多能扩增间充质前体细胞子代(memp)及其应用的制作方法

专利名称：：多能扩增间充质前体细胞子代(memp)及其应用的制作方法
技术领域：
：本发明涉及多能扩增的间充质前体细胞子代(MEMP)。本发明还涉及用于产生MEMP的方法以及MEMP在治疗性应用中的用途。
背景技术：
：存在于体内且分离时可产生多能细胞的非造血祖细月包净皮称为间充质前体细胞(MPCs)。更具体地，纯化的MPCs能够形成大量多能细胞集落。Simmons等人(AdvancesinBoneMarrowPurgingandProcessing:FourthInternationalSymposium,pages271-280,1994)阐述了通过选择表达STRO-l细胞表面标记物的细胞，从新鲜收集的骨髓细胞富集MPCs。如作者在第272-273页所解释的，已知骨髓细胞包含一定比例能够产生CFU-F的MPCs。这些CFU-F在合适的条4牛下又能够产生多种(abroadspectrumof)完全分4b的结締组织，包括软骨、骨、脂肪组织、纤维组织和骨髓支持基质(myelosupportivestroma)。MPCs和CFU-F通常以非常低的发生率存在于骨髓细月包中(通常在0.05%-0.001o/。之间)，并且这种稀缺性一直是其过去研究中的主要限制。在Simmons"a/,1994(见前)引文中所^仑述的重要发9现证实可以通过选择STRO-l阳性细胞，从新鲜分离的骨髓细胞中一定程度的富集MPCs。特别地，STRO-l阳性细胞的选择4吏得分离MPCs(以及4寻到的CFU-F)而不污染造血3且细力包成为可能。WO01/04268(Simmons")通过鉴定STRO-l卩曰性纟田胞部分内包含MPCs的亚群，提供了另一个在MPCs富集方面非常重要的进展。特别地，WO01/04268描述了将STRO-l阳性细月包群分选为三个亚类STRO-l暗、STRO画l中间和STRO-l亮。在不同的分选亚群中进行CFU-F集落形成(clonogenic)测定，表明绝大多凄tMPC包含于STRO画l亮部分中。WO2004/085630(Gronthosaa/)首次4皮露了MPCs存在于血管周围组织中。这个发现的一个益处在于它极大地扩展了MPC可以从其分离或富集的源组织的范围，并且不再存在对MPCs的骨髓来源的有效限制。才艮据WO2004/085630中描述的方法，MPCs可以从其分离的组织包括人类骨髓、牙髓、脂肪组织、皮肤、脾、胰腺、脑、肾、肝脏和心脏。/人血管周围组织分离的MPCs对于细月包表面标记物3G5是阳性的。因此，它们可以通过富集携带3G5标记物的细月包、或者通过富集存在于血管周围细胞上的早期发育表面标记物(如CD146(MUC18)、VCAM-1)、或通过富集高水平表达的细月包表面标记物STRO-l来分离。用于体外繁殖分离的MPC的方法已有描述(Gronthos"or/.JoMma/o/0〃Sc&"ce116:1827-1835,2003)。然而，普遍4妄受的，见点是MPC的体外扩增通过分化使其祖细胞本质丢失。10
发明内容现在，本申请的发明人得到了令人惊奇的发现，即，体外扩增的MPCs能产生一种保留多能性的子代亚群。这种MPC子代亚群为Stro-I*3"细月包并在本文中^皮称为多能扩增MPC子代(MEMPs)。本申请的发明人还得到了令人惊奇的发现，即MEMPs在体外和体内均能够刺激组织特异性定型细胞(TSCCs)的增殖。因此，MEMPs在多种需要产生或〗奮复组织的治疗性应用中具有>替在用途。因此，本发明提供了富集细胞群体，其中总细胞群体的至少10%为具有STRO-lw、ALP—表型的多能扩增间充质前体细胞子代(MEMPs)。本发明还提供了包括培养的和/或扩增的细胞群体的组合物，其中总细胞群体的至少1%为具有Stro-l&i、ALP—表型的MEMPs,并且其中组合物进一步包括主要为一种组织类型的TSCCs。本发明还l是供了通过将TSCCs与具有Stro-lb"、ALP—表型的MEMPs共培养或通过将TSCCs与从具有Stro-lb"、ALP—表型的MEMPs获得的培养上清液、细胞裂解物或部分(fraction)4妾触来刺激TSCCs增殖的方法。本发明还提供了一种富集具有STRO-1bd、ALP_表型的MEMPs的方法，所述方法包括在一种或多种刺激因子存在的情况下培养或扩增MPC或其子代，所述刺激因子选自由loc,25-二羟基维生素D3(1，25D)、血小板源性生长因子(PDGF)、肿瘤坏死因子oc(TNF-oc)、白介素-1(3(IL-1P)和基质衍生因子1a(SDF-1a)组成的组。本发明还^是供了一种产生组织特异性定型细胞群体的方法，所述方法包括在一种或多种刺激因子存在的情况下培养包括MPC或其子代和TSCC的细胞群体，所述刺激因子选自由lot,25-二羟基维生素D3(1,25D)、血小4反源寸生生长因子(plateletderivedgrowthfactor)(PDGF)、月中瘤i不死因子a(TNF陽cc)、白介素-lp(IL-IP)牙口基质衍生因子la(SDF-1a)组成的组；以及使所述培养的群体处于使MPC或TSCC分化偏向于特异性组织类型的条件。本发明还4是供了一种包括MPC或其子4、和刺激因子的组合物，所述刺激因子选自由la，25-二羟基维生素D3Cl,25D)、血小板源性生长因子(PDGF)、肺瘤坏死因子a(TNF-oc)、白介素-l(3(IL-1(3)和基质书亍生因子1a(SDF-1cc)纟且成的纟且。本发明还提供了一种用于产生或修复患者组织的方法，所述方法包括将本发明的富集群体给予患者。本发明还提供了一种用于产生或修复患者组织的方法，所述方法包括将本发明的组合物给予患者。本发明还提供了一种具有STRO"bri、ALP—表型的分离的遗传<奮饰的MEMP。附图i兌明图1.来源于培养的MPCJL^达STRO-lbri或STRO-ld^的细胞的基因表达i普。体外扩增的骨髓MPC单细胞悬浮液通过胰蛋白酶/EDTA处理而制备。细胞利用STRO-1抗体染色，随后通过用羊抗鼠IgM-荧光素异硫氰酸盐(酯)孵育显示。在荧光激活的细胞分选(A)之后，从纯化的表达STRO-ldim或STRO-1^的细胞群体制备细胞总RNA。利用RNAzo旧提耳又方法以及标准步骤，将总RNA从每个亚群分离并且用作cDNA合成的模版。利用前面阐述的标准流^1，通过PCR扩增评估各种转录体的表达(Gronthos"Jowmfl/o/CW/Sc/ewce116:1827-1835,2003)。用于本研究中的引物对示于表2。扩增后，通过1.5%琼脂糖凝胶电泳分析每个反应混合物，并且通过溴化乙锭染色使其可视化(B)。每个细胞标记物参照于管家基因(GAPDH)表达的相对基因表达，利用ImageQant软件力口以；平估(C)。图2.来源于骨髓MPCs的体外扩增细胞的免疫表型表ii^式。来源于骨髓MPC的体外扩增细胞的单细胞悬浮液通过力夷岛素/EDTA解离来制备，随后与STRO-l抗体以及鉴定多种细胞系相关标记物的抗体一起孵育。利用羊抗鼠IgM-荧光素异^L氰酸酯(盐)鉴定STRO-l,同时利用羊抗鼠或羊抗兔IgG-藻红蛋白鉴定所有其^也标i己物。只于那些鉴定细月包内抗原的抗体，细月包制备4勿首先用STRO-l4元体才示i己、用冷70%乙醇固定以透4匕(permeabilize)细月包月莫并随后用细月包内抗原特异性抗体孵育。在同样的条件下4吏用匹配的同型对照抗体。利用COULTEREPICS流式细月包4义进4亍只又色流式细胞分析，并收集列表模式数据(listmodedata)。点状图表示5000个列表才莫式的事件(listmodeevents)，表明每个种系细胞标记物(y轴)和STRO-l(x轴)的荧光强度水平。垂直和水平象限参照匹配的同型阴性对照抗体而建立。图3.体外成脂发育。单细胞悬浮液通过从体外扩增细胞(来源于STRO-lb"/VCAM-l+分选的骨髓细胞)的继代培养物进行胰蛋白酶/EDTA消化而生成，然后利用单色荧光素激活的细胞分选将扩增的细胞才艮据其STRO-l表达加以分离，如图1A所示。然后，STRO-lb"和STRO-ldim分选的MPC衍生细胞在常规生长培养基中，以1x105个细胞/孔的密度铺于6孔板中过夜。第二天，将培养基用如在方法中所述的成脂诱导培养基替换。此后，培养基每周补充两次，共计三周，此时固定该细胞并用油红O进行染色。本图示出了低(4x)和高(20x)倍放大，以描述含有遍布粘附性基质层中含脂质的脂肪细胞的油红O染色。与STRO-l"im培养物中7±2脂肪细胞(20x的每单位面积，n=9个视野)相比，在STRO-lbri培养物中平均鉴定出22±5个油红O阳性脂肪细胞(20x的每单位面积，r^9个^见野)。图4:体外成骨发育。单细胞悬浮液通过从体外扩增细胞(来源于STRO-lbri/VCAM-l+分选的骨髓细胞)的继代培养物进行胰蛋白酶/EDTA消化而生成。然后利用单色荧光素激活的细月包分选(FAC)将扩增的细胞根据其STRO-l表达加以分离，如图1A所示。然后将STRO-lb"和STRO-ldimFACS分离的细胞在常规生长培养基中、以0.3Xl()S个细胞/孔的密度铺于48孔板中过夜(每个条件重复4次)。第二天，将培养基用如在方法中所述的成骨诱导培养基^^换。此后，将培养物每周补充两次，共计三周，此时洗涤该细胞，然后用0.6NHCL处理以提取矿化沉积物中的钙。将样品与o-甲酚-酞-配位酮反应，比色反应在570nm处读凄t。绝对钙浓度才艮据钙的标准曲线来确定。(A)钙测量值表明，相比于STRO-ld^培养物，STRO-lb"培养物合成显著(*;p<0.05;t-检验)较多的矿物质。将重复的培养物加以固定，并用茜素红染色法加以染色以描述STRO-lbri(B)和STRO-ld^(C)培养物的粘附层中矿化沉积物的典型水平。图5:体外软骨发育。单细胞悬浮液通过从体外扩增细胞(来源于STRO-lb"/VCAM-l+分选的骨髓细胞)的继代培养物进行胰蛋白酶/EDTA消化而生成，然后利用单色荧光激活的细胞分选14(FACS)，将扩增的细胞根据其STRO-l表达加以分离，如图1A所示。然后将STRO-l^和STRO-ldimFACS分离的细月包以2.5x105个细胞/管的密度成团于聚丙烯管中并在软骨形成诱导培养基中培养。此后，将该培养物每周补充两次，共计三周。回收细力包团并用于组织学4全查或如方法中所述制备总RNA。STRO-lbd(A)和STRO-ldim(B)细胞群体均能够形成含软骨细胞样细胞的细胞团。RT-PCR分析表明，相比于STRO-ldim(SD)细胞群体，STRO-lbri(SB)群体显示出较高水平的软骨相关基因X型胶原和聚集蛋白聚糖(C)。图6:STRO-lBri细胞资导STRO-ldim细胞增殖。体外扩增的骨髓MPC的单细胞悬浮液通过胰蛋白酶/EDTA处理而制备。细胞用STRO-l抗体进行染色并分选为表达STRO-ldim或STRO-lb"的培养细胞群体，如图1中所述。细胞如方法中所述用CFSE力口以标记。未标记的细胞用来建立阴性对照(自体荧光)。利用Colcemid(100ng/ml)来抑制细胞分裂并提供一个总标记指数(0代)。随后将未标记的STRO-lbri以(A)0STRO國lbri个细胞:lxl()5STRO-ld'm个细胞(0%);(B)0.05xl05STRO-lbri个细胞:0.95x105STRO-ldim个细胞(5%);(C)O.lxlO5STRO画lbri个细胞:0.9x105STRO-ldim个细胞(10%);(D)0.2xl05STRO-lb""i个细胞:0.8x105STRO-ldi，细胞(20%);(E)0.5xl05STRO-lbri个细胞:0.5xl()5STRO画ld^个细月包(50%)的比率力口回到CFSE标i己的STRO-ldim细月包中。一寻该4卜力口的混合物培养7天，收集，并如方法中所述通过流式细胞仪进行分析。利用用于win32的ModFitLT(2.0版)分析细胞增殖，发现STRO-lbri细胞(Rl)以剂量依赖性方式刺激STRO-ldim细胞的增殖。图7:细胞因子和成骨性试剂增加培养物中的STRO-lbri细胞的数量。将已建立的MPC培养物在补充了10%FCS(A)，或一系列因子(包括lxl08Mla，25-二羟基维生素D3(1，25D)(B);lOng/ml15血小板源性生长因子(PDGF)(C);10ng/ml瘤坏死因子-a(TNF-a)(D);10ng/ml白介素-l卩(IL-ip)(E)以及30ng/ml基质衍生因子l-a(SDF-la)(F))的基础培养基中培养5天，用STRO-lmAb染色并如上所述进行分析，发现这些因子增加STRO-lbriMPC的数量。示出的结果是3次独立实-验的4戈表性示例。图8:将无胸腺净果大鼠进行冠状动脉左前降支(LAD)结扎并于48小时后注射盐水、lx106个人STRO-ldim细胞、lx106个人STRO-lb"细胞或lxl(^个人Stro-l-缺失的骨髓单核细胞。两周后，处死动物，固定心脏组织，同时用两种单克隆4元体加以染色第一种抗体与大鼠(而不是人类)Ki67抗原选择性反应，第二种抗体与心肌细胞标记物肌钙蛋白I反应。双重染色的细胞(表示增殖的大鼠心肌细胞)通过免疫过氧化酶技术进行4全测。相比于4妻受盐水或lx106个STRO-ld^人细胞的对照动物，接受1X106个STRO-l^人细胞的动物表现为增殖的大鼠心肌细胞呈2.5-5倍较高的数量(p<0.05)。图9:无胸腺棵大鼠皮下注射大鼠成胶质细胞瘤细胞，其构成性地分泌VEGF。两周后，该大鼠接受瘤内注射盐水、0.5xl()S个人STRO画ldim细月包或0.5X1()6个人STRO-lb"细月包。一周后，处死动物，固定瘤《且织，同时用两种单克隆抗体力。以染色第一种4元体与a-平滑肌肌动蛋白抗原(由平滑肌细胞表达)反应，而第二种抗体与vWF抗原(由脉管内皮细胞表达)反应。双重染色的结构(表示含有内皮和平滑肌的小动脉和动脉)通过免疫过氧化酶4支术进行4金测。相比于接受盐水或lxl()S个STRO-ldim人细胞的对照动物，接受0.5x106STRO-lb"个人细胞的动物在瘤内细胞注射的部位表现为小动脉和动脉呈3.5-8倍的较高数量(p<0.05)。在注射了人细胞的远端部^立处未，见察到差异。图10:IL-ip增加从MPC扩增的细胞的增殖能力。如方法中所述，将细胞用CFSE进行标记，随后在10ng/mlIL-ip存在的情况下将细胞培养5天，用STRO-l和ALKPHOSmAb力。以染色并如上所述进4亍分冲斤。(A)未处理的(NT)和(B)IL-lp处理的i咅养物表现出STRO-lbri/ALP阳性细胞数量的增加。这种STRO-l表达的增加伴随着如(C)中所示的细胞增殖的增加，其中未处理的培养物经历了四次细胞分裂，同时(D)IL-ip处理的培养物通过增加STRO-l^骨原细胞的数量而表现出细胞分裂次数增力口。