心脏干细胞的制作方法

专利名称：：心脏干细胞的制作方法心脏干细胞本发明涉及成体干细胞领域。具体而言，它涉及干细胞的获取、扩增和再引入。
背景技术：
：直到最近，主流观点断定心脏是终末分化的器官，不具有再生潜能。该观点受到下面证明的破坏成体心脏含有一小群内源性定向心脏干细胞(cardiacstemcell,CSCs)，也称为心脏祖细胞，通过它们的c-Kit、MDRl或Sca-l的表而表达可以鉴定(l-5)。CSCs代表了开发心肌再生疗法的合乎逻辑的细胞来源。它们的早期心脏转录因子的农达、以及在体内和体外向心脏谱系分化的能力赋予相比于艽它细胞來源增强的心脏发生前景。CSCs可以在无选择压力的情况下从人f术样品中分离并在原代培养屮扩增(6)。培养中的心脏手术活组织检査得到球形的多细胞簇，称为"心球(cardiospheres)"(6)。令人感兴趣的是，此类心球在它们的关键心肌结构蛋白的农达上是心脏样的；当注射入小鼠心脏时，人心球在体内再牛.出心肌和血管。在木领域中存在对用于获取和扩增人CSCs的简单的、非手术方法的持续需求，所述人CSCs用于随后的自体(autologous)、异基因(allogeneic)、同基因(syngeneic)或异种(xenogeneic)移植。发明概述根据本发明的一个实施方式，提供了增强哺乳动物的受损或患病心脏的功能的方法。向哺乳动物施用一群细胞。该细胞群从而增强哺乳动物中的心脏功能。通过在表面上将从心球获得的细胞培养为单层的方法，获得该细胞群。本发明的另一个实施方式提供了增强哺乳动物的受损或患病心脏的功能的方法。向哺乳动物施用一群体外扩增的细胞。该细胞具有在悬浮培养中形成心球的能力。然而，当施用时，该细胞并非是心球的形式-本发明的又一个实施方式提供了治疗具有受损或患病心脏的哺乳动物的方法。通过经皮心内膜活检，从哺乳动物的受损或患病心脏或从供体的健康心脏获得心脏组织。处理该心脏组织，以获得并扩增心脏干细胞群。所述心脏干细胞和/或它们的子代被弓I入哺乳动物的受损或患病心脏。根据本发明的另一个实施方式，处理心脏活检样品的方法被提供。在蛋白酶存在的情况下温育该心脏活检样品。收集通过蛋白酶温育从该活检样品释放出的细胞。在表面上将收集的细胞培养成单层，扩增细胞数。本发明的另一方面是治疗具有受损或患病器官的哺乳动物的方法。通过经皮活检，从哺乳动物的受损或患病器官或从供体的健康器官获得组织。处理该组织，以获得并扩增干细胞群。所述干细胞和/或它们的子代被引入哺乳动物的受损或患病器官。本发明的进一步的方面是扩增心脏干细胞群的方法。一个或一个以上的心球被解聚成单独的细胞或较小的细胞集合。在表面上将该单独的细胞或较小的细胞集合培养成单层。本发明还提供单层的体外扩增细胞群。所述细胞具有在悬浮培养中形成心球的能力。然而，所述细胞并非是心球的形式。[13本发明的又一个方面是通过在表面上将细胞培养成单层的方法而得到的细胞群。所述细胞从解聚的心球获得。本发明的进一步的分支是处理肾活检样品的方法。在蛋白酶存在的情况下温育该肾活检样品。收集通过蛋白酶温育从该活检样品释放出的细胞。在表面上将收集的细胞培养成单层，扩增细胞数。在阅读说明书后，这些实施方式和其它实施方式对于本领域技术人员将是显而易见的，所述实施方式为本领域提供了用于患病和受损器官治疗的方法和群体。附图简述房Z4-2C心i^7CZX:表l。图2A)通过其中心表达c-Kit和在其外周表达CD105的心球。图2B)主要在其外周表达心脏MHC和Tnl的心球。图2C)—个代表性样品表现出的在第2代的CDCs中的c-Kit和CD105表达水平(n-3和n=2)。^W-犯.移A浙厚主。图3A和3B)描绘了在注射20天后，在对H&E和P-半乳糖苷酶双染色的心脏切片中，CDCs(图3A)或成纤维细胞(图3B)的移入。可见CDCs的浸润，为明显的带，同时在一些切片中很少的一些成纤维细胞组可以被检测到。图3C和图3D)对于代表性的CDC注射小鼠(图3C)和成纤维细胞注射小鼠(图3D),用于计算心肌再生的Masson三色染色被示出。图3E)在CDC注射组(n-8)、PBS注射组(n-4)和成纤维细胞注射组(n-4)中，在梗塞区内发现的存活心肌的百分比被示出。*p<0.01。[19]劝激汰夢。图4A和图4B)在20天后，在CDC注射小鼠中进行的超声心动图的长轴视图。图4A示出舒张末期。图4B示出收縮末期。黄线画出用于计算LVEF和LVFA的左心室区周围的轮廓。图4C和图4D)在成纤维细胞注射小鼠中的比较视图。