以向神经元和神经胶质细胞分化。它可从发育中甚至成年的中枢神经内能分离出来。
本发明的优点显著。本研究选择一种基因重组腺病毒表达载体来促进受损伤的中枢神经元存活及其轴突再生，以及促进神经干细胞更多地分化为神经元，替换受损伤的神经元或死亡的神经元。对危害人民健康较大的创伤性中枢神经疾病如脊髓创伤等进行防治基础性研究，将会有力地推动整个创伤性中枢神经疾病防治研究领域的发展。本研究集中力量进行系统的工作，在分子和细胞水平上加强对中枢神经创伤后的细胞治疗和细胞替换等方面的研究。这对延长人类寿命，提高伤病者生存质量，减轻社会和家庭负担，促进我国社会经济发展，都具有重要意义。本发明将使我国的创伤性中枢神经疾病防治水平居于国际领先水平。
具体实施例方式
下面通过具体实施例对本发明所用的主要仪器和试剂作详尽的描述1.主要仪器PCR仪(Gene Amp pcr system 9700)、低温离心机(Beckman)、超高速离心机(美国Beckman公司)、CO2孵箱(NAPCO公司)、PRISM377DNA测序仪(美国ABI公司)、高速台式离心机5415D(德国eppendorf)和BeckmanDV640型紫外分光光度仪(美国Beckman公司产品)。
2.载体与菌株Adeno-XTMExpressien System试剂盒为Clontech公司产品，HEK293细胞株与大肠杆菌DH5α为肿瘤防治中心黄文林教授实验室惠赠。
3.基因重组腺病毒表达载体的主要试剂RT-PCR试剂盒、Trizol为Promege公司产品，限制性内切酶XbaI、KpnI、DNA MarkerDL2000、DNA Ligation Kit Ver.2为大连Takara公司产品，DNA Marker 1 KB Ladder为申能博采生物公司产品，人脑mRNA为深圳市君轩生物技术有限公司产品，质粒提取试剂盒、QIAquick(R)Gel Extraction Kit为QIAGEN公司产品。Agarose Gel为Biowest公司产品，LipofectamineTM2000购自Invitrogen公司。ELISA试剂盒购自武汉博士德公司。
4.生物活性检测所用的动物细胞和主要试剂神经干细胞取自于绿色荧光(GFP)小鼠(由昆明医学院神经研究所王延华教授提供)的海马组织，bFGF、B27、RPMI 1640和DMEM/F12购自Gibico公司；SABC-Cy3试剂盒购自武汉博士德公司；小鼠抗人TrkC单克隆抗体购自R&D公司。
本发明详细的具体操作技术说明如下1.引物设计合成从GenBank检索人TrkC基因，针对基因全长，设计两端引物(引物由上海申弓生物技术有限公司合成)。上游引物5’TGTCTAGAA GCAGCGATCGGAGATG3’；下游引物5’ACGGTACCACTAGCCAAGAATGTC 3’。上、下游引物5’端分别包含XbaI和KpnI限制性内切酶酶切位点，扩增产物为2500bp。
2.RT-PCR取人脑mRNA进行反转录，反应体系参照promege公司Reverse trancriptionsystem试剂盒说明。42℃60min反转录，95℃5min灭活反转录酶AMV；然后做PCR94℃ 1min、50℃1min30s、72℃3min，35个循环，最后72℃7min。另设一阴性对照，以dH20代替cDNA，余相同。反应结束后，取反应液5ml于1％琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像系统观察结果。