示出的结果是3次独立实马全的4戈表性实例。当1,25D、PDGF-BB、TNF-a、IL-ip以及SDF-1用来刺纟敫MPC时，也可4寻到类4以结果。图11:在成骨i秀导剂(地塞朱松，desamethasone)存在的'清况下，IL-ip刺激MPC增殖并且增强其骨形成能力。将体外扩增的人(A)MPC后代以2,000个细胞/孔的细胞密度接种于96孔板中并在a-MEM-10中培养。培养基补充了指定浓度的IL-1(3,并且如在方法中所述，在第7天利用WST-l对细胞^t和生存力进4亍定量。浓度为0.01ng/ml的IL-ip显著将细胞数增至未处理对照培养物的136.6±1.2%(D,P=0.000003，学生t-检验)。在大于0.1ng/ml的浓度下获得平台效应。数值表示每个浓度的三次重复培养物的平均值土SEM。(B&C)一夸体外扩增的MPC后4义以5xl()4/孔的细胞密度三份平行接种于24孔板中，并在成骨i秀导性条件下进行培养，如方法中所述。该细胞用浓度为10ng/ml的IL-ip处理，并且培养物每周"补充"一次含有IL-ip的新鲜培养基。乂人基质中释》欠的游离钙通过如方法中所述在酸性条件下处理粘附细胞而获得。将样品与邻曱酚-酜配位酮反应，比色反应在570nm处读数。绝对4丐浓度冲艮据4丐的标准曲线来确定。结果表明，相比于未处理的细胞(B),在用IL-1J3处理的细月包中矿物沉积增力。(C)。在IL-1卩处理的细月包中，4丐水平在第4周(**尸=0.00009，学生t-枱r-验)和第6周(**尸=0.00004，学生t-检—验)均显著高于未处理的细月包(D)。示出的结果是3次独立实验的代表性实例，其中利用来源于三个不同供体的基质细胞。图12:IL-ip刺激STRO-lbriMPC增殖，而地塞^fO^H秀导碱性磷酸酶(ALP)表达。将已建立的人MPC培养物以3xl0V孔的细胞密度接种到(A)无补充物(NT)、补充了(B)10ng/mlIL-1(3或(C)1x10-8m地塞米^^以及(D)10ng/mlIL-ip和1x1Ct8m地塞米松的完全培养基的24孔板中。将细胞如方法中所迷培养21天。结果表明，IL-1卩的促有丝分裂作用用于增加STRO-lbriMPC的数量(B),后者又刺激STRO-ld^细胞的增殖(见图6)。另外，MPC响应存在于生长培养基中的FCS和抗坏血酸盐-2-磷酸盐而获得ALP表达，而ALP表达在响应于4唐皮质5敫素(glucocorticosteroid)地塞米松(dex)时被增强(D)。IL-ip和dex的组合作用用来增强骨形成，如图11所示。实-验进4亍了三次并且在来源于三个不同供体的MPC中观察到相似的趋势。图13:PDGF对体内骨形成的作用。将来源于STRO-1"VCAM-1+分选的骨髓细胞的体外扩增细胞的半融合继代培养物在PDGF-BB(10ng/ml)存在或不存在的情况下培养5天。单细胞悬浮液通过胰蛋白酶/EDTA消化形成，然后如方法中所述与用于才直入的40mg羟石粦灰石/石粦酸三钙颗冲立(HA/TCP)—起在免疫缺陷小鼠中进行孵育。8周后，将获得的移植物固定并加以处理用于组织学4企查。新骨形成的分析利用Scion成^f象软件才艮据三个重复移才直物的每个表面积(20x)来确定(A)。相比于未处理的对照培养物，用PDGF-BB预处理的培养物显示出显著(*;pO.05;t-检验)较多的异位骨形成。示出的典型图片以横截面描述苏木精/伊红染色的异位骨，代表未处理的(B)和PDGF处理的(C)移植物。图14:多能扩增间充质前体细胞子^R(MEMPs)或STRO-lbri/ALP-MPC存在于STRO-l选择的BMMPC的体夕卜培#^中。体外培养物四次传代后，利用双色荧光和流氏细胞仪分析STRO-l选才奪的BMMPC的STRO-l和ALP表达。点图直方图表示5x104个以列表^^式数据收集的事件。垂线和水平线设定为反应水平低于利用匹配的同型对照抗体1B5(IgG)和1A6.12(IgM)在相同条件下处理;彈到的平均荧光的1.0%。具体实施例方式现在，本申请的发明人得到了令人惊奇的发现，即体外扩增的MPCs包含可保留多能性的细胞亚群。更具体地，本申请的发明人发现才艮据由STRO-1抗体识别的抗原的表达水平，从收集的MPC细胞获得的扩增(expanded)群体可以分成至少两个群体STRO-1b"和STRO-ldim。本文所示的功能性数据表明扩增的STRO-lbri细胞是较低定型的而且更能够响应于支持脂肪发育、软骨发育和骨发育的诱导因子。相反，STRO-1^细胞代表更分化的群体并且包括组织特异性定型细胞(TSCC)类型。在扩增的子代内的Stro-lb"细胞在本文中被称为多能扩增MPC子代(MEMPs)。本申请的发明人还得到了令人惊奇的发现，即MEMPs能够在体外和体内刺激组织特异性定型细胞(TSCCs)增殖。因此，MEMPs在多种需要产生或i奮复组织的治疗性应用中具有潜在用途。如本文所4吏用的，"MPC"是能够形成大量多能细胞集落的非造血祖纟田胞。"MPC子代"指的是来源于MPC的细胞。优选地，MPC子代是集落形成单位-成纤维细胞(CFU-F)的子代，而CFU-F又来源于MPC。更优选地，所述细胞通过扩增或体外培养,人MPC或CFU-F获得。优选地，该培养涉及两次以上、优选三次以上、4交优选四次19以上的传代。在培养或扩增后，优选富集群体包括至少5x106个细月包，4交4尤选至少107个细月包，更4尤选至少109个细月包。WO01/04268和WO2004/085630中阐述了用于制备富集MPC群体(子代可以从其衍生)的方法。在体外环境下，MPC很少以绝对纯净的制备物存在，通常与其它为组织特异性定型细力包(TSCC)的细胞一起存在。WOO1/04268提到了从骨髓中以约0.1%到90%的纯度水平收集这样的细胞。包括MPC(子代从其衍生)的群体可以直接从组织来源收集，或者可替代地，它可以是已经在体外扩增的群体。例^口，该子4戈可以来源于^:集的、未扩增的(unexpanded)、基本上纯化的MPC群体，包括它们存在于其中的群体的总细胞的至少约O.l、1、5、10、20、30、40、50、60、70、80或95%。这个水平可以通过，例如，选才奪对于至少一种标记物为阳性的细胞来实现，所述标记物选自由STRO-lbd、VCAM-lbl_i、THY-lbri、CD146b"和STRO-2b"组成的组。该MPC起始群体可以来源于WO01/04268或WO2004/085630中列出的任何一种或多种组织类型，即骨髓、牙髓细胞、脂肪组织和皮肤，或者可能更广泛的来源于脂肪组织、牙齿、牙髓、皮肤、肝、肾、心、视网膜、脑、毛嚢、肠、肺、脾、淋巴结、胸腺、胰腺、骨、韧带、骨髓、腱和骨骼肌。这种细胞的优选来源为人类，然而，预期本发明也可以适用于动物，包括农业动物(如牛、羊、猪等)、家畜(如狗和猫)、实验动物(如小鼠、大鼠、仓鼠和兔)或者用于运动的动物(如马)。可以理解，在实施本发明的过程中，携带任何特定细胞表面标i己物的细月包的分离可以利用多种不同的方法而实5见，然而，^尤选的方法依赖于将结合剂结合到所涉及的标记物，随后分离那些表现出结合(高水平结合或低水平结合或者无结合)的。最方便的结合剂是抗体或基于抗体的分子，由于单克隆抗体的特异性而优选为单克隆抗体或基于单克隆抗体。抗体可以用于两个步骤，然而，其它试剂也可以j吏用，因此，也可以采用这些标i己物的配体富集携带或在夹乏它O的纟田月包。所述抗体或配体可以附着于固体支撑物以实现斗且分离。分离才支术优选最大化保留待收集部分的生存能力。可以采用各种不同效率的技术获得相对粗分离。所采用的特定技术依赖于分离效率、相关细胞毒性、操作的难易和速度以及先进装备和/或工艺技术的必要性。用于分离的方法可以包括但不限于利用抗体被覆的磁珠进行磁性分离、亲和层一斤以及用附着于固体基质的抗体进行"筛选(panning)"。提供精确分离的技术包括但不限于FACS。用于分离MPC的方法4尤选包4舌，例如，第一步，为固相分选步骤，利用例如MACS识别STRO-l的高水平表达。如果需要，第二分选步骤可以随后进行，得到如专利说明书WO01/14268中所述的较高水平的前体细胞表达。该第二分选步骤可能涉及到应用两种或多种才示i己物。获得MPC的方法还可以包括在第一富集步骤前利用已知才支术]欠集细月包源。因it匕可以一夸该纟且织手术切除。包4舌该源纟且织的细月包随后将^皮分散入所谓的单细力包悬浮液。这种分散可以通过物理和/或酶法获得。一旦获得合适的MPC群体，它可以通过任何合适的方法进行培养或扩增以获得MEMPs。MEMPS可以与新鲜收集的MPC区别开并且它们对标"i己物STRO-lbri是阳性的，对标记物碱性磷酸酶(ALP)是阴性的。相反，新鲜分离的MPC对STRO-l^和ALP均是阳性的。当我们提到细胞对特定标记物为"阳性"时，根据细胞表面上该标i己物存在的禾呈度，其可以为标i己物的4氐(k)或dim)或高(bright,所使用的其他颜色的强度。Lo和bri的区别在^皮分选的特定细胞群体上所用的标记物的上下文中将被理解。本文中我们提到细胞对特定标记物为"阴性，，时，并不意p未着该细胞一点也不表达所述标记物，而指该细胞以相对非常低的水平表达该标记物，且当可才企测的标记时，产生非常低的信号。当在本文中使用时，术语"亮"指的是细胞表面上的标记物在可检测地标记时产生相对较高的信号。同时不希望受限于理论，我们提出了"亮，，细胞比样品中的其它细胞表达较多的靶标记蛋白(例如，由STRO-l识别的抗原)。例如，当用FITC轭合的STRO-l抗体标记(如通过FACS分析所确定的)时，STRO-l亮细胞相比非亮纟田月包(STRO-l,im)产生较强的荧光信号。优选地，"亮，，细胞构成起始样品中包含的最亮标记的骨髓单核细胞的至少约0.1%。在其它具体实施方式中，"亮"细胞构成起始样品中包含的最亮标记的骨髓单核细月包的至少约0.1%、至少约0.5%、至少约1%、至少约1.5%或至少约2%。因此，本发明提供了富集细胞群体，其中总细胞群体的至少10%是具有STRO-lb",ALF表型的多能扩增间充质前体细胞子代(MEMPs)。22在本发明的一个优选具体实施方式中，总富集细胞群体的至少15%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或95%为具有STRO-lbri,ALF表型的MEMPs。在另一个优选的具体实施方式中，所述富集细胞群体与具有STRO-lbri，ALP一表型的MEMPs同源(homogenous)。在进一步优选的具体实施方式中，所述MEMPs对标记物Ki67、CD44和/或CD49c/CD29、VLA-3、a3卩l中的一种或多种为阳性。在更进一步优选的具体实施方式中，所述MEMPs不表现TERT活性，并且(或者)对标记物CD18为阴性。在进一步优选的具体实施方式中，根据本发明的富集群体进一步包4舌组织特异性定型细月包(TSCCs)。TSCCs一皮i人为定型于特定细力包或组织种系，特4正在于其为Stro-l,细胞。"定型"指该细胞定型于特定细胞或组织类型，但不一定为终末分化的。来源于在例如FCS存在的情况下扩增的MPCs的细胞群体将包括定型于不同种系的TSCCs。因此，一部分TSCCs将定型于比方说骨，另一部分TSCCs则将定型于脂肪细胞(adipocyte)分化，而且还存在多种不同细胞或组织种系的代表性TSCCs。TSCCs倾向定型于一种细胞或组织种系类型，然而其可以为双潜能的，即能够进一步分化成两种不同细月包或组织类型中的一种。TSCCs可以被定型至其的种系的非限制性实例包括骨前体细胞；肝祖细胞，其对于胆管上皮细胞和肝细胞是多能的；神经元限制性细胞，其可产生发展为少突胶质细胞和星形胶质细胞的胶质细胞前体；神经元前体，其发展为神经元；用于心月几和心月几细月包的前体、分泌葡萄糖感应胰岛素的胰腺p细胞系。其它TSCCs包括^f旦不限于软骨细胞、成牙本质细胞、产生牙本质和專欠骨细胞以及下列细胞的前体细胞视网膜色素上皮细胞，成纤维细胞、皮肤细胞如角化细胞，树突细胞，毛嚢细胞，肾管上皮细胞，平滑肌和骨骼"几细胞，睾丸祖细胞，脉管内皮细胞，腱、韧带、软骨、月旨肪细胞，成纤维细胞，骨髓基质、心肌、平滑肌、骨骼肌、周细胞、脉管、上皮、神经力交质、神经元、星形月交质细月包和少突月交质细月包。TSCCs还包括那些特异性产生结締组织(包括脂肪、蜂窝、骨质、软骨、弹力和纤维结締组织)的前体细胞。在本发明的一个具体实施方式中，所述富集细胞群体包括主要为一种纟且织类型的TSCCs。"主要为一种组织类型"指群体内所有TSCCs的至少20%、较优选至少30%、较优选至少40%、较优选至少50%、较优选至少60%、较优选至少70%、4交优选至少80%以及4交优选至少90%为同一种纟且织类型。富集群体内的MEMPs和TSCCs可以来源于同一个体。可替代地，MPC子代和TSCCs可以来源于不同个体(换句话说，MPC子代和TSCCs是同种异体的)。本发明还提供了包括培养的和/或扩增的细胞群体的组合物，其中所述总细月包群体的至少1%为具有Stro-lbri、ALP—表型的MEMPs,且其中组合物进一步包括主要为一种组织类型的TSCCs。在一个优选的具体实施方式中，该总细胞群体的至少5%、较优选至少10%、较优选至少20%为具有STRO-lbH、ALP—表型的间充质前体细力包(MPC)子讦戈。在进一步优选的具体实施方式中，TSCCs定型于组织种系或细胞类型，其选自由骨、神经组织、脂肪、软骨、骨骼肌、心肌、上皮组织、成骨细力包、腱、韧带、成牙本质细月包、周细力包、平滑月几、神经月交质组织、月永管组织、内皮组织、造血组织、肝组织以及肾组织纟且成的纟且。在更进一步优选的具体实施方式中，所述TSCCs是造血细胞。本申i青的发明人的另一个发现是MPC子4气的存在对于通过TSCC的增殖以及组织形成具有刺激效应。这一点在体外和体内均已发现。因此本发明构思了一种通过与MPC子代共培养或通过与MPC子代的培养上清液、细胞裂解物或培养片段接触来刺激TSCCs增殖的方法。本申请的发明人已经证实，在体外，当测定为STRO-lbri细胞的MPCs比例保持在5%或更高水平时，可促进STRO-ldim细胞的增殖。刺激的程度可被渐进性的增强到这样的水平，其中Stro-lbri细胞达到约20%。我们设想在不同于迄今为止进行的培养条件下进行较长时期的研究，可能会表明较高浓度具有更强的有利效应，或者较低水平也可能有益。因此提出存在1，2,3或4。/o的MPCs也可能有利。本发明还提供了通过将TSCCs与具有Stro-lbri、ALP—表型的MEMPs共培养或通过将TSCCs与从具有Stro-lbl"i、ALP—表型的MEMPs获得的培养上清液、细月包裂解物或片,殳4妄触来刺激TSCCs增殖的方法。