专利名称：一种消除皮肤皱纹生物制剂的配制的制作方法
技术领域：
本发明属组织工程领域，涉及皮肤胶原蛋白形成细胞的分离和规模体外培养的方法，以及和肉毒毒素A的组合配方，可用于人皮肤动力性皱纹的治疗。
背景技术：
皱纹的发生归结起来有4个原因自然老化、地心引力作用、阳光中紫外线照射使皮肤发生光老化与光损伤和面部表情肌过多的收缩。其中面部表情肌过多的收缩产生的皱纹称动力性皱纹。主要表现为眶外侧的鱼尾纹，额头纹和眉间纹、鼻唇沟纹和唇上纹和颈阔肌纹。除皱有许许多多的办法，局部外用各种各样的除皱霜、抗皱霜、防晒霜只能改善外观，它对皱纹的消除不会有较大的作用。医用胶原注射充填术有效，但因为是非自身物质，只能存在几个月就会被机体清除，同时注射后会有一定的过敏反应。整形外科医生们常采用化学剥皮术、皮肤磨削术、激光重塑术和面部整形拉皮除皱术等。病人都需要住院，需要麻醉，手术烦琐，常常需要经受巨大的痛苦，还需要经过一段皮肤恢复创伤愈合的过程，价格又非常昂贵，做得不好既有遗憾的色素沉着，又发生令人不愉快的副作用、并发症和后遗症。近年来美容医学界有两项技术令人瞩目，一种是A型肉毒毒素注射除皱，另一种是采用自体胶原蛋白形成细胞经体外扩增后注射美容除皱，此技术已取得了极大的成功。肉毒毒素注射除皱技术是通过阻断神经肌肉的传导冲动使肌肉麻痹松弛而起作用。有以下特点1.疗效快、疗效高。2.副作用少又轻，且为一过性，无全身系统性副作用，故安全、可靠。3.操作方便，在门诊条件下即可进行，不需要住院，不需要麻醉。4.病人痛苦小，属于非创伤性治疗。5.治疗费用少，价格低廉。6.病人易于接受。7.操作简单，易于推广普及。不足之处没有根本消除皱纹，可影响面部表情肌引起的表情的不自然，此外维持时间较短，一次注射后可维持平均4个月；显效3个月后会由于新的神经形成会逐渐恢复肌肉的收缩功能，动力性皱纹重新出现。虽然可重复注射治疗，但由于肉毒毒素也是一种抗原，反复注射会使机体产生抗体而失去作用。因此需要和一种能够长期起效，不会产生抗体的生物材料联合作用方能珠联璧合。自体胶原蛋白形成细胞美容除皱技术是近几年国际上突破的另一项重要生物技术。其原理是采用受术者自体的皮肤组织，通过组织工程技术，从中分离出胶原蛋白形成细胞，放到无菌培养液中培养，分化后再回输到受术者脸部皱纹、凹陷性疤痕的真皮层下，使真皮层胶原蛋白密度和厚度增加，恢复皮肤弹性，填平皱纹和疤痕。这种技术的优点在于细胞取自受术者自身，无任何排异反应；细胞输入自体的生长环境，在自体的调控下既不过度生长，又可以长期存活、扩充，源源不断产生胶原蛋白，这种美容除皱形态自然、作用长久。唯一不足之处是起效时间长，需时2-3个月这些新输入的细胞分泌的胶原蛋白才能积累到开始显效的程度。如果将上述两种技术联合应用，可以相互取长补短，相得益彰。
发明内容
本发明的目的之一，利用肉毒毒素注射技术显效快的特点，克服了自体细胞注射除皱美容起效慢的缺点。
本发明的目的之二，利用自体细胞的自然特性，克服了肉毒毒素除皱技术不能持久，表情不自然以及可能有的过敏反应的缺点。
本发明的目的之三，利用这两种技术的组合，治疗额头纹、眉间纹、眼角鱼尾纹鼻唇沟纹和唇上纹等人体皮肤动力性皱纹；同时克服其它几种除皱技术不能消除颈阔肌横纹的缺陷。
具体实施例方式
(一)皮肤胶原蛋白形成细胞的分离与培养，其特征在于以下步骤首先无菌从耳后或前臂内侧皮肤细嫩处取一块约0.5cm宽，2cm长的皮肤，放入特制的保存液(100u/ml青、链霉素的M199培养液)中，放入预冻有冰的冰壶内，迅速(通常8小时内)送交专业实验室分离。
将皮肤取出，放入50mm无菌塑料平皿内，用无菌眼科剪除去多余的皮下组织和脂肪；然后用含青、链霉素(100u/ml)的磷酸盐缓冲液洗液(pH7.4 0.01M PBS)漂洗数次，洗去皮肤表面的血污和毛发。
将皮肤转入6孔培养板，用2ml预冷的pH7-9Hank’s液配制的0.1-1％的胰酶4-16C消化6-24小时。
轻吸弃消化液，加入预冷的2ml含10％胎牛血清的M199培养液，终止消化反应，用力吹打分散细胞，静置10分钟，取中间无明显组织块的悬液于新孔，37C，5％CO2，(SANYO公司)静置培养。
