专利名称：半胱氨酸改造的抗体和偶联物的制作方法
技术领域：
本发明一般涉及用反应性半胱氨酸残基改造的抗体，且更具体地说，本发明涉及具有治疗或诊断应用的抗体。可以使半胱氨酸改造的抗体与化疗药；毒素；亲和配体，诸如生物素和检测标记，诸如荧光团偶联。本发明还涉及使用抗体和抗体-药物偶联物化合物在体外、原位和体内诊断或治疗哺乳动物细胞或相关病理性情况的方法。
背景技术：
已经建立了靶向治疗患有癌症、免疫病症和血管生成病症的患者的抗体疗法。在发现用于使用抗体的癌症诊断和疗法有效细胞靶标的尝试中，研究人员寻求鉴定跨膜，或肿瘤相关多肽类，与正常非癌细胞相比，它们在癌细胞表面上得到特异性表达。鉴定这类肿瘤相关细胞表面抗原多肽类，即肿瘤相关抗原(TAA)已经带来了特异性靶向癌细胞的能力以便通过基于抗体的疗法产生破坏作用。
抗体-药物偶联物(ADC)，即免疫偶联物在局部递送细胞毒性剂或细胞生长抑制剂，即在治疗癌症中杀伤或抑制肿瘤细胞的药物中的应用(Lambert，J.(2005)Curr.Opinion in Pharmacology 5543-549；Wu等(2005)NatureBiotechnology 23(9)1137-1146；Payne，G.(2003)Cancer Cell 3207-212；Syrigos和Epenetos(1999)Anticancer Research 19605-614；Niculescu-Duvaz和Springer(1997)Adv.药物Del.Rev.26151-172；US 4975278)在理论上能够将药物部分靶向递送至肿瘤并且在其中发生胞内蓄积，其中全身给予这些未偶联的药物活性剂在对肿瘤细胞消除的同时也对正常细胞产生了不可接受水平的毒性(Baldwin等(1986)Lancet pp.(Mar.15，1986)603-05；Thorpe，(1985)″Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer TherapyAReview，″-Monoclonal Antibody′84Biological and Clinical Applications，A.Pinchera等(ed.s)，pp.475-506)。由此人们期望寻求到最高的功效与最低的毒性。设计和精制ADC的努力已经集中到单克隆抗体(mAbs)的特异性以及药物-连接和药物-释放特性上(Lambert，J.(2005)Curr.Opinion in Pharmacology5543-549；已经报导了多克隆抗体和单克隆抗体可用于这些策略中(Rowland等(1986)Cancer Immunol.Immunother.，21183-87)。用于这些方法的药物包括柔红霉素(daunomycin)、多柔比星(doxorubicin)、甲氨蝶呤(methotrexate)和长春地辛(vindesine)(Rowland等(1986)，文献同上)。用于抗体-毒素偶联物的毒素包括细菌毒素，诸如白喉毒素，植物毒素，诸如蓖麻毒素；小分子毒素，诸如格尔德霉素(geldanamycin)(Mandler等(2000)J.of the Nat.Cancer Inst.92(19)1573-1581；Mandler等(2000)Bioorganic & Med.Chem.Letters 101025-1028；Mandler等(2002)Bio偶联物Chem.13786-791)；美登木素生物碱(maytansinoids)(EP 1391213；Liu等(1996)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 938618-8623)；和加利车霉素(calicheamicin)(Lode等(1998)Cancer Res.582928；Hinman等(1993)Cancer Res.533336-3342)。毒素可以通过包括微管蛋白结合、DNA结合或拓扑异构酶抑制的机制完成其细胞毒性和细胞抑制作用。某些细胞毒性药物在与大的抗体或蛋白质受体配体偶联时趋向于失活或活性降低。