在本方法的一个优选具体实施方式中，MPC子代与TSCC—起存在于共培养条件下，其水平大于1%,4交优选大于5%,一交伊0选大于10%，较优选大于20%,较优选大于30%，较优选大于40%,寿交优选大于50%，4交优选大于60%、70%、80%或90%。本发明的该方法同样适用于那些通常不存在MPC子4戈的TSCC群体。因此MPC子代可以加入TSCC群体中，并在合适的培养条件下保持预定的时间。预期细胞数量可利用不时加入更多MPC子代而维持在一个有效的水平，可能通过在分批培养中更换培养基或可替代地，在分批或连续培养系统中每天或每几天更换培养基而实现，或者如果最初存在足够数量，则细胞凄t量可自我维持一代、两代、三代或更多代。在一个具体实施方式中，TSCCs是来源于纯化的MPCs群体的STRO-ldim细胞，可能根据STRO-lbri选择或上面提到的其他选择而力口以分选。我们I是出通过MPC子代刺激TSCCs不^f又适用于间充质细胞而且适用于其他细胞类型。迄今为止4是供的关于RNA和细胞表面标记物表达的凄t据表明STRO-l^群体中呈现的TSCCs包括外胚层、内胚层和中胚层细胞或组织。由MPC子代刺激的细胞类型不一定来自于MPC，还可以来自于其4也来源。一个具体实施方式中，这种造血细月包是CD34+细胞。一般预期本发明不仅适用于细胞的体外培养，即与体外扩增的培养物相关，然而，当TSCCs位于机体组织部位的原位且含有MPC子代的群体递送至该部位时，本发明也具有适用性。因此，在本发明该方法的一个具体实施方式中，TSCCs在体夕卜培养。26在本发明该方法的另一个具体实施方式中，TSCCs^f立于患者体内的组织部位，MPC子代、MPC子代的培养上清液、细胞裂解物或片革殳递送至该《且织部位。在本发明该方法的另一个具体实施方式中，TSCCs和MPC子代均是外源性的，二者均3皮递送至该组织部位。一次这样的递送可能是足够的，然而短暂而间隔的递送^是供的益处可能会加速或更大。在另一个具体实施方式中，该方法涉及到4吏所述i咅养的群体处于可4吏MPC或TSCC的分化偏向于特定组织类型的条^牛下。在本发明该方法的另一个具体实施方式中，所述TSCCs定型于组织类型，所述组织类型选自由骨、神经组织、脂肪、软骨、骨骼月几、心"几、上皮组织、成骨细力包、腱、韧带成牙本质细力包、周细胞、平滑月几、神经月交质组织、脉管组织、内皮组织、造血组织、肝组织和肾组织组成的组。本发明该方法的另一个具体实施方式中，所述TSCCs是造血细胞。在另一个具体实施方式中，该方法进一步包括^吏受刺激的TSCC群体处于可使TSCC的分化偏向于特定组织类型的条件下。设想在恰当的培养条件下，可以根据该方法产生的细胞类型的范围包括但不限于以下细胞软骨组织细胞、软骨细胞、透明软骨细胞、纤维软骨细胞、弹性软骨细胞、韧带组织细胞、成纤维细胞、软骨祖细胞、透明软骨祖细胞、纤维软骨祖细胞、弹性專欠骨祖细胞、成纤维^L细月包、神经组织细月包、4中经元、神经月交质细月包、神经元的祖细胞、神经胶质细胞的祖细胞、月旨肪细胞、月旨肪组织细胞、月旨细胞、褐色脂细胞、白色脂细胞、白色脂细胞的祖细胞、褐色脂细胞的3且细力包、成骨细力包、成骨细力包的^且细胞、成牙本质细力包、成牙本质软骨细胞、骨细胞、骨细胞的祖细胞、骨衬细胞、骨衬细胞的相—细胞、脉管细胞、脉管细胞的祖细胞、腱细胞、骨髓基质细胞、石皮骨-和造血支持基质细胞、心肌细胞、心肌细胞的祖细胞、平滑力几细胞、骨骼月几细胞、周细胞、内皮细胞、内皮细胞的祖细月包、上皮细胞、上皮细胞的祖细胞、星形胶质细胞或者少突胶质细月包。本申请的发明人还设计了用于增加MEMPs生成的培养条件。以前的培养条件不适于MEMPs的优先扩增。事实上，在以前的结-养条件下，由于分化成Stro-ldimTSCCs，MEMPs的比例通常随时间而降^f氐。因此，本发明还提供了富集具有STRO-lbd、ALP—表型的MEMPs的方法，所述方法包括在一种或多种刺激因子存在的情况下培养或扩增MPC或其子代，所述刺激因子选自由loc,25-二羟基维生素D3(1,25D)、血小板源性生长因子(PDGF)、肿瘤坏死因子oc(TNF-a)、白介素-1P(IL-1P)和基质彩亍生因子1a(SDF-la)组成的组。在该方法的一个具体实施方式中，所述一种或多种刺激因子包括PDGF和/或IL-1P。在本发明该方法的另一个具体实施方式中，所述MPC或其子代在两种或多种刺激因子存在的情况下进行培养。增殖的刺激可能适用于收集的未扩增的基本上纯化的MPC群包4舌其戶斤存在的群体总细月包的至少约20，30，40,50,60,70,80或95%。刺激增殖的效应可能是限制体外培养时MPCs分化的程度。在本发明该方法的另一个具体实施方式中，所述MPC或其子代在培养或扩增前已经在体外进行了扩增。在本发明该方法的另一个具体实施方式中，相对于未受刺;敫的对照，刺激得到多于10%的具有STRO-lbri,ALF表型的MPC子代的增力口，4尤选多于20%，4尤选多于40%,<尤选多于50%。在本发明该方法的另一个具体实施方式中，用于培养或扩增的MPC来源于4壬<可一种或多种组织，所述组织《且成包4舌骨髓、牙f逸细^^、脂肪组织和皮^^的组，或者可以更广泛的来源于脂肪组织、牙齿、牙髓、皮月夫、肝、肾、心、一见网膜、脑、毛嚢、肠、肺、脾、淋巴结、胸腺、胰腺、骨、韧带、骨髓、腱和骨骼肌。在本发明该方法的另一个具体实施方式中，所述MPC或其子代在一种或多种刺激因子存在的情况下进行体内培养或扩增。从上述内容应该理解，本发明适用于MPC体外增殖，然而，其可能同样适用于体内原位增殖。因此，所述MPC刺激因子可以直接给予例如需要刺激固有MPC增殖的损伤处，因此，所述MPC刺激因子可以单独给予，或者可替代的与包括MPC的群体一起给予。后者可—见为优选，因为组织中MPC的凄t量通常非常4氐，而另外认为通过存在專交大量MPC可能会促进对恰当间充质组织生成的有益效应。在另一个具体实施方式中，该方法进一步包括j合予外源性TSCCs。本发明还纟是供了一种产生组织特异性定型细胞群体的方法，所述方法包括在一种或多种刺激因子存在的情况下培养包括MPC或其子4、和TSCC的细胞群体，所述刺激因子选自由la,25-二羟基维生素D3(1,25D)、血小板源性生长因子(PDGF)、胂瘤坏死因子a(TNF-a)、白介素—1|3(IL-1P)和基质书f生因子1a(SDF—1a)纟且成的纟且；以及使所述培养的群体处于使MPC或TSCC的分化偏向于特异性组织类型的条件。在本发明该方法的一个具体实施方式中，所述组织类型选自由心月几细月包、月永管组织、骨组织、神经组织、平滑月几和内皮组织《且成的组。还应该理解本发明还涵盖包括MPC子代和刺激因子的组合物。这种组合物可能是治疗上有益的，因此将被制备成药用形式。所述组合物可以包4舌富集的或纯〗匕的MPC子^f戈群体以及一种或多种刺激因子。所述组合物中存在的刺激因子的水平可经-睑性确定，但大多凝:情况下，其可能为纳克(或几十纳克)/毫升的数量级。体内递送时，可能希望同时在所述组合物中递送TSCCs。例如，在骨或其局部、心力几或其局部、"永管组织或其局部或者包括一种或多种内皮细胞的局部损伤时，递送的TSCC优选至少部分定型于相关细月包类型(例如成骨纟田月包、心月几细胞或内皮细月包)。这些可以4乍为混合TSCC培养物的部分或以更加纯化的形式提供，例如，对已知存在于组织特异性定型细力包类型上的标记物进行分选。可^,^的或另外的，被递送的组合物可能包括一种或多种分化刺激因子以使存在于组合物中或存在于靶部位的MPCs分化成一种或多种感兴趣的纟且织类型。因此，本发明还提供一种包括MPC或其子代和刺激因子的组合物，所述刺激因子选自由1ot，25-二羟基维生素D3(1，25D)、血小板源性生长因子(PDGF)、肿瘤坏死因子oc(TNF-a)、白介素—1(3(IL-1(3)和基质彩亍生因子1a(SDF—la)纟且成的纟且。在一个具体实施方式中，所述组合物进一步包括TSCC。在另一个具体实施方式中，所述组合物进一步包括4吏TSCC或MPC或两者的分化偏向于一种特异性组织类型的因子。优选的，所述纟且织类型选自由心月几、力永管^L织、骨组织、^申经组织、平滑月几一口内皮组织组成的组。<吏TSCC或MPC的分化偏向于特异性组织类型的因子在本文提供的实施例中有阐述。使MPC或骨前体细胞或骨的分化发生偏向的条件可能涉及到例如在补充了10%FCS、100pML-抗坏血S吏盐(ascorbate)-2-磷酸盐(phosphate)、地塞米松10-7M和3mM无机磷酸盐的aMEM中培养。这些条件已证实可诱导人BM基质细月包在体外发育成一种矿化的骨基质(Gronthos"a/.,S/ood54:4164-73,1994)。用于使TSCCs分化成成骨细胞的条件可能涉及到在I型力交原、纤维蛋白原、纤维蛋白、聚乙醇酸、聚乳酸、骨钙蛋白或骨粘连蛋白存在的情况下培养所述TSCCs。在一个具体实施例中，TSCCs在I型胶原、纤维蛋白原以及纤维蛋白存在的情况下进行培养。在一个可替代性实施例中，TSCCs在I型胶原、纤维蛋白原、纤维蛋白、骨钙蛋白以及骨粘连蛋白存在的情况下进行培养。在该方法的范围中，I型胶原、纤维蛋白原、纤维蛋白、聚乙醇酸、聚乳酸、骨4丐蛋白或骨粘连蛋白可以单独使用或在生长因子存在的情况下使用。应当理解，本段以上列出的化合物的任意组合也属于本发明的构思范围。本发明还提供了一种生成或修复患者组织的方法，该方法包括「给予患者本发明的富集群体。本发明还4是供了一种生成或修复患者组织的方法，该方法包招:给予患者本发明的组合物。在这些方法的4尤选具体实施方式中，所述ia织选自由心月几、骨、月永管纟且织、3中经纟且织和内皮纟且织纟且成的组。本发明还提供了确定化合物能否刺激MPC细胞增殖以生成MEMPs的方法，包括以下步骤使含有MPCs的群体4妻触一种或多种候选MPC刺激性化合物达规定的时间用于所述群体的繁殖，以及确定MEMP数量的增加并与对照比较结果。上述方法可使得生成或修复骨骼肌、心肌、骨、牙齿或脉管组织。更广泛的，该方法可^f吏4f生成或〗奮复以下细胞或组织，其选自由心月几、心月几细月包、库欠骨细l包、成骨细胞、石皮骨细月包、成牙本质细胞、牙本质生成软骨细胞、骨细胞、骨衬细月包、骨駱肌细胞、脉管内皮细胞、骨髓基质、破骨细胞和造血细胞支持基质、心肌、骨骼月几、内皮细月包禾口月永管细月包纟且成的纟且。本发明还提供一种具有STRO-lbri、ALp-表型的独立的遗传修饰的间充质前体细月包(MPC)子代。在一个优选的具体实施方式中，所述MPC子4<经过遗传4务饰以表达异种蛋白。该异种蛋白可以为4壬4可感兴趣蛋白。例如，该异源性蛋白可以为促进MEMPs生成的刺激性因子，如la，25-二羟基维生素D3(1,25D)、血小板源性生长因子(PDGF)、肿瘤坏死因子oc(TNF-ot)、白介素-1P(IL-1(3)和基质衍生因子1a(SDF一1oc)。在另一个实施例中，该异种蛋白是可加速MPC或TSCC分化成特异性组织类型的生物活性因子。该生物活性因子可以是例如合成的糖皮质激素如地塞米+>,或骨形态发生蛋白如BMP-2、BMP-3、BMP-4、BMP-6或BMP-7。在整个说明书中，词语"包括"或变形如"包含"或"含有"应当理解为表示包括所述元件、整体或步骤，或元件、整体或步骤的组，<旦不排除<壬何其它元件、整体或步骤，或元件、整体或步骤的组。显而易见的，本发明一个方面优选的的特征和特点适用于本发明的i午多其^f也方面。遗传修饰细胞的制备在本发明的一种具体实施方式中，本发明提供了一种具有STRO-lb"、ALP—表型的分离的遗传修饰的间充质前体细胞(MPC)子代。优选的，所述MEMPs经过遗传修饰以产生异种蛋白。典型的，所述细胞经过遗传l奮饰4吏得异种蛋白/人该细胞分泌。遗传-修饰的细胞可在至少一种其量足以支持该经^f务饰细力包生长的细胞因子存在的情况下进行培养。这样获得的遗传修饰细胞可以立即被利用(例如，在移植物中)、培养和体外扩增或保存以备用。该^奮饰的细力包可以通过本领域熟知的方法例如在液氮中冷冻而保存。如本文所〗吏用的，遗传-修饰涵盖任何遗传^修饰方法，其涉及^1寻夕卜源性或夕卜来多核芬酸引入MEMP或MEMP前体(例如MPC)中或在MEMP或MEMP前体内对内源性基因的》务饰。遗传修饰包4"舌^f旦不限于转导(病毒介导的宿主DNA从宿主或供体到受体的转移，体外或体内)、转染(用分离的病毒基因组DNA转化细胞)、月旨质33体介导的转移、电穿孔、,岸酸钙转染或共沉淀及其他。4争导的方法包4舌将细月包与生产细月包(producercell)直4妻共i咅养(Bregnietal.,Blood80:1418-1422，1992),或在有或没有合适生长因子牙口聚阳离子的情况下单独利用病毒上清液进4亍培养(Xuetal.，Exp.Hemat.22:223-230，1994)。优选将编码异源性多肽的多核苷酸在载体内？1入宿主细月包。该载体优选包括插入的编码序列转录和翻i奪所必需的元件。用来构建这种载体的方法在本领域是熟知的。例如，用于构建合适表达载体的4支术在Sambrooketal.,MolecularCloning:ALaboratoryManual,ColdSpringHarborPress,N.Y.(3rdEd"2000);和A謂beletal"CurrentProtocolsinMolecularBiology,JohnWiley&Sons,Inc.,NewYork(1999)中有详细描述。载体可以包括^旦不限于病毒载体如逆转录病毒、A，病毒、^!^相关病毒和单纯疱渗病毒、粘粒、质粒载体、合成型载体以及通常用于本领域中的其它重组载体。含有启动子和克隆位点(多核苷酸可操作地连接入其中)的载体在本领域中是熟知的。这样的载体能够在体外或体内转录RNA，并且可/人诸如Stratagene(LaJolla，Calif.)和PromegaBiotech(Madison,Wis.)等来源购得。具体实例包4舌来自Stratagene的pSG、pSV2CAT、pXtl以及来自Pharmacia的pMSG、pSVL、pBPV和pSVK3。优选的载体包括逆转录病毒载体(参见Coffinetal.，"Retroviruses",Chapter9pp;437-473，ColdSpringsHarborLaboratoryPress,1997)。本发明中有用的载体可通过本领域熟知的工艺经重组制备。例如，W094/29438、W097/21824和W097/21825阐述了逆转录病毒包装质粒和包装细胞系的构建。示例性载体包括pCMV哺乳动物表达载体，例3口pCMV6b和pCMV6c(ChironCorp.)、pSFFV-Neo和pBluescript-Sk+。有用的逆转录病毒载体的非限制性实例是那些来源于鼠类、鸟类或灵长类逆转录病毒的载体。