流感病毒的拯救的制作方法

专利名称：流感病毒的拯救的制作方法
流感病毒的拯救 本发明涉及流感病毒疫苗生产的领域。
流感病毒(正粘病毒科)是具有片段化基因组(Taubenberger和 Layne， Molecular Diagnosis第6巻No. 4 2001)的有包膜负链RNA
病毒。基于其核蛋白和基质蛋白之间的显著抗原差异，将其分为两个 属 一个属包含A型和B型流感病毒，而另一个属由C型流感病毒组 成。所述三种病毒类型在病原性和基因组组织上也不相同。A型发现 于广泛的恒温动物中，但B型和C型主要是人的病原体。根据血凝素 (HA)和NA表面糖蛋白的抗原特征对A型流感病毒进一步分类，所述 NA表面糖蛋白是病毒体表面突出物。目前有15种HA和9种NA亚型。 A型流感病毒感染广泛的动物，包括禽类、猪、马、人和其它哺乳动 物。水生禽类充当了所有已知A型流感病毒亚型的天然储存库，并且
可能是人大流行性流感林系的遗传材料源。
与相关的副粘病毒不同，流感病毒具有片段化的RM基因组。A 型和B型流感病毒具有相似的结构，而C型流感病毒更具趋异性。其 中A和B型病毒各包含8个分开的基因片段(各编码至少一个蛋白)， C型包含7个分开的片段，其中合并了 A和B型的片段4和6。 A和B 型流感病毒覆盖有三种蛋白HA、 NA和基质2 (M2 ) 。 C型流感病毒 只具有一种表面糖蛋白。各流感RM片段被核蛋白(NP)包裹以形成 核糖核苷酸核蛋白(RNP)复合体。三个聚合酶蛋白与RNP复合体的一 个末端结合。RNPs被具有基质蛋白(基质l)的膜包围。所述膜的磷 脂部分来源于细胞宿主的膜。在病毒颗粒内部也发现了非结构性蛋白 2 (NS2) 针对流感病毒的命名系统，世界卫生组织(WHO)的指导方 针如下。首先，指出病毒类型(A、 B或C)，然后是宿主(如果是非 人类)、分离的地方、分离的编号和分离的年份(通过斜扛分隔)。 对于A型流感病毒，在括号内注明HA和NA亚型。例如，包含于最近
的2000至2001季度的三价疫苗的林系是A/Panama/2007/99 (H3N2)、 A/New Caledonia/20/99 (H1N1)和B/Yamanashi/16/98。自1977年 以来，已有两种A型亚型流感病毒H1N1和H3N2在人中共循环。
流感病毒在复制期间积累了点突变，因为其RM聚合酶复合物不 具有校正活性。改变表面糖蛋白抗原部分的氨基酸的突变可能为病毒 林系提供选择性的有利方面，以允许其避开已存在的免疫性。HA分子 通过结合某些宿主细胞上的受体启动感染。抗HA蛋白的抗体阻止受体 结合并且非常有效地阻止相同林系的再感染。通过抗原性飘移或抗原 性转变，HA可逃避之前已获得的免疫性，在所述抗原性飘移中，当前 循环的HA基因的突变干扰了抗体结合，而在抗原性转变中，所述病毒 获得了HA新亚型。在HA分子中，抗原性飘移压力是不均等的，正选 择变化主要发生在HA蛋白的球状头部。在HA中，这些变化积累的程 度也超过NA中积累的程度。在其它流感蛋白中变化的发生更加緩慢。 同样，在人适合的流感株系中抗原性飘移压力是最大的，在猪和马适 合性林系中抗原性飘移压力居中，在禽类适合性林系中抗原性飘移压 力是最小的。
因为流感病毒具有片段化的基因组，所以在相同的宿主中用两种 不同的林系共感染可导致新的重排流感病毒林系的产生，所述重排林 系包含亲本基因片段的不同重组。已知在野生鸟类中存在15种HA亚 型，其提供了新的人HAs源。通过抗原性转变在人循环中出现的具有 新亚型的流感林系曾经是过去的1957和1968年中两次流感大流行的 原因和很可能是1918年流感大流行的原因。与所有已知的有关大流行 流感病毒出现相一致，大流4亍林系必须具有在抗原性上不同于当前流 行的HA的HA;该HA不能已在人中循环60-70年；并且所述病毒必须 可在人与人之间传染。1957年和1968年中，大流行是由于HA转变导 致的，在这两种情况下，大流行林系的HAs与禽类林系紧密相关.尽 管大流行的一个必要条件是HA必须改变，但病毒的其余部分可以或必 须改变的程度是未知的.只能获得1957和1968年的大流行病毒用于 直接研究，1918年的大流行流感病毒可通过使用分子考古学来进行表
征。在1957年，三个基因HA、 NA和聚合酶复合物(PB1)的亚基被 鸟类样基因替换。在1968年，只有HA和PB1被替换。
可通过病毒分离、血凝素抑制(HI)检测、通过免疫测定进行的 抗原检测、血清学检验、分泌物中NA活性的验证或基于分子的测定法 进行流感感染的特异性诊断。可将唾液、鼻咽抹拭物或用緩冲盐水溶 液漱洗的鼻咽洗出液作为样品进行收集。流感诊断的标准曾经是培养 后进行免疫学表征。血清学分析提供了精确的但溯及以往的用于流感 感染的方法，因为其要求收集急性的和康复期的血清。
