生产辅酶q10的细菌菌种及生产辅酶q10的方法

专利名称：生产辅酶q10的细菌菌种及生产辅酶q10的方法
技术领域：
本发明涉及一种生产辅酶Q10的新菌株。另外，本发明涉及包含所述微生物的发酵肉汤及用于辅酶Q10的技术生产的合适的培养系统。本发明还涉及通过培养本发明的菌株以有利地生产辅酶Q10的方法。本发明的另一方面还涉及所述微生物的16srRNA。
辅酶Q(也称作CoQ、Q或泛醌)被发现普遍存在于微生物、植物、真菌和动物细胞的膜中。该分子在结构上是由共价附着于2，3-二甲氧基-5-甲基-苯醌的聚异戊二烯基侧链组成。侧链的长度在不同物种之间有所不同，其主要形式包括6-10个异戊二烯亚单位。所得泛醌同源物被分别称为辅酶Q6-10。通过人工合成的主要形式是辅酶Q10。
辅酶Q10(也称作CoQ10)对人类健康有一定益处，因此其在化妆品、药物和保健品中有广泛应用。CoQ10是一种脂溶性苯醌，具有两种主要的生物学功能(i)在有氧呼吸期间在线粒体中通过电子传递而产生ATP/能量，和(ii)通过清除自由基而保护各种细胞成分，例如脂质、蛋白质和DNA。CoQ10目前被用于不同目的-作为膳食补剂(保健品)以改善某些器官/组织的CoQ10供给。这对老年人尤其重要，因为科学研究已经表明CoQ10水平随着年龄的增加而下降，最终导致许多与老年相关的疾病。
-CoQ10与已知可以降低细胞CoQ10水平的降低胆固醇的药物(他汀类(statins))组合使用。另外，CoQ10被用于治疗心肌病，且已经推测CoQ10缺陷参与神经变性疾病如Huntington′s疾病、帕金森氏病和肌萎缩性脊髓侧索硬化。
-CoQ10在化妆品制剂中被用作活性组分，以使皮肤免于因细胞代谢或外因影响例如太阳辐射而产生自由基的损害。临床研究表明CoQ10在皮肤上局部应用有效地降低了皱纹形成并导致皮肤细胞代谢的活化。
在工业上，辅酶Q10是半合成产生的，或者通过发酵微生物及随后从生物量中提取产生的。辅酶Q10的完全化学合成途径已经建立。然而，这一途径成本高昂并且与发酵或半合成生产相比都无竞争力，因此无法以商业规模应用。
CoQ10的商业生产由Kanegafuchi在1977年左右始于日本(DE2740614；DE 2747510)。这些专利描述了通过发酵不同的酵母菌株生产和回收CoQ10。然而，在那之前和自那之后已经申请了描述使用不同的微生物(细菌、酵母、丝状真菌)生产和提取CoQ10的大量专利。对专利和/或论文中提及的生产CoQ10的微生物所做的综述在1981年由Kanegafuchi公布(Coenzyme Q10 by fermentation.Kanazawa，Morishige；Takahashi，Tamio.Pharm.Div.，KanegafuchiChem.Ind.Co.，Ltd.，Osaka，Japan.Biomedical and Clinical Aspects of辅酶Q(1981)，3，31-42)。
在过去的几年里，越来越多的科技出版物和专利申请探讨了用属于蛋白菌(proteobacteria)的α-亚组的细菌经发酵生产CoQ10。尽管CoQ10作为主要的泛醌在大多数微生物中相对罕见，但所述组中却有极高比例生产CoQ10。另外，属于该组的许多细菌，尤其是光养菌，建立了胞内膜结构，在此可贮存相对高量的CoQ10。然而，这些光养菌中许多都显示出低生长速度并因此需要较长时间以积聚CoQ10，导致发酵过程的成本增加。
许多专利和出版物描述了通过关键的类异戊二烯生物合成基因的内源或异源过表达，或者通过失活与CoQ10竞争类异戊二烯前体的旁路的靶基因来生产CoQ10(例如WO02/026933、WO01/027286、WO04/047763、WO05/005650)。
目前关于发酵野生型细菌菌株或通过传统诱变产生的突变株生产Q10的文献有Yoshida、Hajime、Kotani、Yukinobu、Ochiai、Keiko、andAraki、Kazumi(1998)Production of ubiquinone-10 usingbacteria.J.Gen.Appl.Microbiol.44，19-26。在此对得自菌株保藏中心的属于α-蛋白菌的各种菌株进行筛选并分析CoQ10生产情况。产生突变菌株以增加CoQ10产量。在补料分批发酵中，根癌农杆菌突变体达到180mg/l，Rhodobacter sphaeroides菌株达到350mg/l。