已经批准了抗体-放射性同位素偶联物。ZEVALIN(替伊莫单抗(ibritumomab tiuxetan)，Biogen/Idec)由定向于正常和恶性B淋巴细胞表面上的CD20抗原的鼠IgG1κ单克隆抗体和硫脲连接基-螯合剂结合的111In或90Y放射性同位素组成(Wiseman等(2000)Eur.J.Nucl.Med.27(7)766-77；Wiseman等(2002)Blood 99(12)4336-42；Witzig等(2002)J.Clin.Oncol.20(10)2453-63；Witzig等(2002)J.Clin.Oncol.20(15)3262-69)。尽管ZEVALIN对B-细胞非何杰金(non-Hodgkin’s)淋巴瘤(NHL)具有活性，但是给药在大部分患者中产生严重和延长的细胞减少。MYLOTARGTM(吉姆单抗吉姆单抗(gemtuzumab ozogamicin)，Wyeth Pharmaceuticals)，即由与加利车霉素连接的hu CD33抗体组成的抗体-药物偶联物于2000年经批准用于通过注射治疗急性髓细胞样白血病(Drugs of the Future(2000)25(7)686；美国专利US4970198；5079233；5585089；5606040；5693762；5739116；5767285；5773001).Cantuzumab mertansine(Immunogen，Inc.)；由通过二硫化物连接基SPP与美登木素生物碱药物部分DM1连接的huC242抗体组成的抗体-药物偶联物(Xie等(2004)J.of Pharm.And Exp.Ther.308(3)1073-1082)正在进入用于治疗表达CanAg的癌症，诸如结肠癌、胰腺癌、胃癌等的II期试验。MLN-2704(Millennium Pharm.，BZL Biologics，Immunogen Inc.)，即与美登木素生物碱药物部分DM1连接的抗-前列腺特异性膜抗原(PSMA)单克隆抗体组成的抗体-药物偶联物正处于用于可能治疗前列腺肿瘤的研发中。
Auristatin肽类、auristatin E(AE)和monomethyl auristatin(MMAE)、多拉司他汀(dolastatin)的合成类似物(WO 02/088172)与下列偶联(i)嵌合单克隆抗体cBR96(对癌上的Lewis Y具有特异性)；(ii)对血液恶性肿瘤上的CD30具有特异性的cAC10(Klussman，等(2004)，Bioconjugate Chemistry15(4)765-773；Doronina等(2003)Nature Biotechnology 21(7)778-784；Francisco等(2003)Blood 102(4)1458-1465；US 2004/0018194；(iii)用于治疗表达CD20的癌症和免疫病变的抗-CD20抗体，诸如B细胞单克隆抗体(rituxan)(WO 04/032828)；(iv)用于治疗结肠直肠癌的抗-EphB2R抗体2H9和抗-IL-8(Mao等(2004)Cancer Research 64(3)781-788)；(v)E-选择蛋白抗体(Bhaskar等(2003)Cancer Res.636387-6394)；和(vi)其它抗-CD30抗体(WO 03/043583)。auristatin E的变体披露在US 5767237和US 6124431中。与单克隆抗体偶联的Monoemethyl auristatin E披露在Senter等的Proceedingsof the American Association for Cancer Research，Volume 45，Abstract Number623中，2004年3月28日提交。Auristatin类似物MMAE和MMAF与各种抗体偶联(WO 2005/081711)。
常规附着方式，即通过共价键连接，药物部分与抗体一般产生不均一的(heterogeneous)分子混合物，其中药物部分结合在抗体上的许多位点上。例如，细胞毒性药物一般与抗体通过抗体的通常大量的赖氨酸残基偶联，从而产生不均一的抗体-药物偶联物混合物。根据反应条件的不同，所述的不均一混合物一般含有抗体0-约8或8以上附着的药物部分的分布。此外，在具有特定整数比的药物部分与抗体的偶联物各亚组内可能是不均一的混合物，其中药物部分结合在抗体上的不同位点上。分析和制备方法不足以分离和表征由偶联反应产生的不均一混合物中的抗体-药物偶联物类分子。抗体为较大的复杂的并且结构多样的生物分子，通常带有许多反应性官能基。其与连接基试剂和药物-连接基中间体的反应性取决于如下因素诸如pH、浓度、盐浓度和共溶剂。此外，多步骤偶联过程因控制反应条件和表征反应剂和中间体方面的困难而可能不可再现。