3.克隆穿梭载体pShuttle-TrkC的构建及鉴定取RT-PCR反应液，0.8％琼脂糖凝胶电泳后，用QLAquik(R)Gel Excraction Kity试剂盒，割胶纯化目的基因片断。分别用XbaI和KpnI双酶切目的基因及载体pshuttle用Gel Extraction Kit试剂盒切胶，按DNA LigationKit Ver.2试剂盒说明配制连接反应体系，16℃温育过夜。连接纯化TrkC基因和线性化的pShuttle，产物按常规方法转化DH5α菌惑受态，将转化菌涂布于含20mg/ml卡那霉素的LB琼糖平板，37℃培养过夜。挑取存活的菌落，扩增并提取质粒，PCR鉴定及XbaI和KpnI双酶切鉴定后，再测序鉴定质粒中目的基因的序列。
4.重组腺病毒载体pAdeno-TrkC的构建及鉴定将pShuttle-TrkC用I-CeuI和PI-SceI双酶切后，与Adeno-XTMExpression System试剂盒中的腺病毒骨架质粒(已用I-CeuI和PI-SceI切开)连接，常规方法转化后，将转化菌涂布于含50mg/ml氨苄的LB琼脂糖平板，37℃过夜培养。挑取菌落，PCR鉴定，选阳性克隆扩增并提取质粒，I-CeuI和PI-SceI双酶切及HindIII和XhoI单酶切鉴定，并测序鉴定。
5.293细胞包装pAdeno-TrkC用PacI酶切成线性后，用脂质体介导在24孔板内转染HEK293细胞，细胞长满后，转入25m2培养瓶内继续培养，转染后第10天出现293细胞病变CPE(cytopathic effect)。收集病变细胞于-80℃/37℃反复冻融3次获得病毒粗裂解液，并反复感染293细胞扩增病毒。
6.重组腺病毒载体Adeno-TrkC的鉴定(1)PCR鉴定抽提病毒DNA为模板，以目的基因的上、下游引物进行PCR鉴定。反应条件为94℃1min、50℃1min30s、72℃3s，35个循环，最后72℃7min。阳性对照以pAdeno-TrkC为模板，阴性对照以水为模板，余相同。
(2)RT-PCR鉴定Adeno-TrkC感染293细胞48小时后收获细胞，Trizol试剂提取总RNA进行反转录，反应体系参照promege公司Reverse trancription system试剂盒说明书。42℃60min反转录，95℃5min灭活反转录酶AMV，逆转录获得cDNA。以其作为模板，PCR扩增TrkC基因内的一段112bp序列。设计两端引物(引物由上海申弓生物技术有限公司合成)进行PCR鉴定。上游引物为5’TTGGATCCTCACCACTGATGACAG3’；下游引物为5’TTGCTGCTTTTGCCTGTGTCCTG 3’。反应条件为94℃50s、55℃50s、72℃1min，35个循环，最后72℃7min。另设一阴性对照，以未转染病毒的293细胞的RNA反转录成的cDNA为模板，余相同。阳性对照以质粒pAdeno-TrkC为模板。反应结束后，取反应液5ml于1％琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像系统观察结果。
(3)小鼠神经干细胞(NSC)的体外培养将出生24h内的绿色荧光小鼠断头处死，在D-Hank’s液中分离出海马，剪碎，0.25％胰蛋白酶消化10分钟，血清终止，加入DMEM/F12(含20ng/mlbFGF、20μl/mlB27)无血清培养液制成1×104/ml单细胞悬液，于37℃、5％CO2培养箱中进行悬浮培养，约3天左右形成神经干细胞球。
(4)免疫细胞化学染色上述体外培养的神经干细胞球，0.25％胰蛋白酶消化成单细胞，接种于多聚赖氨酸处理过的24孔板内，24h贴壁生长，粗裂解的病毒液感染约培养48h后，用2.5％多聚甲醛固定细胞，鼠抗人TrkC为一抗做免疫细胞化学染色，DAB显色，阴性对照的NSC转染Ad-LacZ，空白对照的NSC没有腺病毒转染。
(5)Western blot粗裂解的Adeno-TrkC病毒液感染25cm2的神经干细胞(约2×106个)，转染24小时后裂解细胞做Western blot，一抗为鼠抗人TrkC。同时设立Ad-LacZ转染的神经干细胞和不加病毒液的神经干细胞作为对照。