关于通过发酵球形红假单胞菌生产CoQ10的详细研究由Sakato、Kuniaki、Tanaka、Hisao、Shibata、Susumu和Kuratsu的研究中提供，Yoshiyuki in Agitation-aeration on Coenzym Q10 productionusing Rhodopseudomonas sphaeroides.Biotechnology And AppliedBiochemistry 1992，16，19-28。这篇论文的注意力集中在通过改变不同的发酵参数，例如氧供给、氧减少潜力、搅拌，而对方法进行最优化。所述菌株达到770mg CoQ10/l。这是迄今为止所报道的最高效价。
关于CoQ10的生物合成、生物技术生产方法及应用的综述由Choi、Jin-Ho、Ryu、Yeon-Woo和Seo、Jin-Ho在“辅酶Q10的生物技术生产和应用”中公布。Applied Microbiology andBiotechnology，在线公开2005年3月3日(已接受待发表)。
通过阅读上述关于辅酶Q10合成的改良措施，所有人都不得不承认使用大多数微生物生产辅酶Q10的产量仍相对较低并且不令人满意。已经尝试通过分子生物学的方法来增加辅酶Q10生产力，导致显示出辅酶Q10生产力增加的经遗传修饰的菌株的产生。然而，在工业生产中通常优选使用天然的菌株以生产所期望的化合物。因此，在科学界仍需要筛选用于CoQ10生产的更有效的菌株。
因此本发明的目的是进一步获取在发酵期间具有生产高效价CoQ10的能力的微生物。
这个目的通过权利要求中所述的实施方式达到。本发明提供了一种新的微生物，其被命名为WSH-W04。本发明还涉及包含本发明的微生物的组合物或装置、一种用于发酵该新菌株的方法，以及本发明的微生物的有利应用，另外，本发明还涉及一个16S rRNA基因序列及包含该序列的微生物。
在提供的新微生物WSH-W04中，技术人员拥有快速生长的生物，该微生物使得在发酵时可以生产高效价的CoQ10。特别地，所述新的微生物使得在旋转震荡发酵模式中生产所述辅酶的量达到64mg/l。技术人员应意识到尽管在旋转震荡器中发酵，现有技术中的菌株也仅显示CoQ10的生产率低于100mg/l。因此，本发明的菌株当在优化条件下以工业规模被发酵时具有生产高效价CoQ10的高度潜力。
本发明的另一方面涉及包含本发明微生物的发酵肉汤。有利的发酵肉汤为技术人员所已知，典型地含有一种碳源、一种氮源和一种磷酸盐源，以及盐、维生素和微量元素，以优化细胞生长和产物形成。在一个优选的实施方式中，本发明提供了一种还包含添加剂的发酵肉汤，该添加剂在发酵本发明的微生物时正向影响CoQ10生产。这种添加剂选自由以下所组成的组CoQ10前体对羟基苯甲酸酯(PHB)、异戊烯醇、香叶醇、酪氨酸、莽草酸酯和分支酸，及豆油、西红柿提取物和胡萝卜提取物的复合蔬菜提取物。通过以下段落可以获知，在本发明中特别优选使用的是蔬菜提取物。
本发明的另一方面还涉及一种培养系统，其包括i)一种可以进行发酵的容器；ii)一种包含本发明的微生物的发酵肉汤；iii)一种破碎所述微生物的工具；
iv)一种从发酵肉汤中分离辅酶CoQ10的装置。
该培养系统可以根据技术人员的知识进行装配。其中可以进行发酵的容器可以是本领域技术人员已知的任何容器。优选的容器是存在于现有技术中的容器(例如在Stanbury et al，1998，Principles ofFermentation T echnology，B utterworth-Heinemann中的容器)。这种容器包括，例如，自定义大小和形状的Erlenmeyer培养瓶或发酵罐。发酵肉汤如上述产生，优选包含所述添加剂。在发酵完成后，将产生的CoQ10须从反应混合物中分离。由于CoQ10贮存在微生物内，因此细胞在分离之前被破碎。因此，本发明的培养系统还具有一种破碎微生物的工具。这个设备可以是本领域技术人员已知的任何设备，例如Hopkins，1991所提及的设备。
回收CoQ10的方法是公知的，包括通过用有机溶剂从细胞膜中提取CoQ10，任选随后进行进一步的纯化，例如通过沉淀、结晶、柱层析、薄层层析等进行纯化。鉴别和量化的分析方法包括HPLC、质谱分析法、核磁共振质谱法等。然而，技术人员可以自己选择正确的方法。
