专利名称：呈递抗原的人γδT细胞的制备和在免疫治疗中的用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及制备有效呈递抗原的人γδT细胞的方法、通过该方法制得的γδT细胞及其在免疫治疗、抗原鉴定和免疫力诊断中的用途。
背景技术：
适应性免疫系统的细胞成分将免疫系统的细胞成分分成先天性免疫系统的细胞和适应性(获得性或特异性)免疫系统的细胞。先天性免疫系统的细胞包括(特别是)外周血中的单核细胞、粒细胞、天然杀伤细胞和血管外区室中的肥大细胞、巨噬细胞和树突细胞(DC)，血管外区室包括外周组织，如皮肤、气道、胃肠道和泌尿生殖道，内脏以及次级淋巴组织，如脾脏、淋巴结(LN)和派伊尔结(PP)。先天性细胞的主要功能是a)通过中和和限制传染性颗粒的传播并通过肿瘤细胞清除来提供即时的保护，b)健康组织的免疫监控，和c)启动适应性免疫应答。适应性免疫系统的细胞包括淋巴细胞，如T和B细胞。通过称为T细胞抗原受体(TCR)和B细胞抗原受体(BCR)的克隆型细胞表面抗原受体的存在来区分出先天性细胞和适应性细胞。每个淋巴细胞携带识别特定抗原的截然不同的TCR或BCR。通过T和B细胞发育过程中以及效应T和B细胞产生时的抗原亲和力成熟过程中多个可变TCR或BCR基因片段的重排决定了抗原识别的特异性。外周血中的原初、未经历过抗原的T细胞彼此间的TCR抗原选择性是不同的，单个原初T细胞响应由含有它们特异性抗原的物质引起的免疫激活开始扩充。因此，在适应性免疫应答的过程中，一组具有潜在传染性因子特异性TCR的原初T细胞通过细胞增殖开始扩充，并发育成a)即时参与对潜在传染性因子的防御的效应T细胞，和发育成b)对这种特定潜在传染性因子长期保护的记忆T细胞。效应T细胞的寿命短，即，在免疫应答的消退期的过程中消失，而记忆T细胞的寿命长，并根据它们最初的组织滞留或优先的再循环途径分成记忆T细胞亚类(Moser等，2004)。根据杂二聚TCR的组成将T细胞进一步分成αβT细胞和γδT细胞(见下文)；αβ-TCR由α-和β-蛋白链构成，而γδ-TCR由γ-和δ-蛋白链构成。正常健康人中所有CD3+T细胞的大部分(＞80％)是αβT细胞。TCR结合不变的CD3分子，CD3分子将T细胞与B细胞和所有其他类型免疫细胞区分开来。大部分αβT细胞以所谓的主要组织相容性复合体(MHC)分子限制方式来识别抗原。这与以MHC非限制方式直接结合名义抗原的B细胞中的BCR相反。术语MHC限制指的是TCR识别其抗原的模式，并涉及在包括DC的呈递抗原细胞(APC)上抗原肽和MHC分子一起，称为MHC-肽复合体的呈递(见下文)。存在两种主要类型的MHC分子，即I类MHC(MHC-I)和II类MHC(MHC-II)，其引发αβT细胞两个主要亚类，即CD8+αβT细胞和CD4+αβT细胞的TCR。CD4+αβT细胞上的TCR识别MHC-II-肽复合体，而CD8+αβT细胞上的TCR识别MHC-I-肽复合体。明显相反，人外周血中γδT细胞的主要亚类不表达CD4或CD8，并且对于抗原识别其TCR不需要MHC-限制(见下文)。
γδT细胞γδT细胞是CD3+T细胞独特的亚类，CD3+T细胞的特征在于由Vγ-和Vδ-基因片段编码的TCR(Morita等，2000；Carding和Egan，2002)。根据它们在血液或组织中最初的滞留、其VγVδ-TCR的蛋白链组成及其抗原选择性将它们进一步分类。在人体中，表达γδT细胞(Vδ1+T细胞)的Vδ1+-TCR链主要在皮肤、气道、消化道和泌尿生殖道的上皮或上皮相连的/粘膜组织以及几个内脏中，并构成外周血中γδT细胞的次要部分(＜20％)。Vδ1+T细胞的TCR识别由MHC相关CD1分子呈递的脂质抗原。此外，Vδ1+T细胞响应应激相关蛋白，包括MHC相关分子MICA和MICB，以及热激蛋白。认为它们提供了防御肿瘤和其他应激细胞的第一线防御，此外，认为它们有助于伤口愈合、组织修复和自体免疫。在健康个体的人外周血中，γδT细胞构成总CD3+T细胞的2-10％，且大部分(＞80％)的外周血γδT细胞是表达Vγ2Vδ2+-TCR链的γδT细胞(Vγ2Vδ2+γδT细胞)(Morita等，2000；Carding和Egan等，2002)。它们对于主要微生物来源的小非肽抗原是高度选择性的，并且不需要由经典MHC分子呈递抗原，而这对于肽选择性αβT细胞是典型的(见上文)。Vγ2Vδ2+γδT细胞抗原包括异戊二烯基-焦磷酸酯，如异戊烯焦磷酸酯(IPP)，烷基胺和新发现的见于大部分人微生物病原体和共生细菌中的类异戊二烯生物合成途径中的代谢物(Morita等，2000；Eberl等，2003)。这些Vγ2Vδ2+γδT细胞抗原中的一些，如IPP和烷基胺，还通过坏死的组织细胞来释放。人Vγ2Vδ2+γδT细胞的同源物，携带对微生物来源的小非肽抗原具有选择性的同源VγVδ-TCR，还确实存在于高等灵长类，如猕猴中，但不存在于啮齿类，包括老鼠和兔子中。还不清楚为什么Vγ2Vδ2+γδT细胞的存在限于高等灵长类，但是可以推测它们通过进化进程发展以满足对微生物独特的种特异性选择的细胞保护的特殊需要。Vγ2Vδ2+γδT细胞在外周血Vγ2Vδ2+γδT细胞的组织培养过程中体外，或在高等灵长类如猕猴接种疫苗实验过程中体内，响应模式抗原IPP或微生物提取物而迅速扩充(Chen和Letvin，2003)。此外，人的微生物感染通常与外周血Vγ2Vδ2+γδT细胞的巨大扩充相关，达到高至＞60％总外周血CD3+T细胞的水平。这些发现支持人Vγ2Vδ2+γδT细胞在微生物感染期间的免疫过程中起重要作用的见解(Morita等，2000；Carding和Egan等，2002；Chen和Letvin，2003)。它们对通常在微生物(包括病原体和共生细菌)中发现的非肽抗原的唯一选择性表明Vγ2Vδ2+γδT细胞中的TCR执行和to11-样受体(TLR)相似的功能，TLR响应微生物来源的不同配体引发DC和其他APC的激活和成熟。
γδT细胞通过快速分泌启动先天性免疫系统细胞募集的趋化因子和刺激呈递抗原细胞并提高粒细胞、巨噬细胞和NK细胞的细菌杀伤的促炎性细胞因子(TNF-α，IFN-γ)而有助于病原体消除(Morita等，2000；Carding和Egan等，2002；Chen和Letvin，2003)。它们还表达用于杀伤受感染细胞或肿瘤组织细胞的天然杀伤细胞受体。这些发现支持γδT细胞主要执行先天性功能的见解，尽管已知促炎性细胞因子如TNF-α的分泌也有助于局部适应性免疫应答。另一方面，γδT细胞直接参与适应性免疫应答的证据不明确。例如，报道了CD1限制的T细胞诱导呈递CD1-脂质复合体的DC的成熟。此外，对小鼠的研究证明了没有进一步解释γδT细胞在B细胞应答中的作用，且显示出人γδT细胞在体外共培养过程中调节B细胞应答(Brandes等，2003)。最后，对猕猴的研究证明了Vγ2Vδ2+γδT细胞能够引发对牛分枝杆菌(Mycobacterium bovis)抗原的体内记忆应答(Chen和Letvin，等)。总的说来，这些发现提供了γδT细胞能够与适应性免疫系统的细胞如B细胞和DC相互作用的证据。这些免疫调节功能中的大部分归因于由γδT细胞引起的细胞因子产生或尚未得到解释。重要地，这些发现中没有一个支持γδT细胞在呈递抗原中的作用。淋巴细胞功能与淋巴细胞迁移潜能密切相关，如通过趋化因子受体和粘附分子的表达所确定的(Moser等，2004)。因此，将αβT细胞分成a)表达LN-归巢趋化因子受体CCR7但缺乏炎性趋化因子受体的原初T细胞，b)寿命短的效应T细胞，该细胞携带反映感染部位炎症状况的趋化因子受体和诱导性粘附分子的不同组合，和c)静息的、寿命长的记忆T细胞的三个亚类。根据它们的移动潜能，即它们的细胞表面趋化因子受体和粘附分子的表达特征的T细胞亚类的区别，与它们的分化状态和免疫过程中的潜在功能相关。值得注意的是，趋化因子受体和粘附分子的“特征剖析”广泛用于白细胞亚类，包括DC以及T和B细胞的表型和功能限定(Moser等，2004)。人外周血γδT细胞的迁移特征明显不同于人外周血αβT细胞的迁移特性(Brandes等，2003)。最值得注意的是，大部分(＞80％)的Vγ2Vδ2+γδT细胞(此后称为“γδT细胞”)缺乏CCR7，因此被排除在次级淋巴组织外，但反映出炎症迁移特征(Brandes等，2003)。明显相反，外周血中大部分(＞70％)的αβT细胞表达CCR7，这与它们通过次级淋巴组织(脾脏、LN、PP)的连续再循环相一致，在次级淋巴组织中它们审视APC中合适的MHC-肽复合体的存在。在进行中的适应性免疫应答的情况中，αβT细胞的选择在接触呈递它们的相关抗原的APC的过程中变成激活的并分化成具有炎症归巢潜能的CCR7阴性效应细胞。相反，外周血γδT细胞的特征在于响应感染部位产生的炎性趋化因子的即时组织动员的炎症迁移程序。激活时，例如，响应微生物提取物抗原或限定的小非肽抗原(如IPP)，γδT细胞中的迁移特征从炎症表型快速转变成LN-归巢表型，如通过炎性趋化因子受体的下调和CCR7的诱导所证明的(Brandes等，2003)。与αβT细胞相反，γδT细胞在LN中相对稀少，这与它们存在于这些位置上的MHC限制APC完全无关的独特激活模式相一致(Brandes等，2003)。γδT细胞的出现率在疾病相关的LN中(特别是在生发中心)提高，表明γδT细胞可能有助于体液(抗体)应答和其他可能的适应性免疫过程的启动。
