专利名称：一种转基因牛的获得方法
技术领域：
本发明涉及动物转基因技术及细胞工程领域中的一种乳汁成分改进的转基因牛的获得方法。
背景技术：
“一杯奶强健一个民族”，随着生活水平的提高，人们对奶制品的需求量越来越大。目前，中国已进入了奶制品需求的快速增长期，近年来奶制品的人均消费增长率每年都超过10％。至2015年，中国奶产品消费总量将达到2500万吨，年均增长6.8％，增长速度高于世界同期的1-2％。但中国奶产品的生产还处在一个比较落后的水平。随着对奶制品需求的增加，奶制品的品质越来越受到人们的关注。
摄入牛奶可导致人体过敏是不争的事实。牛奶过敏症是指人体对牛奶(主要是牛奶中的某些蛋白质如α-S1酪蛋白和β-乳球蛋白)产生过敏反应，也叫做牛奶蛋白不耐受。牛奶中的某些蛋白质如α-S1酪蛋白和β-乳球蛋白是目前公认的过敏源。正常情况下，如果这两种蛋白质能被人体消化吸收则不会引起人体的过敏反应(即过敏源能被人体消化系统破坏)。但是，如果人体的消化能力不足，则这两种蛋白质可能以未被消化的形式进入人体，从而引起过敏反应。
新生婴幼儿和老年人是容易发病人群。老年人因为消化能力下降，对大分子长链蛋白质难于消化，而新生婴幼儿则是因为他们的消化系统和免疫系统尚未发育完全。一般对新生婴幼儿而言，0-6个月是最敏感的时期。
对付婴幼儿牛奶过敏症有两种办法切断过敏源和药物治疗。
药物治疗虽能在短时间内控制过敏的临床症状，但是停药后，若宝宝继续食用牛奶，则过敏的症状又会再次出现。而且，药物治疗潜在的副作用不容忽视，尤其是针对皮疹(湿疹、奶癣)症状，经常会使用激素药膏。而长期反复使用激素类药物会对宝宝产生较大的不良影响。
正常牛乳中含有约2.2-4.4％的蛋白质，是牛乳中最重要的营养物质之一。牛乳中的蛋白质主要包括酪蛋白、乳清蛋白及少量的脂肪球膜蛋白等。β-乳球蛋白属于乳清蛋白的一种，在牛乳中的含量大约为2-4g/L。β-乳球蛋白是反刍动物中最主要的乳清蛋白，也存在于某些非反刍动物中，比如猪、马、猫、狗、袋鼠、海豚和鲸鱼。但人类、啮齿类和兔类的乳汁中不含有该蛋白。在正常生理条件下，β-乳球蛋白以同源二聚体的形式存在，分子量为36,400道尔顿。在pH2-3或pH大于9的条件下，可以解聚为单体，在pH3.5-5.5，4℃的条件下，可以形成八聚体，即4个二聚体，以422对称存在。
编码β-乳球蛋白的基因全长4729bp，包含7个外显子和6个内含子，其原始转录物编码178个氨基酸残基，包括长度16个氨基酸残基的信号肽，其成熟肽含有162个氨基酸残基，其中α-螺旋结构约占15％，β-折叠结构约占50％。
基因敲除技术的分子生物学基础是同源重组(homologous recombination)，基因的同源重组是较普遍的生物学现象，从噬菌体、细菌到真核生物都有存在。同源重组发生的几率一般在10-5-10-7之间，而非同源重组的发生几率却可以达到10-2-10-4之间。同源重组除可在DNA分子间进行，还可在RNA分子间或RNA与DNA分子间进行。
基因敲除技术是70年代在酿酒酵母(S.cerevisiae)中建立起来的。1985年，Smithies等人首次利用同源重组将一段外源质粒PΔβ117插入到人染色体的β-globin位点，这是在哺乳动物细胞中打靶成功的第一例(Smithies，Ronald G等，Insertion of DNAsequences into the human chromosomal β-globin locus by homologousrecombination.Nature，1985，317230-234)。1987年，Thomas和Capecchi等两个研究小组同时报道在ES(Embryo Stem)细胞进行了基因的定位敲除(Thomas K R和Capecchi等，Site-directed mutagenesis by gene targeting in mouseembryo-derived stem cells.Cell，1987，51503-512)。此后，用小鼠ES细胞进行基因敲除的研究蓬勃发展，现已成为研究基因结构功能和建立人遗传性疾病模型的一种常规实验方法。迄今已建立的突变小鼠有近千种，并以每年数百种的速度增长。