菌株的培养可以在Erlenmeyer培养瓶中小规模进行，或者在发酵罐中补料分批培养或持续培养。在发酵罐中的培养通常获得较高的细胞产量；并且需要更严格控制关键发酵参数，例如pH、溶解氧浓度、氧化还原电位(ORP)、养分消耗/损耗。这些参数先前已经显示出对CoQ10的大量生产是关键的(Kuratsu et al.，1984；Wu et al.，2003；Urakami and Hori-Okubo，1988；Sakato et al.，1992)。
培养基的pH范围在6和8之间适于发酵。优选pH范围在6.5和7.5之间进行发酵，最优选pH7.2。考虑到氧供给问题，发酵应搅拌进行。对于Erlenmeyer培养瓶，合适的搅拌速度为100-300rpm。优选搅拌速度在150和250rpm之间，最优选的搅拌速度为200rpm。先前对多种CoQ10生产菌株进行的实验已经证明胞内CoQ10量随着发酵时间而增加。使用本发明的微生物，适当的发酵时间为至少58小时。优选的发酵时间为72小时，更优选的发酵时间为120小时。当然，这可以根据最佳的发酵条件的应用而改变。发酵应在20和40℃之间的一个合适的温度进行。优选温度为25-35℃，特别优选温度为30℃。
本发明的再一方面涉及一种培养本发明微生物的方法，该方法是以在发酵期间将具有刺激CoQ10生产的潜力的添加剂与所述微生物接触的方式进行的，所述添加剂选自由以下所组成的组CoQ10前体对羟基苯甲酸酯(PHB)、异戊烯醇、香叶醇、酪氨酸、莽草酸酯和分支酸，及豆油、西红柿提取物和胡萝卜提取物的复合蔬菜提取物。已经证实使用这样的添加剂，CoQ10的产量几乎可以加倍(见表4)。在本发明中，优选使用PHB、豆油、西红柿提取物或胡萝卜提取物。更优选使用的是豆油、西红柿提取物或胡萝卜提取物。这些添加剂是可商购的。
最后，本发明涉及本发明的微生物在生产CoQ10中的应用。生产的CoQ10方法可以如在本申请中所例证的方法进行。然而，所提供的实施例不被认为是对各个发明的限制。本领域技术人员已知进行本发明方法的替代方式和方法来生产CoQ10。特别优选该方法根据前面提出的微生物自身的生产方法进行。另外，本发明的微生物也可以被用于生产该菌株的突变株和变异株。同样本领域技术人员具备怎样获得本发明菌株的这种突变株和变异株的知识。这样的方法是本领域所已知的，包括将细胞暴露于紫外光、X射线或放射性物质。另外，细胞可以用诱变剂进行处理，所述诱变剂例如是N-甲基-N’-硝基-N-亚硝基胍(NG)、甲基磺酸乙酯(EMS)、硫酸二甲酯(DMS)及所有类似的诱变剂。这样的技术中的一些在例如Ausubel etal.，1997，Current protocols in molecular biology，John Wiley and Sons中被概述。
为获得本发明的微生物，土壤样品选自中国的不同区域，包括蔬菜园、花园、酿造厂及厌氧颗粒污泥。选择这些样品中包含的微生物并测试其生产泛醌的能力。
迄今为止所测试的大多数微生物菌株均不产生辅酶Q10，但产生具有较短类异戊二烯侧链的衍生物(即辅酶Q6-辅酶Q9)。本申请发明人进行了HPLC分析以最初鉴别具有形成辅酶Q10能力的那些菌株。总而言之，因此分离了982个纯培养物，随后测试其形成辅酶Q10的能力。
共10个菌株被证实产生辅酶Q10作为主要泛醌。在这些菌株中，命名为WSH-WO4的菌株显示出最高的辅酶Q10生产力(16mg/l)，并因此被选择来开发发酵生产辅酶Q10的方法。命名为WSH-W04的菌株的分离的传代培养物被送至Deutsche Sammlungvon Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH(DSMZ，Braunschweig，Germany)进行分类学、形态学和生化鉴定。DSMZ对菌株WSH-W04所做的培养物鉴定如下形态学细胞是革兰氏阴性，直棒状，宽度为0.6-0.7μm，长度为1.5-2.5μm。细胞是活跃运动的并具有＞1个极性鞭毛。
生化和生理学特征表1-3显示了菌株WSH-W04的主要生化和生理学特性。结合脂肪酸分布图(未显示)，WSH-W04被鉴定为蛋白菌(Proteobacteria)的α-亚组(α-subgroup)的一个成员。
表1生化和生理学测试
表2碳源利用
表3氧化酸的产生