图4E)在20天后3个实验组的左心室射血分数(CDCn=8，PBSn=7,成纤维细胞!1=4;*pO.Ol)。LVEF=100x(LV容积舒张-LV容积收缩)/LV容积舒张，其中从假设为长椭球体的长轴视图计算LV容积。图4F)在20天后3个实验组的左心室面积分数百分数。*p<0.01。LVFA-100x(LV面积舒张-LV面积收缩)/LV面积舒张。房5乂-5C定量厚生。图5A)示出代表性CDC注射小鼠的Masson三色染色。在图5B和图5C中以黄色描绘总梗塞区的轮廓。图5B)在图像处理后以红色示出纤维化区域。图5C)在图像处理后以红色示出存活心肌区域。每只动物分析六个切片并取平均值。[21]風M-6F移乂好程。图6A)在H&E染色切片中，示出在第0天注射细胞的团块。凰6B)描绘了注射后8天CDCs的移入。图6C和图6D)注射后20天CDCs的移入。图6E和图6F)是图6C和图6D的相应更高放大率视图，证明lac-Z阳性CDCs和活心肌的共定位。发明详述本发明人已经开发出扩增器官的驻留干细胞(residentstemcell)群的方法，使得仅需要少量的初始样品。此类少量初始样品可以通过简单的经皮进入相对非侵入性地获得。此类步骤如此简单，以至于它们可以在门诊病人的基础上进行，而不需要大外科和全身麻醉。[23]驻留干细胞是在特定器官发现的那些。尽管申请者不希望束缚于任何具体理论，据认为，在特定器官中发现的干细胞并非多能的，而是定向于特定的分化支。因此，在心脏中，期望发现心脏干细胞，以及在肾中，期望发现肾干细胞。但是，可能的是，通过本发明扩增和分离的干细胞中的一些能够发育成器官的细胞，所述器官不同于从其中获得干细胞的器官。心球是细胞的自缔合聚集体，已经显示，所述细胞表现出心肌细胞的一些性质。因此，心球已经显示出在体外"搏动"。它们是可兴奋的并同步收縮。已经从心脏活检获得形成心球的细胞。使用本领域中用于分离细胞团或聚集体的标准方法，包括但不限于研磨、搅拌、摇动、捣碎，可以解聚所述心球。优选地，心球被解聚成单个细胞，但至少将它们解聚成较小的细胞聚集体。在解聚后，细胞可以在固体表面上生长，例如培养皿、容器壁或底部、微量滴定皿、珠、瓶、滚瓶等。表面可以是例如玻璃或塑料。细胞可以粘附到固体表面的材料或者固体表面可以用增加粘附的物质包被。此类物质是本领域中熟知的，并且非限制性地包括纤连蛋白、水凝胶、聚合物、层粘连蛋白、血清、胶原、明胶和聚L-赖氨酸。在表面上生长将优选是单层生长。[25]在解聚细胞生长后，它们可以直接被施用于需要它们的哺乳动物，或者它们可以在有利于心球形成的条件下生长。表面生长和悬浮生长(心球)之间的重复循环导致期望细胞的快速和指数扩增。也可以省略心球阶段，并重复扩增在表面上生长的细胞，其中在每次传代不形成心球。本发明的细胞培养——或者在细胞表面上或在心球中——可以在不存在外源生长因子的情况下进行。尽管可以使用胎牛血清，但己经发现其它因子是不必要的。例如，本发明的细胞在不存在添加的EGF、bFGF、心肌营养蛋白-1和凝血酶的情况下被容易地培养。可以是细胞的供体或受者的哺乳动物并未受限制。尽管人可以提供细胞并可以是受者，但通常其它哺乳动物将是有用的。例如，猪细胞可以移植入人。此类交叉物种移植被称为异种移植。移植还可以是异基因的、同基因的或自体的，它们都在一个物种内。用在本发明中的合适的哺乳动物包括宠物，例如狗、猫、兔；农用动物，例如马、牛、绵羊、山羊、猪；以及人。可以通过本领域中己知的任何方法将细胞施用于哺乳动物。心脏细胞可以被全身性或局部输送至心脏。细胞通常不以心球的形式。然而，它们在合适的条件下通常有形成心球的能力。局部施用可以通过导管或在手术期间进行。全身施用可以通过静脉内注射或动脉内注射、灌注或输注。当本发明的细胞群被全身性施用时，它们迁移至合适的器官，例如，如果细胞是来源于驻留心脏干细胞的话，迁移至心脏。在施用细胞至哺乳动物后观察到的有益效果的原因可以在于细胞本身，或者在于细胞表达的产物。例如，可能是细胞移入产生有利的结果。还可能是细胞因子或趋化因子或其它可扩散因子刺激驻留细胞更好地生长、再生或执行功能。心脏干细胞的有效剂量通常在1x106和100x106之间，优选在10"06和50xl()S之间。取决于心脏受损区的大小，可以使用或多或少的细胞。较大的受损区需要较大的细胞剂量，而小的受损区要求较小的细胞剂量。基于受者体重，有效剂量可以在每千克体重1和10x106之间，优选每千克体重在lxl(^和5xl(^个细胞之间。