由于人、鼠在生理学上具有较大差异，小鼠模型也有其局限性。用大动物进行基因敲除操作可省去烦琐的分离动物胚胎干细胞的步骤，并避免了小鼠产生嵌合体的麻烦，可大大提高生产效率。此外，家畜如猪、牛、羊等在解剖和生理学上更接近人类，用它们做疾病动物模型更接近人。例如敲除膀胱纤维化跨膜诱导调节因子(Cfrt)基因的小鼠模型未能明显表现出类似人体条件下的肺部疾病特征，这主要是人和鼠的肺部生理学上存在较大差异造成的。但敲除Cfrt基因的绵羊可能会产生类似人体膀胱纤维化的精确模型，因为人和绵羊的肺部生理很相似。
大动物的基因打靶研究远远落后于小鼠，主要是因为其它动物无法建立ES细胞系，而体细胞克隆技术是自1997年克隆羊“Dolly”诞生之后才开展起来的。2000年6月，世界上第一只通过核移植生产的体细胞基因打靶绵羊诞生。PPL公司的McCreath等人在Nature上报道了选择COL1A1基因对羊胎儿成纤维细胞进行基因打靶，得到三只存活羔羊(McCreath等，Production of gene targeted sheep by nucleartransfection from cultured somatic cells.Nature，2000，4051066-1069)。这一结果标志着定点改变基因结构、修复缺陷基因、敲除有害基因等遗传工程方法的开始。利用该方法制备的转基因羊外源基因的表达量可达60g/L乳汁，开辟了转基因动物生产的新纪元。2002年2月，赖良学等人在Science报道了用克隆的方法生产了敲除α-1.3-半乳糖苷酶基因的克隆猪，猪细胞表面的末端α-1.3半乳糖苷(Gal)抗原决定簇的存在是用猪进行异种移植时发生亚急性排斥反应的根源。
发明内容
本发明的目的是提供一种乳汁成分得到改进的转基因牛的获得方法。
本发明所提供的转基因牛的获得方法，是将线性化的携带有插入突变的β-乳球蛋白基因的靶载体通过同源重组与体细胞结合，形成β-乳球蛋白基因沉默的介导细胞，将介导细胞核导入牛的去核卵母细胞中得到重构胚，再将重构胚移入代孕母牛子宫中，得到的子代即为转基因牛。
所述携带有突变的β-乳球蛋白基因的靶载体可具有序列表中序列1的核苷酸序列；所述移入代孕母牛子宫中的重构胚是囊胚期胚。
所述体细胞可为牛胎儿成纤维细胞；所述牛胎儿成纤维细胞可为牛胎儿的耳成纤维细胞、皮肤成纤维细胞、输卵管上皮细胞、颗粒细胞或成年成纤维细胞等，优选为牛胎儿的耳成纤维细胞。
将线性化的携带有突变的β-乳球蛋白基因的靶载体转染牛胎儿成纤维细胞方法可为电转染法、脂质体转染法、磷酸钙共沉淀法等常规的生物学转染方法，优选为电转染法。
所述电转染的条件为DNA浓度为18-22μg/mL，电场强度为1.2kV/cm，脉冲时间为7ms。
为提高转基因效率，所述去核卵母细胞不含有第一极体。
所述将整合有线性化的携带有突变的β-乳球蛋白基因的靶载体的介导细胞核导入牛的去核卵母细胞的方法为显微注射法。
本发明利用同源重组和体细胞克隆的方法将线性化的携带有插入突变的β-乳球蛋白基因的靶载体的体细胞核导入牛的去核卵母细胞中，使之与细胞染色体内同源的靶序列进行重组，最终得到β-乳球蛋白基因沉默的子代。用本发明所提供的方法获得的转基因牛生产的乳汁，其乳汁成分中不含有β-乳球蛋白，更加近似于人奶，既有营养，又不会引起对牛奶的过敏反应，使牛奶具有了更广泛的食用人群。本发明具有较高的实际应用价值和广阔的市场前景。
图1为体细胞克隆β-乳球蛋白基因敲除转基因牛的生产流程2为β-乳球蛋白基因敲除载体构建示意3为转基因克隆牛的PCR检测结果图4为转基因克隆牛的PCR检测结果图5为转基因克隆牛的Southern鉴定结果图6为转基因克隆牛的Southern鉴定结果具体实施方式
下述实施例中如无特别说明均为常规方法，所用试剂及药品如无特别说明均购自Sigma公司。
