专利名称：一种黄瓜霜霉病菌菌株的保存方法
技术领域：
本发明涉及植物保护领域中一种专性寄生菌的保存方法，特别是涉及黄瓜霜霉病菌菌株的一种保存方法。
背景技术：
黄瓜是我国蔬菜产区露地和保护地栽培的主要种植品种，在多数地区可以整年种植。霜霉病是黄瓜生产上最重要的病害之一，凡栽培黄瓜的地区均有发生，在我国尤以北方地区受害最重，露地栽培以春茬黄瓜发病最重，保护地栽培则春季或冬季发病较重。该病主要由气流传播，具有侵染频繁、潜育期短的特点，流行危害严重，能在几日内导致植物全部死亡，俗称“跑马干”，也因在其发病后，黄瓜叶背出现大量紫褐色的霉状物，而称之为“黑毛病”。
黄瓜霜霉病的病原菌为古巴假霜霉菌(Pseudoperonospora cubensis(Berk.EtCert.)Rostr.)，该菌是一种专性寄生菌，其孢子萌发后菌丝主要在寄主细胞间隙扩展，不能在人工培养基上生长，因此该菌株难于在离体条件下进行长期的保存。国内外的许多研究机构和农化企业现正加紧研制对该致病菌具有有效防治效果的新型杀菌剂。在用所研制的不同杀菌剂对黄瓜霜霉病菌进行毒力测定时需要用到大量的该活体致病菌，因此迫切需要一种黄瓜霜霉病菌菌株的长期保存方法。
发明内容
本发明的目的是提供一种黄瓜霜霉病菌菌株的较长期的保存方法。
本发明所提供的黄瓜霜霉病菌菌株的保存方法，是在无菌条件下，用经消毒的黄瓜植株第3-6叶位上的健康离体叶片制成叶碟，将每个叶碟背面滴加黄瓜霜霉病菌的孢子囊悬浮液，然后将其在17-20℃黑暗条件下保湿培养20-28h，再于17-20℃、湿度RH大于80％、10-14h光暗交替条件下保湿培养，待叶碟背面产生黑色霉层后，置于-30℃至-80℃下密闭保存。
上述方法中，所述健康离体叶片优选为黄瓜植株第4叶位上的叶片；叶碟的尺寸为Φ1.2-2.0cm，优选为Φ1.5cm；黄瓜霜霉病菌的孢子囊悬浮液的浓度为1×104-1×105个孢子囊/mL，优选为1.0×104个孢子囊/mL；每个叶碟背面滴加的孢子囊悬浮液的体积为10μL；背面滴加有黄瓜霜霉病菌的孢子囊悬浮液的叶碟的培养条件优选为先在19℃的黑暗条件下保湿培养24h，再于19℃、湿度RH大于80％、12h光暗交替条件下保湿培养；保存温度优选为-80℃。
所述孢子囊悬浮液的获得方法为；田间采集叶背面有黑色霉层的病叶，室内将病叶上的杂质和老熟的孢子囊洗净后，在19℃下暗培养诱导产生新的孢子囊，再将新生孢子囊接种到无菌的健康离体黄瓜叶片背面，置于17-20℃黑暗条件下保湿培养20-28h，再于17-20℃、湿度RH大于80％、10-14h光暗交替条件下保湿培养，待叶片背面产生黑色霉层后，挑取单根的孢囊梗进行菌株的纯化，并将单孢囊梗及其着生的孢子囊转接到健康黄瓜第3-5叶位上的离体叶片背面在17-20℃下保湿培养，发病后洗脱病斑上的孢子囊配成孢子囊悬浮液。
在上述孢子囊悬浮液的获得方法中，新生孢子囊的接种方法为液滴法，用液滴法接种时所用的新生孢子囊悬浮液的浓度优选为1.0×104个孢子囊/mL，接种体积为10μL；背面接种有黄瓜霜霉病菌孢子囊的黄瓜叶片的培养条件优选为先在19℃的黑暗条件下保湿培养24h，再于19℃、湿度RH大于80％、12h光暗交替条件下培养。
在实际应用中，可将上述方法保存的黄瓜霜霉病菌菌株放入冰盒中使其缓慢升温，以免孢子囊骤热而开裂，然后洗脱孢子囊，制成孢子囊悬浮液即可使用。