患者年纪、一般状况、以及免疫状态可以用作确定施用剂量的因素。[30]根据本发明可以治疗的疾病包括急性和慢性心脏病。例如，心脏可以经受过缺血性事件，或者可以是慢性缺血或充血性心脏病的主体。患者可以是心脏移植的候选者或心脏移植的受者。此外，由于创伤导致受损的心脏，例如在手术期间诱导的损伤或其它意外损伤，可以用根据本发明的细胞治疗。由于实现了细胞群的优异扩增，不需要大的初始细胞样品。因此，并非从手术期间获得的常规活检样品开始，而是可以使用较小的样品，这消除了对侵入性手术的需要。此类样品可以使用经皮活体钳(bioptome)获得。活体钳可以被用于进入来自任何器官来源的组织样品，包括心脏、肾脏、肝、脾和胰腺。在心脏内使用活体钳可以进入的特别合适的位置包括界嵴、右室心内膜、间隔或心室壁、和心耳。已经发现这些位置提供丰富的干细胞或祖细胞。利用比用于为诊断目的而进入右室心内膜的标准活体钳更柔软的活体钳，促进进入此类位置。优选地，活体钳也可以通过外部控制器被操纵。[32]引起能够使用小活检样品作为原材料的增强之一是收集以前被忽视或丢弃的细胞群。通过用蛋白酶处理活检样品并收获或收集从该活检样品释放出的细胞，形成所述细胞群。这些释放的细胞的使用增加了细胞群扩增的速率。可以使用的蛋白酶的例子包括胶原酶、基质金属蛋白酶、胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶。该技术可以被应用于其驻留干细胞被期望的任何器官，包括，例如心脏、肾脏、肺脏、脾脏、胰腺和肝脏。可以遗传修饰根据本发明收集、扩增和/或施用的细胞群。它们可14以用例如蛋白的编码序列转染。所述蛋白可以是对于患病器官例如心脏有益的。可以使用的编码序列的例子非限制性地包括akt、连接蛋白43(connexin43)、其它连接蛋白、HIFla、VEGF、FGF、PDGF、IGF、SCF、心肌素(myocardin)、心肌营养蛋白、L型钙通道a亚单位、L型钙通道卩亚单位和Nkx2.5。在所述细胞被施ffl于哺乳动物之前，可以常规地遗传修饰所述细胞。遗传修饰细胞以表达已知蛋白的技术在本领域中是熟知的。从活检样品容易收获并容易扩增心球衍生细胞(CDCs)，并且我们已经示出，它们在急性MI模型中再生心肌并改善功能。显著地，通过我们的方法，70位患者中的69位具有产生细胞的样品，使得自体细胞心肌成形术的目标可以达到。早期临床研究将理所当然地集中于自体细胞，其是理想的遗传匹配，从而比异基因细胞存在更少的安全顾虑。使用自体细胞的一个实践中的限制源于从组织收获到细胞移植的延迟。为避免延迟，可以建立具有限定免疫特征的患者的心脏干细胞(cardiacstemcells(CSCs))细胞库。这些应该允许供体细胞和受者的免疫抗原匹配，用于异基因移植。匹配抗原在移植领域中是已知的。[35]在以前的临床研究中，骨髓源干细胞在急性MI2周内被注射入患者，导致LVEF的显著改善，其中冠状动脉内输注5-80"06个细胞(15-17),这使得我们假设，好几百万的CDCs可以构成有效的治疗剂量。通过单个活体钳样品，仅在2次传代后，就可以得到数百万的CDCs;如果特别为了治疗的目的进行活检，那么原材料的量可以容易地增加10倍或以上，进一步改进总体细胞产量。具有慢性心力衰竭的患者也是CDC治疗的合适候选者。最小化扩增的传代数将使CDCs癌性转化的风险最小化，该问题已经在基质干细胞中观察到，但仅在>6次传代后(18)。细胞移植另一个突出的风险在于致心律失常的潜能(19-21)。关于心脏干细胞，尚未报道过心律失常。我们已经使用了未经抗原选择的来自人活检的CDCs。我们有意包括从初始心脏样品释放出并继续对心球形成起作用的所有细胞。因此，我们的细胞根本上不同于通过一种或另一种公认干细胞标记物的抗原淘选而分离的心脏"干细胞"(2，3)。然而，CDCs包括相当大的表现出干细胞标记物的细胞群，并且观察到的体内再生能力进一步支持了如下观点CDCs包括许多驻留干细胞。我们确实还不知道CDCs的亚级分(subfraction)是否足以产生该有益效果；事实上，我们已经避免了亚分级化(subfractionation)，因为它将可能延迟移植并弓I起由引入人工选择步骤导致的常规顾虑。成人心脏干细胞己经显示出通过增殖和心肌再生有限程度地应答于心脏肥大状态(4)并且通过动员至损伤边沿区和随后的再生有限程度地应答于急性缺血，但在慢性缺血情况下经常最终屈服于凋亡(5)。