流感病毒可培养在含胚鸡蛋或许多组织培养系统中。胰蛋白酶 (用于HA的切割激活)的加入允许流感病毒在Madin-Darby犬肾 (MDCK)细胞和其它细胞系中增殖。用于疫苗生产的主要方法仍是在 蛋中培养流感病毒。细胞系中的培养通常用于初级的人流感病毒(A 型和B型)分离。许多人流感病毒可直接在含胚蛋的尿嚢腔中培养。 一些A型和B型流感病毒要求在羊膜腔中进行初始培养，然后再适应 在尿嚢腔中培养。在培养分离后，使用免疫测定法或免疫荧光最后确 定大部分流感分离林。流感病毒的HA分子结合呼吸细胞表面上的唾液 酸残基以使病毒进入。
通过利用流感病毒在体外凝集红细胞的能力在抗原性上表征流 感林系。抗HA抗体可抑制凝集。因此，血凝抑制(HI)测定法是用于 表征流感林系的一个标准方法。HI测定法用于确定样品林系是否是与 最近的疫苗林系免疫学相关(即，交叉反应的)的。将确定的血清类 型(通常在白鼬中产生的)以两倍稀释的系列加入小孔中，然后实验 室工作人员通过观察悬浮的与凝聚成团的红细胞的比值来给测定小孔
打分。在大多数情况下，成组的血清用于将样品抹系与疫苗和参照抹 系匹配，在任何给定的流感活动期，通过HI测定法，绝大多数样品林 系被成功地匹配。
在鉴定单个病毒抹系的抗原特征上，WHO提供了指导方针，WHO 合作中心也提供了指导，并且可为希望获得其的机构提供这些林系. 根据免疫学系镨可对样品林系进行分类，例如A/Moscow/10/99 (H3N2)
样、A/New Caledonia/ 20/99 (H1N1)样和B/Beijing/184/93样病 毒。对于在HI测定法中未能表征的样品林系，实验室工作人员必须将 其接种到白鼬中以产生株系特异性抗血清。当准备好新的抗血清后， 如上所述再次进行HI测定。如果新的血清在交叉反应性上显示显著的 差距(通常定义为样品和疫苗林系之间的4倍差异)，那么将其合并 入常规的实验室组中并用于寻找新的流行性林系。因此，HI测定法在 用于疫苗抹系选择的流感病毒监视努力中是极其重要的并且是估计抗 原性飘移最普遍使用的方法。
通过单个基因片段的序列比较可从遗传上表征流感林系，WHO指 导方针和WHO合作中心对包含流感病毒基因组的单个RNA片段的性质 的鉴定提供了指导；也提供指导鉴定下列的性质A型和B型流感病 毒核酸片段，编码核蛋白(NP)、碱性聚合酶l (PB1)、碱性聚合酶 2 (PB2)、酸性聚合酶(PA)、血凝素(HA)、神经氨酸酶(NA)、 基质蛋白(M1和M2)和非结构蛋白(NS1和NS2);和C型流感病毒 核酸片段，编码核蛋白(NP)、碱性聚合酶l (PB1)、碱性聚合酶2 (PB2)、血凝素-神经氨酸酶样糖蛋白(HN)、基质蛋白(M1和M2) 和非结构蛋白(NS1和NS2)。
如果需要参照林系，例如用于抗原性分析、核酸序列比较和鉴定 疫苗病毒，可求助于位于45 Poplar Road， Parkville， Victoria 3052， 澳大利亚(传真+61 3 9389 1881，网址http〃www. influenza centre, org)的WHO流感鉴定和研究合作中心；WHO流感鉴定和研究合 作中心，国家传染病研究所，Gak画4-7-1， Musashi-Murayama， 东 京208-0011，日本(传真+81 42 5610812或+81 42 5652498); WHO 监视、流行病学和流感控制合作中心、疾病控制和预防中心，1600 Clifton Road, Mail stop G16，亚特兰大，GA 30333，美国(传真+1 404 639 23 34);或WHO流感鉴定和研究合作中心，国家医学研究所， The Ridgeway， Mill Hill,伦敦NW7 1AA,英国(传真+44 208 906 4477),在WHO的网站http: 〃www. who, int/inf luenza和地理信息系 统，FluNet， http: 〃www. who, int/flunet上可获得更新的流行病学信息。
对流感的影响和其预防的健康和经济利益的意识在不断地增长， 过去十年已看到接种的用途和益处，并且产生了大量的抗流感药物。 在许多国家，由于更长的预期寿命的原因，更多的人处于并发症的风 险中，在流感大流行期间健康保健系统的负担受到更广泛的承认，更 频繁的国际旅行已为病毒的传播提供了机会，同时新的药物的引入已
增加了预防和治疗疾病的选择。大约50个国家具有政府资助的国家 流感免疫项目，并且所述疫苗在许多其它国家是可获得的。疫苗应用 的特定推荐是可变的，但通常包括对年长的和超过6个月大的个体每 年进行免疫，所述个体由于已存在的慢性医学状况的原因，处于增加 的严重疾病的风险中。在一些国家，疫苗用于减少流感对处于增加的 医学风险的人的传播。成员国家需要考虑流感预防工作在其全体公共 卫生优先背景中的利益。