半胱氨酸巯基在中性pH具有反应性，这与在接近pH 7时质子化和亲核性降低的大部分胺类不同。由于游离巯基(RSH，硫氢基)具有相对的反应性，所以带有半胱氨酸残基的蛋白质通常以其作为二硫化物-连接的寡聚体的氧化形式存在或具有内部桥连的二硫化物基团。胞外蛋白一般不带有游离巯基(Garman，1997，Non-Radioactive LabellingA Practical Approach，Academic Press，London，55页上)。可以通过标准Ellman测定法估计蛋白质中游离巯基的量。免疫球蛋白M为二硫化物-连接的五聚体的实例，而免疫球蛋白G为带有彼此结合的亚单位的内部二硫键的蛋白质的实例。在诸如这种蛋白质中，用诸如二硫苏糖醇(DTT)或硒醇还原二硫键(Singh等(2002)Anal.Biochem.304147-156)是产生反应性游离巯基所需的。这种手段可以导致抗体的三级结构和抗原结合特异性丧失。
抗体半胱氨酸巯基一般对亲电子偶联反应剂比对抗体胺或羟基更具反应性，即更具亲核性。已经通过遗传改造将半胱氨酸残基引入了蛋白质以便形成与配体的共价结合物或形成新的分子内二硫键(Better等(1994)J.Biol.Chem.139644-9650；Bernhard等(1994)Bioconjugate Chem.5126-132；Greenwood等(1994)Therapeutic Immunology 1247-255；Tu等(1999)Proc.Natl.Acad.Sci USA 964862-4867；Kanno等(2000)J.of Biotechnology，76207-214；Chmura等(2001)Proc.Nat.Acad.Sci.USA 98(15)8480-8484；US 6248564)。然而，通过使蛋白质的不同氨基酸残基突变成半胱氨酸氨基酸的在半胱氨酸巯基上的设计可能存在问题，特别是就未配对的(游离Cys)残基或那些相对易于进行反应或氧化的残基而言。在蛋白质的浓溶液中，无论是在大肠杆菌(E.coli)的周质中，还是在培养物上清液或部分或完全纯化的蛋白质中，蛋白质表面上的未配对的Cys残基可以配对并且氧化成分子内二硫化物和由此的蛋白质二聚体或多聚体。二硫化物二聚体的形成使得新的Cys无法与药物、配体或其它标记发生偶联反应。此外，如果蛋白质以氧化方式在新改造的Cys和已存在的Cys残基之间形成分子内二硫键，那么两种Cys基团对活性位点的参与和相互作用而言均无法利用。此外，可以通过错误折叠或丧失三级结构使蛋白质失活或赋予其非特异性(Zhang等(2002)Anal.Biochem.3111-9)。
概述本发明的化合物包括半胱氨酸改造的抗体，其中亲代抗体的一种或多种氨基酸被游离半胱氨酸氨基酸替代。半胱氨酸改造的抗体包含一个或多个具有0.6-1.0范围的巯基反应值(thiol reactivity value)的游离半胱氨酸氨基酸。游离半胱氨酸氨基酸为已经被改造进入亲代抗体中并且不为二硫键的组成部分的半胱氨酸残基。
在一个方面中，通过包括下列步骤的方法制备半胱氨酸改造的抗体(a)用半胱氨酸替代亲代抗体的一种或多种氨基酸残基；和(b)通过使半胱氨酸改造的抗体与巯基-反应试剂反应测定半胱氨酸改造的抗体的巯基反应性(thiol reactivity)。
半胱氨酸改造的抗体可以比亲代抗体更具与巯基-反应试剂的反应性。
游离半胱氨酸氨基酸残基可以位于重链或轻链中或恒定域或可变域中。还可以通过用一个或多个半胱氨酸氨基酸替代抗体片段的氨基酸来改造抗体片段，例如Fab，以便形成半胱氨酸改造的抗体片段。
本发明的另一个方面提供了制备半胱氨酸改造的抗体的方法，包括(a)将一个或多个半胱氨酸氨基酸引入亲代抗体以便生成半胱氨酸改造的抗体；和(b)测定半胱氨酸改造的抗体与巯基-反应试剂的巯基反应性；其中半胱氨酸改造的抗体比亲代抗体更具与巯基-反应试剂的反应性。
制备半胱氨酸改造的抗体的方法的步骤(a)可以包含(i)诱变编码半胱氨酸改造的抗体的核酸序列；(ii)表达半胱氨酸改造的抗体；和(iii)分离和纯化半胱氨酸改造的抗体。
制备半胱氨酸改造的抗体的方法的步骤(b)可以包含表达选自噬菌体或噬菌粒颗粒的病毒颗粒上的半胱氨酸改造的抗体。
制备半胱氨酸改造的抗体的方法的步骤(b)还可以包含(i)使半胱氨酸改造的抗体与巯基-反应性亲和试剂反应而生成亲和标记的半胱氨酸改造的抗体；和
(ii)测定亲和标记的半胱氨酸改造的抗体与俘获介质的结合。
本发明的另一个方面为筛选带有高反应性的未配对的半胱氨酸氨基酸的半胱氨酸改造的抗体的巯基反应性的方法，包含(a)将一个或多个半胱氨酸氨基酸导入亲代抗体以便产生半胱氨酸改造的抗体；(b)使半胱氨酸改造的抗体与巯基-反应性亲和试剂反应而生成亲和标记的半胱氨酸改造的抗体；和(c)测定亲和标记的半胱氨酸改造的抗体与俘获介质的结合；和(d)测定半胱氨酸改造的抗体与巯基-反应试剂的巯基反应性。
筛选半胱氨酸改造的抗体的方法的步骤(a)可以包含(i)诱变编码半胱氨酸改造的抗体的核酸序列；(ii)表达半胱氨酸改造的抗体；和(iii)分离和纯化半胱氨酸改造的抗体。