7.人TrkC基因重组腺病毒表达载体的生物学活性检测体外培养取自于绿色荧光小鼠海马的神经干细胞。将其制成4×104个/ml细胞悬液，置入96孔板内培养，每孔50μl，培养液换成含10％FBS的DMEM/F12。实验分4组，Ad-TrkC+Ad-NT-3组、Ad-NT-3组、Ad-TrkC组和Ad-LacZ组，每组6个孔，其中一个为阴性对照，共24个孔。Ad-TrkC+Ad-NT-3组每孔同时加入Ad-TrkC粗裂解病毒液100μl和Ad-NT-3感染293细胞后分泌的上清100μl，Ad-NT-3组加入Ad-NT-3感染293细胞后分泌的上清100μl，Ad-TrkC组加入Adeno-TrkC粗裂解病毒液100μl，Ad-LacZ组加入Adeno-LacZ病毒液100μl。培养2d后用2.5％多聚甲醛固定，做MAP-2、GFAP及nestin的SABC-Cy3免疫荧光细胞化学染色，观察NT-3和TrkC对体外培养的神经干细胞诱导分化的影响。荧光显微镜下(200倍)用目镜测试网格计数神经干细胞(绿色荧光)和Cy3免疫标记的阳性细胞(红色荧光)，以及双标记(黄色)数量，每孔随机取3个视野，每组共15个视野。计算神经干细胞分化为不同类型细胞数占总细胞数的百分率，应用SPSS10.0统计软件作x2检验。
8.实验结果显示(1)RT-PCR将RT-PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，可见一约2500bp的特异性条带，与理论预期值(2500bp)一致，阴性对照无片断扩出。
(2)克隆载体pShuttle-TrkC鉴定挑取菌落扩增，提取质粒后，用XbaI+KpnI、KpnI、SacI和SalI酶切，琼脂糖凝胶电泳后观察结果。可见6.5kb、6.2kb、4.0kb、2500bp和320bp、的条带。测序结果表明插入的人TrkC基因序列与Genbank登录的cDNA序列相同。
(3)重组腺病毒载体pAdeno-TrkC的鉴定经氨苄青霉素筛选后，扩增存活菌落提取质粒，XhoI和HindIII酶切，电泳后观察结果。可见14.5kb、8.1kb、8.0kb、7.5kb、5.9kb、5.3kb、4.6kb、3.8kb、3.1kb、3.0kb、2937bp、2802bp、2466bp、2081bp、1445bp、595bp和75bp。I-CeuI和PI-SceI双酶切，结果为32kb的腺病毒骨架和3.8kb的表达盒。
(4)细胞包装脂质体转染pAdeno-TrkC入293细胞后第4-5天，293细胞出现收缩、变圆等病理改变，第9-10天细胞出现噬斑，噬斑周围病变细胞呈原形，第12天有部分细胞剥离。
(5)293细胞的Adeno-TrkC鉴定转染Adeno-TrkC的293细胞和未转染的293细胞均有特异性条带，做半定量RT-PCR，并将特异性条带做灰度分析。
(6)体外培养神经干细胞约培养3天，神经干细胞可形成神经干细胞球。
(7)免疫细胞化学染色转染Adeno-TrkC的神经干细胞呈TrkC阳性染色，转染Adeno-LacZ的神经干细胞以及神经干细胞本身NT-3呈阴性染色。
(8)Western blot转染Adeno-TrkC的神经干细胞有特异性TrkC条带，分子量大小约为145KD。阴性对照和空白对照均无此特异性条带。
附表 4组神经干细胞分化为MAP-2、GFAP和nestin阳性细胞百分率的比较