实施例1、体细胞克隆β-乳球蛋白基因敲除的转基因牛的生产及分子生物学检测体细胞克隆β-乳球蛋白基因敲除转基因牛的生产流程如图1所示，具体过程包括以下步骤1、β-乳球蛋白基因敲除靶载体的构建β-乳球蛋白基因敲除载体构建过程如图2所示，具体方法如下以牛胎儿成纤维细胞的基因组DNA为模板，在引物pLeft upper5’-cagcggccgctagactgtgtgaatgcccactgac-3’(带下划线部分碱基为限制性内切酶NotI识别位点)和引物pLeft lower5’-ctctcgagcttcatggtctgggtgacaatgag-3’(带下划线部分碱基为限制性内切酶XhoI识别位点)的引导下，PCR扩增2488bp的DNA片段，PCR反应条件为94℃5min；94℃30s，58℃30s，72℃150s，30个循环；72℃7min。反应结束后对PCR产物进行0.7％琼脂糖凝胶电泳检测，回收2488bp的特异性PCR产物，将其用限制性内切酶Not I和Xho I酶切后与经相同酶酶切的载体pLox连接，然后将连接产物转化E.coli DH5α感受态细胞，经蓝白斑筛选后挑选白色单菌落提质粒，并进行酶切和测序鉴定，得到含有目的片段的重组载体，命名为pLox-BLG-Left，在该质粒中包含了β-乳球蛋白基因的启动区和第一外显子。
以牛胎儿成纤维细胞的基因组DNA为模板，在引物pRight upper5’-tcattgtcacccagaccatgaag-3’和引物pRight lower5’-tgccaccgagcggctgtcctgg-3’的引导下，PCR扩增6326bp的DNA片段，PCR反应条件为94℃5min；94℃30s，66℃30s，72℃7min，30个循环；72℃10min。反应结束后对PCR产物进行0.7％琼脂糖凝胶电泳检测，回收6326bp的特异性PCR产物，将其与载体pMD18-T(具有G418抗性标记基因，TaKaRa公司)连接，然后将连接产物转化E.coli DH5α感受态细胞，经蓝白斑筛选后挑选白色单菌落提质粒，并进行酶切和测序鉴定，得到含有目的片段的重组载体，命名为pMD18-Right，在该质粒中包含了β-乳球蛋白基因的部分第一外显子和编码区。
将pMD18-Right用限制性内切酶Xba I和Sal I酶切后与经相同酶酶切的重组载体pLox-BLG-Left连接，然后将连接产物转化E.coli DH5α感受态细胞，经蓝白斑筛选后挑选白色单菌落提质粒，并进行酶切和测序鉴定，得到β-乳球蛋白基因敲除靶载体，命名为pLox-BLG-KO，对其进行核苷酸序列测定，该载体具有序列表中序列1的核苷酸序列，与正常的β-乳球蛋白基因的核苷酸序列相比，载体上β-乳球蛋白基因的开放阅读框获得了插入突变。将质粒载体pLox-BLG-KO经限制性内切酶Not I酶切线性化后，进行0.7％琼脂糖凝胶电泳检测，用QIAEX II试剂盒(QIAGEN公司)回收并纯化16874bp的线性片段，将其溶解于经灭菌的超纯水中，-20℃保存。该序列中自5’端第6-2487位DNA序列为包含BLG基因的启动区序列和第一外显子的同源左臂序列，自5’端第2562-4335位DNA序列为插入的新霉素基因，自5’端第4382-10702位DNA序列为包含BLG基因部分第一外显子及其编码序列的同源右臂序列，自5’端第11254-12450位DNA序列为tk基因的编码区。
2、牛胎儿耳成纤维细胞系的建立选用5月龄的荷斯坦奶牛胎儿(购自北京市奶牛中心)，取下胎儿耳朵，用PBS和70％酒精清洗数遍后，剪碎成体积约为1mm3的小块，再用DMEM培养基(Invitrogen公司)清洗2遍后分批植块于装有3mL DMEM培养基(含10％FBS)的容积为75cm3的培养瓶中，待组织块贴壁牢固后再补加DMEM(含10％FBS)至10mL，将其置于37℃、5％CO2的培养箱中培养6-7d，每2d换液1次，待细胞生长汇合后，用0.25％胰蛋白酶(Invitrogen公司)消化再传代2-3次，液氮保存(冻存液成分为60％DMEM，30％FBS和10％DMSO)，得到牛胎儿耳成纤维细胞系。
3、牛胎儿耳成纤维细胞的电转染和筛选收集处于对数生长期的牛胎儿耳成纤维细胞，用电击液HeBS(含140mmol/L NaCl，5mmol/L KCl，0.75mmol/L Na2HPO4，6mmol/L葡萄糖和25mmol/L Hepes)重悬细胞至浓度为5×106个/mL，在DNA浓度为20μg/mL、电场强度为1.2kV/cm、脉冲时间为7ms的条件下进行电击，将载体pLox-BLG-KO的线性化片段转染牛胎儿耳成纤维细胞，48h后加入800μg/mL G418和2uM/L Gancvilor(Sigma)作为筛选压力进行筛选，每2-3d换液1次，14d后用0.25％胰蛋白酶(trypsin)消化收集克隆点细胞并继续用300μg/mLG418和2uM/L Gancvilor筛选4-5代，待生长汇合并血清饥饿2-4d后用于体细胞核移植。