筛选半胱氨酸改造的抗体的方法的步骤(b)可以包含表达选自噬菌体或噬菌粒颗粒的病毒颗粒上的半胱氨酸改造的抗体。
筛选半胱氨酸改造的抗体的方法的步骤(b)还可以包含(i)使半胱氨酸改造的抗体与巯基-反应性亲和试剂反应而生成亲和标记的半胱氨酸改造的抗体；和(ii)测定亲和标记的半胱氨酸改造的抗体与俘获介质的结合。
半胱氨酸改造的抗体可以用于治疗癌症并且包括对细胞表面和跨膜受体和肿瘤相关抗原(TAA)具有特异性的各种抗体。这样的抗体可以用作裸抗体(未与药物或标记部分偶联)或用作式I抗体-药物偶联物(ADC)。
制备和筛选半胱氨酸改造的抗体的方法的实施方案包括其中亲代抗体为抗体片段，诸如hu4D5Fabv8。亲代抗体还可以为包含清蛋白-结合肽序列(albumin-binding peptide)(ABP)的融合蛋白。亲代抗体还可以为选自huMAb4D5-1、huMAb4D5-2、huMAb4D5-3、huMAb4D5-4、huMAb4D5-5、huMAb4D5-6、huMAb4D5-7和huMAb4D5-8(曲妥单抗(trastuzumab))的人源化抗体。
本发明的半胱氨酸改造的抗体可以以位点特异性和有效的方式与巯基-反应试剂偶联。巯基-反应试剂可以为多官能连接基试剂(multifunctionallinker reagent)、俘获标记试剂(capture label reagent)、荧光团试剂(fluorophorereagent)或药物-连接基中间体(drug-linker intermediate)。
可以用可检测标记来标记半胱氨酸改造的抗体，使其固定在固相支持体上和/或与药物部分偶联。
本发明的另一个方面在于包含半胱氨酸改造的抗体(cysteine engineeredantibody)(Ab)和药物部分(drug moiety)(D)的抗体-药物偶联物化合物，其中半胱氨酸改造的抗体通过一个或多个游离半胱氨酸氨基酸经连接基部分(linker moiety)(L)与D结合；所述化合物即具有式I的化合物Ab-(L-D)pI其中p为1、2、3或4；且其中所述的半胱氨酸改造的抗体是通过包含用一个或多个游离半胱氨酸氨基酸替代亲代抗体的一种或多种氨基酸残基的方法制备的。药物部分包括，但不限于美登木素生物碱、auristatin、多拉司他汀、单端孢霉烯(trichothecene)、CC1065、加利车霉素(calicheamicin)和其它烯二炔类抗生素、紫杉烷(taxane)、蒽环类抗生素(anthracycline)和它们的立体异构体、同电子排列体(isostere)、类似物或衍生物。典型的药物部分包括DM1、MMAE和MMAF。
式I的抗体-药物偶联物可以进一步包含清蛋白-结合肽(albumin-bindingpeptide)(ABP)序列；该组合物具有式IaABP-Ab-(L-D)pIa本发明的另一个方面在于包含半胱氨酸改造的抗体或半胱氨酸改造的抗体-药物偶联物和生理学或药学上可接受的载体或稀释剂的组合物。用于治疗应用的该组合物为无菌的并且可以是冻干的。
本发明的另一个方面包括本文披露的化合物和组合物的诊断和治疗应用。药物组合物包括式I化合物和一种或多种化疗剂的组合。
本发明的另一个方面为杀伤或抑制增殖的肿瘤细胞或癌细胞的方法，包含用有效杀伤或抑制增殖的肿瘤细胞或癌细胞用量的本发明的抗体-药物偶联物或其药学上可接受的盐或其溶剂合物治疗所述细胞。
本发明的其它方面包括治疗下列疾病的方法癌症；自身免疫性疾病；或感染性疾病，包含对有此需要的患者给予有效量的本发明抗体-药物偶联物化合物或其药学上可接受的盐或溶剂合物。
本发明的另一个方面为治疗哺乳动物癌症的方法，其中所述的癌症的特征在于ErbB受体过表达。所述的哺乳动物任选对使用未偶联的抗-ErbB抗体治疗无应答或应答差。该方法包含对所述的哺乳动物给予治疗有效量的本发明抗体-药物偶联物化合物。
本发明的另一个方面为抑制过表达生长因子受体的肿瘤细胞生长的方法，所述的生长因子受体选自HER2受体和EGF受体组成的组，该方法包含对患者给予特异性结合所述生长因子受体的抗体-药物偶联物化合物和化疗剂，其中以有效抑制患者肿瘤细胞生长的用量给予所述的抗体-药物偶联物和所述的化疗剂。
本发明的另一个方面为治疗易患特征在于ErbB2受体过表达的病症或对已诊断患该病的人体患者的方法，包含给予有效量的抗体-药物偶联物化合物和化疗剂的联合用药。
本发明的另一个方面为用于检测癌细胞的测定方法，包含将细胞暴露于抗体-药物偶联物化合物，并且测定抗体-药物偶联物化合物与细胞的结合程度。
本发明的另一个方面为一种制品，其包含抗体-药物偶联物化合物；容器；和指示所述化合物可以用于治疗癌症的包装说明书或标签。
附图简述附