注Ad-TrkC+Ad-NT-3 VS Ad-NT-3，Ad-TrkC+Ad-NT-3 VS Ad-TrkC，Ad-TrkC+Ad-NT-3 d-TrkC VSAd-LacZ，Ad-NT3 VS Ad-LacZ，Ad-TrkC VS Ad-LacZ，P＜0.05；Ad-NT-3 VS Ad-TrkC，P＞0.05(9)Adeno-TrkC的活性检测体外培养2d后，多数神经干细胞基本上贴壁并逐渐长出突起呈分化状态。根据免疫荧光化学染色显示，4组的神经干细胞中均有部分细胞分化为MAP-2、GFAP和nestin阳性细胞。经观察及计数发现(附表)，Ad-TrkC+Ad-NT-3组的MAP2阳性细胞百分率明显高于其它各组，而GFAP、nestin阳性细胞百分率明显低于其它各组，且有统计学差异(P＜0.05)；Ad-NT-3组和Ad-TrkC组的MAP-2阳性细胞百分率明显高于Ad-LacZ组，而GFAP、nestin阳性细胞百分率明显低于Ad-LacZ组，且有统计学差异(P＜0.05)；Ad-NT-3组和Ad-TrkC组间无差异(P＞0.05)。
9.实验结果表明应用体外连接法已构建了人TrkC基因重组腺病毒表达载体(Adeno-TrkC)，这种重组腺病毒载体能在神经干细胞内表达，且具有促进神经干细胞分化为神经元样细胞活性的作用，这为进一步应用NT-3和TrkC联合进行基因治疗中枢神经损伤研究奠定了基础。
权利要求
1.一种人神经营养素-3受体基因重组腺病毒构建方法，其特征是，该方法包括(1)引物设计合成从GenBank检索人TrkC基因，针对基因全长设计两端引物；(2)RT-PCR过程取人脑mRNA进行反转录，反应结束后，取反应液5ml于1％琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像系统观察结果；(3)克隆穿梭载体pShuttle-TrkC的构建及鉴定取RT-PCR反应液，0.8％琼脂糖凝胶电泳后，割胶纯化目的基因(TrkC)片断；连接纯化TrkC基因和线性化的pShuttle，将产物扩增并提取质粒，再测序鉴定质粒中目的基因的序列；(4)重组腺病毒载体pAdeno-TrkC的构建及鉴定将pShuttle-TrkC与腺病毒骨架质粒连接，常规方法转化后进行扩增并提取质粒，并测序鉴定；(5)293细胞包装pAdeno-TrkC用脂质体介导转染HEK293细胞，转染后第10天出现293细胞病变；收集病变细胞于-80℃/37℃反复冻融3次获得病毒粗裂解液，并反复感染293细胞扩增病毒；(6)重组腺病毒的鉴定①PCR鉴定抽提病毒DNA为模板，以目的基因的上、下游引物进行PCR鉴定；②RT-PCR鉴定Ad-TrkC感染293细胞后收获细胞，用Trizol试剂提取总RNA进行反转录；反应结束后，取反应液5ml于1％琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像系统观察结果；③免疫细胞化学染色将上述粗裂解的病毒液感染体外培养的神经干细胞球，用免疫细胞化学染色证实是否Ad-TrkC转染；④Western blot粗裂解的Ad-TrkC病毒液感染神经干细胞24小时后，裂解细胞做Western blot证实是否有TrkC表达；(7)人神经营养素-3受体基因重组腺病毒表达载体的生物学活性检测体外培养取自于绿色荧光小鼠海马的神经干细胞，观察神经营养素-3和神经营养素-3受体对体外培养的神经干细胞诱导分化的影响。
全文摘要
本发明涉及一种用人神经营养素－3受体基因(人TrkC基因)重组的腺病毒表达载体的构建方法及其应用。本发明的基本方案包括引物设计合成，RT－PCR过程，克隆穿梭载体pShuttle－TrkC的构建及鉴定，重组腺病毒载体pAdeno－TrkC的构建及鉴定，293细胞包装，重组腺病毒的鉴定，人神经营养素－3受体基因重组腺病毒表达载体的生物学活性检测等步骤。本发明的优点在于选择一种基因重组腺病毒表达载体来促进受损伤的中枢神经元存活及其轴突再生，以及促进神经干细胞更多地分化为神经元，替换受损伤的神经元或死亡的神经元。
文档编号C12N15/861GK1683541SQ200510033569
公开日2005年10月19日 申请日期2005年3月17日 优先权日2005年3月17日
发明者曾园山, 王俊梅 申请人:中山大学中山医学院科技开发中心