通过16S rRNA序列的确定进行种系发育分析在从基因组DNA中扩增之后，对完整的16S rRNA编码基因进行测序。相应的DNA序列如SEQ ID No1所示。因此，本发明的另一方面是一种分离的核酸序列，其具有SEQ ID No1所示序列或者相应的rRNA序列或者在严格条件下与这些序列杂交的序列或者与SEQ ID No1或相应的rRNA序列在核酸水平上具有＞97.1％同源性的序列。
本发明的序列可以被用作探针以探查钓取具有高CoQ10生产潜力的其它与种系发育相关的菌株。
本发明以下的实施方式涉及包含上述一个或多个序列的微生物。
术语“在严格条件下”在本文的含义如Sambrook et al.(Sambrook，J.；Fritsch，E.F.and Maniatis，T.(1989)，Molecular cloninga laboratory manual，2nded.，Cold Spring Harbor Laboratory Press，NewYork)所述。优选地，如果在用1×SSC(150mM氯化钠，15mM柠檬酸钠，pH 7.0)和0.1％SDS(十二烷基硫酸钠)，在80℃、优选85℃、更优选88℃、最优选在90℃洗涤1小时之后；更优选在用0.2×SSC和0.1％SDS在80℃、优选85℃、更优选88℃、最优选在90℃洗涤1小时之后，仍观测到阳性的杂交信号，则说明存在根据本发明的严格杂交。
该DNA序列与来自参比α-蛋白菌的可利用的16S rRNA基因序列比对，与Ochrobactrum sp.有97.1％的最大相似性(Relman1999)，随后与马尔他布鲁氏菌(Brucella melitensis)的不同亚种具有96.5％的相似性，与Ochrobactrum gallinifaecis DSM 15295和Ochrobactrum intermedium LMG3301具有96.2％的相似性。考虑到rRNA相似性、脂肪酸分布图、生化和生理学数据，可以将WSH-W04指定为Ochrobactrum属的一个新种。
从上述可以看出，本发明提供了一种发酵生产辅酶Q10的新的及高潜力的候选菌。
菌株WSH-W04的纯培养物于2005年6月5日根据布达佩斯条约的规定保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏号为CCTCC M 205054。
本发明的术语微生物是指包括了完整生物体形式的完整细胞以及破碎形式的细胞。
所要求保护的核酸序列根据本发明也包括与SEQ ID No1或其相应rRNA序列的同源性大于97.1％，优选大于97.2％、97.3％或97.4％，更优选大于97.5％或97.6％，特别优选大于98％、98.5％或99％的序列。文中所用术语“同源性”(或相同性)可用公式H(％)＝[1-V/X]×100定义，其中H是指同源性，X是对比序列中核碱基总数，V是与对比序列相对比的序列中不同的核碱基的数目。
实施例新的大量生产辅酶Q10的菌株的分离土壤样品选自中国的不同区域，包括蔬菜园、花园、酿造厂及厌氧颗粒污泥。将样品各自于30℃，厌氧和光照条件下，在100ml富集培养基(1％蛋白胨、1％NH4Cl、2％NaCl、1％NaHCO3、0.5％Na2HPO4、0.2％MgCl2、pH 7.0)中培养168小时。将富集培养的样品涂布在含有固体复合培养基(1％蛋白胨、0.5％酵母提取物、0.5％NaCl、2％琼脂，pH 7.0)的平板上。平板在30℃有氧保温72小时。将单个的集落转移至相同培养基的琼脂斜面上以获得纯培养物。为了确定辅酶Q10，将每个纯培养物接种到含有25ml的Q10生产培养基的250ml培养瓶中，所述Q10生产培养基由4％蔗糖、5％糖蜜、1％(NH4)2SO4、0.05％KH2PO4、0.05％K2HPO4、0.025％MgSO4·7H2O、4％玉米浸液和1ml/l微量元素溶液组成。该微量元素溶液在1升去离子水中含有88mg Na2B4O7·10H2O、37mg(NH4)6Mo7O27·4H2O、8.8mg ZnSO4·7H2O、270mg CuSO4·5H2O、7.2mg MnCl2·4H2O和970mg FeCl3·6H2O。在高压灭菌之前，Q10生产培养基的pH用28％氨水调节为7.2。在30℃，以200rpm在旋转摇床上培养72小时，之后收获细胞并分析CoQ10形成情况(见下文)。