灭活的疫苗分为几种类型，视其是否包含完整的病毒颗粒、部分 破坏的病毒颗粒(分裂疫苗)或纯化的包膜抗原(亚单位疫苗)而定。 一些亚单位疫苗已和佐剂或递送系统结合。
少数国家已批准针对某些靶群体的活的减毒流感疫苗。在俄罗斯 联邦， 一种疫苗的两种不同制剂已用于健康的成人和孩子中，并且另 一种活疫苗已进行广泛的测试但仍未被批准。在活的减毒疫苗能更广 泛地获得之前，其通常不会被推荐用于流感预防。
已发展了两类抗病毒剂用于预防和治疗流感。M2抑制剂，即金刚 烷胺和金刚乙胺，被限定用于治疗A型流感病毒并且据报道在流感预 防方面也是有效的。然而两种药物都导致一些副作用，在使用金刚烷 胺的情况下，更容易产生显著的神经学上的副作用。神经氨酸酶抑制 剂，例如扎那米韦和奥塞米韦，在许多国家近来被批准用于治疗A型 和B型流感，并且已报道在预防方面是有效的。在接受这两类抗病毒 剂的患者中已检测到抗性突变体。尽管目前并不认为这是个重要的公 共卫生问题，但当这些药物在非常大的规模上使用时，情形将发生变 化。
WHO维持着由位于82个国家的IIO个国家流感中心以及位于亚特 兰大(美国)、伦敦(英国)、墨尔本(澳大利亚)和东京(日本)的4 个WHO流感鉴定和研究合作中心合作运行的国际监视项目。这些中心 为具有大流行潜能的新出现的抹系提供早期预警系统。该系统非常重 要，因为如果流感疫苗不包含目前循环的林系那么其功效将会降低。 WHO发布疫苗组合物的推荐组合物，如可在由世界卫生组织出版的 Weekly Epidemiological Record (例如参见2004， 79，第9期，第 88页或ht tp: 〃www. who, int/wer)中查到的，在二月份用于北半球的 疫苗和在九月份用于南半球的疫苗。由于在赤道地区的流感季节模式 还不明确，流行病学因素将影响这些推荐疫苗(二月或九月)中何种 疫苗适合用作用于赤道国家的疫苗。
所述合作中心对国家中心提供的流感分离株系进行抗原和遗传 分析。当观察到抗原变异的迹象时，将该变异与流行病学数据进行比 较以估计变体的流行病学重要性。通过使用成组的在接种之前或之后 收集的人血清，将代表性的分离林与当前的疫苗林系进行比较，从而 估计目前的疫苗是否预期能抵抗这些病毒。根据WHO公开的每年的推 荐疫苗，培育了高生长速率的林系并作为参照病毒提供给生产者以帮 助产生用于疫苗生产的种子病毒。流感疫苗的安全性和功效检测包括 病毒的灭活、微生物灭菌、用于破坏所述病毒的化学物质的测量和推 荐的抗原的浓度确定。 一般推荐疫苗要遵照WHO的要求，然而，国家 控制机构应当批准用于各国的特异性疫苗病毒。国家公共卫生机构负 责有关疫苗使用的推荐。WHO也公开了用于预防流感病毒感染的推荐 疫苗。(参见WERNo. 35， 2002， pp. 281-288.)。
在含胚鸡蛋中生产流感疫苗已超过50年，但近来在发展用于疫 苗生产的细胞培养系统上作出了大量的努力。含胚鸡蛋中的常规标准 方法学非常繁瑣并且具有一些主要的不利方面需要数百万的鸡蛋； 在美国每个季度超过100万个鸡蛋必须单个地接种和收获；要求许多 过滤和离心步骤进行繁瑣的纯化以确保疫苗不含卵蛋白，从而最大限 度地减小过敏的风险；要求许多难以自动化并且非常费力的生产步骤，
更不用说费时和遭受污染。
因此在工业上长期存在对发展疫苗生产技术的需求，所述生产技 术证明要优于目前的疫苗生产技术，即，通过发展利用特异性细胞系 的生产方案以取代现有的疫苗生产方法学，所述细胞系能够支持流感 病毒生长并适合在自动化的生物反应器中、在生物载体上或在其它细 胞培养系统中生长。
通常，良好表征的传代细胞系，例如VER0细胞或其它灵长类动 物来源的细胞，4皮建议用于流感病毒疫苗的生产。然而，注册机构今 天仍回避用于人用途的灵长类动物细胞中生产的疫苗。越来越多地， 这些机构建议所有来自灵长类动物细胞(例如Vero)的产品不含有残 留的完整细胞并且对在这些细胞中生产的产物中的残留材料(例如灵 长类动物细胞DNA)水平表示持续的关注。尽管世界卫生組织(WHO) 目前接受在肠胃外施用时每剂lOng来自传代细胞系的残留DNA的限 定，但基于个案基础，注册机构仍要考虑由残留的灵长类细胞材料例 如DNA施加的风险水平。
长期以来，由于缺少可获得的有效的反向遗传学系统，阻碍了 A 型流感病毒的基础研究。尽管事实上发展了最早的针对A型流感病毒 的用于负链RNA病毒的反向遗传学技术，但只有到最近才实现从重组 DNA中专门地拯救出该病毒。重组流感病毒通过用成组的八个质粒(各 基因组病毒RNA ( vRNA)片段通过RNA聚合酶I从所述质粒转录)和 成组的四个额外的表达核蛋白(NP)和聚合酶蛋白PB1、 PB2和PA的 质粒转染真核细胞产生。据报道使用该12-质粒系统的病毒生产效率 相对较低，当编码血凝素(HA)、神经氨酸酵(HA)、基质蛋白l和 2 (Ml和M2)和非结构蛋白2 (NS2)的5个额外质粒共表达时，上清 液中病毒的滴度可增加。这些12和17-质粒系统的简化修饰是提供双 向载体将转染的质粒数目减少至8个.使用该系统后，可从同一质粒 中合成负链vRM和正链mRNA。