通用的逆转录病毒载体包4舌那些基于莫洛尼氏鼠白血病毒(MoMLV-载体)的载体。其它源于MoMLV的载体包4舌Lmily、LINGFER、MINGFR和MINT(Changetal.,Blood92:1-11，1998)。另外的载体包括那些基于长臂猿白血病毒(GALV)和莫洛尼氏鼠肉瘤病毒(MOMSV)以及脾病灶形成病毒(SFFV)的载体。来源于鼠干细月包病毒(MESV)的载体包4舌MESV-MiLy(Agarwaletal.，J.ofVirology,72:3720-3728,1998)。逆转录病毒载体还包括基于'隄病毒的载体，非限制性实例包括基于人免疫缺陷病毒(HIV-1和HIV-2)的载体。制备逆專t录病毒载体构建体时，病毒gag、pol和env序列可乂人该病毒去除，形成用于外来DNA序列插入的空间。由外来DNA编码的基因通常在长末端重复序列(LTR)中的强病毒启动子控制下表达。合适的控制调节序列的选择取决于所使用的宿主细胞，且选择属于本领域技术人员的能力范围。除LTR的启动子外，还有多种启动子为人所知。非限制性实例包括噬菌体XPL启动子、人巨细月包病毒(CMV)立即早期启动子、莫洛尼氏鼠肉瘤病毒(MMSV)、劳氏肉瘤病毒(RousSacromaVirus,RSV)或脾病》土形成病毒(SFFV)的U3区启s力子、GranzymeA启动子以及GranzymeB启动子。另外，可使用可诱导或多重控制元件。选才奪合适的启动子对于本领域技术人员是显而易见的。^口果gag、pol禾口env功肯fe由包装(packing)纟田月包系反式4是供，则这样的构建体可被有效地包装到病毒粒子中。因此，当该载体构建体一皮引入所述包装细月包中时，由该细月包产生的gag-pol和env蛋白与载体RNA—起组装以产生感染性病毒颗并立(viron)，其分泌到培养基中。这样产生的病毒可感染并整合入靶细胞的DNA，<旦不产生感染性病毒粒子因为其缺少基本的包装序列。目前使用的大多凄t包装细胞系已用单独的质粒(每种质粒含有必需的编码序列中的一个)进行转染，因此在可复制病毒产生之前多重重组事件是必需的。可替代地，该包装细胞系带有前病毒。该前病毒已^皮破坏，因此尽管其可以产生组装感染性病毒所必需的全部蛋白质，但是其自身RNA不能包装入病毒，而是包装由重组病毒产生的RNA。因此，从该包装细胞释放的病毒原种仅含有重组病毒。逆转录病毒包装林系的非限制性实例包括PA12、PA317、PE501、PG13、PSI.CRIP、RDI14、GP7C-tTA-GIO、ProPak-A(PPA-6)以及PT67。参见Milleretal"Mol.CellBiol.6:2895,1986;Milleretal.，Biotechniques7:980，1989;Da画etal"Proc.Natl.Acad.Sci.USA85:6460，1988;Pearetal"Proc.Natl.Acad.Sci.USA90:8392-8396，1993;andFineretal"Blood83:43-50,1994。其它合适的载体包括腺病毒载体(参见Freyetal.,Blood91:2781，1998;和WO95/27071)以及腺相关病毒载体。这些载体在本^贞i或中啫卩是熟杀口的，长口Chatterjeeetal"CurrentTopicsinMicrobiol.AndImmunol"218:61-73，1996;StemcellBiologyandGeneTherapy,eds.Quesenberryetal"JohnWiley&Sons,1998;andU.S.Pat.Nos.5,693,531and5,691,176中所描述的。腺病毒衍生载体的应用在某些情形下可能是有利的，因其不能够感染非分裂细胞。与逆转录病毒DNA不同，腺病毒DNA不整合入靶细胞的基因组中。而且，腺病毒载体携带外来DNA的能力比逆转录病毒载体大很多。腺相关病毒载体是另一种有用的递送系统。这种病毒的DNA可以;故整合入非分裂细胞中，利用腺相关病毒载体已将多种多核苷酸成功引入不同细月包类型中。在一些具体实施方式中，该构建体或载体包括两种或更多种异源性多核香酸序列。优选地，所述其它核酸序列是编码选择性标记物、结构基因、治疗性基因或其它细胞因子/趋化因子基因的多核苷酸。一种选4奪性标记物可以包含于构建体或载体中，用于监测遗传修饰的成功以及用于选择DNA已整合入其中的细胞。非限制性实例包4舌耐药性标记物，如G148或潮霉素。另外也可采用阴性选4奪，例如，其中的标记物是HSV-tk基因。该基因使细胞对诸如阿昔洛韦(acyclovir)和更昔洛韦(gancyclovir)等药物壽丈感。通常使用NeoR(新霉素/G418抗性)基因，但任何便利的标记基因均可使用，只要其基因序列尚未存在于耙细胞中。进一步的非限制性实例包括低亲和力的神经生长因子(NGFR)、增强绿色荧光蛋白(EFGP)、二氲叶酸还原酶基因(DHFR)、细菌hisD基因、鼠CD24(HSA)、鼠CD8a(lyt)、赋予嘌呤霉素或腐草霉素抗性的细菌基因以及(3-半乳糖苷酶。其它多核苷酸序列可以在与编码异源性蛋白的多核苷酸相同的载体上^皮引入到宿主细胞中，或者所述其它多核苷酸序列可以在另一个载体上被引入宿主细胞。在一个优选的具体实施方式中，选择性标记物将被包含在与编码异源性蛋白多核苷酸相同的载体上。本发明还涵盖对内源性基因的启动子区进行遗传修饰，以使该内源性基因的表达上调，导致相比于野生型MEMPs，编码蛋白的产生增力p。刺激因子的纟合予本发明的方法可能涉及将一种或多种刺激因子给予患者，以原4立富集MEMPs。这些方法可能涉及部分、系统或局部如在4直入物或装置内部绐^予一种或多种刺激因子例如1ot,25-二羟基维生素D3(1,25D)、血小板源性生长因子(PDGF)、肿瘤坏死因子ot(TNF-a)、白介素-1P(IL-1P)和基质书亍生因子1a(SDF-1a)。在一个特定的具体实施方式中，本发明提供一种通过将刺激因子系统性给予所述患者，而在需要其的患者中富集MEMPs的方法。例如，该刺激因子可通过皮下或肌内注射而给予。本发明的这个具体实施方式可能对那些希望在特定组织中富集MEMPs的系统变性疾病的治疗4艮有用。可用这种方式治疗的系统变性疾病的实例包括骨质疏松症或骨折、软骨变性疾病、动脉粥才羊石更化、外周动力永疾病或心血管疾病等。因此，根据本发明，治疗或预防有效量的刺激因子可用于治疗的疾病或失调选自由自身免疫性疾病、急'hi'f曼'l"生炎症、癌症、心血管病、感染4生疾病以及炎症性疾病(包4舌风湿'1"生关节炎、1曼4生炎症性肠道疾病、'f曼性炎症性盆月空疾病、多发性硬yf匕症、哮喘、骨关节炎、动脉粥样硬化、银屑病、鼻炎、自身免疫性和器官移植排斥)组成的《且。在一个实施例中，这种组合物包4舌一种或多种治疗或预防有效量的刺激因子，足以用来辅助刺激组织特异性细胞的产生。"治疗有效量"是指在必要的剂量和时间期内可有效获得MEMPs富集的量。"预防有效量，，是指在必要的剂量和时间期内可有效获得希望的子贞防岁丈果如防止或抑制MPC或其书f生后^(戈死亡的量。在特定的具体实施方式中，刺激因子的优选范围可以是O.lnM-O.lM、0.1nM-0.05M、0.05nM-15fiM或O.OlnM画lOjLiM。应当注意，剂量值可以随着4寺緩解病症的严重程度而变化。对于任4可特定的患者，根据个体需要以及给予或监控该组合物给予的人员的专业判断，特定的剂量方案可随时间进^亍调整。本文4是出的剂量范围仅是示例性的，并不限制可由医疗人员选择的剂量范围。组合物中刺激因子的量可以根据诸如个体疾病状态、年龄、性别以及个体体重等因素而变化。可对剂量方案进行调整以提供最佳治疗应答。例如，可以主会予单一4,注，可以在一定时间内给予若干分次剂量，或者该剂量可以4艮据治疗情形紧急性的指示而成比例地减少或增加。将肠胃外组合物配制成剂量单位形式，可能对方便给予和统一剂量是有利的。如本文所使用的，"剂量单位形式"是指物理性分开的单位，适合作为用于待治疗患者的单一剂型；每一个单元含有经计算的预定量活性化合物，眹合必需的药用载体而产生希望的治疗作用。应当理解，刺激性因子可以以一种包含药用载体或贝武形剂的组合物形式给予。如本文所使用的，"药用载体"或"赋形剂"包括任何以及所有生理相容的溶剂、分散介质、涂层、抗细菌和抗真菌试剂、等渗和延緩吸收剂等。在一个具体实施方式中，该载体适合于肠胃外给予。可替代地，该载体可适合于静脉内、腹膜内、肌内、舌下或口服给予。药用载体包括无菌水性溶液或分散液以及用于无菌可注射溶液或分散液的临时制剂的无菌粉末。这些用于药学活性物质的介质和试剂应用在本领域是熟知的。除了任何与该活性化合物不相容的常头见介质或试剂的范围之外，均考虑其在本发明药物组合物中的应用。^卜充的活性4匕合物也可并入到该组合物中。用于肠胃外给药的药物制剂可以包4舌脂质体。脂质体和乳液是熟知的对于疏水性药物特别有用的递送工具或载体的实例。根据治疗试剂的生物学稳定性，可以采用其它用于稳定蛋白质的方案。此外，人们可以给予存在于靶向药物递送系统中的药物，例如，存在于涂覆靶特异性抗体的脂质体中。该脂质体会结合于靶蛋白并由表达把蛋白的细胞选择性吸收。39通常，在生产和贮存条件下治疗性组合物应该是无菌且稳、定的。该组合物可配制成溶液、樣支乳液、脂质体或其它适于高药物浓度的有序结构。该载体可以是含有例如水、乙醇、多元醇(例如，丙三醇、丙二醇和液态聚乙二醇等)及其合适的混合物的溶剂或分散介质。适当的流动性可通过例如利用涂层如卵磷脂、通过在分散的情况下保持所需颗粒大小以及通过利用表面活性剂来保持。在许多情况下，优选在该组合物中包括等渗剂，例如糖类、多醇(如甘露醇、山梨一唐醇)或氯Y匕钠。可注射组合物的延迟吸收可通过在该组合物中包含一种延緩吸收的试剂例如单硬脂酸盐和明胶而实现。此外，刺激因子可以在延时释放制剂中给予，例如在包括緩释聚合物的组合物中给予。该活性化合物可利用防止该化合物快速释放的载体如控释制剂一起制备，包括植入物和微嚢化递送系统。可以使用可生物降解的生物相容性聚合物，如乙烯基乙酸乙烯酯、聚酐、聚乙醇酸、胶原、聚原酸酯、聚乳酸和聚乳酸聚乙醇酸共聚物(PLG)。用于制备这些制剂的许多方法都被授予专利或通常对于本领域熟练才支术人员是已知的。另外，刺激因子的悬浮液可净皮制成适当的油状悬浮液用于注射。合适的亲脂性溶剂或载体包括脂肪油如芝麻油；或合成脂肪酸酯，如油酸乙酯或甘油三酸酯；或脂质体。用于注射的悬浮'液也可含有增加该悬浮液粘度的物质，如羧甲基纤维素钠、山梨糖醇或葡聚#唐。可选地，该悬浮液还可含有合适的稳定剂或增加该化合物〉容解性的试剂，以制备高度浓缩的-容液。无菌可注射溶液可通过在合适;容剂中以需要量的活性化合物才艮据需要与上述列举组分中的一种或其组合加以混合而制备，随后进行过滤消毒杀菌。通常，分散液通过将活性化合物并入含有一种基本分散介质以及所需的来自以上列举的其它组分的无菌载体中而制备。在用于无菌可注射溶液的无菌粉末的情况下，优选的制备方法是真空干燥和冷冻干燥，可从其之前已无菌过滤的溶液得到一种活性成分与任何其它希望组分的粉末。根据本发明的一个可替代方面，刺激因子可以与一种或多种增强其溶解性的其它化合物一起配制。如果该刺激性化合物需要通过吸入给予，则它们可以以压缩包装的气溶胶喷射规才各(spraypresentation)或雾化剂的形式，同时采用合适的推进剂(例如，二氯二氟甲烷、三绿氟甲烷，二氯四氟乙烷，二氧化碳或其它合适的气体)一起方便地加以递送。在一种压缩气;容力交的情况下，剂量单^f立可以通过一个阀递送可测定的量来确定。例如用于吸入器的胶嚢和明胶套可以配制成包含该化合物和一种合适粉末基质如淀粉或乳糖的粉末混合物。本发明的细胞组合物的给予包含MEMPs和/或TSCCs的本发明的细月包组合物可对多种类型的组织再生很有用，包括骨、软骨、腱、韧带、肌肉、皮肤和其它结締组织，以及神经、心脏、肝、月申、肾、胰腺、脑和其它器官组织。在一些具体实施方式中，本发明的组合物可以结合一种适当的基质(例如，用于支持MEMPs和/或其衍生后代并为骨、软骨、肌肉、神经、表皮和/或其它结締组织的生长提供表面)一起给予。该基质可以是传统基质生物材料的形式。该基质可以提供所述表达的蛋白和分化的细胞的緩释和/或其存在的适当环境。在一些具体实施方式中，预期多种胶原和非胶原被上调并从MEMPs分泌。这种现象通过增强基质沉积而加速组织再生。基质蛋白也可在遗传改造的细胞中表达且促进移植的细胞移入并附着于移植区。41基质材料的选择根据生物相容性、生物降解性、机械性能、创面外观和界面性质。该基于细胞的组合物的特定应用将确定适当的制剂。用于该组合物的可能基质可以是生物可降解的以及化学定义的石危酉臾4丐、石岸酉臾三4丐、步5石粦灰石、聚吝'L酸禾口聚肝(polyanhydride)。其它可能的材料是生物可降解的和生物学上良好定义的，如骨或真皮胶原。其它基质由纯蛋白或胞外基质组分构成。其它可能的基质是非生物降解的和化学定义的，如烧结的羟;粦灰石、生物^皮璃、铝酸盐或其它陶瓷材料。基质可以由上述类型的材料中任意的组合构成，如聚乳酸和羟-粦灰石或力交原与-粦酸三钙的组合。生物陶瓷在组成上可以一皮改变如在-岸酸铅钓中，也可经加工以改变孔径大小、颗粒大小、颗粒形状和生物降解性。本发明的细力包《且合物可以用来治疗由疾病或创伤或该组织发育不正常引起的需要软骨或骨组织修复或置换的患者，或用来提供一种整容功能，如增强身体的面部或其它特征。治疗可4吏得本发明的细胞的应用很必要，以产生新的软骨组织和骨组织。例如，包含未分化的或软骨形成分化诱导的前体细胞的组合物可用来治疗软骨病症，例如风湿性关节炎或骨关节炎，或对软骨的创伤性或手术性损伤。作为另一个实施例，包含骨前体细胞的组合物可用来治疗骨的病症，包括代谢和非代谢骨疾病。骨病症的实例包括半月板撕裂、脊柱融合、脊推盘摘除、脊柱重建、骨折、骨/脊柱变形、骨肉瘤、骨髓瘤、骨发育异常、脊柱侧凸、骨质疏;&症、牙周病、牙骨质丢失、骨软化症、软骨病、纤维性骨炎、肾性骨营养不良和骨佩吉特式病(Paget'sdiseaseofbone,变形性骨炎)。本发明的细力包组合物可单独纟会予或作为与其它细力包的混合物或多向性细胞或软骨细胞、成软骨细胞、骨细胞、成骨细胞、石皮骨细胞、骨衬细月包、干细胞或骨髓细胞。不同类型的细胞可在给予前立即或短期内与本发明的组合物进行混合，或在给予前它们可共培养一l殳时间。本发明的细胞组合物可与其它有益的药物或生物分子(生长因子、营养因子)一起给予。当MEMPs与其它试剂一起给予时，它们可以在单一药物组合物中一起乡会予，或在分开的药物组合物中同时或与其它试剂按顺序给予(在给予其它试剂之前或之后)。