通过分离的菌株对辅酶Q10形成进行检测将1毫升如上述培养的各培养物通过在10ml的玻璃管中以10,000rpm离心10分钟收获。弃去上清并将细胞在-70℃冷冻以促进细胞破碎。随后，将细胞材料在冷却的水浴超声发生器中通过超声处理，用3ml丙酮提取两次。组合丙酮级分并在装备有Zorbax-SB-C18柱的Agilent 1100系统上通过反向HPLC进行分析。用甲醇-乙醇50∶50(v/v)进行洗提。辅酶Q10通过与得自Sigma的可靠样品进行对比而被鉴别，并从校准曲线中估计出它的量。
通过WSH-W04的辅酶Q10生产的确定和优化基于其生产辅酶Q10的高度潜力，菌株WSH-W04被选择来开发一种适于辅酶Q10生产的工业化方法。首先将WSH-W04在琼脂斜面(2％蔗糖、1％蛋白胨、1％酵母提取物、0.5％NaCl，pH7.2)上，于30℃培养24小时。将该斜面用无菌水洗涤(每个斜面3ml)，并将悬浮液合并在一起。随后，将无菌甘油以1∶4的比率(甘油细胞悬浮液，v/v)加入。将细胞悬浮液分为1ml的等份，并于-70℃在聚丙烯管中冷冻。为进行培养，将1小管原种培养物接种于含有25ml种植培养基的摇瓶中，并在30℃以200rpm在旋转摇床上保温，所述种植培养基由2％蔗糖、1％蛋白胨、1％酵母提取物和0.5％NaCl(pH7.2)组成。将2.5ml种植培养物转移至含有25ml基本培养基的250ml培养瓶中，所述基本培养基由4％蔗糖、0.7％(NH4)2SO4、0.05％KH2PO4、0.05％K2HPO4、0.025％MgSO4.7H2O、8％玉米浸液、8mg/l硫胺、8mg/l烟酸和1ml/l微量元素溶液组成。所述微量元素溶液在1升去离子水中含有88mgNa2B4O7·10H2O、37mg(NH4)6Mo7O27·4H2O、8.8mg ZnSO4·7H2O、270mg CuSO4·5H2O、7.2mg MnCl2·4H2O和970mg FeCl3·6H2O。
发酵培养基在高压灭菌之前用28％氨水调节至pH 7.2，并在30℃以200rpm在旋转摇床上培养120小时。当需要时，如上述以1毫升/份进行收获、提取并通过HPLC分析辅酶Q10。
将细菌培养物用蒸馏水稀释100倍后，测定其在660nm处的光密度以监测其生长，从校准曲线中估计出细胞干重(cdw)。
Q10产量的提高为增加菌株WSH-W04中的辅酶Q10生产，在培养期间将不同的复合营养添加剂加入基本培养基中，所述添加剂即对羟基苯甲酸酯(PHB)、豆油、西红柿提取物和胡萝卜提取物(表4)。基本的辅酶Q10效价(无任何特异性添加剂而获得)为37mg/l。补加不同的添加剂产生最多64mg/l辅酶Q10，等于增加73％。这些结果清晰地表明菌株WSH-W04特别适于用作发酵生产辅酶Q10的生产微生物。
表4营养添加剂对菌株WSH-W04a生产辅酶Q10的作用
a值是三个独立培养的平均值。
参考文献Sakato，Kuniaki；Tanaka，Hisao；Shibata，Susumu；Kuratsu，Yoshiyuki.Agitation-aeration studies on Coenzyme Q10 production usingRhodopseudomonas spheroides.Biotechnology and AppliedBiochemistry(1992)，16(1)，19-28.
Aeration-agitation effect on Coenzyme Q10 production byAgrobacterium species.Kuratsu，Yoshiyuki；Sakurai，Minoru；Hagino，Hiroshi；Inuzuka，Keiichi.Tech.Res.Lab.，Kyowa Hakko Kogyo Co.Ltd.，Hofu，Japan.Journal of Fermentation Technology(1984)，62(3)，305-8.
Urakami，Teizi；Hori-Okubo，Makiko.Production of isoprenoidcompounds in the facultative methylotroph Protomonas extorquens.Journal of Fermentation Technology(1988)，66(3)，323-32.