总的来说，人γδT细胞的迁移特征及其在LN中的偶尔存在表明这些细胞在适应性免疫应答启动中的作用。然而，这种作用没有得到进一步的确定且不存在γδT细胞可以起呈递抗原细胞作用的证据。
树突细胞(DC)DC形成不同类别的白细胞，源自骨髓中的造血始祖细胞，并主要存在于血管外的部位，包括上皮/粘膜组织(特别是皮肤、气道和胃肠道/泌尿生殖道)和次级淋巴组织(脾脏、LN、PP)(Banchereau和Steinman，1998；Steinman等，2003；Banchereau等，2004)。在外周血中，DC或DC前体构成小于1％的单核白细胞。不同DC亚类的组织位置不同，如以主要存在于软组织边缘上皮中的间质DC、存在于表皮中的朗格汉斯细胞(LC)和具有LN归巢偏向的类浆细胞DC举例说明的。这些DC亚类是完全分化的非增殖细胞，具有几天至几周的有限寿命，表明它们在稳定条件下被骨髓产生的前体持续替代。相反，人记忆T细胞存活很多年并通过稳态(体内稳态)增殖来维持。组织滞留DC的主要功能是局部抗原的摄取和加工，其通过输入淋巴管至排出LN的重新定位和抗原特异性适应性免疫应答的启动(Banchereau和Steinman，1998；Steinman等，2003；Banchereau等，2004)。当在致耐受条件下，即不存在促炎性T细胞共刺激下向T细胞呈递抗原时，DC还诱导耐受性。相似地，呈递抗原B细胞已经显示出诱导耐受性(Zhong等，1997)。认为对自体抗原的免疫耐受性的破坏是自体免疫疾病的常见诱因，因此，呈递自体抗原的致耐受DC是免疫体内稳态的必需调节物。在健康外周组织中，DC以完全分化但“未成熟”的状态存在。未成熟DC表达一组用于至局部感染、炎症或组织损伤的快速募集的炎性趋化因子受体。它们自身的致免疫性差，即，不能够诱导初次适应性免疫应答。但是，它们专长于抗原摄取(通过受体介导的内吞或液相胞饮机制)、抗原加工和将肽加载到胞内MHC-I/II分子上和细胞表面呈递。因为未成熟DC通常不表达LN-归巢受体CCR7，所以目前还不知道这种类型的DC怎样到达脾脏、LN和PP中的T细胞区域。许多成熟信号，包括病毒或细菌衍生的引发toll-样受体(TLR)的刺激物、宿主细胞衍生的炎症介质(特别是干扰素[IFN]-γ、肿瘤坏死因子[TNF]-α、白细胞间介素[IL]-1、前列腺素E2[PGE2]、组织生长因子)和T细胞共刺激分子(CD40-配体/CD154)，诱导DC“成熟”(Banchereau和Steinman，1998；Steinman等，2003；Banchereau等，2004)。在DC成熟的早期过程中，DC分泌高水平的炎性趋化因子，用于通过募集另外的未成熟DC和先天性免疫系统的细胞(单核细胞、粒细胞、天然杀伤细胞)来增强炎症应答。随后，炎症迁移程序逐渐地由LN-归巢迁移程序替代，后者的特征在于炎性趋化因子受体由CCR7替代。CCR7对于敏化的DC响应存在于淋巴管上以及存在于脾脏、LN和PP中的T细胞区域中的两种CCR7-选择性趋化因子ELC/CCL19和SLC/CCL21从外周组织至排出LN的有效重新定位是必要的。因此，CCR7表达标志着成熟的或正在成熟的DC。除了LN归巢特征外，成熟DC的特征还有大量MHC-I/II-肽复合体以及适当刺激原初(未经历过抗原的)αβT细胞所需要的不同共刺激分子的稳定细胞表面表达(Banchereau和Steinman，1998；Steinman等，2003；Banchereau等，2004)。DC也称为“专门”APC，因为它们在初次免疫应答过程中能够刺激原初αβT细胞。记忆(经历过抗原的)T细胞具有较低的激活阈值，并因此响应低严谨性的刺激方案。区分这两种分化状态的DC功能双重性是DC生理学的标志并与局部炎症、感染和组织损伤密切相关，这两种分化状态为a)外周组织中的未成熟的、呈递抗原DC和b)组织-排出LN中的重新定位的成熟的、呈递抗原和共刺激DC。最后，适应性免疫应答的结果(质量和数量)极大程度地由应答启动的“模式”来决定。已知关于病原体消除所需要的免疫应答类型，DC“指示”LN和PP的T细胞区域内的原初T细胞(Banchereau和Steinman，1998；Steinman等，2003；Banchereau等，2004)。因此，组织中的炎症环境直接影响DC成熟，且由于DC重新定位，还决定了排出LN内的T细胞分化。原初T细胞分化的不同效应子命运包括T辅助细胞(特别是产生IFN-γ/TNF-α的1型T辅助[Th1]细胞，产生IL-4/IL-5/IL-13的Th2细胞)、调节T细胞和细胞毒性T细胞(CTL)的专门亚类。效应T细胞归巢至炎症部位，快速引发效应子功能(细胞因子分泌、裂解/杀灭受感染细胞/肿瘤细胞)并具有有限的寿命。相反，记忆T细胞是初次免疫的耐久产物并引发优良的对回忆抗原的免疫应答。
免疫治疗中的树突细胞DC是“生物界的佐剂”，即，构成最专门的诱导保护性免疫应答的细胞系统，因此正在开发用于人免疫治疗中(Fong和Engleman，2000；Steinman等，2003；Schuler等，2003；Figdor等，2004)。潜在的应用包括癌症治疗、对抗病原体(如人免疫缺陷病毒[HIV]-1和丙肝病毒)的疫苗接种和自体免疫疾病的治疗。目前的DC治疗方案包括
1.从患者血液分离和纯化DC前体(骨髓产生的CD34+造血前体或外周血CD14+或CD11c+细胞)。
2.在体外细胞培养过程中使DC产生。
3.体外加载用于由成熟DC呈递肽的抗原。
4.通过单次或重复注射呈递肽的DC来治疗患者。
目前，免疫治疗中DC的应用面临几个问题(Fong和Engleman，2000；Steinman等，2003；Schuler等，2003；Figdor等，2004)。简而言之，DC前体在外周血中不足且在体外培养过程中不增殖，需要使用患者的大量血样来重复操作。DC在功能上是非纯一的并可以诱导相反的或不利的作用，例如代替效应T细胞产生的免疫抑制。此外，DC在功能上是不稳定的并经历预定顺序的不可逆分化步骤，结果为受到损害的(“耗尽的”)免疫功能。这在通过体外操作产生功能上相似的DC制剂中造成极大的困难。最后，用于免疫治疗中的呈递肽DC的产生是技术上苛求的、费时的且高成本的。
发明内容
本发明描述了呈递抗原的人γδT细胞的简单分离和体外制备及其用作免疫治疗中有效的呈递抗原细胞(APC)的用途。人γδT细胞的效力和功效与树突细胞(DC)相似，加工抗原和向αβT细胞呈递抗原肽并诱导原初αβT细胞中的抗原特异性应答(增殖和分化)。γδT细胞在外周血中相对常见(CD3+T细胞的2-10％)，易于通过多种简单技术从外周血纯化，在简单刺激条件下体外培养1天内获得“成熟”状态(MHC-II以及必要的粘附分子和共刺激分子的表达)，在体外培养7天或更长的时间内维持有效的呈递抗原功能并诱导强烈的初次和再次T辅助细胞应答。此外，γδT细胞在用于存储和之后使用的体外培养过程中容易扩充。
本发明涉及制备有效呈递抗原的人γδT细胞的方法，该方法包括从人外周血单核细胞中选择γδT细胞，用诱导呈递抗原功能的刺激物处理选定的细胞，并将所述抗原应用于这些细胞(在诱导呈递抗原功能之前、期间或之后)，涉及通过该方法制得的有效呈递抗原的人γδT细胞，及其在免疫治疗中和在制备用于免疫治疗的药物中的用途，涉及用这样的有效呈递抗原的人γδT细胞治疗肿瘤或慢性或复发性传染病的方法，涉及用靶向γδT细胞的疫苗对抗肿瘤或诱导传染或非传染病物质的接种方法和涉及这样的靶向γδT细胞的疫苗在制备药物中的用途，涉及鉴定新的肿瘤或病原体衍生的抗原的方法，和涉及使用这样的有效呈递抗原的人γδT细胞诊断患者免能力的方法。
图1(1A和1B).受刺激的γδT细胞呈现多种呈递抗原、共刺激和粘附分子。
通过流式细胞术进行细胞表面分子的检查，使用从外周血新鲜分离的或用IPP刺激和体外培养1或7天后的γδT细胞(γδT)，或使用用抗CD3/CD28刺激1天后的αβT细胞(αβT)，或使用新鲜分离的外周血单核细胞(M)。各个点阵(dot-blot)上方的数字表示体外培养时间；(0d)新鲜分离的，(1d)1天或(7d)7天。用同型相配的对照抗体染色来确定阳性，且水平线表示对99％背景染色的门控。
图2.受刺激的γδT细胞表达功能性CCR7并应答LN趋化因子SLC/CCL21。
数据摘自Brandes等，2003。A)用IPP刺激36小时后检查γδT细胞中的细胞趋化性应答，并以已经应答所示趋化因子而迁移的细胞分数(％)来表示，即全部输入细胞的％。C＝对照(空白)。B)通过流式细胞术测定CCR7表达，n＝细胞计数。实线和虚线表示分别在I PP刺激的(参见趋化性)和静息的外周血γδT细胞上的CCR7表达；填满的柱状图描绘了使用同型抗体的对照染色。
图3.受刺激的γδT细胞和原初αβT细胞之间快速而大范围的聚集物形成。
将刺激1天的γδT细胞和自体的原初CD4+αβT细胞以1∶5的比例一起培养3小时(γδT，2个实例)。将分别作为阳性和阴性对照的成熟单核细胞衍生的DC(DC)和刺激1天的αβT细胞(αβT)与自体的原初αβT细胞混合。从相同供体分离所有细胞来排除抗原的相互作用。将原初CD4+αβT细胞加载CFSE，用于通过荧光显微镜来鉴别。用Zeiss-Axiovert 35倒置显微镜获取活细胞的相差和荧光图像，并将图像重叠合并。
图4.受刺激的γδT细胞诱导静息CD4+αβT细胞中有效的TT-特异性增殖应答。