图1A表示通过X射线晶体坐标衍生的hu4D5Fabv7抗体片段的三维代表图。对重链和轻链的例示性改造的Cys残基的结构位置进行了编号(按照序列编号系统)。
附图1B表示4D5v7fabH的与Kabat编号方案(下排)对比在N-末端开始的序列编号方案(上排)。Kabat编号插入由a、b、c标注。
附图2A和2B表示通过与BSA(空心条柱)、HER2(具条纹的条柱)或链霉抗生物素(实心条柱)相互作用的PHESELECTOR测定法，使用在450nm处吸光度检测的hu4D5Fabv8和hu4D5Fabv8 Cys突变体(ThioFab)噬菌体变体的结合测定值(A)未生物素化噬菌体-hu4D5Fabv8和(B)生物素化噬菌体-hu4D5Fabv8(B)。
附图3A和3B表示通过与BSA(空心条柱)、HER2(具条纹的条柱)和链霉抗生物素(实心条柱)相互作用的PHESELECTOR测定法，使用在450nm处吸光度检测的hu4D5Fabv8(左)和hu4D5Fabv8 Cys突变体(ThioFab)的结合测定值(A)未生物素化噬菌体-hu4D5Fabv8和(B)生物素化噬菌体-hu4D5Fabv8。轻链变体位于左侧，而重链变体位于右侧。巯基反应性＝链霉抗生物素结合的OD450nm÷HER2(抗体)结合的OD450nm。
附图4A表示野生型hu4D5Fabv8上残基的表面可接近分数值(FractionalSurface Accessiblity Value)。轻链位点位于左侧，而重链位点位于右侧。
附图4B表示通过在450nm处检测吸光度测定的与HER2(第2天)、链霉抗生物素(SA)(第2天)、HER2(第4天)和SA(第4天)的相互作用的生物素化的hu4D5Fabv8和hu4D5Fabv8 Cys变体(ThioFab)的结合测定值。分离噬菌体-hu4D5Fabv8 Cys变体并且储存在4℃下。在第2天或第4天时进行生物素偶联，随后进行PHESELECTOR分析以便如实施例2中所述监测其与Her2和链霉抗生物素的相互作用并且探测改造的ThioFab变体上反应性巯基的稳定性。
附图5表示通过在450nm处检测吸光度测定的生物素-马来酰亚胺偶联的-hu4D5Fabv8(A121C)和未生物素化的野生型hu4D5Fabv8在结合链霉抗生物素和HER2中的结合测定值。在2ng和20ng测试每种Fab。
附图6表示通过在450nm处检测生物素化的ABP-hu4D5Fabv8野生型(wt)和ABP-hu4D5Fabv8半胱氨酸突变体V110C和A121C在结合兔清蛋白、链霉抗生物素(SA)和HER2中的吸光度的ELISA分析。
附图7表示通过在450nm处检测吸光度对生物素化的ABP-hu4D5Fabv8半胱氨酸突变体(ThioFab变体)(左至右)单Cys变体ABP-V110C、ABP-A121C和双Cys变体ABP-V110C-A88C和ABP-V110C-A121C的在结合兔清蛋白、HER2和链霉抗生物素(SA)并且使用Fab-HRP或SA-HRP探测的ELISA分析。
附图8表示生物素化的ThioFab噬菌体和抗-噬菌体HRP抗体与HER2(上)和链霉抗生物素(下)的结合。
附图9表示ABP-ThioFab融合蛋白药物偶联物结合HER2受体抗原的例示图。ABP＝清蛋白结合蛋白。
附图10表示用-●-曲妥单抗(trastuzumab)；-▲-曲妥单抗-SMCC-DM1；和-◆- hu4D5Fabv8半胱氨酸突变体-(A121C)-BMPEO-DM1处理的SK-BR-3细胞的体外细胞增殖试验。
附图11表示用-○-曲妥单抗；-●-曲妥单抗-SMCC-DM1；和-□-hu4D5Fabv8半胱氨酸突变体(V110C)-BMPEO-DM1处理的SK-BR-3细胞的体外细胞增殖试验。
附图12表示在第0天给药的具有MMTV-HER2 Fo5乳腺肿瘤同种异体移植物的无胸腺裸鼠随时间改变的肿瘤体积改变的平均值 媒介物(缓冲液)；-■-ABP-hu4D5Fabv8半胱氨酸突变体(V110C轻链)-DM1；和-●-ABP-hu4D5Fabv8半胱氨酸突变体(A121C重链)-DM1。
附图13A表示结合固定的HER2的生物素化抗体在结合用于吸光度检测的HRP标记的二抗(second antibody)的卡通画描绘。
附图13B表示在450nm处检测吸光度测定的生物素-马来酰亚胺偶联的硫代-曲妥单抗变体(thio-trastuzumab variant)和未-生物素化的野生型曲妥单抗结合固定的HER2的结合测定。从左至右V110C(单cys)，A121C(单cys)，V110C/A21C(双cys)和曲妥单抗。以1、10和100ng测试了各thio IgG变体和曲妥单抗。
附图14A表示结合固定的HER2的生物素化抗体和用于吸光度检测的生物素与抗-IgG-HRP结合的卡通图描绘。