可以共同给予的生物活性因子包括抗凋亡试剂(例如，EPO，EPO才莫拟抗体(mimetibody),TPO，IGF-I和IGF-II,HGF,胱冬酶抑制剂(caspaseinhibitor))、抗炎剂(例如，p38MAPK抑制剂，TGF-(34中制剂，他汀类药物，IL-6和IL-1抑制齐'j,PEMIROLAST，TRANILAST，REMICADE,SIROLIMUS,和NSAID(非甾力矣^t炎剂物；例如TEPOXALIN,TOLMETIN,SUPROFEN))、免疫氺卩制/免疫调节剂(例如，钓调磷酸酶(calcineurin)抑制剂，如环孢素，他克莫司(tacrolimus);mTOR抑制剂(例如，SIROLIMUS，EVEROLIMUS);抗增殖剂(例如，咪唑巯噪呤，吗乙霉酚酸盐/酯)；皮质激素类(例如，氢化泼尼松(prednisolone),氢化可的松)；抗体如单克隆抗-IL-2Ra受体抗体(例如，巴利昔单抗、达克i朱单抗)、多克隆抗-T细胞抗体(例如，抗胸腺细月包J求蛋白(ATG)、抗淋巴细胞球蛋白(ALG)、单克隆抗-T细胞抗体OKT3))、抗-血才全形成剂(例如，肝》粦脂、肝磷脂衍生物、尿激酶、PPack(右力走苯丙氨酸脯氨酸精氨酸氯甲基酮)、抗凝血酶化合物、血小板受体拮抗剂、抗凝血酶抗体、抗血小板受体抗体、阿斯匹林、双嘧啶胺醇、鱼精蛋白，水蛭素，前列腺素抑制剂，和血小板抑制剂)和抗氧化剂(例如，丙丁酚，维生素A，抗坏血酸，生育酚，辅酶Q-10,谷光甘肽，L-半胱氨酸，N-乙酰基半胱氨酸)以及局部麻醉剂。作为另一个实施例，该细胞可以与瘢痕抑制因子(如在第5,827,735号美国专利中描述的，其内容结合于此作为参考)一起给予。在一个具体实施方式中，本发明的细胞组合物作为未分化的细胞给予，即，如在生长培养基中培养的细胞。可替代地，该细胞组合物可以在培养过程中暴露于刺激分化朝向希望表型例如成骨表型的条件之后纟合予。本发明的细月包组合物可以手术才直入、注射、递送(例如，通过导管或注射器)，或以其它方式直接或间接给予至需要》爹复或加强的部位。这些细胞可以借助基质(例如，一种三维支架)而给予。这些细胞可以与传统药用载体一起《合予。本发明的细胞或其组合物或组分(例如，ECM，细胞溶解产物，条件培养基)的纟会予途径包括肌内、眼用、肠胃夕卜(包括静脉内)、动脉内、皮下、口服以及鼻道给予。肠胃外给药的特定路径包括但不限于肌内、皮下、腹膜内、大月亩内、心室内、月亩心室内、胸内、脑池内，脊4主内禾口/或脊牙主周围的给药^各径。当这些细胞以半固态或固态装置进行给予时，手术才直入体内的精确位置通常是一种合适的给药方式。然而，液体或流体药物组合物可以给予至一个更广泛的位置(例如，整个广泛受影响的区域)，其/人该位置移动到一个特定位置，例如，通过对化学信号产生反应。其它具体实施方式涵盖了通过给予含细胞组分(例如，细胞溶解产物或其组分)或产物(例如，通过遗传修饰产生的胞外基质、营养和其它生物因子)的药物组合物的治疗方法。用于给予本文所述的细胞组合物的剂型和方案是才艮据良好的医疗实践而开发的，考虑了个体患者的情况，例如正治疗病症的性质和程度、年龄、性别、体重和整体医疗条件以及其它为医疗人员所知的因素。因此，待给予患者的药物组合物的有效量是通过本领i或已知的这些考虑来确定的。在本发明的一些具体实施方式中，在用本发明的细胞组合物开始治疗之前抑制一个患者的免疫反应可能是不必要的或不希望的。因此，利用同种异体或甚至异基因的MEMPs进行移植在某些情况下可耐受的。然而，在其它情况下，可能希望或需要在细胞治疗开始之前药理学地抑制患者的免疫反应。这可以通过系统或局部应用免疫抑制剂来实现，或者通过在嚢化装置中递送该细胞而实现。MEMPs可以被包被于胶嚢中，该胶嚢允许细胞和治疗因子所需的营养物质和氧气透过，而该细胞对免疫体液因子和这些细胞是不可透过的。优选地，该胶嚢密封材料是低变应原性的，易于稳定定位于靶组织中，并且对该植入的结构提供额外保护。这些以及其它用于减少和消除代方案，MEMPs可以经过遗传修饰以减少其免疫原性。移植的MEMPs在生存患者中的存活可通过利用各种扫描^支术来确定，例如计算才几化轴向断层^r查(CAT或CT)扫描、^兹共振成像(MRI)或正电子发射断层成像术(PET)扫描。移植物存活的确定也可通过死后取出靶组织，并通过肉眼或通过一个显樣"竟来一佥查而完成。可替代地，这些细胞可利用特异于特定种系细胞染剂来处理。移4直的细力包也可通过4是前并入示踪性染冲+如罗丹明或荧光素标记的微球体、快蓝(fastblue)、二苯甲酰胺、含铁孩i粒或遗传性引入报道子基因产物如(3-牛乳糖或(3-葡糖醛酸糖苷酶来而加以鉴定。移植的MEMPs功能性整合入患者可通过4佥查被损伤或不健全的功能的恢复而进行评估，例如关节或骨功能的恢复或功能的加强。本发明的细月包组合物可以包括一种或多种生物活性因子，例如但不限于生长因子、分化诱导因子、细胞存活因子如胱冬酶抑制剂、抗炎剂如p38激酶抑制剂或血管生成因子如VEGF或bFGF。生物活性因子的一些实例包4舌PDGF-bb、EGF、bFGF、IGF-1和LIF。可-齐^C地，4寺移才直的MEMPs可以经过遗传改造，以表达这些生长因子、抗氧化剂、抗凋亡剂、抗炎剂或血管生成因子。本发明的药物组合物可以包含MEMPs的同源或异源群体、月包外基质或其细胞溶解产物或其在药用载体中的条件培养基。用于本发明细胞的药用载体包括合适的有机或无机载体物质，其不会与本发明的细胞或其组合物或组分有害地反应。在它们是生物相容性的程度上，合适的药用载体包括水、盐溶液(如林才各氏溶液)、乙醇、油、明胶和碳水化合物如乳糖、直链淀粉或淀粉、脂肪酸酯、羟甲基纤维素和聚乙烯基吡咯烷。这样的制剂可被消毒杀菌，如果需要，其可与辅助试剂如润滑剂、防腐剂、稳、定剂、润湿剂、乳化剂、用于影响渗透压的盐、緩沖剂和着色剂混合。适合用于本发明中的药用载体在本领域是已知的，且在例如PharmaceuticalSciences(17.sup.thEd.,MackPub.Co.,Easton,Pa.)和WO96/05309中有描述，每一个的内容均结合于此作为参考。可将一种或多种其它组分添加到移植的细胞中，包括所选的胞外基质组分，如本领域已知的一种或多种类型的胶原、和/或生长因子、富血小板血浆以及药物。可替代地，本发明的细胞可经遗传改造以表达和产生生长因子。本文中提供了关于本发明细胞的遗传改造的详细内容。在一个非限制性具体实施方式中，制备包含本发明细胞的制剂，用于直4妄纟合予至需要新组织如骨组织产生的部位。例如，<旦不限制地，该MEMPs可^皮悬浮在一种用于注射的水凝胶溶液中。用于本发明的合适水凝胶的实例包括自组装肽如RAD16。可替代地，含有这些细月包的水凝月交)容液4直入前可允许固化，例如在一个才莫具中形成细胞分散于其中的一种基质。或者，一旦该基质已被固化，则该细胞制备物可以;故培养，以4吏这些细胞在植入前经有丝分裂而扩增。该水凝胶是一种有机聚合物(天然的或合成的)，其通过共价键、离子键或氢键交联产生三维开放的晶格结构，其捕获水分子而形成凝胶。可用来形成凝胶的材料的实例包括离子交联的多糖(如藻酸盐)及其盐、肽、聚磷嗓和聚丙烯酸酯，或者嵌段聚合物如聚环氧乙烷-聚丙二醇嵌段共聚物，其分别通过温度或pH进行交联。在一些具体实施方式中，MEMPs的支撑物是生物可降解的。在本发明的一些具体实施方式中，制剂包含一种可原位聚合的;疑月交，侈寸^口美国专矛J申^青7>开2002/0022676;Ansethetal.,J.ControlRelease,78(1-3):199-209(2002);Wangetal"Biomaterials，24(22):3969-80(2003)中所描述的。在一些具体实施方式中，该聚合物在含水溶液如水、緩沖盐;容液或水-乙醇溶液中至少部分可溶，所述溶液具有带电侧基或其单Y介离子盐。带有可与阳离子反应的酸性侧基的聚合物实例是聚(磷腈)、聚(丙烯酸)、聚(曱基丙烯酸)、丙烯酸和曱基丙烯酸的共聚物，聚(乙酸乙烯酯)和石黄酸化聚合物，如石黄酸化聚苯乙烯。也可以4吏用通过丙烯酸或甲基丙烯酸与乙烯基醚单体或聚合物反应形成的具有酸性侧基的共聚物。酸性基团的实例是羧酸基、磺酸基、卣化的(优选氟化的)醇基、酚OH基和酸性OH基。带有可与阴离子反应的碱性侧基的聚合物实例是聚(乙烯基胺)、聚(乙烯基吡啶)、聚(乙烯基咪唑)以及一些亚胺基耳又4义的聚石粦腈。该聚合物的铵盐或季盐也可由主链氮或侧《连亚氨基形成。碱性侧基的实例是氨基和亚氨基。室温下，藻酸盐可在水中与二价阳离子进行离子交联，形成一种水凝胶基质。由于这些温和的条件，藻酸盐已成为用于杂交瘤细胞嚢化最通用的聚合物，例如在Lim的第4,352,883号美国专利中描述的。在该Lim工艺中，包含待封装生物材料的含水溶液被悬浮于水溶性聚合物的溶液中，所述悬浮液形成^:滴，其通过"^妄触多^f介阳离子而被配制成分散的微胶嚢，然后该微胶嚢的表面用多氨基酸进行交联，而在嚢化的材料周围形成半透膜。聚磷腈是其主链由交替单键和双键分隔的氮和磷构成的聚合物。每一个磷原子共{介4建合至两条侧链。适合于交耳关的聚^粦腈其大部分的侧链基团是酸性的并且能够与二价或三价阳离子形成盐桥。优选的酸性侧基的实例是羧酸基和石黄酸基。水解稳定的聚石粦腈由具有羧酸侧基(其通过二<介或三<介阳离子如Ca"或A产进行交联)的单体形成。通过并入具有咪唑、氨基酸酯或丙三醇侧基的单体可合成通过水解作用而降解的聚合物。例如，一种聚阴离子的聚[双(苯氧基)]磷腈(PCPP)可以^皮合成，其可于室溫或低于室温下在含水介质中与溶解的多价阳离子进行交耳关，以形成水;疑月交基质。生物可降解的聚磷腈具有至少两种不同类型的侧链能够与多价阳离子形成盐桥的酸性侧基以及在体内条件下可水解的侧基，例如。米唑基、氨基酸酯、甘油和葡糖基。侧链的水解导致聚合物的腐蚀。水解性侧链的实例是未取4戈和耳又代的咪唑以及氨基酸酯，其中该基团通过一个氨基4建4建合于^粦原子(其中两个R基团以这种方式连接的磷腈聚合物被称为聚氨基磷腈)。对于聚咪唑磷腈，在聚磷腈主链上的"R"基团的一部分是咪唑环，通过一个环氮原子连接于主链中的磷。其它"R"基团可以是不参与水解的有才几残基，如曱基苯氧基基团或其它在AllcockW"/.,48Macromolecule10:824(1977)的牙牛学i仑文中示出的基团。该水凝月交才才料的合成方法以及用于制备这种水凝胶的方法在本领域中是已知的。制剂中也可包括其它组分，包括f旦不限于下列组分中的任何一种(1)用来提供适当pH和等渗压性的緩冲剂；(2)润滑剂；(3)用来在给予部^立或附近保持该细"包的粘性材津十，包括例如藻酸盐、琼脂和一直物l交；以及(4)可以在纟会予部位产生子贞期岁丈应的其它细胞类型，例如组织或其物化特性形成的增强或^f资饰，或者作为用于细胞生存的支撑物，或者抑制炎症或排斥。这些细胞可以用一种适当的创面覆盖物力口以覆盖以防止细胞离开该部位。这样的创面覆盖物对于本领域的熟练技术人员是已知的。骨组织补片的配制MEMPs在预成型孔中的培养或共培养4吏得能够制造预定厚度和体积的组织补片。所得组织补片的体积取决于孔的体积和该孔中MEMPs的ft量。最佳预定体积的组织可通过改变前述参数中的一个或两个而以常^见实验进行制备。孔的细胞接触表面可以涂覆一种阻碍MEMPs粘附至该细月包4妄触表面的分子。优选的涂覆剂包括硅基试剂，即二氯二曱基硅烷，或聚四氟乙烯基试剂，即TEFLON。用于将材料涂覆硅基试剂，特别是二氯二甲基硅烷的流程步骤在本领域是熟知的。参见，例如Sambrooketal.(1989)"MolecularCloningALaboratoryManual",ColdSpringHarborLaboratoryPress,其内容结合于此4乍为参考。应当理解，阻止细胞附着于孔表面的其它生物相容性试剂在本发明的实践中可能^^艮有用。可-齐代地，该孔可由一种柔韧性或可塑性生物相容材并牛(其本身不允许细胞附着)铸成。阻止这种细胞附着的优选材料包括但不限于琼脂糖、玻璃、未处理的细胞培养塑料和聚四氟乙烯(即TEFLON)。未处理的细力包培养塑^"，即还没有用具有静电荷的桐-泮+处理或由其制成的塑冲牛是商业上可获得的，并且可/人例如FalconLabware，Becton-Dickinson，LincolnPark,N丄购得。然而，前述材料不用于限制的目的。应当理解，本身可阻止MPC或其书t生后代附着的任何其它柔韧性或可塑性生物相容材料在本发明的实践中可能很有用。悬浮液中的MEMPs可以接种到预成型孔中并进行培养。MEMPs可以在该孔的培养基中^皮谦导分化成成软骨或成骨表型，或可能在接种到孔中之前已被诱导分化。可通过加入培养基而将细胞稀释到细胞密度为约lxl()S至lxl(f个细胞/毫升。这些细月包可以形成一种细月包的内聚塞(cohesiveplug)。所述细胞内聚塞可以A人该孔移出，经手术才直入组织缺损中。预期未分4匕的MPC或其书于生后^C可以原位分化，乂人而在体内形成组织。骨缺损可以通过利用计算4几辅助层析成4象(CAT扫描)、X射线才企查、石兹共纟展成4象(MRI)、滑液或血清标i己物的分析，或通过本领域已知的任何其它工艺步骤而进行推理鉴定。哺乳动物中的缺损在关节镜检查或开放性手术过程中也易于肉眼鉴定。该缺损的治疗可利用本文中4皮露的方法和组合物在关节镜a企查或开;at性手术过程中实现。因此，一旦该缺损被鉴定，则该缺损可通过以下步骤进行治疗(1)在预定部4立手术才直入利用本文所述方法学制备的组织补片，以及(2)允i午该組织补片整合入预定部位处。该组织补片具有的最适大小和形状可使得当该补片被植入所述缺损中时，植入的组织的边缘直接接触该缺损的边缘。另外，可在手术过程中将该组织补片固定于适当位置。这可以通过手术3寻该补片利用生物可降解的缝固定入所述缺损中和/或通过将生物粘合剂施加于该补片和缺损的分界区域而实现。在某些情况下，损伤的组织可以在该组织补片才直入前手术+刀除。利用支架移才直MEMPs本发明的细月包组合物或其共培养物可以-接种到一个三维支架上或其内部并才直入体内，其中4妾种的细胞将在该框架上增殖并与患者的细月包共同在体内形成置4奐组织，如骨组织。例如^f旦不限制i也，该支架可以一皮i殳计，以^吏该支架结构(1)在没有后续降解的情况下支撑-接种的细胞；(2)从接种直至该ia织移才直物由宿主组织重建的时间内支撑这些细月包；(2)允i午4姿种的细胞附着、增殖并在体外发育成具有足够机械整体性以支撑其自身的纟且织结构，jt匕时该支架净皮F争解。支架i殳计的综述由Hutmacher,J.Biomat.Sci.PolymerEdn.,12(1):107-124(2001)提供。本发明的支架可联合任意一种或多种生长因子、细胞(例如，干细力包，骨髓细力包，库欠骨细力包，成4欠骨细力包，骨细力包，成骨细胞，石皮骨细l包，骨4t细月包，或它们的前体)、药物或上述的刺激组织形成或其它方式增强或改进本发明实践的其它组分一起主合予。待4妄种于该支架上的MEMPs可进4亍遗4专改造以表达生长因子或药物。