在20μg/ml TT存在下将γδT细胞刺激1天，洗涤，然后以1∶2的比例加入CFSE标记的TT-特异性αβT细胞中。在培养4天(4d)和6天(6d)后，通过流式细胞术检查CD4+细胞中的CFSE信号(γδT(+TT))。作为阳性对照，在20μg/ml TT存在下使单核细胞衍生的DC成熟(DC(+TT))，并在与呈递TT的γδT细胞相同的条件下以1∶10的比例用于刺激αβT细胞。作为阴性对照，分别用在TT不存在下刺激和成熟的γδT细胞(γδT(-TT))和DC(DC(-TT))共培养αβT细胞。柱状图上方的水平条表示未分裂的(非反应性)细胞中CFSE信号的位置；n＝细胞计数。
图5.TT-特异性CD4+αβT细胞的增殖需要接触TT-呈递γδT细胞。
完全如图4中所述的进行TT-呈递γδT细胞和CFSE标记的应答细胞的制备以及数据分析。在两室组织培养系统中，将TT-呈递γδT细胞和TT-特异性应答(CD4+αβ+T)细胞加入下部室(B)中，并将应答细胞单独加入上部室(A)中。两个室由多孔膜隔开，多孔膜允许可溶蛋白质自由交换，但完整的细胞不可以。柱状图上方的水平条表示对未分裂的加载CFSE的细胞的门控。
图6.TT-呈递γδT细胞诱导TT-特异性CD4+αβT细胞中的TCR下调。
在递增浓度，从0(未加入TT)至1,000μg/ml的TT存在下，分别刺激和γδT细胞和DC并使之成熟，然后以APC应答细胞1∶2的比例用静息TT-特异性CD4+αβT细胞培养。18小时后，通过流式细胞术测定αβT细胞上的CD3表达水平，并表示为与没有加入TT的细胞相比较的平均荧光强度(MFI)％。完全如图4中所述的进行TT-呈递γδT细胞和应答细胞的制备以及数据分析。
图7.TT-呈递γδT细胞诱导TT特异性CD4+αβT细胞上激活标记的表达。
用在10μg/ml TT存在(+TT)或不存在(-TT)下刺激的γδT细胞培养5天后，通过流式细胞术测定TT特异性CD4+αβT细胞(应答细胞)上激活标记CD25、ICOS和OX40的水平(参见图4)。空心和填满的柱状图分别表示使用特异性和对照同型抗体的荧光染色；n＝细胞计数。水平条表示对标记阳性的细胞的门控，柱状图上方的数字表示阳性程度，表示为阳性细胞百分比(％)和平均荧光强度(MFI)。
图8.异种EBV-B细胞和TT-特异性CD4+αβT细胞在功能上不向对TT特异性应答细胞呈递TT。
将CP.EBV细胞、应答细胞(TT-特异性CD4+αβT细胞)和γδT细胞(作为阴性对照)在20μg/ml TT存在下培养1天，洗涤，照射，然后以1∶2的比例加入TT-特异性CD4+αβT细胞中。培养3天(3d)和8天(8d)后，通过流式细胞术检查CD4+细胞中的CFSE信号。CP.BSV和应答细胞制备、CFSE-标记和流式细胞术描述于“实施例”中。
图9.受刺激的γδT细胞在加工和呈递复合蛋白抗原(PPD)中也是有效的。
在20μg/ml PPD的存在(+PPD)或不存在(-PPD)下刺激/成熟γδT细胞和DC，并分析在静息的自体PPD-特异性CD4+αβT细胞中增殖的诱导。作为另外的阴性对照，在γδT细胞或DC不存在下但在20μg/ml PPD存在下培养PPD-特异性CD4+αβT细胞。实验设置与图4中所用的相同。γδT细胞和DC制备、PPD-特异性CD4+αβT细胞的CFSE-标记和流式细胞术描述于“实施例”中。
图10.加载TSST-1的γδT细胞诱导自体原初CD4+αβT细胞中的增殖。
将受刺激的γδT细胞(γδT)、受刺激的CD4+αβT细胞(αβT)、成熟的DC(DC)和新鲜分离的血液单核细胞(M)加载10ng/mlTSST-1，并以1∶5的比例和新鲜分离的、CFSE标记的原初CD4+αβT细胞混合。培养4天后，通过流式细胞术来测定Vβ2+-αβT细胞(Vβ2)中的增殖应答。点阵中的垂直和水平线限定了对Vβ2+-αβT细胞和分裂细胞的门控；左上和左下象限分别显示了分裂的Vβ2+-细胞和分裂的Vβ2neg-细胞，而右上和右下象限分别显示了未分裂的Vβ2+-细胞和未分裂的Vβ2neg-细胞；数字指的是各个象限内存在的全部细胞的百分比。根据“实施例”进行细胞制备、TSST-1-加载和流式细胞术。
图11.加载TSST-1的γδT细胞表明了有效的APC功能(TSST-1的滴定)。
用递增浓度的TSST-1加载受刺激的γδT细胞(γδT)和αβT细胞(αβT)、树突细胞(DC)和单核细胞(M)，并以1∶5的比例与CFSE标记的原初CD4+αβT细胞混合。培养4天后，通过流式细胞术测定每个培养孔中分裂的Vβ2+-αβT细胞数目(Vβ2+T)(参见图10的左上象限)。测试的呈递抗原细胞是图10中所示的那些，除外，还有培养7天然后加载不同浓度TSST-1的受刺激的γδT细胞(γδT 7d)。每个数据点加上误差棒表示来自2次单独的实验的重复值的平均值±标准偏差(SD)，且数据表示3次独立实验。根据“实施例”进行细胞增殖、TSST-1加载和流式细胞术。
图12.加载TSST-1的γδT细胞表明了有效的APC功能(APC的滴定)。
将受刺激的γδT细胞和成熟DC加载1μg/ml或100ng/mlTSST-1，并在各种稀释度(1∶5至1∶200)的APCαβT细胞(APCγδT细胞或成熟DC)测试在原初CD4+αβT细胞中增殖的诱导。根据“实施例”进行细胞增殖、TSST-1加载和流式细胞术。
图13(13A和13B).加载TSST-1的γδT细胞诱导原初CD4+αβT细胞中的T辅助细胞分化。
将加载10ng/ml TSST-1的受刺激的γδT细胞、αβT细胞或成熟DC与原初CD4+αβT细胞混合，并如图10中所述的检查Vβ2+应答细胞增殖。培养4天后，通过流式细胞术测定Vβ2+应答细胞中记忆标记CD45RO的表达和细胞分裂的程度。培养21天后，当细胞恢复至静息、非增殖状态时，用PMA/离子霉素刺激细胞并通过流式细胞术检查胞内细胞因子IL-4和IFN-γ的产生(图13B)。左上、右上和右下象限中的数字分别限定了所产生的Th2、Th0和Th1细胞的分数(全部细胞的百分比)，且各个点阵上方的数字指的是细胞培养开始时APC与应答细胞的比例。细胞增殖、TSST-1加载和细胞因子产生的测定描述于“实施例”中。
图14.通过加载TSST-1的γδT细胞诱导原初CD4+αβT细胞中的增殖是细胞接触依赖性的。
将受刺激的γδT细胞加载100ng/ml TSST-1并将CFSE标记的原初CD4+αβT细胞单独培养(A)或以1∶5的APC∶应答细胞比例和γδT细胞一起培养(B)。图5中描述了两室培养系统和CFSE流式细胞术数据分析。
图15.γδδT细胞诱导初次CD8+T细胞应答。
以递减的APC应答细胞比例使用原初CD8+αβT细胞和异种IPP-刺激的γδT细胞(圆圈)、LPS-成熟的单核细胞衍生的DC(方块)或超抗原刺激的αβT细胞(三角形)的混合白细胞应答(表示6次实验)。通过图5中所述的流式细胞数据分析来评定CFSE标记的CD8+应答细胞中的增殖应答。
图16.γδT细胞诱导原初CD88+T细胞分化成细胞毒性T细胞。
在培养14天后，检查源自如图15中所述的混合白细胞应答的CD8+T细胞的细胞溶解活性。细胞毒性试定包括效应细胞，即，源自混合白细胞应答的CD8+T细胞，和CFSE标记的靶细胞。靶细胞混合物含有1∶1比例的真实靶细胞(异种CD4+T细胞)和阴性对照靶细胞(自体CD4+T细胞)。在混合之前用不同浓度的CFSE标记真实和阴性对照靶细胞，以便区分这两个靶细胞亚类。
(A)效应细胞不存在下靶细胞混合物的流式细胞术分析表示阴性对照(C)和真实靶(T)细胞群。
(B)30∶1、10∶1、3∶1和1∶1比例的CD8+T细胞和靶细胞共培养12小时后，通过测量真实靶细胞群数量的减少(箭头)来评定靶细胞溶解的程度。箭头所示的数目指的是特异性杀灭的百分比，且涉及与具有低CFSE荧光的对照细胞计数相比较，具有高CFSE荧光细胞计数(真实靶细胞)的损失。
左列CD8+T细胞源自使用IPP-刺激的γδT细胞作为APC的混合白细胞应答。
右列CD8+T细胞源自使用成熟DC作为APC的混合白细胞应答。
图17.γδT细胞表达高水平的内吞细胞表面蛋白DEC205(CD205)和CD11b。
通过图7中所述的流式细胞术分析从外周血新鲜分离的γδT细胞(γδT)和未成熟DC(DC)中的CD205和CD11b表达。点阵图中的垂直和水平线限定了表达CD205或CD11b细胞的门控，且图中的右上象限描绘了对CD205和CD11b呈双阳性的细胞；数字指的是各个象限内存在的全部细胞的百分比。通过用同型相配对照抗体染色来确定阳性，且水平或垂直线表示对99％背景染色的门控。
发明详述流程图概括了本发明通过分离和体外处理人外周血γδT细胞制备有效呈递抗原的人γδT细胞(Vγ2 Vδ2+γδT细胞，此后称为“γδT细胞”)的方法。尽管分离和体外增殖γδT细胞的方案本身是已知的，但还没有描述刺激和抗原应用或肽加载的特定结合。起始物料是通过差速离心或免疫吸附加工过的人外周血，分别产生扩充的或新鲜分离的高纯度γδT细胞。短期(例如，24小时)刺激结合抗原应用或肽加载结果形成用于免疫治疗的具有有效呈递抗原功能的γδT细胞。
a)在异戊烯焦磷酸酯(IPP)或如下所示的具有γδT细胞选择性的其它小分子量非肽化合物的存在下，γδT细胞在外周血淋巴细胞(PBL)培养过程中容易扩充(Morita等，2000；Eberl等，2003)。IPP或具有γδT细胞选择性的其它小分子量非肽化合物也可用于诱导如下文所述选定的γδT细胞的呈递抗原功能。培养10-21天后，绝大部分活的、扩充的细胞是Vγ2Vδ2+)γδT细胞，通过菲可帕克(Ficoll-Paque)离心将其从死细胞中分离出来并立即用于呈递抗原细胞(APC)产生或贮存于液氮中。或者，如“实施例”中所述，通过阳性选择从外周血单核细胞(PBMC)中直接分离出γδT细胞。