4、卵母细胞的成熟培养将成年黄牛的卵巢(取自周边地区屠宰场)用37℃的PBS液清洗三遍后，用直径为0.7mm的针头抽取直径为2-8mm的卵泡，回收形态均匀、结构致密的卵丘-卵母细胞-复合体(COCs)，将其用成熟液(在M199的基础上添加10％FBS，0.01U/mL bFSH，0.01U/mL bLH和1μg/mL雌二醇)洗涤两遍，然后将卵丘-卵母细胞-复合体按50-60枚/孔放入含成熟液的四孔板，置于38.5℃、5％CO2培养箱中成熟培养18-20h后，将成熟的卵母细胞放入含0.1％透明质酸酶的管内振荡2-3min后，再用玻璃管轻轻吹打，使卵丘细胞与卵母细胞完全脱离，选择形态完整，细胞质均匀并排出第一极体的卵母细胞为胞质受体。
5、核移植和克隆胚胎的体外培养将步骤4获得的带有第一极体的卵母细胞移入操作液(在M199的基础上添加了10％FBS和7.5μg/mL细胞松驰素B)中，在200倍显微镜下用一玻璃针于极体上方将透明带切一小口，再用内径为20μm的玻璃管将第一极体及其下方的卵母细胞内的染色体一并吸除，再用含20％FBS的M199液体培养基洗三遍后，置于38.5℃、5％CO2培养箱中备用。将步骤3获得的血清饥饿2-4d的转基因细胞用0.25％胰蛋白酶(trypsin)消化2-4min，选择直径为10-12μm的胎儿耳成纤维细胞核，用20μm直径玻璃管将其移入去核的卵母细胞透明带内，然后将其放入含0.3M甘露醇(Mannitol)，0.15mmol/L Ca2+和0.15mmol/L Mg2+的溶液中，3-5min后放入融合槽内，转动卵细胞使供体细胞核与卵母细胞接触面与电场垂直，同时在直流脉冲的场强为2.5kV/cm、脉冲时间为10μs、脉冲次数为2次、脉冲间隔为1s的条件下融合(融合仪为BTX公司的ECM-2001)后，迅速将重构胚移入含10％FBS的M199液体培养基中，放置0.5h后观察融合率，挑选融合胚进行下一步的激活处理。将重构胚放入5μmol/L离子霉素(Ionomycin，Sigma)液中，4min后移至1.9mmol/L 6-DMAP液中，4h后再移入含5％FBS的CR1aa液中，在38.5℃、5％CO2培养箱中培养，分别在2d和7d后观察胚胎的发育状况。
6、胚胎移植与妊娠检测将形态优良的第7d的克隆囊胚移入已同期的受体牛的子宫角内。在移植后的第30d对受体母牛进行B超检测以确定受胎情况，并分别在移植后的第60d和第90d进行直肠检测以确定妊娠率。共移植受体牛15头，移植后第60d的直肠检测表明，其中8头怀孕。最终有2头转基因克隆牛出生，产犊率为13.3％。
7、转基因克隆牛的分子生物学鉴定1)PCR鉴定采集步骤6获得的转基因和非转基因克隆牛耳部的组织样品，按常规方法提取基因组DNA，并以其为模板，分别在引物对1(引物T1upper5’-GTCTGAAGGCAGCTCGCTGTG-3’和引物T1 lower5’-GGGAAACCAGGGCACGCAAAG-3’)和引物对2(引物T2 upper5’-TATTGGCAGGCAGATTCTTTACCAC-3’和引物T2 lower5’-tgttaagcgggtcgctgca-3’)的引导下，对转基因和非转基因克隆牛的基因组DNA进行PCR检测，以普通荷斯坦奶牛的基因组DNA作为阴性对照，以β-乳球蛋白基因的敲除载体pLox-BLG-KO作为阳性对照。引物对1的PCR反应条件为先94℃5min；然后94℃30sec，61℃30sec，72℃180sec，共30个循环；最后72℃7min。反应结束后对PCR产物进行0.7％琼脂糖凝胶电泳检测，检测结果如图3(泳道1为1kb Marker，泳道2为阳性质粒pLox-BLG-KO，泳道3为灭菌蒸馏水，泳道4为普通荷斯坦奶牛，泳道5和泳道6为β-乳球蛋白基因敲除克隆牛)所示，表明转基因克隆牛可扩增出1143bp的野生型条带和3087bp的插入型条带，而普通荷斯坦奶牛仅能扩出1143bp的野生型条带。引物对2的PCR反应条件为先94℃5min；然后94℃30sec，61℃60sec，72℃30sec，共30个循环；最后72℃7min。反应结束后对PCR产物进行0.7％琼脂糖凝胶电泳检测，检测结果如图4(泳道1为1kb Marker，泳道2为阳性质粒pLox-BLG-KO，泳道3为灭菌蒸馏水，泳道4为普通荷斯坦奶牛，泳道5和泳道6为β-乳球蛋白基因敲除克隆牛)所示，表明转基因克隆牛与正常荷斯坦奶牛都不能扩增出1182bp的tk基因条带，而只能在载体上扩增得到。