本发明的细胞可用来在体外产生新的组织，其随后可^皮才直入、移植或以其它方式插入患者需要组织修复、置换或加强的部位。在一个非限制性具体实施方式中，本发明的细胞用来在体外产生三维组织构建体，其随后植入体内。作为产生三维组织构建体的一个实例，参见第4,963,489号美国专利，其内容结合于此作为参考。例如，本发明的细胞可"接种"到一个三维框架或支架上，并在体外增殖或生长，以形成可才直入体内的活组织。本发明的细月包可在i咅养亚内自由生长至亚融合或融合，/人i咅养基转移接种于三维框架上。利用高浓度细胞(例如，约106至5乂107个细胞/毫升)接种该三维框架将实现在相对较短的时间周期内建立三维支撑物。可用于本发明的支架实例包括无纺垫、多孔泡沫或自组装肽。无纺垫可以是例如利用由合成的乙醇酸和乳酸的可吸收共聚物(PGA/PLA)构成的纤维形成，该共聚物以商标名VICRYL出售。由例如利用诸如冷冻干燥或冻干过程(如在美国专利第6,355,699中论述的)形成的聚U-己内酯)/聚(乙醇酸)(PCL/PGA)共聚物构成的泡沫也是可能的支架。也可以使用i^如自组装肽(例如，RAD16)的水凝力交。这些材冲牛经常用作用于组织生长的支撑物。三维框架可由陶乾材料制成，其包括但不限于磷酸一钙、磷酸二钓、碌酸三钙、磷酸a三钓、磷酸p三钙和磷酸四钙；羟石粦灰石；氟^粦灰石；碌u酸钙；氟4b钙；氧化钙；石友酸钙；^粦&复钙4美；生物学活性3皮璃如BIOGLASS(UniversityofFlorida,Gainesville,Fla.)及其混合物。目前在市场上存在多种合适的多孔生物相容性陶瓷材料，如SURGIBON(UnilabSurgibone,Inc.,Canada)、ENDOBON(MerckBiomaterialFrance,France)、CEROS(Mathys,A.G"Bettlach,Switzerland)和INTERPORE(Interpore,Irvine,Calif"UnitedStates),以及矿化月交原骨^家4妄产品，如HEALOS(Orquest,Inc"MountainView,Calif.)和VITOSS,RHAKOSS,以及CORTOSS(Orthovita,Malvern,Pa.)。该框架可以是天然和/或合成材料的混合物、掺合物或复合物。在一些具体实施方式中，该支架为笼子形式。在一个伊乙选具体实施方式中，该支架涂覆有月交原。才艮据一个优选的具体实施方式，该框架是毡制品，其可由多纤维丝(复丝)构成，而该多纤维丝由生物可吸收材料，例如PGA、PLA、PCL共聚物或掺合物或透明质酸制成。该纤维丝利用一示准的织物加工4支术(包括巻边、剪切、一危理和缝制)制成毡制品。在另一个优选的具体实施方式中，本发明的细胞^皮^妻种于可为复合结构的泡沫支架上。另外，该三维框架可以被^t制成有用的形状，如为耳朵外部、骨、关节或体内待修复、置换或加强的特定结构的形习犬。在另一个优选的具体实施方式中，这些细胞被接种到构成用于植入患者体内的假体装置的框架上，如描述于第6,200,606号美国专利中的，其内容并入本文作为参考。如其中所描述的，多种临床有用的々i体装置已纟皮开发用于骨和软骨嫁接手术。(参见例如，BoneGraftsandBoneSubstitutions.Ed.M.B.Habal&A.H.Reddi,W.B.SaundersCo.,1992)。例如，有效的膝关节和髋关节置换装置已被且将持续广泛用于临床环境中。许多这些装置是利用各种具有较<氐免疫原活性的无4几材并+制造的，其在体内安全地发一军作用。已经过试验证实的合成材料的实例包括钛合金、磷酸钙、陶瓷羟磷灰石以及各种不锈钢和钴-铬合金。这些材料提供结构支撑并且可形成宿主血管形成和细月包迁移可在其内部发生的支架。该才医架可以在4妾种本发明的细胞之前加以处理以〗更增强细月包附着。例如，在用本发明的细胞接种之前，尼龙基质可用0.1摩尔乙酸加以处理并在多聚赖氨酸、PBS和/或月交原中孵育以涂覆该尼龙基质。聚苯乙烯可利用^5克酸类似地加以处理。53另外，该三维才匡架的外部表面可加以^修饰以改善细月包的附着或生长以及组织分化，如通过等离子喷涂的框架或加入一种或多种蛋白质(例如，胶原，弹力纤维，网状纤维)、糖蛋白、糖胺聚糖(例如，》危酸肝素，4-碌^酸软骨素，6-;克酸软骨素，》危酸皮力夫素，石克酸角质素)、细胞基质和/或其它材料如但不限于明胶、藻酸盐、琼脂、琼脂糖和植物胶，等等。在一些具体实施方式中，该支架由可使其为非血栓形成性的材泮牛构成或用该材冲牛进4亍处理。这些处理和材并牛也可促进并维:持内皮生长、迁移和月包外基质沉积。这些材料和处理的实例包括-但不限于天然材料如基膜蛋白如层粘连蛋白和IV型胶原，合成材冲牛如ePTFE,以及分4爻的聚氨酯脲《圭酮如PURSPAN(ThePolymerTechnologyGroup,Inc.,Berkeley,Calif.)。这些才才泮+可进一步力口以处理以-使该支架为非血纟全形成性的，这些处理包括抗血^全形成剂如肝素，以及改变该材并牛表面电荷的处理如等离子喷涂。在一些具体实施方式中，支架的表面是粗糙的。例如，在本发明的某些方面，所-提供的支架带有一种凹槽和山脊紋型。该凹槽优选小于约500纟效米，4交优选小于约IOO樣吏米，并且最优选在约10纳米与10微米之间。这样的"微槽"允许细胞可以根据表面凹槽的引导进行排列和/或迁移。在一些具体实施方式中，在培养基中再造体内存在的细胞樣吏环境很重要，以使本发明的细胞在植入体内或在体外应用之前的生长程度可以变化。另外，可以在这些细胞接种之前、过程中或之后将生长因子、软骨形成分化诱导剂、成骨诱导剂以及血管形成因子加入培养基中，以引发利用MPC或其衍生后代或其共培养物的分4b禾口纟且织形成。该三维框架可以被修饰以使细胞的生长和其上的组织产生增强，或使得对植入物的排斥减弱。因此，可以将一种或多种生物学活性化合物(包括但不限于抗炎剂、免疫抑制剂或生长因子)添加到该^f匡架。月包外基质或细月包;容解产物的治疗应用作为本发明才直入这些细胞或其产生的活组织的可替4戈方案，需要组织修复、置换或加强的患者可获益于MEMPs的组分或产物的给予(尤其是在它们已经过遗传修饰的情况下)，如由这些细胞产生的胞外基质(ECM)或细胞溶解产物。在一些具体实施方式中，本发明的细胞已在体外培养后，例如通过利用本文描述的三维支架系统，使得希望量的ECM分泌到该框架上。一旦ECM分泌到该框架上，即可移出这些细^^。ECM可以进一步处理以备后用，例如作为一种可注射的制剂。在一些具体实施方式中，这些细胞被处死并且将细胞碎片(例如，细胞膜)从该框架移出。这个过程可以多种不同方式实施。例如，活组织可在没有低温保存剂(低温防腐剂)时在液氮中被闪冻，或者该组织可一皮浸入无菌蒸馏水中，以4吏这些细月包响应于渗透压而破裂。一旦这些细胞被处死，则细胞膜可被破坏并且通过用温和去垢剂漂洗(如EDTA、CHAPS或两性离子去垢剂)处理而移出细月包碎片。利用温和去垢剂漂洗的优点在于其溶解膜结合的蛋白(其经常是高度抗原性的)。可^l代地，该组织可纟皮酶促消化和/或用石先晬细月包力莫的试剂进4亍提取。这种酶的实例包括但不限于透明质酸酶、分散酶(中性蛋白酶)、蛋白酶、核酸酶(例如，脱氧核糖核酸酶和核糖核酸酶)。去垢剂的实例包括非离子去垢剂例如烷基芳基聚醚醇(TRITONX隱IOO),辛基苯氧基聚乙氧基-乙醇(RohmandHaasPhiladelphia,Pa.)，BRIJ-35,聚乙氧基乙醇月才圭酰醚(AtlasChemicalCo.,SanDiego,Calif.),聚山梨酸酯20(TWEEN20),聚乙氧基乙醇山梨聚糖单月桂酸酯(RohmandHaas),聚乙烯月桂酰醚(RohmandHaas);以及离子去垢剂例如十二烷基硫酸钠，硫酸化高级脂肪醇，在支化或未支化链中含有7至22个碳原子的磺酸化烷烃和磺酸化烷基芳烃。包含ECM的支架可以如上所述在治疗上使用。可替代地，ECM可乂人该支架收集。ECM的收集可以以多种方式来实玉见，取决于例如该支架为生物可降解的还是非生物可降解的。例如，如果该框架为非生物可降解的，则ECM可通过4吏该框架经受声波降解、高压水射流、机械刮耳又或者用去垢剂或酶的温和处理或上述处理的任意纟且合而禾多出。如果该框架是生物可降解的，则ECM可通过例如使该框架在'溶液中降解或、溶解而收集。可^,代地，如果该生物可降解4匡架由一种其自身可与ECM—起注射的材4+构成，则该才医架和ECM可全部加工用于随后的注射。可^,^地，ECM可通过用于/人非生物可降解才匡架4t集ECM的上述方法中的4壬4可一种/人该生物可降解才匡架移出。优选地，所有收集工艺加以设计，以便不会使由本发明的细胞所产生的ECM或细力包;容解产物变寸生。行详纟田描述。材料和方法,悉者，勿^^乂##和拔伴56按照由南澳大利亚皇家阿德莱德医院的伦理委员会(theethicscommitteeoftheRoyalAdelaideHospital,SouthAustralia)糸匕〉食的方法步骤，在知情同意后，骨髓(BM)吸出物获自正常成人志愿者(20-35岁)的后腺嵴。Bonemarrowmononuclearcells(BMMNC)wereobtainedbycentrifugationoverFicoll1.077g/ml(Lymphoprep,Nycomed，Oslo,Norway)at400gfor30minutes(min)andthenwashedandresuspendedwithHank'sbufferedsalinesolutioncontaining1%bovineserumalbuminand10mMHEPES，pH7.35(HBSS),。原代BMSSC培养物如前所述在补充了20%胎牛血清、2mML-谷氨酰胺和100pML-抗坏血酸-2J粦酸盐的a-MEM(最小必需i喬养基)中建立(GronthosJCellSci.116:1827-1835，2003)。如下所述，在血清充足的培养基中传代培养后，BMSSC克隆细胞系通过从第14天的集落(来源于STRO-lb"/VCAM-l+分选的细胞)的限制性稀释而形成，用于增殖、RT-PCR、免疫组织化学和发育研究。STRO-l4元体可乂人R&DSystems购4寻(Minneapolis，US)。其4也在本发明中很有用的抗体列于表1中。^"邀活的细y^为、逸("M^CS,可^口前戶斤述而实施(Gronthosa/"Isolation,PurificationandInVitroManipulationofHumanBoneMarrowStromalPrecursorCells.InMarrowStromalCellCulture.OwenM.andBeresfordJ.N.(eds).CambridgeUniversityPressUK，Chapter3，p.26-42,1998;GronthosandSimmons,Blood85(4):929-940，1995)。大约1x108BMMNC与终浓度10|ig/ml的STRO-l上清液在冰上共孵育60分钟。标记了STRO-l的细胞用HBSS洗涤，分别重悬于1ml含1/50稀释的生物素4匕的羊#元鼠IgM((i-链净争异；SouthernBiotechnologyAssociates,Birmingham,AL)或者生物素化的羊抗鼠IgG(y-链特异；SouthernBiotechnologyAssociates,Birmingham,AL)的HBSS，》Jc上45分4中。随后，细胞在MACS緩沖液中洗涤两次，重悬于其中加入lOOpl抗生蛋白链菌素孩丈珠(MiltenyiBiotec,BergischGladbach,RR.G.)的90(HilMACS緩冲液中。所述细胞在水上孵育15分钟后，将抗生蛋白链菌素-焚光素异硫氰酸酯(盐)(FITC)直接加入悬浮液，再放置5分钟。按照制造商的说明，细胞在MiniMACS石兹性柱(柱容量107个细月包，MiltenyiBiotec)上分离。炎^激活的细/《为\逸O^CS^将STRO-1+MACS分离的细胞用轭合抗生蛋白链菌素的FITC进4亍标记，然后在水上利用纯化的抗-CD106(VCAM-1)抗体6G10或4元-CD146(MUC-18)4元体或同型乂于照1B5(10|ag/ml)孵育30分钟，洗涤并在冰上用轭合藻红蛋白(PE)的羊抗-鼠IgG抗体(1/50;SouthernBiotechnologyAssociates,Birmingham,AL)再卵孚育20分4中。利用FACStarPLUS流式细月包4义(BectonDickinson,Sunnyvale,CA)来分选细胞。将STRO-lbCD106+或STRO-l"CD146+细胞在在补充了20%月台牛血清、L-谷氨酰胺2mM、抗坏血酸-2-石粦酸盐(lOO(aM)的a-MEM中进行培养，于含5。/。C02、37。C的湿润大气环境下启动原代培养。^/^间接龙瘦炎^进/力#悉和双芭流式细y^^炎为V^这个步艰《之前已纟至才艮道过(Gronthosda/"Isolation,PurificationandManipulationofHumanBoneMarrowStromalPrecursorCells.InMarrowStromalCellCulture.OwenM.andBeresfordJ.N.(eds).CambridgeUniversityPressUK,Chapter3，p.26-42，1998)。简而言之，MPC或MPC衍生细胞的初代培养物通过胰蛋白酶/EDTA消化而释放，然后在水上孵育30分钟。大约2x105细胞被洗涤并重悬于200jul第一抗体混合物中，冰上1小时。第一抗体混合物由饱和浓度的鼠IgM单克隆抗体STRO-l和/或抗人石咸性磷酸酶(ALP,B4-78)的鼠IgG单克隆抗体组成。对于利用与细胞内抗原反应的抗体进行的染色，细胞首先用PBS洗涤，然后用70%乙醇冰上处理10分钟以透化细胞，然后在染色前进行洗涤。鼠同型IgM和IgG阴性对照Mabs在相同条件下进4亍处理。用第一抗体孵育后，洗涤细胞并使其暴露于饱和水平的羊抗鼠IgMju-链特异-FITC(1/50稀释)以及羊抗鼠IgGy-链特异-PE(1/50稀释)或羊抗兔Ig画对争异-PE(1/50稀释)(SouthernBiotechnologyAssociates),纟冬体积、100jul。细胞在冰上孵育45分钟后洗涤两次，然后在FAXFIX(补充了1%(v/v)D-右旋糖、2%(w/v)0.01%叠氮化钠的PBS)中固定。随后细月包在Epics-XL-MCL流氏细胞4义上进4亍分析(BeckmanCoulter,Hialeah,FL)。凌差^^素乙^乙^磁磁凝亚應游("CF5^,4方记细胞通透性荧光素基染料CFSE用来研究在MPC衍生细胞发育过程中分裂相关的表型和功能变化。