产生重组A型流感病毒的能力促进了未来流感病毒的研究，然而， 由于绝大部分(如果不是全部)用于疫苗生产的细胞系统由于聚合酶
(参与反向遗传学系统)和最常用的细胞种类之间的不相容性导致不
允许或仅极少量允许上述重组病毒的复制，还未发现使用重组A型病 毒以充分地提高疫苗产品滴度的实际解决方案，所述重组A型病毒通 过反向遗传学技术获得。
A型流感病毒是负链RNA病毒。这意味着在一轮复制周期中，产 生三种类型的RNA:反义vRNA、有义cRNA和有义mRM。与病毒RM (vRM) 不同，mRNA被加帽并且具有poly ( A)尾巴。mRNA的poly ( A)尾巴 的第一A残基与基因组中的U残基短片段匹配，所述U片段被认为是 转录终止/聚腺苷酰信号。据认为，当聚合酶到达该U残基片段时，其 进行相反方向滑动的重复循环并通过这种方式产生完整的mRNA poly (A)尾巴。
发明筒述
本发明提供了能够应用于不同物种的细胞类型的用于流感病毒 的反向遗传学系统。聚合酶I是转录核糖体RNA的核仁中的酶并且在 正在生长的细胞中大量表达。rRM，与vRNA相似，不具有帽和poly(A) 尾巴，因此聚合酶I可用于从cDNA产生vRNA。通过聚合酶I的病毒 cDNA的转录允许产生具有正确5，和3，末端的病毒样RNAs。然而， 尽管聚合酶II的转录机器通常与来自不同物种的基因相容，但聚合酶 I转录表现出严格的(尽管不是绝对的)种特异性。该种特异性是由 转录因子与启动子之间的相互作用和在较低的程度上由所述因子间的 蛋白-蛋白相互作用提供的。基于聚合酶I的反向遗传学系统的种特异 性是疫苗发展的主要不利方面，因为除了人以外的细胞种类的聚合酶 I启动子例如犬类或禽类的聚合酶I启动子还未曾被描述，而在工业 上，良好确定的犬类(即Madin Darby犬肾(MDCK)细胞)或禽类细 胞(鸡胚胎成纤维细胞(CEF))通常用于流感病毒疫苗生产，
本发明提供了包含流感病毒基因片段和噬菌体聚合酶启动子的 核酸或所述核酸的互补链。与Neumann和Kawaoka (Virology 287，
243-240， 2001)的发现相反，本发明为该基于噬菌体聚合酶的反向遗 传学技术学在有关质粒载体和其包含的元件方面提供了显著的灵活 性，所述发现表明与非片段病毒相反，所述非片段病毒明显例外地 是流感病毒，其中T7聚合酶被认为不起作用，除了来自克隆的cDNA 的聚合酶和核蛋白外，其产生包括八个病毒RNAs的增加的合成复杂 性。例如，我们使用噬菌体T7的RM聚合酶产生vRNA或cRNA样RM 分子，但也可使用各种其它的RNA聚合酶例如噬菌体SP6RNA聚合酶。 在优选的实施方案中，本发明提供了包含流感基因片段和T7启动子的 核酸或所述核酸的互补链，从而允许我们将本发明的系统建立在于T7 启动子的控制之下的流感病毒基因片段的表达的基础上。在一个实施 方案中，缺少聚合酶终止子。优选地，在紧邻启动子之后给所述核酸 提供了一个或两个额外的鸟嘌呤残基。为了疫苗目的，提供了根据本 发明的核酸，所述核酸包含来源于流感病毒的基因片段，所述病毒是 由WHO推荐用于疫苗目的的病毒。在优选的实施方案中，本发明提供 了包含A型流感病毒的基因片段和T7启动子的核酸或所述核酸的互补 链。特别是在双向系统中，优选地，根据本发明的核酸不包含T7终止 子。因为所述聚合酶优选地表达自与表达所述病毒的质粒一起转染的 质粒，此处提供的系统并不限定于特定物种。尽管基于T7聚合酶的反 向遗传学系统有时用于非片段负链病毒的拯救，但基于噬菌体聚合酶 技术的片段化流感病毒的反向遗传学系统之前从未被成功地利用过。 有时试图通过在转录起始位点引入G残基以增强T7聚合酶驱动的转录 来克服使用T7聚合酶转录cDNA的反向遗传学系统中的一个限制因素。 该方法已用于例如RV、VSV和SV的拯救，然而，Zobel等人(Virology. 1994Jul;202(1):477-9;NucleicAcidsRes. 1993 Aug 11; 21 (16): 3607-14)明确指出需要精确地确定A型流感基因片段的5， 和3，以使病毒聚合酶正确地发挥作用；因此明显地在转录位点无空 间加入额外的核苷酸，从而与在转录起始位点引入G残基沖突。然而， 令人惊奇的是，在本发明优选的实施方案中，我们提供了根据本发明 的核酸，在所述核酸上，在紧接着T7启动子的位置提供了至少一个额