附图14B表示在450nm下检测吸光度的生物素-马来酰亚胺偶联的-硫代曲妥单抗变体和未-生物素化的野生型曲妥单抗在结合固定的链霉抗生物素中的结合测定值。从左至右V110C(单cys)，A121C(单cys)，V110C/A121C(双cys)和曲妥单抗。以1、10和100ng测试了各thio IgG变体和曲妥单抗。
附图15表示制备由细胞培养物表达的用于偶联的半胱氨酸改造的抗体(ThioMab)的一般方法。
附图16表示在固定的蛋白质A上纯化后2H9 Thiomab Fc变体的非还原(上)和还原(下)变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分析(左至右，泳道1-9)A339C；S337C；S324C；A287C；V284C；V282C；V279C；V273C；和2H9野生型。右侧的泳道为分子大小标记梯，表示完整蛋白质约为150kDa、重链片段约50kDa和轻链片段约25kDa。
附图17A表示在固定的蛋白质A上纯化后2H9 Thiomab变体(左至右，泳道1-4)L-V15C；S179C；S375C；S400C的非还原(左)和还原(+DTT)(右)变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分析。
附图17B表示在固定的蛋白质A上纯化后2H9和3A5 ThioMab变体的非还原(左)和还原(+DTT)(右)变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分析。
附图18表示生物素化thio-IgG变体的蛋白印迹分析。用还原的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分析2H9和3A5 ThioMab变体，将蛋白质转移到硝酸纤维素膜。分别用抗-IgG-HRP(上)和链霉抗生物素-HRP(下)探测抗体和偶联的生物素的存在。泳道13A5 H-A121C。泳道23A5 L-V110C。泳道32H9H-A121C。泳道42H9 L-V110C。泳道52H9野生型。
附图19表示通过用抗-IgG-HRP探测和在450nm测定吸光度进行的生物素化的2H9变体与链霉抗生物素结合的ELISA分析(上部条柱形图)。下部示意图描绘了用于ELISA分析的实验设计。
附图20表示用下列处理的SK-BR-3细胞的体外细胞增殖试验-●-曲妥单抗；-▲-具有3.4DM1/Ab药物负荷的曲妥单抗-SMCC-DM1；和-◆-具有1.6DM1/Ab药物负荷的硫代-曲妥单抗(A121C)-BMPEO-DM1。
附图21A表示用下列处理的HT 1080EphB2细胞的体外细胞增殖试验 亲代2H9抗-EphB2R；和-□-thio2H9(A121C)BMPEO-DM1。
附图21B表示用下列处理的BT 474细胞的体外细胞增殖试验 亲代2H9抗-EphB2R；和-□-thio2H9(A121C)BMPEO-DM1。
附图22表示用下列处理的PC3/neo细胞的体外细胞增殖试验-◆-3A5抗MUC16-SMCC-DM1；和-■-thio3A5(A121C)BMPEO-DM1。
附图23表示用下列处理的PC3/MUC16细胞的体外细胞增殖试验-◆-3A5抗MUC16-SMCC-DM1；和-■-thio3A5(A121C)BMPEO-DM1。
附图24表示用下列处理的OVCAR-3细胞的体外细胞增殖试验-◆-3A5抗MUC16-SMCC-DM1；和-■-thio3A5(A121C)BMPEO-DM1。
附图25表示在第0天给予单剂量的下列物质给药后具有MMTV-HER2Fo5乳腺肿瘤同种异体移植物的无胸腺裸鼠21天内的肿瘤体积改变的平均值 媒介物(缓冲液)；-●-曲妥单抗-SMCC-DM1 10mg/kg，具有3.4DM1/Ab的药物负荷(drug loading)；-■-硫代曲妥单抗(A121C)-SMCC-DM1 21mg/kg，具有1.6DM1/Ab的药物负荷；和-□-硫代曲妥单抗(A121C)-SMCC-DM1 10mg/kg，具有1.6DM1/Ab的药物负荷。
典型实施方案的详细描述详细内容参照本发明的某些实施方案，其实施例在附带的结构和通式中例示。尽管结合列举的实施方案描述了本发明，但是应理解它们并非指定用于将本发明限定到那些实施方案。相反，本发明覆盖所有的备选、变型和等同技术方案，它们均包括在如权利要求定义的本发明范围内。
本领域技术人员知道可以用于实施本发明的与本文所述的那些相似或等同的许多方法和物质。本发明决不限于所述的方法和物质。