CFSE共价结合于细胞的胞质组分，得到均匀的明亮荧光，其随细胞分裂而均等分布于子细胞之间。利用流式细胞仪，该技术可实现达8个细胞分裂周期的分辨率。将体外扩增的MPC衍生细胞的单细胞悬浮液洗涤一次，再悬浮在1ml的PBS/0.1%BSA中，加入2|il的5mMCFSE(终浓度lO)LiM)，然后在37。C孵育10min。通过加入5体积的冰冷培养基a-MEM-l(H吏染色淬火，并在冰上孵育5min。将这些细月包在培养基中洗涤三次，然后以低密度lx105铺于培养瓶(T-25)中。在各个时间点，通过胰蛋白酶-EDTA解离细胞并利用流式细胞计数进行分析。59逆脊z秀躇果合錄濰餸^d^Or-尸CT》浙如上所述，原4气MPC书亍生培养物通过月夷蛋白酶/EDTA处理而释放，然后用STRO-l上清液染色。洗涤后，将细胞与轭合藻红蛋白的羊抗鼠IgM抗体(1/50;SouthernBiotechnologyAssociates,Birmingham,AL)—起在冰上再孵育20分钟。利用FACStarPLUS流式细月包4义(BectonDickinson,Sunnyvale,CA)分选细月包。才艮才居制造商的建议，从2xl06个STRO-l^或STRO-ldim分选的原代细胞、软骨细胞团以及其它诱导培养物制备细胞总RNA,并利用RNAzo旧4是耳又方法(BiotecxLab.Inc.,Houston,TX)4吏其-容解。/人每一个亚群分离的RNA随后用作cDNA合成的才莫一反，而cDNA利用First-strandcDNA合成"i式剂盒(PharmaciaBiotech,Uppsala,Sweden)制备。利用以前4葛述的一种才示准:^禾呈(Gronthosaa/,,J.BoneandMin.Res.14:48-57，1999)，通过PCR扩增评估各种转录体的表达。用于本研究中的引物对示于表2。扩增后，将每一个反应混合物通过1.5%琼脂糖凝胶电泳进行分析并通过溴化乙锭染色使其可视化。RNA完整性通过GAPDH的表达来评估。CFt7-尸的体,A为、化我们之前已才良道了用于诱导在补充了10%FCS、100jaML-抗坏血酸_2—石岸酸盐、地塞米+>1(T7M和3mM无才几石舞酸盐的a-MEM中培养的人BM基质细胞在体外形成矿化骨基质的条件(Gronthos"a/"Blood.84:4164-4173,1994)。矿物沉淀通过阳性雨Kossa染色进行鉴定。脂肪形成如前所述在0.5mM甲基异丁基曱基黄嘌呤、0.5(iM氢化可的+>和60Mm卩引哚美辛存在的情况下进行诸导(Gimble，J.M.Marrowstromaladipocytes.InAfarow5trow"/ce〃cw/fwre.OwenM.andBeresfordJ.N.(eds).Cambridge:CambridgeUniversityPressUK.Chapter5，p.67-87，1998)。油红O染色用来鉴定充满脂质的脂肪细力包。專欠骨形成分化如前所述在用10ng/mlTGF-p3处理的聚集i咅养物中加以-〖平估(PittengerW"/.,Science,284:143-147，1999)。景多^^沐力为V^将来源于代2-3的STRO-lbri/VCAM-l+细胞的粘附细胞胰蛋白酶化，与40mg羟石粦灰石/石粦酸三钙陶瓷颗冲立(ZimmerCorporation,Warsaw,IN)进4亍混合，然后如前所述植入两月龄SCID小鼠的背侧皮下间隙中(Gronthose"/.，ProceedingsoftheNationalAcademyofSciences(USA)，97(25):13625-13630，2000)。这些方法步驶《依才居一个批准的动物方案来实施(AdelaideUniversityAEC#M/079/94)。将植入物在6-8周后取回，在4%多聚曱醛中固定2天，随后在10%EDTA中再脱钓10天，然后包埋入石蜡。制备该才直入物的5(xm+刀片并用苏木4青^M尹纟工进4亍染色(GronthosWa/.,ProceedingsoftheNationalAcademyofSciences(USA),97(25):13625-13630,2000),用于组织学分析。^伊经ie织发f。将单层培养物在成神经细胞A培养基(Ivitrogen/GIBCO+5%马血清，1%胎牛血清，L-谷氨酰胺(2mM)，转铁蛋白(100吗/ml),胰岛素(2吗/ml)，维曱酸0.5mM，月亩衍生的神经营养因子(10ng/ml))中进行培养。y^y^发f"。将单层培养物在补充了10%胎牛血清、L-谷氨酰胺2mM、抗坏血酸-2-磷酸盐(100(iM)、0.5mM甲基异丁基黄嘌呤、0.5mM氢化可的木〉、60mM吲咮美辛的a-MEM(JRH)中进行培养。炎fH.将在聚丙烯管中的颗粒培养物在补充了1%牛血清白蛋白、转《失蛋白(100吗/ml)、胰岛素(2吗/ml)、L-谷氨酰胺(2mM)、抗坏血酸-2-磷酸盐(100(iM/ml)、地塞米松(10—8M)和BMP-7(50ng/ml)、TGFp3(10ng/ml)的a-MEM中进4亍;咅养。索搭^/心^^:f。将单层培养物在补充了10%胎牛血清、l-谷氨酰胺(2mM)、抗坏血酸-2-石岸酸盐(100(iM/ml)以及5-氮胞香(5pM/ml)的a-MEM(JRH)中进行培养。丄^:友f。将单层培养物在补充了牛垂体提耳又物(50昭/ml)、表皮生长因子(10ng/ml)、氢化可的松(0.5昭/ml)、胰岛素(5pg/ml)的角化细胞基本培养基中进行培养。威#细/《、處、^7夢咸成牙本l细^^发f"。将单层培养物在补充了10%胎牛血清、l-谷氨酰胺2mM、抗坏血酸-2J粦酸盐(lOOjuM)、；也塞米+>(1(T7M)和BMP-2(50ng/ml)的a画MEM(JRH)中进行培养。^勿y敏成乎^^A勿y^菱f"。将体外培养的MPC培养物以20,000个/孔在补充了10%胎牛血清、l-谷氨酰胺2mM、抗坏血酸-2J粦酸盐(lOOfiM)、血小板源性生长因子-BB(10ng/ml)(悬浮于48孑L板的2001的基质胶(matrigel)中)的a-MEM(JRH)中进行培养。实施例1:Stro-l咖培养细胞是较高定型的而Stro-l"细胞是较低定型的前体细胞。我们之前已报道了，多能间充质前体细胞(MPC)可根据STRO-lbri/VCAM-l(CD106)+或STRO-lbri/MUC-18(CD146)+表型乂人成人骨髓单核细胞純化(Gronthos"a/.J.CellSci116:1827-1835,2003;ShiandGronthosJBMR18(4):696-704,2003;PCTAU2004/000416)。在特定培养条件下MPC群体易于进4亍体外才广》曾(Gronthos"J.CellSci116:1827-1835，2003)。我々]i见在才艮据与不同细胞系相关的标记物，分别利用逆转录聚合物酶链反应(RT-PCR)和流式细胞计数分析在mRNA和蛋白质水平提供表征体外扩增的MPC后代的数据。同时，在体外扩增后，所有新鲜分离的骨髓MPC高水平表达STRO-l(Stro-lbri),而大多数细胞下调STRO-l表达(Stro-ldim)(Gronthos"a/.J.CellSci116:1827-1835,2003)。在首次系列实验中，采用半定量RT-PCR分冲斤来才全查各种由STRO-l抛或STRO-lb"群体表达的种系相关基因的基因表达谱，所述群体通过荧光激活细胞分选加以分离(图1A)。每个标记物的相对基因表达参照管家基因GAPDH的表达利用ImageQant软件进行评估(图1B、C)。另外，双色流式细胞计数分析连同STRO-l抗体用来检查体外扩增MPC的蛋白质表达谱，这基于其更宽范围的细胞系相关标记物的表达(图2)。基于STRO-l^和STRO-l^培养细胞的基因和蛋白质表达的通用表型概括展示于表3中。该数据表明，体外扩增的STRO-lb"MPC表现出与血管周细胞相关的标记物(包括血管生成素-1、VCAM-1、SDF-1、IL-1J3、TNFa和RANKL)的差异性较高表达。相反地，STRO-ldim体外扩增细胞表达较高水平的nestin、GFAP、osterix、骨4丐蛋白、SOX9、GATA-4、瘦素和平滑月几肌J求蛋白重链。因此，相比于STRO-l龜细胞，似乎体外扩增的STRO-lb"MPC表现为一种更不成熟和血管周样表型，而STRO-ldim细胞表现为一种较高定型的前体细胞型(包括成软骨细胞、成骨细胞、成脂肪细胞、表皮细胞、神经祖细胞和成心肌细胞)的表型特性。STRO-l^和STRO-lbri培养细胞的蛋白质和基因表达谱之间的比较总结在表3、4和5中。新鲜分离的MPCs和MPCs的STRO-l1^培养子代(MEMPs)之间标记物表达的比较示于表6中。实施例2:STRO-l涵和STRO-lbri培养细胞(MEMPs)在体外分化的差异能力接下来，我们考察了在STRO-ldim和STRO-lb"培养细胞的基因和蛋白质表达i普之间7见察到的差异是否反映其分化成多种细胞系的能力方面的任何功能性差异。体外扩增的STRO-lbrVCD146+衍生细胞的培养物如上所述基于其STRO-l抗原表达而通过FACS进4亍分离。随后FACS分离的STRO-l^和STRO-l^培养细胞置于用于脂肪(图3)、骨(图4)和软骨(图5)形成的诱导条件下。在所有情形下，相比于STRO-l翻培养细胞，STRO-lb"培养细胞在指定条件下，显示出较高的脂肪、骨和软骨形成的能力。来自这些实-验的数据证实了以上获得的基因和蛋白表达结果，表明STRO-l^培养细胞是一种含有高比例较低定型的前体细胞的原始群体，其可被影响以在适当培养条件下朝向任何特定细胞系分化(图3、4、5),并且可以称为MPC。相反，STRO-ldim培养细胞含有高比例的代表各种种系的定型细月包并且可以称为TSCC。我们4是出STRO"dim群体是异源性的，包含单独定型于一系列不同组织类型的细胞。实施例3:STRO-lbri细胞(MEMPs)可l多饰体外和体内纟且织特异性定型细胞(TSCC)的生长能力代表不同发育阶段的两种不同的体外扩增MPC衍生细胞群体的鉴定对于来源于STRO-lbH细力包的完全培养制备物应用于临床治疗具有重要启示。将最初研究设计为考察原始的较低定型的STRO-l^培养MPC对较成熟和定型STRO-ldim培养TSCC生长的影响。设计实验将FACS分离的STRO-l^培养TSCC(其之前已用一种焚光标签CFSE进行标记)与百分比不断增加的FACS分离的STRO-lb"培养MPC—起加入。图6示出了标记的STRO-ldin^i5胞的增殖受未标记的STRO-lbfi细胞存在的影响。当一个CFSE标记的细胞分裂时，两个子细月包含有亲细胞的一半荧光。因此，不同代的子细胞^皮表示为具有成比例不断降低的荧光强度的荧光分布，其中在直方图的最右方(垂线相交的)的曲线表示起始STRO-ldim群体的点(图6)。该数据表明，较高比例的STRO-ld""细胞被刺激以增加其增殖速率，其中可证实更多细胞在加入大于5%STRO-lb*"i细胞后经历至少3至4次分裂。因此，为了获得未分裂MPC衍生64细胞的可持续且有效的体外扩增，应遵循该培养物需要多于5%的STRO-lb"细胞存在于群体中。实施进一步考察以确定更原始的较低定型STRO-1培养MPC是否也可以影响体内TSCC的增殖能力。两个体内才莫型用来解决这个问题。第一个才莫型采用无胸腺:沐大鼠，其进行了左前降支(LAD)冠状动脉的结扎并且在48小时后注射盐水、FACS分离培养的人STRO-ldin^pSTRO-l^细胞以及无STRO-l的骨髓单核细胞的新鲜p及出物(图7)。两周后，将动物处死，固定心脏iEL织并同时用两种单克隆抗体进行染色第一个与大鼠(而不是人)Ki67抗原选择性反应，第二个与心月几细胞标记物月几钙蛋白I反应。双重染色的细月包(表示增殖的大鼠心月几细刀包)通过免疫过氧化物酶4支术进4亍4全测。与接受盐水或STRO-ldim人细胞的对照动物相比，接受STRO-lbri人细胞的动物表现出2.5-5倍较高数量的增殖大鼠心肌细胞(图7)。第二个才莫型利用无胸腙j果大鼠，其皮下注射了大鼠成力交质细月包瘤细胞，其组成性地分泌VEGF。两周后，该大鼠4妻受瘤内注射盐水、FACS分离的STRO-ld^或STRO-lb"人细胞(图8)。一周后，将动物处死，固定肿瘤组织并同时用两种单克隆抗体进4亍染色第一个与平滑肌细胞表达的a平滑肌肌动蛋白抗原反应，第二个与脉管内皮细月包表达的vWF抗原反应。双重染色的结构(表示既含内皮又含平滑肌的纟敬动脉和动脉)通过免疫过氧化物酶技术进行检测。与接受盐水或STRO-ldim人细胞的对照动物相比，接受STRO-lbri人细胞的动物在肿瘤内的细胞注射部位处表现出3.5-8倍较高数量的微动脉和动脉(图8)。在已注射人细胞处的远端部位处未观察到差异。实施例4:来源于STRO-l卩曰性细胞的细胞培养物中的STRO-lbriMEMPs的数量增加在证实STRO-l^培养MEMPs促进更多TSCC增殖的能力之后，我们接下来考察了一系列生长因子增加体外扩增的STRO-lbriMPC比例的作用(图9)。将已建立的来源于STRO-l"CD146+分离的骨髓细胞的培养物在补充了10%FCS(A)或一系列因子包招「lxl(r7Mla,25-二羟基维生素D3(1,25D))(B)、10ng/ml血小板源性生长因子(PDGF)(C)、10ng/ml肿瘤坏死因子a(TNF-a)(D);10ng/ml白介素-ip(IL-l卩)(E)以及30ng/ml基质书f生因子1-a(SDF画la)(F)的基石出i咅养基中i告养5天，用STRO—1mAb进4亍染色(图9)。发现这些因子才及大地增加体外STRO-lbriMPC的数量。为了研究这些因子如何在体外扩增后增高表达STRO-lbfi的细胞百分数的机制，将培养的Stro-lbri如方法中所述用CFSE进行标记，然后暴露于各种因子。图10示出了一个代表性实验，其中IL-1|3增加用CFSE标记(如方法中所述)的MPC的增殖能力。将细月包在10ng/mlIL-lp存在的情况下培养5天，用STRO-1mAb染色并如上所述进行分析。发现IL-1(3通过增加亮STRO-1+骨祖细胞的凄欠量而i曾力口MPC分裂的次凄l。1,25D、PDGF-BB、TNF-a、IL-1J3和SDF-la用来刺激MPC时也可获得类似结果。实施例5:增加STRO-lbri细胞的增殖也增加Stro-ldim细胞的数量在各种因子存在的情况下增加STRO-lb"培养MEMPs比例的能力也与STRO-ldim细胞的数量增加相关。例如，STRO-lbl"VAlkPhos+(图10B),—种与成骨前细月包一至丈的表型(Gronthosda/.，JBoneMinerRes.14:47-56,1999;Pan"a/"Bone34(1):112-23，2004)。