2)Southern鉴定取约10μg转基因克隆牛耳部组织的基因组DNA，用限制性内切酶Eco72I酶切消化，30V低压电泳，转膜后，进行Southern杂交，杂交所用探针为α-P32dCTP同位素标记的、经限制性内切酶XhoI和XbaI酶切消化的pLox-BLG-KO载体回收产物，以普通荷斯坦奶牛的基因组DNA作为阴性对照，以敲除载体pLox-BLG-KO作为阳性对照，杂交阳性信号为3.2kb片段，结果如图5所示(泳道1，2为两头β-乳球蛋白基因敲除克隆牛，泳道3为普通荷斯坦奶牛，泳道4为1拷贝阳性质粒，泳道5为5拷贝阳性质粒，泳道6为10拷贝阳性质粒)又约10μg转基因克隆牛耳部组织的基因组DNA，用限制性内切酶MscI酶切消化，30V低压电泳，转膜后，进行Southern杂交，杂交所用探针为α-P32dCTP同位素标记的、经限制性内切酶SalI和HindIII酶切消化的pLox-BLG-KO载体回收产物，以普通荷斯坦奶牛的基因组DNA作为阴性对照，以敲除载体pLox-BLG-KO作为阳性对照，杂交阳性信号为5.6kb片段，如图6所示(泳道1，2为两头β-乳球蛋白基因敲除克隆牛，泳道3为普通荷斯坦奶牛，泳道4为1拷贝阳性质粒，泳道5为5拷贝阳性质粒，泳道6为10拷贝阳性质粒)。上述结果表明在这两头β-乳球蛋白敲除个体的基因组的BLG基因座位上发生了预期的同源重组。Southern Blot鉴定结果和PCR检测结果完全一致。
进一步的跟踪实验表明，用本发明的方法得到的转基因牛长成后，其分泌的乳汁中不含有β-乳球蛋白，但其它的成分与普通牛奶没有差别。
序列表<160>1<210>1<211>16874<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>1ggccgctaga ctgtgtgaat gcccactgac cctgcccagc cccacagttt cattctgaga60gaagtgattt cttgcttctg cacttacagg cccaagacct gacctgcttc tgaagagcag120gggttttggc aggaggggga gatgctgaga gccgatgggg gtccaggtct cctcccaggt180cccactctct ggggcagcgc ttggaaaaga ttgtccagcc tccctcccat agtggtcagt240gccagctgcc ccaggccaga ggtgctttat ttccgtctct ctctctggat ggtattctct300ggaagctgaa ggttcctgga agttatgaat agctttgcca tgaagggcat ggtttgtggt360catggttcac aggaacttgg gagaccctgc agctcggacg tcctgaggtt ggtggcaccc420tgatttccta agctcgctgg ggaacggggt gctacttctc cctggctgac ctccctctgc480tctgcatcac ccagttctga gagcagagtg gtgctggggg cacagcctct cgcatctgac540acttgtgttc aaaccaccca tgctggtgtt cggggggcca cctatgggga aggctcctca600ctgcaggggt gcccctgtcc cctgagagat cagaagtccc agtctggatg tcgaatggcc660gagctccctc