外的鸟嘌呤残基。甚至更优选地，在紧接着T7启动子之处提供了两个 额外的鸟嘌呤残基。此外，本发明还提供了具有T7聚合酶的Madin Darby犬肾(MDCK)或鸡胚胎成纤维(CEF)细胞。特别地，本发明提 供了具有至少一个根据本发明的核酸的细胞。本发明有助于多质粒系 统例如17-质粒或12-质粒或8-质粒系统的使用，并且，因为本发明 提供了具有根据本发明的核酸的细胞，所述核酸额外地被提供以n 聚合酶，所述核酸优选地表达自与一个或多个能够表达根据本发明的 流感病毒基因片段的质粒一起转染的质粒，因此所述系统不限定于特 定物种。此处也提供了根据本发明的细胞的用途，其中所述T7聚合酶 包含细胞核定位信号。在优选的实施方案中，此处提供的细胞是非灵 长类动物细胞，因此避免了将灵长类动物DNA引入来源于根据本发明 的核酸或细胞的细胞材料或疫苗中。优选地，使用MDCK细胞或CEF 细胞。本发明的有利方面是反向遗传学系统不需要辅助病毒，所有通 过转染提供的病毒颗粒包含想要的核酸并且可被使用而不用在随后的 疫苗生产系统中建立克隆步骤。本发明也第一次提供了包含根据本发 明的核酸的复制型病毒颗粒。在美国5, 166, 057中，还未提供这种能 够复制的病毒颗粒，在本发明之前，其它试图将T7系统用于片段化流 感病毒的努力也未获成功，如此处提供的具有大约104个病毒颗粒的
病毒滴度的细胞培养组合物可在经转染的细胞培养物中在无病毒复制 的情况下容易地获得，当病毒复制时所迷细胞培养物的病毒滴度可被 提高至>107。在无辅助病毒的情况下实现根据本发明的颗粒的复制特 别有用.这种细胞培养组合物可有利地用于生产药物组合物，所述细 胞培养组合物包含细胞或来源于本发明细胞的材料或者病毒或来源于 本发明病毒颗粒的材料，所述药物组合物用于产生抵抗流感病毒感染 受试者的免疫学保护作用。可以肯定的是，在美国5，166， 057中还未 提供如此处提供的这些细胞。因此，本发明也提供了用于生产复制型 流感病毒颗粒的方法，所述方法包括培养具有至少一个根据本发明的 核酸的细胞。优选地，用于所述方法的至少一个核酸包含至少一个， 但优选地7或8个流感基因片段和噬菌体聚合酶启动子或所述核酸或
酸的互补链。更优选地，所述片段不包含噬菌体聚合酶终止子，由此 有利地该片段在紧接着启动子的位置被提供以至少一个额外的鸟嘌呤 残基，或在紧接启动子的位置被提供以二个额外的鸟嘌呤残基。优选
地，所述片段来源于由WHO推荐的用于疫苗目的的流感病毒，例如A 型流感病毒的基因片段。最后，本发明提供了可用上面公开的方法获 得的复制型流感病毒颗粒。因此本明也提供了用于产生抗流感病毒对 受试者感染的免疫保护的方法，所述方法包括为有此需要的受试者提 供此处提供的组合物。将该组合物优选地配制为疫苗，即，通过将病 毒颗粒或来源于该颗粒的病毒蛋白(亚单位疫苗)与恰当的药物载体 例如盐溶液或佐剂(例如，铝盐或其它普遍使用的赋形剂(参见例如 http: //www, cdc. gov/nip/publications/pink/A卯endices/A/Excip ient. pdf,))混合。


图1，用于基于T7po1的反向遗传学系统的构建体。克隆策略的 详述参见说明书。
图2，用编码GFP小基因组(O. 6 Mg)、 T7po1 (0.6 pg)和A型 流感病毒聚合酶基因(各1 ji g)的构建体转染的293T细胞的FACS分 析。左图转染30小时后GFP阳性细胞的百分比。右图GFP阳性部 分中GFP表达的水平(平均荧光强度)。在X轴上，显示以有义(S) 或反义US)方向排列的被转染的GFP小基因组构建体，并标明额外 G核苷酸的数目。黑色条形表示用A型流感病毒聚合酶复合体的所有4 个成分(PB2、 PB1、 PA和NP)进行的共转染，白色条形表示用省去 pHMG-NP构建体的构建体转染的对照。
图3，经转染的293T细胞的FACS分析，所述细胞用0. 6 jj g具 有2个额外G残基的反义GFP小基因组、4 u g A型流感病毒聚合 酶构建体、和0. 6 Hi g野生型T7po1 ( C )、含有核定位信号(N)的 T7pol或以l: 1比例(C/N)的两种构建体来进行转染。左图转染30小时后GFP阳性细胞的百分比。右图GFP阳性部分中GFP表达的
水平(平均荧光强度)。
图4,经转染的293T或BSR-T7细胞的FACS分析，所述细胞用 0.6 pg编码具有2个额外G残基的GFP小基因组的构建体和4 pgA 型流感病毒聚合酶构建体来进行转染。显示了细胞的GFP阳性部分中 GFP表达的水平(平均焚光强度)。用或不用表达T7po1的质粒转染 细胞，所述T7po1含有核定位信号(293T和293TN比较或BSR-T7 和BSR-T7 N的比较)。黑色条形表示用A型流感病毒聚合酶复合体的 所有4个成分(PB2、 PB1、 PA和NP)进行的共转染，白色条形表示用 省去pHMG-NP构建体的构建体转染的对照。