流程图有效递呈抗原人γδT细胞的制备
b)用(Vγ2Vδ2+)γδT细胞选择性化合物或植物凝集素(PHA)或如下文所列的用于诱导抗原摄取，呈递功能和共刺激分子表达的其它刺激物刺激新鲜分离的和扩充的γδT细胞一段短的时间(例如，12至96小时)。
c)在刺激(b)之前、期间或之后用抗原处理γδT细胞，结果形成呈递抗原的γδT细胞。这种抗原应用包括各种独立的方法，(特别是)如加入来自肿瘤、微生物或病毒感染细胞的复杂提取物或确定的蛋白质或编码这样的病原体衍生蛋白质的DNA/RNA，以纯化的核物质或包装于表达载体中或减毒病毒的形式加入用于γδT细胞的转染/转导和内源表达以及微生物、病原体或肿瘤细胞衍生抗原的加工。
d)代替短期刺激程序过程中将抗原(以蛋白质或DNA/RNA的形式)加入γδT细胞中(b和c的结合)，可以按次序进行这些步骤。然后使用不需要胞内蛋白水解加工的确定的肽抗原将刺激的γδT细胞“加载”一段短的时间。
除了IPP之外，步骤(a)中认为的具有(Vγ2Vδ2+)γδT细胞选择性的备选小分子量非肽抗原是(E)-4-羟基-3-甲基-丁-2-烯基焦磷酸酯(HMB-PP)、焦磷酸乙酯(EPP)、焦磷酸法呢酯(FPP)、二甲基烯丙基磷酸酯(DMAP)、二甲基烯丙基焦磷酸酯(DMAPP)、乙基-腺苷三磷酸酯(EPPPA)、牦牛儿焦磷酸酯(GPP)、牦牛儿牦牛儿焦磷酸酯(GGPP)、异戊烯基-腺苷三磷酸酯(IPPPA)、磷酸一乙酯(MEP)、焦磷酸一乙酯(MEPP)、3-甲酰-1-丁基-焦磷酸酯(TUBAg 1)、X-焦磷酸酯(TUBAg 2)、3-甲酰-1-丁基-尿苷三磷酸酯(TUBAg 3)、3-甲酰-1-丁基-脱氧胸苷三磷酸酯(TUBAg 4)、一乙基烷基胺、焦磷酸烯丙酯、焦磷酸巴豆酯、二甲基烯丙基-γ-尿苷三磷酸酯、巴豆基-γ-尿苷三磷酸酯、烯丙基-γ-尿苷三磷酸酯、乙胺、异丁胺、仲丁胺、异戊胺和含有氮的双膦酸酯。优选使用IPP由B细胞或替代物来呈递。
例如通过将人Vγ2Vδ2-TCR的抗体加入人外周血单核细胞中，例如1-3小时孵育，接着磁性细胞分选来进行阳性选择。或者，通过将人VγVδ-TCR的抗体加入人外周血单核细胞中(总-γδT细胞选择)接着磁性细胞分选来进行阳性选择。
用作步骤(b)中诱导呈递抗原功能刺激物的Vγ2Vδ2u)γδT细胞选择性化合物是IPP和如上步骤(a)中所示的其它非肽化合物，例如，4-羟基-3-甲基-丁-2-烯基焦磷酸酯或其它相关的微生物代谢物。或者，将PHA或替代物用作诱导抗原摄取、呈递功能和共刺激分子表达的刺激物。
为了抑制γδT细胞增殖，如果需要，可以照射刺激的细胞。
用作步骤(c)和/或(d)中蛋白质的抗原实例是使用DC作为呈递抗原细胞的免疫治疗方案中常用的那些并与治疗靶，例如，肿瘤细胞、传染性因子(微生物，包括病毒、细菌、酵母和寄生物)相关，和病原体相关的毒素。这样的抗原包括(但不限于)肿瘤相关抗原(肿瘤特异性代谢、结构和细胞表面蛋白等)；病毒相关抗原(病毒编码的包膜、结构、代谢和酶蛋白，例如，不同病毒分化体的HIV gp 120蛋白、HIV Tat、HIV蛋白酶，例如特别是源自肝炎病毒、流感病毒、人巨细胞病毒、脊髓灰质炎病毒、狂犬病病毒、疱疹病毒的包膜、结构、代谢和酶蛋白)；细菌相关抗原(细菌编码的细胞壁、结构、代谢和酶蛋白等，例如特别是源自分枝杆菌属(Mycobacteria)(例如肺结核分枝杆菌(M.tuberculosis)、麻风分枝杆菌(M.leprae))、单核细胞增生利斯特氏菌(Listeria monocytogenes)、肺炎球菌(Pneumococci)、葡萄球菌属(Staphylococci)(例如，金黄色葡萄球菌(S.aureus))、链球菌属(Streptococci)(例如酿脓链球菌(S.pyogenes)、肺炎链球菌(S.pneumoniae))、霍乱弧菌(Vibrio cholerae)、破伤风梭菌(Clostridium tetani)的那些)；酵母和真菌相关抗原(酵母/真菌编码的细胞壁、结构、代谢和酶蛋白等，例如特别是源自白色假丝酵母(Candida albicans)、烟曲霉(Aspergillus fumigatus)的那些)；和病原体产生的毒素(细菌肠毒素，特别是例如葡萄球菌肠毒素、中毒性休克综合征毒素、破伤风毒素)。用作蛋白质的抗原实例还包括与引起提高的抗生素治疗抗性的细菌和引起全世界致命疾病的那些微生物(特别是例如，疟原虫属(Plasmodia)(例如恶性疟原虫(P.falciparum)、间日疟原虫(P.vivax)、三日疟原虫(P.malariae)、利什曼虫属(Leishmania)、锥虫属(Trypanosoma)、内阿米巴属(Entamoeba)、血吸虫属(Schistosoma)、丝虫属(Filaria))相关的那些。步骤(c)中以RNA/DNA形式使用的抗原包括血液和组织细胞转染方案中常用的那些并包括(但不限于)编码来自肿瘤细胞、传染性因子(微生物，包括病毒、细菌、酵母和寄生物)的蛋白质的那些，和病原体相关毒素，如上所示。
如“有效呈递抗原的人γδT细胞”中所用的“有效”意思是这样的细胞的呈递抗原功能比得上DC的相应呈递抗原功能。“有效”是例如在同等的条件下至少10％和DC一样有效，差异是不同细胞形态，包括细胞形状和表面积的结果。
短期刺激的γδT细胞一律表达趋化因子受体CCR7，其是APC归巢至淋巴结和派伊尔结的先决条件，因此对于适应性免疫应答的启动是关键因素。静息外周血γδT细胞不表达MHC-II分子，因此，不能够以致耐受性方式来呈递肽抗原。这种“安全性”问题使γδT细胞远离具有已知耐受性诱导特征的其它APC，如DC和B细胞。呈递抗原的γδT细胞的应用包括，特别是，在肿瘤患者治疗中对肿瘤和在慢性感染或不当免疫力患者治疗中对微生物和病毒的免疫应答的诱导和/或提高。此外，呈递抗原的γδT细胞可以用于鉴定新的肿瘤和其它病原体产生的具有强烈免疫原性特征的用于免疫治疗中潜在应用的抗原。最后，描述了γδT细胞监控(特别是)免疫抑制个体的适应性免疫力(免疫力的状态)的应用。
现在参照附图来更详细地描述本发明，附图给出了本发明方法的效率的充足证据。
图1描述了从外周血分离后不久的或刺激并培养1或7天后的γδT细胞上细胞表面分子的表达。为了比较，还检查了刺激1天的αβT细胞和新鲜分离的单核细胞上的相同细胞表面分子。图1中所示的细胞表面分子包括MHC-II；共刺激分子CD80和CD86，即用于原初和记忆T细胞上存在的受体CD28的两种选择性配体；CD70，即CD27的配体；CD40，即CD154/CD40-配体的受体以及粘附分子CD54/ICAM-1、CD11a/αL-整联蛋白和CD18/β2-整联蛋白，它们参与细胞与细胞的接触。这些数据证明了新鲜分离的γδT细胞具有适度水平的粘附分子但缺少原初T细胞激活和分化必需的MHC-II和共刺激分子。相反，γδT细胞的短期(1天)刺激导致MHC-II和共刺激分子非常高水平的表达并进一步提高了粘附分子的表达。值得注意的是，除了CD40和CD54，这些细胞表面分子的水平都在γδT细胞7天的培养过程中得到维持或进一步提高。明显相反，相同系列的分子(除了单核细胞上的CD86)在αβT和单核细胞上适度表达或不存在。
表1中的数字总结了对细胞表面分子在γδT细胞上以及为了比较，在αβT细胞、单核细胞和成熟DC上的表达的广泛研究的结果。列表包括图1中所示的实例以及其它的细胞表面分子。数字表示平均表达水平，表示为平均荧光强度(MFI)的平均值，和相应的标准偏差(SD)。注意到激活的γδT细胞上的MHC-II(HLA-DR)、共刺激分子和粘附分子的显著阳性，其类似成熟DC但远超过在激活的αβT细胞和单核细胞中所看到的水平。
图2和表2对应于以前由Brandes等，2003发表的结果，并在此包括来描述与本发明有关的激活人γδT细胞的另外的特征。表2列出了趋化因子受体的表达水平，其在新鲜分离的外周血γδT细胞与受刺激的γδT细胞之间明显不同。外周血中的γδT细胞表达趋化因子受体和粘附分子(图1中所示的)，用于快速募集至炎症和感染部位，而γδT细胞的短期激活部分抑制这些炎症迁移特性(即CCR2和CCR5的下调)并代之以快速诱导CCR7表达，用于有效归巢至脾脏、LN和PP的T细胞区域。
表1.人γδT细胞上细胞表面分子的表达水平。
a如实施例中所述刺激细胞并通过流式细胞术来检查所示分子的细胞表面表达。
MFI＝平均荧光强度；SD ＝标准偏差；(n)表示独立实验的数目。
bn.d.表示未测定。
表2.人γδT细胞中趋化因子受体的表达
a数据摘自Brandes等，Blood(2003)图2说明了短期激活的γδT细胞的迁移特性，如通过体外趋化性分析所评定的(Brandes等，2002)。数据清楚地证明了在激活的γδT细胞中对CCR7配体SLC/CCL21的响应性和强烈降低的对CCR5(和CCR1、CCR3)配体RANTES/CCL5的响应性。数据进一步证明了细胞表面趋化因子受体水平的改变直接反映在对相应趋化因子的迁移应答中。
共同地，图1-2和表1-2中概括的结果强调了受刺激的而不是静息的(新鲜分离的)外周血γδT细胞表达许多LN归巢和原初T细胞刺激所需要的必要因子，包括粘附分子和共刺激分子以及趋化因子受体。将这些迁移和APC相关参数的激活诱导调节与DC中发生的激活诱导改变进行充分比较(Banchereau和Steinman，1998；Steinman等，2003；Banchereau等，2004)。此外，这些数据意味着刺激的人γδT细胞可以充当比得上DC的有效APC。