除非另做陈述，否则，本文所用的技术和科学术语具有本发明所属技术领域普通技术人员通常理解的相同的含义并且与如下文献中所述一致Singleton等(1994)Dictionary of Microbiology and Molecular Biology，2nd Ed.，J.Wiley & Sons，New York，NY；和Janeway，C.，Travers，P.，Walport，M.，Shlomchik(2001)Immonobiology，5th Ed.，Garland Publishing，New York。
定义除非另做陈述，否则，本文所用的下列术语和措词具有如下含义当本文中使用商品名时，申请人意欲独立地包括产品的商品名产品制剂、仿制药和商品名产品的活性药物组分。
本文的术语“抗体”以其最广泛的含义使用并且特别覆盖单克隆抗体、多克隆抗体、二聚体、多聚体、多特异性抗体(例如双特异性抗体)和抗体片段，只要它们表现出所需的生物活性(Miller等(2003)Jour.of Immunology1704854-4861)。抗体可以为鼠、人、人源化、嵌合的抗体或来源于其它物种。抗体为由能够识别和结合特异性抗原的免疫系统产生的蛋白质(Janeway，C.，Travers，P.，Walport，M.，Shlomchik(2001)Immuno Biology，5th Ed.，GarlandPublishing，New York).靶抗原一般具有由多种抗体的CDRs识别的大量结合位点，也称作表位。特异性结合不同表位的各抗体具有不同的结构。因此，一种抗原可以具有一种以上相应的抗体。抗体包括全-长免疫球蛋白分子或全-长免疫球蛋白分子的免疫活性部分，即含有特异性结合所关注靶标的抗原或其部分的分子，这类靶标包括，但不限于癌细胞或产生与自身免疫性疾病相关的自身免疫抗体的细胞。本文披露的免疫球蛋白可以具有免疫球蛋白分子的任意类型(例如IgG、IgE、IgM、IgD和IgA)、类别(例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2)或亚类。免疫球蛋白可以来源于任意的物种。然而，在一个方面中，免疫球蛋白来源于人、鼠或兔。
″抗体片段″包含全长抗体的一部分，一般为其抗原结合区或可变区。抗体片段的实例包括Fab、Fab′、F(ab′)2和Fv片段；双抗体；线性抗体；微抗体(minibody)(Olafsen等(2004)Protein Eng.Design & Sel.17(4)315-323)；Fab表达文库制备的片段；抗-独特型(抗-Id)抗体；CDR(互补决定区)；和以免疫特异性方式结合癌细胞抗原、病毒抗原或微生物抗原的上述任意的表位-结合片段；单-链抗体分子；和由抗体片段形成的多特异性抗体。
本文的术语“单克隆抗体”指从基本上同质的抗体群中获得的抗体，即除可能少量存在的天然发生的可能突变之外，包含在该群体中的各抗体是相同的。单克隆抗体是高度特异的靶向单个抗原位点的抗体。而且，与典型地包括靶向不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制品相反，每种单克隆抗体只靶向抗原上的单一决定簇。除其特异性外，单克隆抗体的优点还在于它们可以以不被其它抗体污染的方式合成。修饰语“单克隆”表示获自基本上同质的抗体群的抗体特性，并非解释为需要由任何特定方法生产抗体。例如，可以通过首先由Kohler等(1975)Nature 256495描述的杂交瘤方法制备用于本发明的单克隆抗体或可以通过重组DNA方法制备(例如，参见US 4816567；US 5807715)。例如，还可以使用Clackson等(1991)Nature，352624-628；Marks等(1991)J.Mol.Biol.，222581-597所述的技术从噬菌体抗体文库分离单克隆抗体。
本文的单克隆抗体特别包括“嵌合”抗体，其中重链和/或轻链的一部分与衍生自特定物种或属于特定抗体类型或亚型的抗体中的相应序列相同或同源，而所述链的剩余部分与来源于另一物种或属于另一抗体类型或亚型的抗体中的相应序列相同或同源，本文还包括嵌合抗体的片段，只要它们展示期望的生物学活性(US 4816567；和Morrison等(1984)Proc.Natl.Acad.Sci.USA，816851-6855)。本文关注的嵌合抗体包括“灵长化(primatized)”抗体，其包含来源于非人的灵长类(例如Old World Monkey、Ape等)的可变区抗原-结合序列和人恒定区序列。