使用动物模型，增强CSCs的体内存活、动员、增殖和随后的分化的鉴定方法正在取得显著的进步(22，23)。我们的用于随后自体移植的驻留干细胞的体外扩增的方法可以赋予这些细胞群——驻留和被扩增的细胞群——介导心肌再生至适宜程度的组合能力。如果是这样，则心脏干细胞治疗可以很好改变我们的治疗心脏功能障碍疾病的基本手段。[39]上面的公开一般性地描述了本发明。所有本文中公开的参考文献被明确并入作为参考。参考下面的具体实施例可以获得更完全的理解，所述实施例仅为了阐述的目的被提供于本文中，并且不意图限制本发明的范围。实施例1材料和方法糊必翻&雜长.'按照规定的歩骤，并在忠者同意下，从经受临床指示(clinically-indicated)的经皮心内膜活检的患者获得人活检样品，并如(6)所述稍作修改加以处理。样品由由完整或部分活休钳"咬合(bites)"组成，在高钾心脏停搏液中储存在冰上并在2小时内处理(图1A,步骤1)。将样品切成片段，并从片段除去粗大结缔组织。然后，洗涤该片段，酶法部分消化，并3l弃单个细胞。剩余的组织片段在包被纤连蛋白的培养皿上作为"外植休"培养(图1A，步骤2)。儿天后，基质样细胞层从贴壁外棺块产生，小的、圆的、亮相细胞在该外植块上迁移。--旦汇合，通过温和酶消化收获所述外植块周围的松散粘附的细胞(图1A，步骤3)。这些细胞在设计用于心球设优生长的培养基中以2-3x104个细胞/mL接种于聚D-赖氨酸包被培养皿上(图1A，步骤4)。然后，分离的心球种板于纤连蛋白包被瓶中并被扩增成贴壁单细胞层(图1A，歩骤5)，其可以随后通过胰蛋白酶化传代。在相差显微镜下使用血球行计数,、以追踪每二样品:细k生长。'从相同的样品分离心球形成细胞又被重复高达3次。W微督喊X、欲應术分添为表征形成心球的细胞的抗原特征，通过用APC-偶联的抗c-Kit单克隆抗体的磁活化细胞分离，随后通过皿珠偶联的抗-APC标记，之后通过使用OctoMACS分离，亚选择在第一次收获(图1A,3)期间获得的细胞。然后，用直接偶联至微珠的二抗亚选择CD105+群。CDCs以贴壁单层传代两次，然后用于流式细胞术实验。使用c-Kit-APC、CD105-PE和相似偶联的同种型匹配对照单克隆抗休。通过7-AAD荧光和前向散射建立门。使用含CellQuest软件的FACScalibur细胞荧光光度讣收集数据。麟泰鹏微應好导将大肠杆菌(3-半乳糖苷酶(lacZ)基因克降进腺病毒穿梭载休pAd-Lox，以在Cre-4293HEK细胞屮通过Cre-Lox重组产生pAd-Lox-LacZ，如所述(9)。CDCs以贴壁单细胞层被传代2次并用病毒转导。使用MOI20达12小吋，获得卯％的转导效率。郝麟鄉鹏浙腺病毒转导的CDCs被注射入10-16周龄的成年雄性SCID-米色鼠。通过扎结冠状动脉左前降支中部，形成心肌梗塞，如所述(IO)，以及在直接可视化下在2个梗塞周围位点注射细胞或载体(vehicle)。注射存在于10Ml休积的PBS中的CDCs(105)(毎一位点5fJ)，以105个原代人皮肤成纤维细胞或10nlPBS作为对照。所有小鼠在手术前(基线)接受超生心动图检査，在手术后20天再次接受该检杳。使用Vl.3.8软件，通过从梗塞区釆集的2D长轴视阁，计算射rfa分数(ejectionfraction(EFs))。然后，在第0、8或20天对小鼠实施安乐死，外且制备切除的心脏用于组织学。免疫染^、i![i^逝众#/_超微术.17[45]当心球大小已达到100-1000个细胞时，收集心球用于免疫染色。抗c-Kit、CD105、心脏肌球蛋白贯链(cardiacmyosinheavychain,cMHC)和心脏肌钙蛋白I(cardiactroponinI，cTnl)的一抗被用于免疫染色。使用Alexa荧光染料偶联的二抗。如以前所述(6)进行免疫染色。在装配有氪/翁激光的EclipseTE2000-U上，使用UltraVIEW软件，进行共聚焦炎光成像。切除小鼠心脏，包埋入OCT化合物中、冷冻、并切片成5Mm的切片。用苏木精-伊红和P-半乳糖哲酶试剂或Masson三色对组织切片进行染色(ll)。通过手动追踪梗塞边界，然后使用ImageJ软件来计算全部梗塞区内的活心肌百分数，从Masson三色染色切片(12，13)计算梗塞区内的组织存活能力，如图S1所阐述。一餘所有的结果都以平均值土SEM表示。任何两组之间的差异显著性通过Student，st检验(学生t检验)进行确定。