快速、广泛和抗原无关的细胞簇形成是DC-T细胞相互作用的特征且是原初T细胞的抗原依赖性刺激和分化的先决条件。图3证明了受刺激的γδT细胞在培养3小时内也诱导原初(静息)CD4+T细胞巨大的细胞成簇。值得注意的是，这些簇在抗原不存在下形成，表明粘附分子和共刺激分子引起了这种效果。γδT细胞介导的簇形成至少和使用成熟DC观察到的情况一样旺盛。相反，1天激活的αβT细胞或新鲜分离的单核细胞(未显示)的效率要低得多，这与这些细胞上降低水平的粘附分子和共刺激分子相一致。这些数据提供了短期激活的γδT细胞具有有效的APC功能的进一步证据。
激活的γδT细胞能够摄取、加工和呈递抗原，用于引发抗原特异性CD4+αβT细胞系中的应答。图4显示了破伤风毒素(TT)特异性CD4+αβT细胞应答短期刺激的呈递TT的γδT细胞的增殖或应答作为对照的呈递TT的DC的增殖。TT特异性CD4+αβT细胞系源自提供γδT细胞的相同供体。将静息TT-特异性CD4+αβT细胞加载CFSE，并通过用流式细胞术测量培养细胞中CFSE信号的降低来测定应答细胞的增殖(参见“实施例”)。在细胞分裂过程中，将CFSE内容物分配到两个子细胞上，使得每轮细胞分裂的特征在于CFSE信号降低50％。这种类型的分析允许测定a)非应答细胞与增殖细胞(输入/最大与降低的CFSE信号)的分数，b)具有不同轮细胞分裂的细胞亚类，和c)实验开始时已经应答APC的细胞的分数。通过进行3H-胸苷掺入测定不能获得这种信息，这种测定是测定细胞增殖的备选方法。图4显示了γδT细胞能够诱导TT-特异性CD4+T细胞中的增殖且这种应答完全取决于抗原，因为在TT不存在下受刺激的γδT细胞是没有活性的。这进一步显示了在培养的第4天至第6天，CD4+T细胞持续增殖，如通过CFSE信号的进一步降低所证实的(在图4中移至荧光信号的左侧)。值得注意的是，γδT细胞在这种应答中和成熟DC的有效性相似，这证明了短期刺激的γδT细胞具有有效的呈递抗原功能。
图5说明了这样的事实TT特异性增殖应答需要TT呈递γδT细胞与应答TT特异性CD4+αβT细胞(应答细胞)之间的细胞接触。通过多孔膜从含有TT-呈递γδT细胞和应答细胞的共培养物中分离出来的应答细胞没有增殖。多孔膜防止了两个培养区室之间的细胞交换，但不防止可溶性介质的交换。因此，图5中的结果还证明了在TT-呈递γδT细胞和应答细胞共培养的过程中产生的细胞因子和生长因子对分开培养的应答细胞的增殖没有影响。
TCR引发伴随着TCR内在化，导致细胞表面TCR和附属分子如CD3的下调。图6证明了TT-呈递γδT细胞诱导TT-特异性应答细胞中的TCR下调(参见图4)，如通过细胞表面CD3的丧失所评定的。因此，γδT细胞具有摄取和加工TT以及以足以TCR接合的方式向TT-特异性应答细胞呈递MHC-II-肽复合体形式的TT-衍生肽的能力。因为激活的而不是静息的外周血γδT细胞表达细胞表面MHC-II分子，所以呈递抗原功能与γδT细胞激活密切相关。图6还显示出TCR下调是受刺激的γδT细胞上TT-肽密度的函数，其通过改变γδT细胞刺激过程中加入的TT量来控制。明显地，刺激的γδT细胞上存在的TT-衍生的MHC-II-肽复合体越多，应答细胞上变为接合和下调的TCR就越多。γδT细胞和DC之间TCR下调的不同效力很可能是由于细胞形态的显著差异引起的，因为成熟的呈递抗原DC的细胞表面积大于刺激的γδT细胞＞10倍(Miller等，2004)。
除了增殖外，TT-呈递γδT细胞还诱导TT-特异性CD4+αβT细胞中激活标记的表达。图7显示了应答细胞的细胞表面上T细胞激活标记包括CD25、ICOS和CD134/OX40的上调，这些T细胞激活标记应答TCR引发而重新表达或提高。与在T细胞增殖的诱导中一样，这些激活标记的高水平表达完全取决于由短期刺激的γδT细胞的TT-肽呈递，因为用TT不存在下受刺激的γδT细胞不诱导这些激活标记。
图8显示出异种EB病毒(EBV)-无限增殖化B细胞和自体应答细胞缺少TT-呈递功能。一个刺激γδT细胞的方案包括使用照射的、IPP-呈递细胞，该细胞是自体B细胞，或者为了体外实验的方便，是EBV-B细胞系，即异种CP.EBV系。图8证明了TT-处理的CP.EBV细胞不能诱导TT-特异性CD4+αβT细胞的增殖，表明CP.EBV材料并未有助于用TT-肽呈递γδT细胞获得的强烈增殖应答。此外，图8说明了αβT细胞系凭借自身的TT-呈递功能差。
使用复杂/未确定的抗原肺结核分枝杆菌纯化的蛋白质衍生物(PPD)获得了与图4-8中所示的使用TT的情况相似的结果。图9显示了用作为APC的PPD-肽呈递γδT细胞或PPD-肽呈递DC刺激后培养4天或8天后PPD-特异性CD4+αβT细胞的增殖应答。再次，在自体条件下进行实验，即，APC(γδT细胞和DC)和应答细胞(PPD-特异性CD4+αβT细胞系)源自相同的供体。如对于TT所证明的，增殖应答是PPD-特异性的且在γδT细胞和DC之间没有显著不同。此外，αβT细胞系自身不能诱导PPD-特异性应答细胞中的增殖。与PPD相比较，使用TT相同浓度的抗原γδT细胞和DC诱导更有力的应答，这是由于TT(Mr[TT]150kDa)和PPD(Mr[PPD]≥10,000kDa)之间的复杂性差异引起的。复杂抗原，如PPD或完整的微生物，抗原肽的全部组成部分高度不同，其结果是各个APC以低水平呈递离散的MHC-肽复合体。相一致地，克隆的、PPD特异性CD4+T细胞与PPD呈递APC的共培养过程中的TCR下调没有在TT-系统中所观察到的那么明显(图6)。
总而言之，使用TT-特异性和PPD-特异性应答细胞的实验证明了本发明的发现刺激的(而不是静息的)源自人外周血的γδT细胞具有有效的抗原摄取、呈递抗原和T细胞刺激功能。这些γδT细胞的效力和功效是显著的并比得上使用DC获得的结果。
有效APC如DC的特征是它们诱导初次适应性免疫应答的能力，所述免疫应答涉及原初(未经历过抗原的)T细胞的刺激及其分化成具有产生细胞因子或杀灭靶细胞能力的抗原特异性效应T细胞(Banchereau和Steinman，1998；Steinman等，2003；Banchereau等，2004)。完全分化的记忆T细胞具有降低的激活阈值，且共刺激不存在下的TCR引发足以启动效应子功能。下图中显示的实验结果证明了受刺激的γδT细胞也具有与DC相当的有效呈递抗原功能。因此，代替经历过抗原的CD4+αβT细胞系(图4-9)，将自体新鲜分离的原初CD4+αβT细胞用作潜在的应答细胞。
图10显示了CFSE标记的、原初CD4+αβT细胞应答加载中毒性休克综合征毒素(TSST-1)的、短期刺激的γδT细胞和加载TSST-1的成熟DC的增殖程度，与加载TSST-1的刺激的αβT细胞或加载TSST-1的新鲜分离的单核细胞相比较。TSST-1结合APC上的MHC-II分子，且对于含有Vβ2-链的αβ-TCR是选择性的。4-10％的外周血CD3+T细胞是Vβ2+并以高亲和力应答TSST-1呈递APC。如图10中所证明的，加载TSST-1的γδT细胞在诱导原初Vβ2+-T细胞中的增殖中是专门的APC，如通过CFSE信号的降低所证明的，且在带有Vβ2+-TCR的原初CD4+αβT细胞中这种应答比带有Vβ2neg-TCR的细胞明显得多。最后，在完成细胞扩充后，大部分所得到的记忆T细胞表达Vβ2+-TCR(也参阅表3)。重要地，增殖应答比得上使用加载TSST-1的DC获得的结果。在这些条件下，加载TSST-1的αβT细胞或单核细胞完全没有活性，表明在这些细胞中TSST-1呈递和/或共刺激水平不足以诱导有效的初次T细胞应答。
表3.长期培养(21天)过程中的αβT细胞表达和Th细胞分化
aAPC是加载了TSST-1的刺激1天的γδT细胞或成熟DC，并以1∶5或1∶1的比例加入原初CD4+αβT细胞中。
bTSST-1是用于加载APC的抗原；或者，在APC不存在下用PHA直接激活原初CD4+αβT细胞。
cVβ2+应答细胞的百分比是如图10中所述的通过流式细胞术测定的。
d细胞因子极化的Th细胞百分比分数是如图13中所述的通过测量胞内细胞因子测定的。
e未测定的数据。
除了共刺激分子外，很大程度上决定原初CD4+αβT细胞中的动力学和增殖程度的参数是APC上MHC-II-TSST-1复合体的密度以及APC与应答细胞之间的比例。图11显示了Vβ2+应答细胞应答递增浓度的用于加载不同类型APC的TSST-1的增殖。在加入原初CD4+αβT细胞之前，将APC进行洗涤来去掉过量的TSST-1(参见“实施例”)。自体APC的名单包括刺激1天的或刺激7天的γδT细胞、成熟DC、新鲜分离的单核细胞和刺激1天的αβT细胞。刺激1天的γδT细胞在低到1ng/ml的TSST-1加载浓度下诱导T细胞增殖应答，且就最大应答而言和DC同等有效。DC的效力约高10倍可能是由于它们极度扩充的细胞表面积(Miller等，2004)，这允许更频繁的或更大范围的接触应答细胞(也参阅图6)。重要的是，用加载TSST-1之前的7天培养过程中扩充的刺激的γδT细胞仍然获得实质性的增殖应答。明显地，γδT细胞在延长的时间段内维持APC功能，这与观察到的粘附分子和共刺激分子的保持相一致(也参阅图1和表1)。单核细胞和αβT细胞的效力低于γδT细胞＞100倍。这些数据证明了刺激的γδT细胞具有有效的呈递抗原功能。