因此，我们考察了表型的这种变化是否也与诱导的STRO-lbriMPC分化为骨形成细胞(成骨细胞)的能力增加相关。图11示出了在骨i秀导剂地塞米^存在的情况下，IL-1|3不^义刺激STRO-l阳性MPC增殖，而且增强其骨形成能力。浓度为O.Olng/ml的IL-ip显著将MPC凄t量增加到未处理的对照培养物的136.6±1.2%(图IIA)，在大于O.lng/ml的浓度下获得了平台效应。将体外扩增的MPC后代如方法中所述在骨诱导条件存在的情况下接种到24孔板中。这些细胞也用浓度为10ng/ml的IL-1(3进行处理，-争周给培养物"补充"含IL-ip的新鲜培养基。才艮据所述方法确定绝对胞外基质钙浓度。结果表明，相比于未处理的细胞(图IIB)，用IL-ip处理的细胞(图11C)中矿物沉积增加。经IL-lp处理的细月包中钙水平在第4周和第6周显著高于未处理细力包的钙水平。图12中展示的数据表明，IL-1p刺激STRO-1BriMPC的增殖，引起骨祖细胞的扩增，同时随后加入另一种分化试剂地塞米松，诱导碱性磷酸酶(ALP)表达和STRO-l表达丧失，有效地提高体外功能性成骨细胞的数量。不同因子可扩增和调节STRO-lB"MPC群体的概念进一步在体内进行测试。从Stro-lb"MPC扩增的的半融合的体外继代培养物在存在或缺乏PDGF-BB(10ng/ml)(另一种已知可增高体外扩增的STRO-l加MPC数量的因子)下进行培养(请参考图9C)。PDGF诱导的和非诱导的细胞制备物接着如方法中所述用羟磷灰石/磷酸三4丐颗粒(HA/TCP)共移植到免疫缺陷的小鼠中。8周后，对收集的移植物进行研究表明，如通过ScionImaging量化的(图13A)，与未处玉里的只于照i告养物(图13B)才目比，用PDGF-BB预处理的培养物表现出显著4交多的异位成骨(图13C)。实施例6:缺乏可检测的ALP表达的未定型STRO-lbriMPC持续存在于STRO-l选择的BMf厅生的MPC体外培^M&中。人BM吸出物如方法中所述进行制备，MPC利用mAbSTRO-l通过MACS分选而回收。利用间4妄免疫荧光和流氏细月包4义，评估67MACS卩日性部分(用来建立初始或PO培养物的细月包)中高水平表达STRO-l抗原(STRO-lB"ght)的细胞比例，发现其占总群体的22.4%(凄t据未显示)。然后这些细胞以lx104细胞/cm2进行接种，在无血清培养基中培养，直至其达到80-90%的融合，如前所述的(G醒thos"Jow謂/0/Ce〃S"'潔e116:1827-1835，2003》每次传时，细月包如方法中所述进4亍解离，并以1x104细胞/cm2进4亍再接种。每一代的细胞样品，对其STRO-l和TSCC标记物石威性磷酸酶(ALP)的表达进行染色。如在图14中示出的，4次传代后，尽管高水平表达STRO-l的细胞(缺乏可评估水平的TSCC标记物ALP)比例降至12.7%，这些培养物仍然包含相当数量的STRO-lb"ALFMEMPs。表l:本专利中采用的抗体<table>tableseeoriginaldocumentpage69</column></row><table>表2:用于人mRNA特异性扩增的RT-PCR引物和条件<table>tableseeoriginaldocumentpage70</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage71</column></row><table>表3:STRO-lBri和STRO-lD^群体中相对基因表达的总结。提供了通过逆转录-PCR确定的STRO-lB"和STRO-lDim群体之间表现出可检测和差异表达的基因列表。数值表示参照管家基因GAPDH的相对基因表达。<table>tableseeoriginaldocumentpage71</column></row><table>表4:STRO-lw和STRO-ld^群体中相对基因表达的总结。提供了通过流式细胞仪确定的STRO-lW和STRO-ld^群体之间表现出差异表达的蛋白质列表。数值表示如图2中所述染色的相对平均荧光强度。平均荧光强度<table>tableseeoriginaldocumentpage72</column></row><table>表5:MEMPs(STRO-lbri)和纟且织特异'性定型细月包(TSCCs)(STRO-l^)之间标记物表达的比较<table>tableseeoriginaldocumentpage72</column></row><table>表6:新鲜分离的MPCs和MEMPs之间标记物表达的比较<table>tableseeoriginaldocumentpage73</column></row><table>权利要求1.一种富集细胞群体，其中总细胞群体的至少10％为具有Stro-1bri、ALP-表型的多能扩增间充质前体细胞子代(MEMP)。2.根据权利要求1所述的富集细胞群体，其中所述总细胞群体的至少20%为具有Stro-1b"、ALP_表型的MEMP。3.根据权利要求1所述的富集细胞群体，其中所述总细胞群体的至少40%为具有Stro-lbri、ALP—表型的MEMP。4.根据权利要求1所述的富集细胞群体，其中所述总细胞群体的至少50%为具有Stro-lb"、ALP—表型的MEMP。5.根据权利要求1所述的富集细胞群体，其中所述总细胞群体的至少70%为具有Stro-lbri、ALP—表型的MEMP。6.根据权利要求1所述的富集细胞群体，其中所述总细胞群体的至少90°/。为具有Stro-lb"、ALP—表型的MEMP。7.才艮据片又利要求1到6中任一项所述的富集群体，其中所述MEMP只于于标i己物Ki67、CD44和/或CD49c/CD29、VLA-3、ot3P1中的一种或多种也是阳性的。8.根据权利要求1到7中任一项所述的富集群体，其中所述MEMP未表现出TERT活性，和/或对于标记物CD18是阴性的。9.根据权利要求1到8中任一项所述的富集群体，其中所述总细胞群体进一步包括组织特异性定型细胞(TSCC)。10.根据权利要求9所述的富集细胞群体，其中所述TSCC定型于组织种系或细胞类型，所述组织种系或细胞类型选自由骨、神经组织、脂肪、软骨、骨骼肌、心肌、上皮组织、成骨细胞、腱、韧带成牙本质细胞、周细胞、平滑肌、神经月交质组织、脉管组织、内皮组织、造血组织、肝组织和肾组织组成的组。11.一种包括培养的和/或扩增的细胞群体的组合物，其中所述总细胞群体的至少10/。是具有Stro-lb"、ALP—表型的MEMP,并且其中《且合物进一步包4舌主要为一种组织型的TSCC。12.根据权利要求11所述的组合物，其中所述总细胞群体的至少5%为具有Stro-1b"、ALP—表型的MEMP。13.根据权利要求11所述的组合物，其中所述总细胞群体的至少10%为具有Stro-1bH、ALP_表型的MEMP。14.根据权利要求11所述的组合物，其中所述总细胞群体的至少20%为具有Stro-1bH、ALP_表型的MEMP。15.根据权利要求11到14中任一项所述的组合物，其中所述TSCC定型于组织种系或细胞类型，所述组织种系或细胞类型选自由骨、神经组织、脂肪、软骨、骨骼肌、心肌、上皮组织、成骨细月包、腱、韧带成牙本质细月包、周细月包、平滑肌、神经胶质组织、月永管组织、内皮组织、造血组织、肝组织和肾组织组成的组。16.才艮据权利要求11到14中任一项所述的组合物，其中所述TSCC为造血细i包。17.根据权利要求11到16中任一项所述的组合物，其中所述MEMP和TSCC均从自体来源获4寻。18.根据权利要求11到16中任一项所述的组合物，其中所述MEMP和TSCC均从异体来源获得。19.才艮据权利要求11到16中任一项所述的组合物，其中所述MEMP和TSCC从不同来源获得，一种为自体来源，另一种为异体来源。20.根据权利要求11到19中任一项所述的组合物，其中所述群体包括至少5x106个细月包。21.根据权利要求11到19中任一项所述的组合物，其中所述群体包4舌至少107个细月包。22.根据权利要求11到19中任一项所述的组合物，其中所述群体包括至少109个细月包。23.—种通过将TSCC与具Stro-lbri、ALP—表型的MEMP共培养或通过将TSCC与从具有Stro-lbd、ALP—表型的MEMP获得的i咅养上清液、细力包裂解物或部分4妻触来刺〗敫TSCC增殖的方法。24.根据权利要求23所述的方法，其中所述MEMP以大于1%的水平与TSCC—起存在于共培养条件中。25.才艮据权利要求23所述的方法，其中所述MEMP以大于5%的水平与TSCC—起存在于共培养条件中。26.才艮据权利要求23所述的方法，其中所述MEMP以大于10%的水平与TSCC—起存在于共培养条件中。27.才艮据权利要求23所述的方法，其中所述MEMP以大于20%的水平与TSCC—起存在于共培养条件中。28.根据权利要求23所述的方法，其中所述MEMP以大于40%的水平与TSCC—起存在于共培养条件中。29.才艮据权利要求23到28中任一项所述的方法，其中所述TSCC在体外培养。30.才艮据权利要求23到28中任一项所述的方法，其中TSCC与MEMP或来自MEMP的培养上清液、细力包裂解物或部分的共培养发生于接受者体外，且共培养的TSCC在体内被递送至所述接受者的组织部位。31.根据权利要求23到28中任一项所述的方法，其中所述TSCC对于所述4妄受者是内源性的且位于组织部位的原位，并且所述TSCC的共i咅养在MEMP或来自MEMP的培养上清'液、细月包裂解物或部分一皮递送到所述组织部4立后发生于体内。32.根据权利要求23到31中任一项所述的方法，其中所述TSCC定型于组织类型，所述组织类型选自由骨、神经组织、脂肪、软骨、骨骼肌、心肌、上皮组织、成骨细胞、腱、韦刃带成牙本质细胞、周细胞、平滑月几、神经月交质组织、月永管组织、内皮组织、造血组织、肝组织和肾组织组成的组。33.根据权利要求23到31中任一项所述的方法，其中所述TSCC为造血细月包。34.—种用于富集具有Stro-lbH、ALP—表型的MEMP的方法，所述方法包括在一种或多种刺激因子存在的情况下培养MPC或其子4戈，所述刺激因子选自由1a,25-二羟基维生素D3Cl，25D)、血小板源性生长因子(PDGF)、肿瘤坏死因子a(TNF-oc)、白介素-1P(IL-1|3)和基质书亍生因子1oc(SDF-1a)组成的组。35.根据权利要求34所述的方法，其中所述MPC或其子代在两种或多种刺激因子存在的情况下培养。36.根据权利要求34或权利要求35中任一项所述的方法，其中所述MPC或其子代已经在体外被扩增。37.根据权利要求34到35中任一项所述的方法，其中所述MPC是未扩增的分离MPC群体。38.根据权利要求34到37中任一项所述的方法，其中，相对于未受刺激的对照，所述刺激引起具有Stro-lbH、ALP—表型的MPC子4气增加超过10%。39.根据权利要求34到37中任一项所述的方法，其中，相对于未受刺激的对照，所述刺激引起具有Stro-lbri、ALP-表型的Mpc子代增加超过50%。40.根据权利要求34到39中任一项所述的方法，其中所述MPC来源于任何一种或多种组织，其选自由骨髓、牙髓细月包、脂肪组织和皮肤组成的组，或者可能更广泛的来源于脂肪组织、牙齿、牙髓、皮肤、肝、肾、心、视网膜、脑、毛嚢、肠、肺、脾、淋巴结、胸腺、胰腺、骨、韧带、骨髓、腱和骨骼肌。41.根据权利要求34到40中任一项所述的方法，其中所述MPC或其子代在一种或多种刺激因子存在的情况下在体内培养。42.根据权利要求41所述的方法，其中所述刺激因子与包括MPC或其子的细胞群体一起纟会予组织部位。43.根据权利要求42所述的方法，其中所述方法进一步包括给予夕卜源寸生TSCC。44.一种产生组织特异性定型细胞群体的方法，所述方法包括在一种或多种刺激因子存在的情况下培养包括MPC或其子代和TSCC的细胞群体，所述刺激因子选自由1a，25-二羟基维生素D3(1，25D)、血小板源性生长因子(PDGF)、肺瘤坏死因子cc(TNF-a)、白介素-1(3(IL-1(3)和基质衍生因子1oc(SDF—1oc)纟且成的纟且；以及使所述培养的群体处于使MPC或TSCC分化偏向于特异性组织类型的条件。45.根据权利要求44所述的方法，其中所述组织类型选自由心月几、平滑月几、月永管组织、骨组织、寿欠骨组织、神经组织、月旨肪组织、上皮组织和内皮组织组成的组。46.—种包括MPC或其子代和刺激因子的组合物，所述刺激因子选自由1oc，25-二羟基维生素D3(1，25D)、血小板源性生长因子(PDGF)、肺瘤坏死因子a(TNF-a)、白介素-1P(IL-1(3)和基质书亍生因子1a(SDF-la)纟且成的纟且。47.根据权利要求46所述的组合物，进一步包括TSCC。48.根据权利要求46或权利要求47所述的组合物，进一步包括使TSCC或MPC或两者分化偏向于特异性组织类型的因子。49.才艮据4又利要求48所述的组合物，其中所述组织类型选自由心肌、平滑肌、月永管组织、骨组织、软骨组织、神经组织、月旨肪纟且织、上皮iSL织和内皮《且织组成的纟且。50.—种用于产生或1^复患者组织的方法，所述方法包4舌爿寻一又利要求1到10中^f壬一项所述的富集群体《会予患者。51.—种用于产生或修复患者组织的方法，所述方法包括将权利要求11到22中4壬一项所述的组合物《合予患者。52.根据权利要求50或权利要求51所述的方法，其中所述组织选自由心肌、平滑肌、脉管组织、骨组织、软骨组织、神经组织、月旨肪组织、上皮组织和内皮组织组成的组。53.—种具有STRO-lbri、ALP—表型的经分离的遗传修饰的MEMP。54.根据权利要求53所述的经分离的遗传修饰的MEMP,其已经过遗传〗奮饰以表达异种蛋白。55.根据权利要求54所述的经分离的遗传修饰的MEMP,其中所述异种蛋白选自由1a,25-二羟基维生素D3(1,25D)、血小板源性生长因子(PDGF)、胂瘤坏死因子a(TNF-oc)、白介素-1P(IL-1|3)和基质书亍生因子1a(SDF-1a)、合成的糖皮质激素如地塞米+〉、或骨形态发生蛋白如BMP-2、BMP-3、BMP-4、BMP-6或BMP-7组成的组。全文摘要本发明涉及多能扩增间充质前体子代(MEMP’s)，其特征在于早期发育标记物STRO-1^bri和ALP。本发明还涉及用于生产MEMP’s的方法以及MEMP’s在治疗性应用中的用途。文档编号C12N5/077GK101506355SQ200580040212公开日2009年8月12日申请日期2005年9月26日优先权日2004年9月24日发明者安德鲁·克里斯托弗·威廉·赞内蒂诺,斯坦·格龙托斯申请人:成血管细胞系统公司