使用GB-Stat软件，釆用单因素ANOVA比较多个组，以及如果得到显著的F值，用Bonferroni-Dunn法比较组对(grouppairs)。认为值P<0.05具有显著性。[48]釆用广义估计力^(generalizedestimation叫uation，GEE)法(14)，以鉴定与高细胞产量独立相关的参数。来自捐献多个样品的患者的数据以重复测量处理。这些在单变量校型屮是显著的(PS0.1)参数被包拈在最终的多变量模型屮。使用SAS软件，进行该分析。巌终值pO.05被认为是显著的。所有报道的p-值都是双侧的。荐养基J&方.'移植块和CDC培养基IMDM,20%FBS,1%青霉素-链每素，196L-谷氨酰胺0.lmM2-琉基乙醇心球培养基在最终工作浓度下35紅MDM和65仰MEM/F-12Mix，3.5%FBS，19b青霉素-链霉素，1%卜谷氨酰胺，0.imM2-巯基乙醇，凝血酶B-27，bFGF，EGF，和心肌营养蛋白-l<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table>实.施例2糊必娜'乙',鄉成鹏图IB示出了在其被获得当天在切碎和部分酶消化后典型的外棺块，以及第3天(图ICJ)和第13天(图ID)，紧在第一次收获之前的外植体。在获得样品后8天或8天以上吋最初进行心球形成细胞收获(图1A，步骤3)，以及其后以4-12天间隔进行收获。面板E概述了使用从3个不同患者样品收获的细胞进行亚群选择实验的结果。大部分产生心球的细胞是CD105+，c-Kit+的细胞和c-Kif的细胞。在图1F屮示出了在收获后12天的典型心球。在步骤3后4-28天将漂浮的心球铺板扩增(图IA，歩骤5)，以及其后以2-7天间隔传代。图lG示出/在第2代扩增期间种板于纤^i蛋白上的CDCs，此吋那些细胞被收获川于注射。实施例3忠辦点與'教/《.使用CDCs的基本原理在于心球和它们的细胞于代的独特生物学。自组织心球建立了有利于干细胞抗原(例如，c-Kit和CD105，图3A)表达的微环境，并且经常表现出成熟心脏特异性抗原(cMHC和cTnl，图3B)标记的表面表型，问时保持内在的"千细胞性(stemness)"。事实上，c-Kit和CD105存在于所有检测的心球屮(来自IO位患者的毎一位的10个或以上)，c-Kit或位于屮心或遍及球表达，而CD105通常位于外周或到处农达。在两次传代后CDCs保持高水平的c-Kit和CD105抗原表达(图3C，分别表示来自3位和2位不同患者的CDCs的表达概况)。实施例5生潘應移肌序顿劝微糸[52]来自4位不同患者的CDCs被用于体内实验。为评价移楨和细胞迁移，用表达lac-Z的CDCs注射小鼠并在3个时间点的W—个处死小鼠(注射后0、8和20天)。在第0天，CDCs位于边沿区中的注射位点，但在第8天和第20犬，注射的细胞主要分布在MI区，形成P-半乳糖昔酶阳性组织岛或连续带(图5)。8只小鼠被注射CDCs并追踪20天；11只小鼠作为对照(4只注射成纤维细胞，以及7只注射PBS)。图4A显示了典型的p-半乳糖苷酶染色模式，表明注射的人细胞20天后在体内的分布。注意到浸润入梗塞区的蓝色细胞的带，其在成纤维细胞注射小鼠(图4B)或PBS注射小鼠中并不明显。如在Supplement屮所述，Masson三色染色切片被用于定量再生(图4，C和D)。面板C，来自CDC注射心脏，在蓝色梗塞区内显示出许多明显的红色区；在成纤维细胞注射心脏屮此类区明显更少(图4D〉。相比p成纤维注射小鼠(17.7土1.8。/o，p〈0.01)或PBS注射小鼠(13.7±0.7%，？<0.01)，CDC注射小鼠在MI区中具有更高的活品红阳性组织分数(24.9±1.1%)，但总的全部梗塞区类似于两个对照组(60.6±6.4CDC，76.9士7.0成纤维细胞，75.7±2.7PBS，104像素中的单元;p=NS)。CDC组和每--对照组在MI区内活心肌—白—分数之间的差异——7.2%和11.2%，表示可归功于CDCs的心肌再生的程度。[54]在第20天对所有组进行超声心动图；图5示出了在舒张末期和收縮末期CDCs和成纤维细胞处理组的例子。左心室EF(LVEF，图5E)和左心室面积分数(LVFA,图5F)的合并数据揭示，相比成纤维细胞处理组(24.5±1.8%，pO.01)或PBS处理组(26.4±3.0%，p<0.01)，CDC处理组具有更高的LVEF(38.8±1.7%)，但两组对照组无差别。在基线处，LVEF之间没有差异。