在图12所示的实验中，代替APC加载过程中的TSST-1滴定，使APC与原初应答细胞的比例在1∶5至1∶200之间变化，同时保持TSST-1加载浓度为100ng/ml或1μg/ml。如图11测定原初Vβ2+CD4+αβT细胞的增殖应答。刺激1天的γδT细胞和DC之间不存在明显的差异，且在最高的APC稀释度(1∶200)下，增殖应答仍然在最大应答的28-40％的范围。这些数据进一步说明了γδT细胞作为有效的APC的胜任性。
初次免疫应答涉及原初CD4+T细胞分化成极化的Th1、Th2或Th0细胞，它们分别具有产生1型(IFN-γ)、2型(IL-4)或0型(IFN-γ+IL-4)细胞因子的能力。原初CD4+T细胞具有分化成这些极化Th细胞任一种的能力。在原初T细胞引发时由APC提供的共刺激环境决定了T细胞极化。有效的APC不仅诱导原初T细胞的增殖，而且还支持它们分化成效应细胞。图13证明了刺激的γδT细胞在合适的共刺激环境中完全能够呈递TSST-1，用于产生效应Th细胞。用加载TSST-1的γδT细胞引发后4天，大部分Vβ2+原初CD4+T细胞已经通过增殖和记忆标记CD45RO的表达产生应答。21天培养后，大部分细胞恢复成静息状态，一律表达CD45RO并由Vβ2+T细胞构成(表3)。重要地，大部分细胞产生Th1、Th2或Th0细胞特有的细胞因子，且通过将加载TSST-1的γδT细胞与应答细胞的比例增加至1∶1进一步提高了Th1极化。此外，使用DC看到的更显著效果可能是由于如上所述的形态学标准所引起的(Miller等，2004)(也参阅图6、9)。相反，抗原非选择性激活(植物凝集素)不导致Vβ2+T细胞的选择性扩充(表3)，且刺激的αβT细胞不能诱导CD45RO表达和原初CD4+αβT细胞的增殖(图13)。
如使用TT-特异性和PPD-特异性CD4+αβT细胞所看到的(参见，例如，图5)，原初CD4+αβT细胞中应答的诱导完全取决于与加载TSST-1的γδT细胞的细胞与细胞接触(图14)。刺激的γδT细胞在原初CD4+αβT细胞中诱导强烈的抗原特异性应答并以有效APC的典型方式支持它们的增殖和分化。
CD4+T细胞识别APC上的II-类MHC-肽复合体，而CD8+T细胞识别APC上的I类MHC-肽复合体。I类MHC分子在血细胞和组织细胞上普遍表达；因此，体内的所有细胞都是CD8+T细胞的潜在靶细胞。值得注意的是，CD8+T细胞是对病毒感染和肿瘤的防御中的关键参与者，并且通常成功的疫苗接种取决于抗原选择性的、细胞毒性CD8+T细胞的产生。图15证明了Vδ2+T细胞是初次CD8+T细胞应答诱导中的非常有效的APC。将原初的、未触及的CD8+αβ T细胞用作增殖测定中的应答细胞，该测定包含IPP-刺激的γδ T细胞、成熟DC或超抗原刺激的αβT细胞作为APC(所有细胞都来自相同的供体)。γδT细胞在诱导CD8+T细胞增殖中完全比得上或甚至优于DC，而αβT细胞是较差的APC。图16证明了γδT细胞诱导细胞毒性效应T细胞的分化。数据说明了γδT细胞与DC在驱动原初CD8+T细胞分化成同种异体抗原特异性的细胞毒性T细胞中是不可区分的。共同地，TCR-刺激的Vδ2+T细胞以类似APC的“专门”方式诱导了原初CD4+和CD8+αβT细胞中的强烈促炎性应答。
γδT细胞还表达内吞受体，如C-型凝集素DEC-205(CD205)和具有多种蛋白和非蛋白配体选择性的整联蛋白亚基CD11b。已知CD205和CD11b在DC上高度表达(Banchereau和Steinman，1998；Steinman等，2003；Banchereau等，2004)。图17证明了γδT细胞，与DC相似，本能地表达高水平的这些内吞受体。与向DC的抗原递送的新方法类似，这些数据证明了抗原，包括用于肿瘤和传染性因子的蛋白疫苗，也可以靶向γδT细胞，用于体内抗原加工和呈递。
这些实验的细节证明了本发明制备有效呈递抗原的人γδT细胞的方法，包括从人外周血单核细胞中选择γδT细胞，用诱导呈递抗原功能的刺激物处理选定的细胞，并将所述抗原用于受刺激的细胞，提供了与DC相当的ACP。
特别地，本发明涉及这样的制备有效呈递抗原的人γδT细胞的方法，其中使用人VγVδ-T细胞受体的抗体进行磁性细胞分选来选择γδT细胞。或者，通过在诱导表达Vγ2Vδ2+-T细胞受体链的γδT细胞选择性扩充的结构上确定的小分子量非肽化合物的存在下培养新鲜分离的外周血淋巴细胞来进行γδT细胞选择，例如在IPP存在下，例如由B细胞或替代物呈递的。
本发明进一步涉及一种特定的方法，其中用于诱导有效呈递抗原功能的刺激物是小分子量非肽化合物或替代物或植物凝集素，和另一种特定的方法，其中以以下形式来应用抗原确定的蛋白质，未确定的蛋白质混合物，或粗制或富集的肿瘤和受感染细胞提取物，例如其中所应用的抗原是病原体-或肿瘤细胞-衍生的肽，或病原体衍生的蛋白质，该蛋白质以在允许所述病原体衍生的蛋白质内源性表达的条件下编码其的DNA或RNA的形式，特别是以纯化的DNA或RNA或含有这样的DNA或RNA的递送载体的形式来应用。如果抗原是DNA或RNA形式，则选择条件使得所述DNA或RNA可以得到适当表达。抗原的应用可以在用于诱导呈递抗原功能的γδT细胞刺激之前、期间或之后进行。如果以肽(蛋白质片段)来应用抗原，其应用也可以在刺激后的称为“肽加载”的分开步骤中进行。
如此前所述的根据本发明制得的有效呈递抗原的人γδT细胞可以用于免疫治疗中。这样的用途与DC在免疫治疗中的已知用途相似，因此克服了使用DC的缺陷，如在外周血中的不足、体外增殖的无能、异种性和功能不稳定性。
特别地，如之前所述的根据本发明制得的有效呈递抗原的人γδT细胞可以用于制备免疫治疗中所用的药物(药物组合物)。
本发明还涉及药物组合物，包含如前文中所述的根据本发明制得的有效呈递抗原的人γδT细胞，尤其可以用于上文和下文中所述的疾病的治疗。特别优选的是用于非肠道给药于人的组合物，如静脉内、肌内、皮下、粘膜或粘膜下给药。该组合物包含所述细胞和药物学上可接受的载体。本发明的细胞的用量取决于待治疗的疾病和年龄、体重和个体状况、个体药物动力学数据和给药方式。该药物组合物包含约0.01％至约50％的本发明的细胞。单位剂型是例如安瓿或小瓶。
优选的是使用等渗水性悬浮液。该药物组合物可以包含赋形剂，例如防腐剂、稳定剂、湿润剂和/或乳化剂、增溶剂、用于调节渗透压的盐和/或缓冲剂，并以本身已知的方式，例如通过常规的混合方法制得。通常在无菌条件下进行注射制剂的制备，例如填充到安瓿或小瓶中，并将容器密封。
本发明进一步涉及肿瘤或慢性或复发性传染病的治疗方法，其中将有效呈递抗原的人γδT细胞注射至需要的患者中。特别地，该方法涉及所述γδT细胞，例如含有该细胞的药物组合物，通过皮内、皮下、肌内、静脉内、粘膜或粘膜下途径的单次或重复应用。
在肿瘤治疗方法中，使用γδT细胞，该细胞已经在确定的肿瘤蛋白质或粗制(未确定的)肿瘤细胞提取物的存在下受到刺激，或者，已经使用常规用于转染或转导活的血细胞或组织细胞的重组RNA/DNA技术处理获得了该细胞。优选，如果用于直接加载至细胞表面MHC分子上的确定的肿瘤肽是已知的，那么将这样的肽加入受刺激的γδT细胞中、孵育、洗涤并立即用于治疗。重要的是强调每次给予所用的γδT细胞数量以及γδT细胞给予的途径和频率取决于免疫应答诱导中所用的单个肿瘤抗原的功效以及个体患者中存在的肿瘤的类型和位置。例如，优选的方案是每次给予1-20×106细胞/0.5-2ml，以两周至两个月的间隔使用相同或较低量细胞的继续给予1至6次。
在慢性或复发性传染病的治疗方法中，使用已经在优选减毒形式的确定的传染性因子或粗制(未确定的)感染细胞提取物的存在下受到刺激的γδT细胞，或者已经使用常规用于转染或转导活的血细胞或组织细胞的重组RNA/DNA技术处理获得的γδT细胞。优选的治疗方案与上述的治疗方案一致。
本发明进一步涉及接种对抗肿瘤或慢性或复发性传染病疫苗的方法，其中将已经应用了非传染性和非致肿瘤性抗原的有效呈递抗原的人γδT细胞注射至待接种疫苗的患者中。出于接种疫苗的目的，使用此前所述的相同程序，但是其中使用已经应用了非传染性和非致肿瘤性抗原的γδT细胞。按照肿瘤免疫治疗的描述(见上文)来制备疫苗呈递抗原γδT细胞和给予这些细胞用于给患者接种对抗肿瘤抗原或传染性因子的疫苗。优选的方案是基于DC的疫苗接种治疗中常用的那些方案。如下所述检查这样治疗过的患者的免疫状态，即，疫苗应答的能力(功效、动力学等)。
本发明进一步涉及另一种(预防性或治疗性)接种对抗肿瘤疫苗或接种对抗诱导传染性或非传染性疾病物质疫苗的方法，包括将靶向γδT细胞的疫苗给药于个体。优选，这样的靶向γδT细胞的疫苗是由疫苗剂和靶向γδT细胞的分子构成的混杂化合物。靶向γδT细胞的分子是γδT细胞上内吞受体，包括但不限于CD11b和CD205特异性的抗体或配体。疫苗剂是需要产生对抗其的免疫保护的蛋白质或相关分子。
靶向γδT细胞的疫苗的给药需要使用靶向γδT细胞的疫苗重复治疗个体，通过注射、口服或任何其他产生最佳免疫保护的疫苗递送方案重复治疗个体。
本发明进一步涉及鉴定新的肿瘤或病原体衍生抗原的方法，包括从人外周血单核细胞中选择γδT细胞，用诱导有效呈递抗原功能的刺激物处理选定的细胞，使用未确定的蛋白质混合物的部分，或肿瘤和受感染细胞的粗制或富集提取物，或源自肿瘤和传染性因子的RNA或DNA文库，测试自体原初αβT细胞的体外激活，并比较不同抗原部分的激活结果。