cagaggctcc agggagggat ccttgccccc tccgccgccg cctccagctc720ctggtgccgc acccttgggc ccgatctcgt agacgcctca gtccagtctc tgcctccgtg780ttcactggca ttctccccat gtcccctctg tgtccccgtt ttctctcaca aggacaccgg840acataagatt agcccccgtt ccagcatcac ctgaacagct cacatctgta aagacctaga900ttccaaacaa gattccatcc tgaagttcct ggtggacgtg agttctggag cgacgccctt960caaccccatc acagcttgcg gttcatcgca aaacacggaa cctgggattt atcgtaaaac 1020ccaggttctt cgtgaaacac tgagcttcga ggcttgttgc aagaattaaa ggtgctaata 1080cagatcaggg caaggaccga agctggccaa gcctcctctt tccatcacag gaaagggagg 1140tctgggggcg gccgggggtc tgctcccgtg ggtgggctct ttctggtaca gtcaccaaca 1200gtctctccgg gaaggaaacc agaggccaga gagcaagcca gagctagtct aggagatccc 1260
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1.一种转基因牛的获得方法，是将线性化的携带有突变的β-乳球蛋白基因的靶载体通过同源重组与体细胞结合，形成β-乳球蛋白基因沉默的介导细胞，将介导细胞核导入牛的去核卵母细胞中得到重构胚，再将重构胚移入代孕牛子宫中，得到的子代即为转基因牛。
2.根据权利要求1所述的转基因牛的获得方法，其特征在于所述携带有突变的β-乳球蛋白基因的靶载体具有序列表中序列1的核苷酸序列；所述移入代孕牛子宫中的重构胚是囊胚期胚。
3.根据权利要求1或2所述的转基因牛的获得方法，其特征在于所述体细胞为牛胎儿成纤维细胞。
4.根据权利要求3所述的转基因牛的获得方法，其特征在于所述牛胎儿成纤维细胞为耳成纤维细胞、皮肤成纤维细胞、输卵管上皮细胞或卵丘细胞。
5.根据权利要求4所述的转基因牛的获得方法，其特征在于所述牛胎儿成纤维细胞为耳成纤维细胞。
6.根据权利要求3所述的转基因牛的获得方法，其特征在于所述将线性化的携带有突变的β-乳球蛋白基因的靶载体转染牛胎儿成纤维细胞方法为电转染法、脂质体转染法或磷酸钙沉淀法。
7.根据权利要求6所述的转基因牛的获得方法，其特征在于所述将线性化的携带有突变的β-乳球蛋白基因的靶载体转染牛胎儿成纤维细胞方法为电转染法。
8.根据权利要求7所述的转基因牛的获得方法，其特征在于所述电转染的条件为DNA浓度18-22μg/mL，电场强度1.2kV/cm，脉冲时间7ms。
9.根据权利要求1或2所述的转基因牛的获得方法，其特征在于所述去核卵母细胞带有第一极体。
10.根据权利要求1或2所述的转基因牛的获得方法，其特征在于所述将整合有线性化的携带有突变的β-乳球蛋白基因的靶载体的介导细胞核导入牛的去核卵母细胞的方法为显微注射法。
全文摘要
本发明公开了一种转基因牛的获得方法。该转基因牛的获得方法，是将线性化的携带有突变的β－乳球蛋白基因的靶载体通过同源重组与体细胞结合，形成β－乳球蛋白基因沉默的介导细胞，将介导细胞核导入牛的去核卵母细胞中得到重构胚，再将重构胚移入代孕牛子宫中，得到的子代即为转基因牛。用本发明所提供的方法获得的转基因牛生产的乳汁，其乳汁成分中不含有β－乳球蛋白，更加近似于人奶，既有营养，又不会引起对牛奶的过敏反应，使牛奶具有了更广泛的食用人群。本发明具有较高的实际应用价值和广阔的市场前景。
文档编号C12N15/87GK1865448SQ20051007097
公开日2006年11月22日 申请日期2005年5月19日 优先权日2005年5月19日
发明者徐慰倬, 李宁, 戴蕴平 申请人:李宁