实施例6A'破雜糊分恥麽子潘應游滩..使用多歩骤方法，可以从心脏活检样品或其它心肌'组织分离多能干细胞(参见图1A，示意图)。首先，通过经皮心内膜活检或通过心脏的无菌解剖心脏获得心赃组织。一且获得后，组织样品在高钾心脏停搏液(含有5°/。葡萄糖，68.6mmol/L甘露醇，12.5m叫氯化钾和12,5m叫碳酸氢钠，其屮添加10单位/mL的肝素)屮储存在冰上，直至它们被处理(可迖12小吋以后)。为了处理，使用无菌镊子和剪刀将样品切成l-2mr^的块；除去任何粗大结缔组织。然后，用无"++-]^++-的磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤此部分，并通常在室温下用0.05y。胰蛋白酶-EDTA消化5分钟。可选地，该组织部分可以在IV型胶原酶(lmg/mL沖于37'C消化30分钟。初歩实验已经表明，当使甩胶原酶时，毎mg外植块组织的细胞产量更大。-.旦消化完成，用"完全外植体培养基(CompleteExplantMedium,CEM)"洗涤剩下的组织部分，以停止消化过程，所述培养基为含冇20%热灭活胎牛血淸、100单位/mL的青霉素G、100pg/mL链霉素、2mmol/LL-谷氨酰胺和0.1mmol/L2-巯基乙醇的IMDM培养基(Iscove'smodifiedDulbeccomedium)。用无菌镊子和剪刀再次将组织部分切碎，然后转移到纤连蛋白包被(25pg/mL，大于等于1小吋)的组织培养板，在那里它们沿着板的表面被均匀地间隔开放置。将最小量的CEM加入到该板，其后在37'C和5c/cC02卜'温育30分钟，使得组织部分——现称为"外植体"，粘附到该板上(图1B)。一旦该外植体粘附后，加入足够的CEM到该板，覆盖所述外植休，并且将该板放冋培养箱。[57]在8天或以上的时期后，一层基质样细胞开始从粘附外桢休产生，覆盖包围外植体的板表面。在该层上，可见一群小的、圆的、亮相细胞(图1C、D)。一旦该基质细胞层开始汇合并且存在一大群亮相细胞，收获包围外植体的松散粘附细胞。这首先通过用无Ca^-Mg卩-的PBS洗涤该板，然后用0.48mmol/LEDTA(l-2分钟)洗涤并显终用0.05%胰蛋白酶-EDTA洗涤(2-3分钟)进行。所有洗涤都在室温下在可视控制下进行，以确定松散粘附细胞已经分离的时刻。在毎一歩后，收集洗涤液休并与其它步骤的洗涤液合并。在设后的洗涤后，再次川CEM覆盖外植体并送回培养箱。可以以这种方式以5-10天间隔收获每一板的外植体高达4次。然后在1000rpm下离心合并的洗涤液6-8分钟，形成细胞沉淀。当离心结朿后，除去上淸，重悬沉淀物，并使用血球计数器对细胞进行计数。然后，将细胞以毎孔3-5乂104个细胞的密度范围(取决于物种)种板于聚D-赖氨酸包被的24孔培养板并放回培养箱。细胞可以在由650/01:1的Dulbeco'sModifiedEagleMedia和Ham'sF-12补充物和35°/。CEM以及2%B27、25ng/mL表皮生长闲子、80ng/mL碱性成纤维细胞生长闵子、4ng/mL心肌营养蛋白-1和1单位/mL凝lftl酶组成的"心球生长培养基(CardiosphereGrowthMedia,CGM)"屮，或在单独的CEM中生长。在仔一种培养基中，在4-28天的时期后，多细胞簇("心球")将形成，从组织培养物表面分离，并开始悬浮生K(图le、f)。^大小和数量足够时，通过抽出它们的培养基收获这些自山漂浮的心球，并且将得到的悬浮液转移到在CEM中的纤连蛋白包被组织培养瓶中(仍粘附于聚D-赖氨酸包被的培养皿上的细胞不再进一步扩增)。在纤迮蛋白存在下，心球粘附并形成"心球衍牛.细胞(CDCs)"的贴壁单层(图lg)。这些细胞将生长至汇合，然后nJ以被宽复传代并扩增成CDCs，或者返回至聚D-赖氨酸包被板，在那里它们再次形成心球。作为CDCs生长，在获得心脏组织的4-6周时间内数百万的细胞可以被生K:，无论组织来源是人(图li)、猪或来自啮齿动物(数据未示出)。当使用胶原酶吋，每块外植体组织收获的细胞的初始增加导致更快产生大量的CDCs。参考文献所引用的毎一参考文献的公开内容被明确并入本文。