本发明根据黄瓜霜霉病菌在低温下能存活的特点，提供了一种低温冷藏条件下保存黄瓜霜霉病菌菌株的简便、长久的方法。可使黄瓜霜霉病菌菌株在60天内均保持较高活性，可用叶盘漂浮法等常规的毒力测定法对其进行毒力测定，测定结果表明用该法保存的菌株在60d内的致病力均与空白对照一致，无明显差异，可用于杀菌剂对黄瓜霜霉病菌的毒力测定，为研究黄瓜霜霉病的防治提供了极大方便。本发明具有较高的实际应用价值。
图1为从田间发病植株采集的叶背面有明显褐色霉层的病叶图2为在病叶上诱导产生的新孢子囊图3为接种有新生孢子囊悬浮液的健康离体黄瓜叶片图4为将接种有新生孢子囊悬浮液的健康离体的黄瓜植株的叶片进行暗培养后于19℃、湿度RH大于80％、12h光暗交替的条件下培养具体实施方式
下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法。
供试植物材料将感病黄瓜品种长春密刺栽培于Φ15cm，高12cm的育苗钵内，置于玻璃温室中培养，待植株长到6叶期后采集健康植株第4叶位的叶片，用于黄瓜霜霉病菌的培养及菌株的低温冷冻保藏。
实施例1、黄瓜霜霉病菌的分离培养和保存1、黄瓜霜霉病样采集和病菌的分离培养从北京郊区的平谷东高村崔庄子科技园、怀柔王化村西菜地、延庆永宁镇孔化营村、昌平南郝庄苹园及中国农业大学昌平实验站、房山豆店村、海淀区西北旺村及河北峦平、内蒙等地区未施用过氟吗啉及同类药剂烯酰吗啉的黄瓜栽培地采集黄瓜霜霉病菌样本，共分离得到77株敏感菌株，同时从北京郊区分离得到6株对甲霜灵具有不同抗性水平的抗药性菌株；从进行过2年腈嘧菌酯田间药效试验的大棚分离得到6株腈嘧菌酯抗药性菌株。具体方法为将从田间发病植株采集的叶背面有明显褐色霉层的病叶(图1)用蒸馏水将叶片上残留的杂质和老熟的孢子囊洗净，然后置于19℃的条件下黑暗培养24h，诱导产生新的孢子囊(图2)。用4℃无菌水将新产生的孢子囊洗脱，配成每毫升含有1×104个孢子囊的悬浮液，用液滴法接种到用无菌水冲洗后的健康离体的黄瓜植株的叶片背面，每滴10μL，再将其置于用吸水纸保湿的Φ150mm培养皿中于19℃黑暗条件下培养24h(图3)，以确保病原菌的侵入，然后于19℃、湿度RH大于80％、12h光暗交替的条件下培养(图4)，叶片接菌3d后可以观察到不规则的水浸状病斑，5d后叶片背面产生黑色霉层。在解剖镜下挑取单根的孢囊梗进行菌株的纯化，并将挑取的单孢囊梗及其着生的孢子囊转移到健康的离体黄瓜叶片背面进行保湿培养，病原菌在黄瓜离体叶片上能保存10-15d。可继续用4℃无菌水洗脱病斑上的孢子囊，转接到新鲜的健康黄瓜离体叶片上继代培养。
2、黄瓜霜霉病菌的低温冷藏保存选择黄瓜植株第4叶位的健康离体叶片，进行表面消毒处理后，用打孔器制取Φ1.5cm的黄瓜叶碟，每个叶碟背面滴加用上述方法分离获得的黄瓜霜霉病菌的孢子囊配制的浓度为1×104个孢子囊/mL的孢子囊悬浮液10μL，然后按照步骤1所述的方法培养，待叶碟背面产生黑色霉层后，将其小心装入10mL具塞离心管中，分别置于4℃，-20℃，-30℃，-70℃和-80℃下保存，每个温度重复放置10管，每隔10d取1管放入冰盒中缓慢升温，以免孢子囊骤热而开裂。然后洗脱孢子囊，制成浓度为1×104个孢子囊/mL的孢子囊悬浮液，将其接种在黄瓜叶盘上，保湿培养，发病后测量病斑面积，比较各保存温度下不同保存时间病菌致病力的变化，黄瓜霜霉病菌在4℃下保存时间小于10d，-20℃下可保存20d，-30℃下至少可保存40d，-70℃和-80℃下可保存至少60d以上。但在-20℃和-30℃条件下保存，随着时间增长，菌种致病力减弱；而在-70℃和-80℃条件下，60d内菌种致病力与空白对照一致，没有显著性差异。当保存时间大于30d时，-80℃条件下菌种的致病力强于其它条件处理的菌种。