在该方法中，将γδT细胞用作体外筛选工具，用于鉴定新的和改良的抗原，用于治疗性和预防性疫苗接种中。如有效呈递抗原的人γδT细胞制备方法中所述的进行γδT细胞的分离、选择和刺激。在应用抗原的步骤中，使用粗制抗原制品(例如，细胞提取物或未确定的混合物)的部分或源自肿瘤和传染性因子的RNA/DNA文库。然后测试这样制得的γδT细胞中相同供体的原初αβT细胞，即自体αβT细胞的激活。这些体外免疫应答测定中的读出是αβT细胞中的增殖和细胞因子产生，或任何其他的αβT细胞激活的简单测量。培养条件优选为以上图10-14和“实施例”中对于αβT细胞应答TSST-1呈递γδT细胞所述的那些条件。当比较不同抗原部分激活效果时，提高的αβT细胞应答表明抗原来源就免疫原性而言是“富集的”。进一步加工相应的“富集”部分，并使用进一步分级的抗原重复实验步骤的整个周期。最后，“富集”抗原来源的重复分级(蛋白质或DNA文库分级)产生具有最大的免疫刺激功能的单个蛋白质。可以通过蛋白酶剪切进一步操作这样的新蛋白质，并相应地分析剪切混合物中用于直接加载至APC上的(小)免疫原性肽的产生。
本发明进一步涉及诊断患者免疫力的方法，包括从患者的外周血单核细胞中选择γδT细胞，用诱导有效呈递抗原功能的刺激物处理选定的细胞，应用必须确定对其的免疫力的抗原，和测试自体αβT细胞的体外激活。
在该方法中，将γδT细胞及其对来自相同供体的抗原特异性记忆αβT细胞的影响用作体外工具，用于诊断患者对于特定抗原的免能力和用于测定疫苗接种是否已经成功。如有效呈递抗原的人γδT细胞的制备方法中所述的进行γδT细胞的分离、选择和刺激。在应用抗原的步骤中，将必须确定对其的免疫力的特定抗原用于受刺激的γδT细胞。培养条件和用于测定αβT细胞应答(体外免疫应答测定)的读出优选为以上图10-14和“实施例”中对于αβT细胞应答TSST-1呈递γδT细胞所述的那些。决定性差异在于监控记忆αβT细胞而不是原初αβT细胞的在用呈递抗原γδT细胞刺激过程中提高的免疫应答(增殖、细胞因子产生等)。成功的免疫治疗(疫苗接种)导致抗原特异性效应/记忆T细胞的产生，其与原初αβT细胞相比较，在免疫状态的体外监控过程中给予许多倍提高的免疫应答。优选使用大量(未分级的)αβT细胞进行这些测试，因为抗原特异性记忆αβT细胞在成功接种疫苗的个体中是高度富集的。
实施例缩写DC树突细胞LN淋巴结PP派伊尔氏结TCR T细胞抗原受体BCR B细胞抗原受体MHC 主要组织相容性复合体APC 呈递抗原细胞Vδ1+T细胞 表达Vδ1+-TCR链的γδT细胞Vγ2Vδ2+T细胞 表达Vγ2Vδ2+-TCR链的γδT细胞IPP 焦磷酸异戊烯酯TT破伤风梭菌破伤风毒素PPD 肺结核分枝杆菌纯化的蛋白质衍生物TSST-1金黄色葡萄球菌中毒性休克综合征毒素1PHA 植物凝集素
IFN-γ 干扰素-γTNF-α 肿瘤坏死因子-αIL白细胞介素FACS 荧光激活的细胞分选MFI 平均荧光强度SD标准误差CFSE 羧基荧光素二乙酸酯琥珀酰亚胺基酯1.细胞分离和产生γδT细胞根据标准方案(Brandes等，2003)通过菲克帕克(Ficoll-Paque)离心从肝素处理的供体血液血沉棕黄层或新鲜血液中分离人外周血单核细胞(PBMC)。使用来自Miltenyi Biotec的磁性细胞分选系统，用人VγVδ-TCR的抗体从PBMC中阳性选择γδT细胞。以这种方式，50ml新鲜血液常规产生2-5×106个细胞，γδT细胞纯度为98-99％。
原初αβT细胞通过阴性磁性细胞分选分别用VγVδ-TCR、CD1c、CD14、CD16、CD19、CD25、CD45RO、CD56、HLA-DR加CD4或CD8的特异性抗体从PBMC中分离出未触及的、原初CD4+或CD8+αβT细胞(98-99％纯度)，接着荧光激活细胞分选对这些标记染色阴性的细胞。
αβT细胞系通过磁性细胞分选用人CD4的抗体从PBMC中阳性选择CD4+αβT细胞。用呈递TT或PPD的自体照射(30Gy)的PBMC刺激CD4+αβT细胞，第一个循环中的细胞比例为1∶100，此后循环中的细胞比例为1∶10，并在含有IL-2的培养基中扩充。在抗原选择和扩充三个循环后通过基于CFSE的增殖测定(见下文)来检验抗原特异性。
B细胞通过阴性磁性细胞分选从PBMC中分离出B细胞。将B细胞直接用于γδT细胞刺激(见下文)，或将B细胞系按照标准方案通过EBV-诱导的转化来传代，然后用于γδT细胞刺激。
单核细胞通过阳性磁性细胞分选用人CD14的抗体从PBMC中分离出单核细胞，并在洗脱磁性捕获的细胞之前严格地洗涤分离柱，使得CD14高单核细胞富集。
DC通过在含有10％FCS的培养基中在IL-4(10ng/ml)和GM-CSF(25ng/ml)的存在下培养CD14高细胞来产生单核细胞衍生的DC。6-7天培养后，大部分细胞是未成熟的，如通过HLA-DR、CD1a、CD14、CD80、CD83、CD86和CCR7的细胞表面染色所评定的。通过在100ng/ml LPS(来自马流产沙门氏菌(Salmonella abortus equi))存在下再培养8小时来诱导DC成熟(Langenkamp等，2000)。通过细胞表面DC成熟标记HLA-DR、CD80、CD83、CD86和CCR7的流式细胞染色来确认DC成熟。
2.T细胞刺激γδT细胞如所述的(Brandes等，2003)，将1∶10稀释度的异种或自体EBV-转化的B细胞系或初级B细胞呈递的50μM焦磷酸异戊烯酯(IPP)用于激活静息(新鲜分离的)γδT细胞。在补充8％人血清的培养基中在IL-2(20或200IU/ml)存在下培养γδT细胞。
αβT细胞在涂敷了10μg/ml抗-CD3抗体(OCT3)加250ng/ml抗-CD28抗体(28.2)，或者涂敷了10ng/ml 13-乙酸12-肉豆蔻佛波醇(PMA)加1μg/ml离子霉素，或者涂敷了1μg/ml PHA的平板上激活阳性选择的αβT细胞，并在补充了8％人血清的培养基中在IL-2(200IU/ml)的存在下培养。
3.羧基荧光素二乙酸琥珀酰亚胺基酯(CFSE)标记用PBS-洗涤细胞并用补充了1％FCS的PBS-中的2.5μM CFSE(Molecular Probes，Eugene，OR)在室温标记4分钟。用补充了5％FCS的冰冷的PBS-重复洗涤细胞来停止标记。将CFSE标记的细胞立即用于细胞激活和增殖测定中。
4.体外呈递抗原测定向αβT细胞系呈递抗原在10-20μg/ml TT(Berna Biotech，Bern，Switzerland)或20μg/ml PPD(Statens Serum Institut Copenhagen，Denmark)存在下通过呈递IPP的和照射的(100Gy)异种EBV-B细胞系CP-EBV激活血液γδT细胞(见上文)24至60小时。用TT或PPD将单核细胞衍生的DC培养相同的一段时间并成熟最后8小时(见上文)。照射(对于γδT细胞和DC分别为26和40Gy)并彻底洗涤后，将这些APC以1∶5的比例(如果没有另外指出)用于刺激TT-和PPD-特异性CD4+αβT细胞克隆。在不同的培养时间点，通过流式细胞术检查应答细胞中的激活标记(HLA-DR、ICOS和CD25)的表达，TCR内在化(细胞表面CD3的丧失)和细胞增殖(CFSE荧光信号的降低)。
原初CD4+αβT细胞的引发γδT细胞和αβT刺激后或单核细胞衍生的DC成熟后或从PBMC分离出单核细胞后，用各种浓度的中毒性休克综合征毒素(TSST-1)(Toxin Technology，Sarasota，FL)将这些潜在的APC在37℃脉冲1小时。然后，用12Gy(或对于DC为40Gy)照射潜在的APC、彻底洗涤并与CFSE标记的原初CD4+αβT细胞混合(常规以1∶5的比例)。通常，96孔圆底平板含有在无外源细胞因子的培养基中的8×103个APC和4×104个CFSE标记的应答细胞。在4天后通过流式细胞术分析细胞增殖。
在Th细胞分化测定中，在培养的第5天加入100IU/ml IL-2，并在随后的10-16天期间将细胞扩充直至应答细胞停止增殖并恢复到静息状态(Langenkamp等，2000)。在第21天，通过测量胞内细胞因子产生来检查Th细胞分化。在10μg/ml布雷菲德菌素A(Sigma-Aldrich)的存在下用PMA/离子霉素刺激细胞6小时，然后用2％多聚甲醛固定，用含有2％FCS的PBS中的0.5％皂苷渗透，用IL-2、IFN-γ、IL-4和Vβ2-TCR的抗体染色，并通过流式细胞术分析。
原初CD8+αβT细胞的引发在混合白细胞应答中，与异种CFSE标记的原初CD8+αβT细胞共培养照射过的IPP刺激的γδT细胞、超抗原激活的αβT细胞或LPS成熟的DC。通常，96孔圆底平板的每孔中含有4×104个CFSE标记的应答细胞和4×104个细胞至4个细胞范围内的APC，对应于1∶1至1∶10,000的APC应答细胞比例。在培养6天后通过流式细胞术分析细胞增殖。与原初CD8+αβT细胞的混合白细胞应答14天后，在细胞毒性测定中评价CD8+效应细胞产生，该测定包括与分别用高(1μM)和低剂量(0.05μM)的CFSE标记的异种(真实靶)和自体(阴性对照)CD4+T细胞的混合物共培养12小时，接着通过流式细胞术分析CFSE信号。真实靶细胞计数的减少表明CD8+效应细胞引起的抗原特异性杀灭，而阴性对照细胞计数的减少表明由CD8+效应细胞引起的非特异性靶细胞杀灭。
5.培养基全部使用的培养基是补充了2mM L-谷氨酰胺、1％非必需氨基酸、1％丙酮酸钠、50μg/ml青霉素/链霉素、5×10-5M 2-巯基乙醇和10％FCS(Hyclone Laboratories，Logan，UT或GIBCO BRL)或8％人血清(SwissRed Cross，Bern，Switzerland)的RPMI 1640培养基。使用基于骨髓瘤的表达系统来产生人重组IL-2。