参考文献1.QuainiF，UrbanekK,BeltramiAP，etal.Chimerismofthetransplantedheart.NEnglJMed2002;346(1):5-15.2.BeltramiAP，BarlucchiL,TorellaD，etal.Adultcardiacstemcellsaremultipotentandsupportmyocardialregeneration.Cell2003;114(6):763-76.3.OhH,BradfuteSB,GalardoTD，etal.Cardiacprogenitorcellsfromadultmyocardium:homing,differentiation,andfusionafterinfarction.ProcNatlAcadSciUSA2003;100(21):12313-8.4.UrbanekK,QuainiF,TascaG,etal.Intensemyocyteformationfromcardiacstemcellsinhumancardiachypertrophy.ProcNatlAcadSciUSA2003;100(18):10440-5.5.UrbanekK,TorellaD，SheikhF，etal.Myocardialregenerationbyactivationofmultipotentcardiacstemcellsinischemicheartfailure.ProcNatlAcadSciUSA2005;102(24):8692-7.6.MessinaE，DeAngelisL，FratiG,etal.Isolationandexpansionofadultcardiacstemcellsfromhumanandmurineheart.CircRes2004;95(9):911-21.7.MasonJW.Techniquesforrightandleftventricularendomyocardialbiopsy.AmJCardiol1978;41(5):887-92.8.Anastasiou-NanaMI,O'ConnellJB,NanasJN,SorensenSG,AndersonJL.Relativeefficiencyandriskofendomyocardialbiopsy:comparisonsinhearttransplantandnontransplantpatients.CathetCai'diovascDiagn1989;18(1):7-U.9.HoppeUC,MarbanE,JohnsDC.Distinctgene-specificmechanismsofarrhythmiarevealedbycardiacgenetransferoftwolongQTdiseasegenes,HERGandKCNEl,ProcNatlAcadSciUSA2001;98(9):5335陽40.10.StullLB，LeppoMK,SzwedaL,GaoWD,MarbanE.Chronictreatmentwithallopurinolboostssurvivalandcardiaccontractilityinmurinepostischemiccardiomyopathy.CircRes2004;95(10):1005-11.11.BiologicalStainCommission.,ConnHJ,ClarkG.StainingproceduresusedbytheBiologicalStainCommission.3ded.Baltimore,:PublishedfortheBiologicalStainCommissionbyWilliams&Wilkins;1973.12.PfefferMA,PfefferJM,FishbeinMC，etal.Myocardialinfarctsizeandventricularfunctioninrats.CircRes1979;44(4):503-12.13.EdelbergJM,LeeSH,KaurM，etal.Platelet-derivedgrowthfactor-ABlimitstheextentofmyocardialinfarctioninaratmodel:feasibilityofrestoringimpairedangiogeniccapacityintheagingheart.Circulation2002;105(5):608-13.14.ZegerSL,LiangKY.Longitudinaldataanalysisfordiscreteandcontinuousoutcomes