本文的“完整抗体”为包含VL和VH结构域以及轻链恒定域(CL)和重链恒定域CH1、CH2和CH3的抗体。恒定域可以为天然序列恒定域(例如人天然序列恒定域)或其氨基酸序列变体。完整抗体可以具有一种或多种“效应子功能”，意旨归因于抗体的Fc恒定区(天然序列Fc区或氨基酸序列变体Fc区)的那些生物活性。抗体效应子功能的实例包括Clq结合；补体依赖的细胞毒性；Fc受体结合；抗体-依赖性细胞介导的细胞毒作用(ADCC)；胞吞作用；和细胞表面受体，诸如B细胞受体和BCR的减量调节。
根据其重链恒定域的氨基酸序列的不同，可以将完整抗体指定为不同“类别”。存在5种主要类别的完整免疫球蛋白抗体IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，且可以将其中的几种进一步分成“亚类”(亚型)，例如IgG1，IgG2，IgG3，IgG4，IgA1，和IgA2。对应于不同抗体类别的重链恒定域分别称作α、δ、ε、γ和μ。不同类别免疫球蛋白的亚单位结构和三维构型为众所周知的。Ig型包括铰链-修饰型或无铰链型(Roux等(1998)J.Immunol.1614083-4090；Lund等(2000)Eur.J.Biochem.2677246-7256；US 2005/0048572；US2004/0229310)。
“ErbB受体”为属于受体ErbB受体家族的蛋白酪氨酸激酶，其成员为细胞生长、分化和存活的重要介导物。ErbB受体家族包括4种不同的成员，包括表皮生长因子受体(EGFR、ErbB1、HER1)、HER2(ErbB2或p185neu)、HER3(ErbB3)和HER4(ErbB4或tyro2)。已经使用人乳腺肿瘤细胞系SKBR3表征了一组抗-ErbB2抗体(Hudziak等(1989)Mol.Cell.Biol.9(3)1165-1172。使用称作4D5的抑制细胞增殖达56％的抗体获得最大抑制作用。在本试验的一组抗体中的其它抗体降低细胞增殖的程度较弱。进一步发现抗体4D5可以使过表达ErbB2的乳腺肿瘤细胞系对TNF-α的细胞毒性效应敏感(US5677171)。Hudziak等讨论的抗-ErbB2抗体进一步在下列文献中得到表征Fendly等(1990)Cancer Research 501550-1558；Kotts等(1990)In Vitro26(3)59A；Sarup等(1991)Growth Regulation 172-82；Shepard等J.(1991)Clin.Immunol.11(3)117-127；Kumar等(1991)Mol.Cell.Biol.11(2)979-986；Lewis等(1993)Cancer Immunol.免疫ther.37255-263；Pietras等(1994)Oncogene 91829-1838；Vitetta等(1994)Cancer Research 545301-5309；Sliwkowski等(1994)J.Biol.Chem.269(20)14661-14665；Scott等(1991)J.Biol.Chem.26614300-5；D′souza等Proc.Natl.Acad.Sci.(1994)917202-7206；Lewis等(1996)Cancer Research 561457-1465；和Schaefer等(1997)Oncogene 151385-1394。
ErbB受体通常包含胞外结构域，其可以结合ErbB配体；亲脂性跨膜结构域；保守的胞内酪氨酸激酶结构域；和包含几个可以被磷酸化的酪氨酸残基的羧基-末端信号传导结构域。ErbB受体可以为“天然序列”ErbB受体或其“氨基酸序列变体”。优选ErbB受体为天然序列人ErbB受体。因此，“ErbB受体家族的成员”为EGFR(ErbB1)、ErbB2、ErbB3、ErbB4或其它任意目前已知或即将在未来鉴定的ErbB受体。
术语“ErbB1”、“表皮生长因子受体”、“EGFR”和“HER1”在本文中可以互换使用并且意旨例如在Carpenter等(1987)Ann.Rev.Biochem.，56881-914中披露的EGFR，包括其天然存在的突变形式(例如作为在Humphrey等(1990)Proc.Nat.Acad.Sci.(USA)874207-4211中的缺失突变体EGFR)。本文的术语erbB1意旨编码EGFR蛋白质产物的基因。例如，Murthy等(1987)Arch.Biochem.Biophys.，252549-560和WO 95/25167中描述了针对HER1的抗体。
术语″ERRP″、″EGF-受体相关蛋白″″EGFR相关蛋白″和″表皮生长因子受体相关蛋白″在本文中可以互换使用并且意旨例如在US 6399743和US
发明者查尔斯·W·艾根布罗特, 杰加思·R·朱纳特拉, 亨利·洛曼, 赫尔加·E·拉布, 理查德·范德伦 申请人:健泰科生物技术公司