6.流式细胞术细胞制备将细胞在补充了2％FCS和0.01％钠-酸的冰冷的PBS-中洗涤两次。用10mg/ml人免疫球蛋白阻断10分钟后，依次用不同细胞蛋白质特异性的第一抗体或同型相配对照抗体将细胞在冰上孵育20分钟，洗涤，并在未标记第一抗体的情况中，进一步用荧光标记物标记的第二种试剂孵育。最后洗涤后，用FACSCalibur(Becton Dickinson，SanJose，CA)测量细胞结合的荧光，并通过CellQuestPro软件(BectonDickinson)分析记录的数据。
抗体抗体来源来自BD PharMingen，San Diego，CA的小鼠单克隆抗体抗-CD1a(HI149)、CD3(UCHT1)、CD4(RPA-T4)、CD8(HIT8α)、CD11b(D12)、CD14(MΦP9)、CD16(3G8)、CD19(HIB19)、CD20(2H7)、CD25(M-A251)、CD40(5C3)、CD45RA(HI100)、CD45RO(UCHL-1)、CD50(TU41)、CD54(HA58)、CD56(B159)、CDw70(Ki-24)、CD80(L307.4)、CD83(HB15e)、CD86(2331；FUN1)、CD134(L106)、CD205(MG 38)、HLA-DR(G46-6)、总-VγVδ-TCR(11F2)、IL-2(MQ1-17H12)、IL-4(8D4-8)、IFNγ(B27)和IL-10(No 20705A)；来自DAKO Diagnostics，Glastrup，Sweden的小鼠单克隆抗体抗-CD1a(Nal/34-HLK)和CD19(HD37)；来自Immunotech，Marseille，France的小鼠单克隆抗体抗-TCRVβ2(MPB2D5)；来自Diaclone，Besancon，France的小鼠单克隆抗体抗-CD138(B-134)；来自Leinco Technologies，St.Louis，MO的小鼠单克隆抗体抗-CD102(B-T1)；来自R.Pardi，Milano，Italy的小鼠单克隆抗体抗-CD11a(TS1-22)和CD18(TS1-18)；来自R.A.Kroczek，Berlin，Germany的小鼠单克隆抗体抗-ICOS(F44)；来自M.Lipp，Berlin，Germany的大鼠单克隆抗体抗-CCR7(3D12)。将这些抗体用于流式细胞术分析或细胞分离。
使用以下的第二抗体，缀合物和对照抗体来自Sigma-Aldrich，St.Louis，MO的RPE缀合的山羊抗小鼠IgG；来自JacksonImmunoResearch Laboratories，West Grove，PA的RPE缀合的驴抗大鼠IgG；来自DAKO的RPE以及RPE-Cy5缀合的链霉抗生物素蛋白(SA)；来自BD PharMingen的APC缀合的SA；来自Sigma-Aldrich的小鼠对照IgG1(MOPC21)；来自BD PharMingen的其它同型相配对照抗体。
7.肿瘤或慢性/复发性感染的免疫治疗为了制备受刺激的、肿瘤呈递抗原γδT细胞，从肿瘤患者(或慢性/复发性感染患者，见下文)中抽取50-150ml外周血并如上所述进行γδT细胞的分离和抗原加载。或者，在Vγ2Vδ2+-TCR刺激条件下(参见以上用IPP激活γδT细胞的方法)在20-1000IU/ml IL-2的存在下通过体外培养来扩充这样新鲜分离的γδT细胞，然后贮存于液氮中，用于之后制备肿瘤(或疫苗，见下文)呈递抗原γδT细胞。重要地，代替确定的肿瘤/疫苗蛋白，许多其它的将抗原递送至用于制备APC的γδT细胞的途径是可能存在的，(特别是)包括加入粗制(未限定的)肿瘤细胞提取物或受感染细胞的提取物(见下文)，或者，通过通常用于转染或转导活的血细胞或组织细胞的重组RNA/DNA技术来处理γδT细胞。此外，如果直接加载到细胞表面MHC分子上的确定的肿瘤(或疫苗，见下文)肽是已知的，那么将0.1-10μg/ml这样的肽加入1-10×106个细胞/ml受刺激的γδT细胞中，然后将其在20-37℃孵育一段短的时间，用等渗磷酸盐缓冲盐溶液洗涤2次，并立即用于治疗。重要的是强调每次给予所用的γδT细胞数量以及γδT细胞给予的途径和频率取决于由所用单个肿瘤(或疫苗，见下文)抗原诱导免疫应答的功效以及个体患者中存在的肿瘤的类型和位置。方案按照基于DC的免疫治疗中常用的那些方案(Fong和Engleman，2000；Steinman等，2003；Schuler等，2003；Figdor等，2004)，即，每次给予1-20×106个细胞/0.5-2ml，以两周至两个月的间隔继续给予相同或较低剂量的细胞1至6次。
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权利要求
1.制备有效呈递抗原的人γδT细胞的方法，包括从人外周血单核细胞中选择γδT细胞，用诱导呈递抗原功能的刺激物处理选定的细胞，并将所述抗原用于由这些细胞的摄取和呈递。
2.权利要求1的方法，其中通过标准方案用人VγVδ-T细胞受体的抗体进行磁性细胞分选来选择γδT细胞。
3.权利要求1的方法，其中在诱导表达Vγ2 Vδ2+-T细胞受体链的γδT细胞选择性扩充的结构上确定的小分子量非肽化合物的存在下培养新鲜分离的外周血淋巴细胞来进行γδT细胞选择。
4.权利要求3的方法，其中结构上确定的小分子量非肽化合物是焦磷酸异戊烯酯。
5.权利要求1的方法，其中诱导呈递抗原功能的刺激物是小分子量非肽化合物。
6.权利要求5的方法，其中结构上确定的小分子量非肽化合物是焦磷酸异戊烯酯。
7.权利要求5的方法，其中结构上确定的小分子量非肽化合物是4-羟基-3-甲基-丁-2-烯基焦磷酸酯。
8.权利要求1的方法，其中诱导呈递抗原功能的刺激物是植物凝集素。
9.权利要求1的方法，其中所应用的抗原呈确定的蛋白质、未确定的蛋白质混合物或粗制或富集的肿瘤或受感染细胞的提取物的形式。
10.权利要求1的方法，其中所应用的抗原是病原体-或肿瘤细胞-衍生的肽。
11.权利要求9的方法，其中抗原是病原体衍生的蛋白质，该蛋白质以在允许所述病原体衍生的蛋白质内源性表达的条件下编码其的DNA或RNA的形式来应用。
12.权利要求11的方法，其中DNA或RNA是纯化的DNA或RNA或含有这样的DNA或RNA的递送载体。
13.通过权利要求1的方法制备的有效呈递抗原的人γδT细胞。
14.有效呈递抗原的人γδT细胞在免疫治疗中的用途。
15.有效呈递抗原的人γδT细胞在制备用于免疫治疗或疫苗接种的药物中的用途。
16.治疗肿瘤或慢性或复发性传染病的方法，其中将有效呈递抗原的人γδT细胞注射至需要的患者中。
17.根据权利要求16的方法，其中注射包括所述γδT细胞通过皮内、皮下、肌内、静脉内、粘膜或粘膜下途径的单次或重复施用。
18.接种对抗肿瘤或诱导慢性或复发性传染病物质的疫苗的方法，其中将有效呈递抗原的人γδT细胞注射至待接种疫苗的患者中，对该细胞已经应用了用于摄取和呈递的非传染性和非致肿瘤性抗原。
19.靶向γδT细胞的疫苗在制备用于免疫治疗或疫苗接种的药物中的用途。
20.接种对抗肿瘤或诱导传染性或非传染性疾病物质的疫苗的方法，其中将靶向γδT细胞的疫苗给药于待接种的患者。
21.权利要求20的方法，其中靶向γδT细胞的疫苗是由疫苗剂和靶向γδT细胞的分子构成的混杂化合物。
22.权利要求21的方法，其中靶向γδT细胞的分子是γδT细胞上内吞受体特异性的抗体或配体。
23.权利要求21的方法，其中靶向γδT细胞的分子是CD11b和CD205特异性的抗体或配体。
24.权利要求21的方法，其中疫苗剂是需要产生对抗其的免疫保护的蛋白质。
25.权利要求20的方法，其中靶向γδT细胞的疫苗的给药需要重复的注射或口服。
26.鉴定新的肿瘤相关或病原体衍生抗原的方法，包括从人外周血单核细胞中选择γδT细胞，用诱导呈递抗原功能的刺激物处理选定的细胞，应用未确定的蛋白质混合物的部分或肿瘤和受感染细胞的粗制或富集提取物，或源自肿瘤和传染性因子的RNA或DNA文库，测试自体原初αβT细胞的体外激活，并选择具有提高的抗原性的蛋白质样品。
27.诊断患者免疫力的方法，包括从患者的外周血单核细胞中选择γδT细胞，用诱导呈递抗原功能的刺激物处理选定的细胞，应用必须确定对其的免疫力的抗原，和测试自体原初αβT细胞的体外激活。
全文摘要
本发明涉及制备有效呈递抗原的人γδT细胞的方法、通过该方法制得的γδT细胞及其在免疫治疗、疫苗接种、疫苗研发和诊断中的用途。这些人γδT细胞的效力和功效与树突细胞(DC)相似，加工抗原并对αβT细胞呈递抗原肽和诱导原初αβT细胞中的抗原特异性应答(增殖和分化)。易于从外周血纯化γδT细胞，在刺激下体外培养1天内获得“成熟”状态(必要的粘附分子、共刺激分子和主要组织相容性复合体分子的表达)并诱导强烈的初次和再次T辅助细胞和细胞毒性T细胞应答。γδT细胞可以用于肿瘤或慢性或复发性传染病的治疗方法中、用于新的肿瘤或病原体衍生抗原的鉴定中和用于患者免疫力的诊断中。
文档编号C12N5/08GK101031641SQ200580032379
公开日2007年9月5日 申请日期2005年8月11日 优先权日2004年8月19日
发明者B·莫瑟, M·布兰德斯 申请人:伯哈德·莫瑟