.Biometrics1986;42(l):121-30.15.SchachingerV,AssmusB,BrittenMB,etal.Transplantationofprogenitorcellsandregenerationenhancementinacutemyocardialinfarction:finalone-yearresultsoftheTOPCARE-AMITrial.JAmCollCardiol2004;44(8):1690-9.16.StrauerBE,BrehmM，ZeusT，etal.Repairofinfarctedmyocardiumbyautologousintracoronarymononuclearbonemarrowcelltransplantationinhumans.Circulation2002;106(15):1913-8.17.Fernandez-AvilesF,SanRomanJA,Garcia-FradeJ,etal.Experimentalandclinicalregenerativecapabilityofhumanbonemarrowcellsaftermyocardialinfarction.CircRes2004;95(7):742-8.18.RubioD,Garcia-CastroJ,MartinMC,etal.Spontaneoushumanadultstemcelltransformation.CancerRes2005;65(8):3035-9.19.MenascheP，HagegeAA，VilquinJT，etal.Autologousskeletalmyoblasttransplantationforseverepostinfarctionleftventriculardysfunction.JAmCollCardiol2003;41(7):1078-83.20.Siminiak丁，KalawskiR,FiszerD，etal.Autologousskeletalmyoblasttransplantationforthetreatmentofpostinfarctionmyocardialinjury:phaseIclinicalstudywith12monthsoffollow-up.AmHeartJ2004;148(3):531-7.21.SmitsPC，vanGeunsRJ，PoldermansD,etal.Catheter-basedintramyocardialinjectionofautologousskeletalmyoblastsasaprimarytreatmentofischemicheartfailure:clinicalexperiencewithsix-monthfollow-up.JAmCollCardiol2003;42(12):2063-9.22.UrbanekK,RotaM,CascaperaS,etal.CardiacStemCellsPossessGrowthFactor-ReceptorSystemsThatAfterActivationRegeneratetheInfarctedMyocardium,ImprovingVentricularFunctionandLong-TermSurvival.CircRes2005.23.LimanaF,GermaniA，ZacheoA,etal.ExogenousHigh-MobilityGroupBox1ProteinInducesMyocardialRegenerationAfterInfarctionviaEnhancedCardiacC-Kit十CellProliferationandDifferentiation.CircRes2005.24.TaylorDO,BarrML，RadovancevicB,etal.Arandomized,multicentercomparisonoftacrolimusandcyclosporineimmunosuppressiveregimensincardiactransplantation:decreasedhyperlipidemiaandhypertensionwithtacrolimus.JHeartLu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