图5，经转染的293T细胞的FACS分析，所述细胞用0. 6 m g编 码具有2个额外G残基的反义GFP小基因组(AS-2G)或有义GFP小 基因组(S-0G)的构建体和0. 6 Mg表达具有核定位信号的T7po1的 质粒和4 ng表达A型流感病毒聚合酶基因的质粒来进行转染。左图 转染30小时后GFP阳性细胞的百分比。右图GFP阳性部分中GFP表 达的水平(平均荧光强度)。黑色条形表示用A型流感病毒聚合酶复 合体的所有4个成分(PB2、 PB1、 PA和NP)进行的共转染，白色条形 表示用省去pHMG-NP构建体的构建体转染的对照。
图6，经转染的293T和MDCK细胞的FACS分析，所述细胞用0. 6 U g编码具有2个额外G残基的反义GFP小基因组(AS-2G )的构建体、 0.6 pg表达具有核定位信号的T7po1的质粒和4 jjg表达A型流感 病毒聚合酶基因的质粒来进行转染，左图转染30小时后GFP阳性细 胞的百分比。右图GFP阳性部分的GFP表达水平(平均荧光强度)。 黑色条形表示用A型流感病毒聚合酶复合体的所有4个成分(PB2、 PB1、 PA和NP)进行的共转染，白色条形表示用省去pHMG-NP构建体的 构建体转染的对照。
详述
实施例1
使用基于T7 RNA聚合酶的反向遗传系统产生重组A型流感病毒 导言
长期以来，由于缺少可获得的有效的反向遗传学系统，阻碍了 A 型流感病毒的基础研究。尽管事实上发展了最早的针对A型流感病毒 (7， 18)的用于负链RNA病毒的反向遗传学技术，但只是到最近才实 现从重组DNA中专门地拯救该病毒(9， 20)。
A型流感病毒是负链RNA病毒。在病毒复制周期中，产生三种类 型的RNA:反义基因组病毒RNA (vRNA)、与基因组RNA互补的有义 RNA ( cRNA )和有义信使RNA ( mRNA )。尽管vRNA和cRM基本上不含 修饰的末端，但mRNA被加帽并且具有poly (A)尾巴(16)。
RNA聚合酶I (PolI)是转录核糖体RNA(rRNA)的核仁中的酶并 且在正在生长的细胞中大量表达。与vRNA相似，rRM不具有帽和 poly(A)尾巴(23)。 Hobom和同事成功地使用Poll产生具有精确的5， 和3，末端的人工流感病毒vRNA样片段。在PolI启动子-终止子盒背 景中克隆的cDNA的转录允许产生具有正确的5，和3，末端的vRM 样分子(29)。随后的涉及辅助流感病毒的研究证明这些基因组vRNA 分子可被识别并且通过流感病毒聚合酶复合体进行复制并被包装入后 代流感病毒中。该系统允许产生流感病毒，所述流感病毒包含其中一 个病毒基因片段或额外的基因片段内的突变，因此允许对病毒基因和 其产物进行研究。作为使用辅助病毒的结果，要求选择转染子病毒， 这是非常麻烦的。
Neumann等人设计了用于从克隆的cDNA (20)完整地回收A型流感 病毒的Poll系统。将编码A型流感病毒的全长vRNAs的cDNAs克隆入 人PolI启动子和小鼠PolI终止子之间。原则上，将这8个质粒导入 真核细胞应当导致所有8个流感vRNAs的合成。用这8个vRNA表达质 粒和表达病毒核蛋白以及来自RNA聚合酶II (PolII)启动子控制下
的聚合酶蛋白PB2、 PB1和PA的质粒共转染人胚胎肾细胞(293T)。 由细胞PolI合成的vRNAs被包装入RNPs并且可以每ml (pfu/ml)上清 液超过lxl(^蚀斑形成单位的感染性病毒的量回收。用表达其它病毒 结构蛋白的质粒共转染导致病毒产量的显著增加，即3xl04至 5xl07pfu/ml (20) 。Fodor等人报道了相似的用于回收A型流感病毒(9 ) 的系统。该系统依赖于8个编码所有8个vRNA cDNAs的质粒，所述 cDNAs在侧翼连接人Poll启动子，但其包含5型肝炎病毒核酶(H5 Vrib)序列而非Poll终止子序列。这些质粒与四个表达2型腺病毒主 要晚期启动子控制下的PB1、 PB2、 PA和NP蛋白的质粒共转染Vero 细胞。通过使用等量的各表达质粒，Fodor等人报道了从l(^经转染的 细胞(9)中获得1-2个感染性病毒颗粒的拯救率。我们已设计了相似 的反向遗传学系统来产生重组流感病毒A/PR/8/34。我们得出在经转 染的细胞培养物中在无病毒复制的情况下可获得大约104的病毒滴度， 当病毒复制时，所述病毒滴度可提高至>107 (4)。因为这些Poll驱 动的系统要求12-16个质粒的共转染，因此使用可高效转染的细胞系 是有效地生产重组病毒所必需的。
后来，Hoffmann等人发展了用于产生仅来自8个质粒(12)的A 型流感病毒的双向PolI-PolII转录系统。在该双向系统中，将vRNA cDNA插入在人PolI启动子和小鼠PolI最小终止子序列之间。将该完 整盒插入PolII启动子和多聚腺苷酰位点之间。这使得可以从单个构 建体中分别转录来自Poll和PolII启动子的vRNA和mRNA。 8个 PolI-PolII质粒(各编码一个A型流感病毒基因片段)在和Madin Darby犬肾(MDCK)细胞共培养的293T细胞中的共转染导致感染性A 型流感病毒的回收，产量高达2xl07pfu/ml上清液(12 )。 mRNA和vRNA 的合成都使用一个模板，这减少了要求用于病毒产生的质粒数目。据 报道在该系统中病毒产生的效率与单向U2-16质粒)Poll系统中的 效率相似。