表1 黄瓜霜霉病菌在低温条件下冷藏不同时间后其致病力的变化
注a＝0.05；-未做接种实验
权利要求
1.一种黄瓜霜霉病菌菌株的保存方法，是在无菌条件下，用经消毒的黄瓜植株第3-6叶位上的健康离体叶片制成的叶碟，将每个叶碟背面滴加黄瓜霜霉病菌的孢子囊悬浮液，然后将其在17-20℃黑暗条件下保湿培养20-28h，再于17-20℃、湿度RH＞80％、光暗交替条件下保湿培养，待叶碟背面产生黑色霉层后，置于-30℃至-80℃下密闭保存。
2.根据权利要求1所述的保存方法，其特征在于所述健康离体叶片为黄瓜植株第4叶位上的叶片。
3.根据权利要求1所述的保存方法，其特征在于所述叶碟的尺寸为φ1.2-2.0cm；黄瓜霜霉病菌的孢子囊悬浮液的浓度为1×104-1×105个孢子囊/mL；每个叶碟背面滴加的孢子囊悬浮液的体积为10μL。
4.根据权利要求3所述的保存方法，其特征在于所述叶碟的尺寸为φ1.5cm；黄瓜霜霉病菌的孢子囊悬浮液的浓度为1.0×104个孢子囊/mL；每个叶碟背面滴加的孢子囊悬浮液的体积为10μL。
5.根据权利要求1或2或3或4所述的保存方法，其特征在于所述背面滴加有黄瓜霜霉病菌的孢子囊悬浮液的叶碟的培养条件为先在19℃的黑暗条件下保湿培养24h，再于19℃、湿度RH大于80％、光暗交替条件下保湿培养。
6.根据权利要求1或2或3或4所述的保存方法，其特征在于所述保存温度为-80℃。
7.根据权利要求1或2或3或4所述的保存方法，其特征在于所述孢子囊悬浮液的获得方法为将病叶上的杂质和老熟的孢子囊洗净后，在19℃下暗培养诱导产生新的孢子囊，再将新生孢子囊接种到无菌的健康离体黄瓜叶片背面，置于17-20℃黑暗条件下保湿培养20-28h，再于17-20℃、湿度RH＞80％、光暗交替条件下保湿培养，待叶片背面产生黑色霉层后，挑取单根的孢囊梗进行菌株的纯化，并将单孢囊梗及其着生的孢子囊转接到健康黄瓜第3-6叶位上的离体叶片背面在17-20℃下保湿培养，发病后洗脱病斑上的孢子囊配成孢子囊悬浮液。
8.根据权利要求7所述的保存方法，其特征在于所述新生孢子囊的接种方法为液滴法，接种时所用的新生孢子囊悬浮液的浓度为1.0×104个孢子囊/mL，接种体积为10μL。
9.根据权利要求7所述的保存方法，其特征在于所述背面接种有黄瓜霜霉病菌孢子囊的黄瓜叶片的培养条件为先在19℃的黑暗条件下保湿培养24h，再于19℃、RH＞80％、光暗交替条件下保湿培养。
全文摘要
本发明公开了一种黄瓜霜霉病菌菌株的保存方法。该保存方法为在无菌条件下，用经消毒的黄瓜植株第3－6叶位上的健康离体叶片制成直径为1.2－2.0cm的叶碟，将每个叶碟背面滴加黄瓜霜霉病菌的孢子囊悬浮液，然后将其在17－20℃黑暗条件下保湿培养20－28h，再于17－20℃、湿度RH大于80％、光暗交替条件下保湿培养，待叶碟背面产生黑色霉层后，置于－30℃至－80℃下密闭保存。本发明根据黄瓜霜霉病菌在低温下能存活的特点，提供了一种低温冷藏条件下保存黄瓜霜霉病菌菌株的简便、长久的方法，为黄瓜霜霉病的防治提供了极大方便，具有较高的实际应用价值。
文档编号C12N1/14GK1693447SQ200510070978
公开日2005年11月9日 申请日期2005年5月19日 优先权日2005年5月19日
发明者刘西莉, 朱书生, 李健强, 顾宝根, 袁善奎, 姜辉, 范洁茹 申请人:中国农业大学