Wu，Zufang；Du，Guocheng；Chen，Jian.Effects of dissolved oxygenconcentration and DO-stat feeding strategy on CoQ10 production withRhizobium radiobacter.World Journal of Microbiology & Biotechnology(2003)，19(9)，925-928.
Yoshida，Hajime；Kotani，Yukinobu；Ochiai，Keiko；Araki，Kazumi.Production of ubiquinone-10 using bacteria.Journal of General andApplied Microbiology(1998)，44(1)，19-26.
Yoshida，Hajime；Araki，Kazumi；Nakayama，Kiyoshi.Fermentativeproduction of L-arginine.Part II.Mechanism of L-arginine productionby L-arginine-producing mutants of Corynebacterium glutamicum.Agricultural and Biological Chemistry(1979)，43(1)，105-11.
Hopkins，T.R.Physical and chemical cell disruption for the recovery ofintracellular proteins.Bioprocess Technology (1991)，12(Purif.Anal.Recomb.Proteins)，57-83.
Kuratsu，Yoshiyuki；Sakurai，Minoru；Hagino，Hiroshi；Inuzuka，Keiichi.Aeration-agitation effect on Coenzyme Q10 production byAgrobacterium species.Journal of Fermentation Technology(1984)，62(3)，305-8.
Kanazawa，Morishige；Takahashi，Tamio.Coenzyme Q10 byfermentation.Biomedical and Clinical Aspects of Coenzyme Q(1981)，3 31-42.
Choi，Jin-Ho，Ryu，Yeon-Woo，and Seo，Jin-Ho.Biotechnologicalproduction and applications of Coenzyme Q10.Applied Microbiologyand Biotechnology，Published online before printing3 March 2005。
序列表<110>德古萨股份公司<120>生产辅酶Q10的细菌菌种及生产辅酶Q10的方法<130>050135 OC<160>1<170>PatentIn Version.3.1<210>1<211>1466<212>DNA<213>Proteobacteria<400>1atcctggctc agaacgaacg ctggcggcag gcttaacaca tgcaagtcga gcgccctttt60cggagggagc ggcagacggg tgagtaacgc gtgggaatct acctatctct agggaataac120tcagggaaac ttgtgctaat accctatacg tccttcggga gaaagattta tcggagatgg180atgagcccgc gttggattag ctagttggtg gggtaaaggc ctaccaaggc gacgatccat240agctggtctg agaggatgat cagccacact gggactgaga cacggcccag actcctacgg300gaggcagcag tggggaatat tggacaatgg gcgcaagcct gatccagcta tgccgcgtga360gtgatgaagg ccctagggtt gtaaagctct ttcaccggtg aagataatga cggtaaccgg420agaagaagcc ccggctaact tcgtgccagc agccgcggta atacgaaggg ggctagcgtt480
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1.微生物WSH-W04，保藏号CCTCC M 205054。
2.一种包含权利要求1的微生物的发酵肉汤。
3.一种培养系统，其包括i)一种其中可以进行发酵的容器；ii)一种包含权利要求1的微生物的发酵肉汤；iii)一种破碎所述微生物的工具；iv)一种从发酵肉汤中分离辅酶Q10的装置。
4.生产权利要求1的微生物的方法，其中在发酵期间，具有刺激辅酶Q10生产潜力的添加剂与所述微生物接触，所述添加剂选自由以下所组成的组辅酶Q10前体对羟基苯甲酸酯和豆油、西红柿提取物及胡萝卜提取物的复合蔬菜提取物。
5.权利要求1的微生物在生产辅酶Q10中的应用。
6.权利要求1的微生物在生产该菌株的突变株和变异株中的应用。
7.一种分离的核酸，其具有SEQ ID NO1所示序列或相应的rRNA序列、或者与这些序列在严格条件下杂交的序列、或者与SEQ ID NO1或相应的rRNA序列在核酸水平具有＞97.1％的同源性的序列。
8.包含权利要求7的一或多种序列的微生物。
全文摘要
本发明基于一种新的Ochrobactrum sp.类型菌株WSH－W04的分离，该菌株产生高基础量的辅酶Q10。另一方面，本发明提供了一种生产辅酶Q10的方法，该方法包括在培养基中培养所述新的细菌使得辅酶Q10积聚，并从培养物中提取辅酶Q10。
文档编号C12N15/31GK1912098SQ20051009141
公开日2007年2月14日 申请日期2005年8月10日 优先权日2005年8月10日
发明者陈坚, 洪忠民, 刘登如 申请人:德古萨股份公司