尽管PolII启动子通常与来自不同种的转录机器相容，但来自 Poll启动子的转录表现严格的(尽管不是绝对的)种特异性。该种特
异性是由转录因子与启动子之间的相互作用和在较低的程度上由所述
因子间的蛋白-蛋白相互作用提供的(23)。
基于PolI的反向遗传学系统的种特异性形成了主要的不利方面。 上述的反向遗传学系统使用了人PolI启动子，从而将重组病毒的产生 限制在灵长类动物来源的细胞例如293T细胞或Vero细胞中。尽管对 几种物种包括人、小鼠、大鼠和猪(8， 14， 17)的Poll启动子已进 行了表征，但对其它许多物种仍不了解。犬和禽类细胞常规地用于A 型流感病毒的研究和疫苗生产中，但犬和禽类Poll启动子仍未得以描 述。为提高流感病毒反向遗传学技术的灵活性，我们试图发展通用的 反向遗传学系统。我们已选择设计基于在噬菌体T7 RNA聚合酶启动子 (pT7 )控制之下表达A型流感病毒的基因片段的系统。因为可通过转 染或通过使用稳定修饰的细胞系将噬菌体T7 RNA聚合酶(T7po1)提 供给细胞，所以该系统并不被限定于来自特定物种的细胞。
将基于T7po1的反向遗传学系统用于拯救非片段化负链病毒。 Schnell等人第一次从克隆的cDNA(27)中单独地拯救出非片段化负链 病毒。制备编码狂犬病毒(RV)的全长反基因组RNA的cDNA克隆。该 cDNA在紧接着T7po1终止子序列(tT7 )的位置侧翼连接pT7和H 5 Vrib 序列。通过T7pol转录后，通过所述H5Vrib序列在3，末端的自溶 性切割产生精确的基因组3，末端。将该质粒和编码在pT7控制下的 病毒N蛋白以及聚合酶L和P蛋白的质粒共转染入表达T7po1的细胞 中。该方法导致重组RV的拯救，但只从大约2xl(T个经转染的细胞(27) 中拯救出一个。其后，曾描述过用于副粘病毒科、弹状病毒科和非片 段NSV的线状病毒科家族(10)的类似系统。
为了成功地回收来自cDNA的非片段负链病毒，通常产生有义反 基因组RNA(cRNA)而非反义vRNA。据i人为，棵露的反义vRNA和编码 病毒蛋白的有义mRNA的同时存在将导致杂交，阻止了基因组装配成核 糖核蛋白复合体(RNPs) (27)。负链病毒通常不会遭遇这种问题， 因为其总是以RNP形式保持其基因组，所述形式防止了杂交。已报道 了用编码反义基因组RNA的cDNA回收仙台病毒(15)、人3型副流感
病毒(6 )和人metapneumovirus (11);然而，效率显著低于通过用 有义RNA获得的结果。该原理也已用于重组流感病毒的扭救。Hoffmann 等人(13)也确定了来自反基因组有义RNA的重组流感病毒生产的效 率。与只在细胞质中复制的非片段化和片段化负链病毒相反，A型流 感病毒可从基因组和反基因组载体中拯救，并且具有相似的效率。
使用pT7的病毒拯救系统中的一个限制因素是在+1至+3位点的 残基可影响转录。据观察，通过在pT7(22)的下游直接导入2或3个G 残基可增加cDNA的转录。该观察结果已用于例如重组RV (27)、水 疱性口炎病毒(28)、呼吸道合胞病毒(3)和人metapneumovirus (11) 的拯救。很明显，对于这些病毒，在基因组的一个末端加入G残基不 会影响病毒复制但对T7po1驱动的转录具有正效应。
基于T7po1的系统已广泛地用于流感病毒的反向遗传学研究 (18)，但基于质粒的重组流感病毒的生产至今仍未得以描述。此处 我们第一次描述了这种用于重组流感病毒生产的基于T7po1的反向遗 传学系统。
材料和方法 细胞和病毒
将Madin-Darby犬肾(MDCK)细胞培养在含有10% FCS、 100 IU/ml青霉素、100 pg/ml链霉素、2mM谷氨酰胺、1. 5 mg/ml碳 酸氩钠、10 mM Hepes和非必需氨基酸的EMEM (BioWhittaker)中。 将293T细胞培养在含有10%FCS、 100 IU/ml青霉素、100 n g/ml链 霉素、2 mM谷氨酰胺、1 mM丙酮酸钠和非必需氨基酸的DMEM (BioWhittaker)中。BSR-T7细胞是稳定地表达T7 RNA聚合酶(2) 的幼年仓鼠肾细胞系。将BSR-T7细胞培养在含有10% FCS、 100 IU/ml青霉素、100 |ig/ml链霉素、2 mM谷氨酰胺、1 mM丙酮酸 钠和0. 5mg/ml G418 (Ufe Technologies, Breda， The Netherlands) 的DMEM中.