培养3-7天，待胶原蛋白形成细胞生长铺满50-70％孔时，吸弃生长液，磷酸盐缓冲液(pH7.4 0.01M PBS)漂洗一次；加入2ml新的消化液，37C，消化10分钟。吸弃消化液，换7ml新生长液重新悬浮细胞并传入T25cm2细胞培养瓶(Nunc公司)，37C，5％CO2，继续静置培养。
视情况3-4天换液一次，一周传代，每次传2-3瓶。
待细胞总数扩至108，0.85％的生理盐水漂洗1次后，加入2～5ml消化液，37C，消化10分钟，吸弃消化液，0.85％的生理盐水吹打重悬并离心漂洗4次，最终重悬于2-4ml生理盐水中备用。
(二)与肉毒毒素A配伍根据所治疗的皱纹大小深浅及数量的多少，用生理盐水溶解稀释，最终取2.5-55单位的肉毒毒素A(兰州生物制品所生产)用已制备的细胞悬液稀释备用。
本发明的优点本发明由于采用两种最新除皱技术的有机组合，保持了两种原技术简便易行、无明显痛苦、无副作用或作用小的优点。充分利用了肉毒毒素注射技术显效快的特点，避免了自体胶原蛋白形成细胞注射除皱美容起效慢的缺点。利用自体胶原蛋白形成细胞的自体、自然特性，克服了外来肉毒毒素除皱技术作用不能持久、因表情肌麻痹引起的表情不自然、反复注射产生抗体失去功效以及可能有的其它副作用的缺点。此外还基本克服了其它几种除皱技术治疗颈阔肌纹效果不佳的缺陷。
权利要求
1.一种消除皮肤皱纹生物制剂的配制，其特征在于以下步骤(1)首先采用无菌技术从耳后或前臂内侧皮肤细嫩处取一块约0.5cm宽，2cm长的皮肤，放入特制的保存液(100u/ml青、链霉素的M199培养液)中，放入预冻有冰的冰壶内，迅速(通常8小时内)送交专业实验室分离。(2)将上述皮肤取出，放入50mm无菌塑料平皿内，用无菌眼科剪除去多余的皮下组织和脂肪；然后用含青、链霉素(100u/ml)的磷酸盐缓冲液洗液(pH7.40.01M PBS)漂洗数次，洗去皮肤表面的血污和毛发。(3)将处理后的皮肤转入6孔培养板，用2ml预冷的pH7-9Hank’s液配制的0.1-1％的胰酶4-16C消化6-24小时。(4)轻吸弃消化液，加入预冷的2ml含10％胎牛血清的M199培养液，终止消化反应，用力吹打分散细胞，静置10分钟，取中间无明显组织块的悬液于新的培养孔，37C，5％CO2，(SANYO公司)静置培养。(5)培养3-7天，待胶原蛋白形成细胞生长铺满50-70％孔时，吸弃生长液，磷酸盐缓冲液(pH7.40.01M PBS)漂洗一次；加入2ml新的消化液，37C，消化10分钟。吸弃消化液，换7ml生长液重新悬浮细胞并传入T25cm2细胞培养瓶(Nunc公司)，37℃，5％CO2，继续静置培养。(6)视情况3-4天换液一次，一周传代，每瓶传2-3瓶。(7)待细胞总数扩至108，0.85％的生理盐水漂洗1次后，再加入2～5ml消化液，37C，消化10分钟，吸弃消化液，0.85％的生理盐水吹打重悬并离心漂洗4次，最终重悬于2-4ml生理盐水中备用。
2.上述细胞与肉毒毒素A配伍根据所治疗的皱纹大小深浅及数量的多少，用生理盐水溶解稀释，最终取2.5-55单位的肉毒毒素A(兰州生物制品所生产)用已制备好的细胞悬液稀释成2-4ml备用。
3.采用以上分离培养的自体细胞加肉毒毒素配方可用于并不局限于额头纹、眉间纹、眼角鱼尾纹鼻唇沟纹和唇上纹和颈阔肌纹等人体皮肤动力性皱纹的治疗。
全文摘要
本发明涉及一种消除人体皮肤皱纹的生物制剂的配方和制备。包括现行的自体胶原蛋白形成细胞的制备方法及与肉毒毒素A的联合应用，属于组织工程领域。本发明采用胰酶消化法成功的从成年人体表皮肤中分离获得了纯净的胶原蛋白形成细胞并规模化培养至上千万个活性胶原形成细胞，可供皮肤美容除皱、疤痕修复、皮肤组织填充、皮肤损伤后修复及烧伤后人工复合皮肤的制备及其它目的所需。本发明采用上述自体细胞与商品化的肉毒毒素A联合配伍，配成新的美容除皱的针剂可以用于人体表皮肤皱纹尤其是动力性皱纹的治疗。最终效果自然、持久无严重副作用。
文档编号C12N5/08GK1951497SQ20051011420
公开日2007年4月25日 申请日期2005年10月21日 优先权日2005年10月21日
发明者张永国, 吕伟光 申请人:张永国, 吕伟光