将适合于在含胚鸡蛋中复制但可能不在哺乳动物细胞培养物中
最优复制的流感病毒A/PR/8/34以低感染复数在培养于Episerf培养 基(Gibco BRL)中的MDCK细胞中传代7次，所述培养基含有10 IU/ml 青霉素和IO jig/ml链霉素。第七次传代后，常规地获得108TCID5。/ml 的病毒滴度。
293T细胞的转染
基本上按(2"所描述的方法进行磷酸^介导的293T细胞瞬时 转染。在转染前一天将细胞涂布在凝胶化的100 mm直径的培养皿中 以获得50%的汇合单层。转染过夜后，用新鲜的含有2 SFCS的培养基 替换转染培养基以用于病毒生产或用含有10% FCS的培养基替换以用 于所有其它转染。将细胞温育30至72小时，之后收集上清液，如果 合适对细胞进行荧光分析。在所有的实验中平行地使用质粒pEGFP-Nl (Clontech， BD Biosciences, Amsterdam, The Nether lands)进行转 染并在FACSCalibur (Becton Dickinson)流式细胞仪中测量荧光细 胞的百分比，经确定转染效率在95-100%的范围之内。通过在300xg 下离心IO分钟澄清含有病毒的上清液。立即或在4。 C贮存短于一周 后，或在-80° C贮存超过一周后确定上清液中的病毒滴度。
MDCK细胞的转染
基本上如以前(1)所描述的进行MDCK细胞的瞬时转染。简而言 之，向lOjLil脂转染胺2000中加入240 0ptimem I培养基 (GibcoBRL)并在室温下温育5分钟。将所需量的DM用Optimem I 培养基调整至50 n 1体积再加入至该混合物中。将该混合物在室温下 温育20分钟。温育后，加入200 y 1不含青霉素和链霉素的MDCK培 养基(参见上面)并将该混合物加入至6孔板中的lxl()s个悬浮MDCK 细胞中。在5小时温育后，用PBS清洗细胞两次并在2ml不含青霉素 和链霉素的MDCK培养基中培养。在过夜温育后，用含有2 % FCS的 MDCK培养基替换该培养基。
BSR-T7细胞的转染
为进行BSR-T7细胞的瞬时转染，在转染前将400. 000细胞涂布 在6孔培养皿中以获得50-70%的汇合单层。将无血清DMEM(240 pi)
加入至10pl脂转染胺2000中并在室温下温育4分钟。用无血清DMEM 将DNA调整至50 pi再加入到该混合物中，并在室温下温育20分 钟。在转染前，用2ml无血清DMEM替换培养基。温育后，将转染混 合物逐滴加入至细胞中并在37 。 C下温育5小时。转染后，用PBS 清洗细胞一次并加入2ml含有2 %FCS的DMEM以用于病毒生产或含有 10 % FCS的DMEM以用于FACS分析。 质粒
使用编码T7po1 (pAR3126和pAR3132)的真核表达载体。尽管质 粒pAR3126编码野生型T7po1，但质粒pAR3132表达含有核定位信号 (NLS)的T7po1，所述核定位信号有效地将T7po1靶向细胞核(5)。 表达A型流感病毒聚合酶蛋白的真核表达质粒使用小鼠羟基甲基戊二 酰辅酶A还原酶启动子，它们是pHMG-PBl、 pHMG-PB2、 pHMG-PA和 pHMG-NP (25)。
通过PCR扩增pPolI-CAT-RT (25)的H 5 Vrib并克隆入pSP72的 XbaI-BamHI位点。将用 BamHI-EcoRV消化的 tT7序列克隆在 pSP72-H5Vrib的BamHI-HpaI位点，产生pSP72-H 5 Vrib-tT7 (MS24)。在合适的背景中将编码pT7的寡核苷酸连接在pSP72-H5 Vrib-tT7的Ndel-Xbal位点以引入Bbsl位点，产生载体pSP72-pT7-H 5Vrib-tT7 (MS25，图1)。通过使用pSP-Hu-GFP-Mu (4)作为模板， 将绿色荧光蛋白(GFP)的开放阅读框克隆在pSP72-pT7-H5 Vrib-tT7 的Bbsl位点，所述开放阅读框的侧翼连接有来自流感病毒A/PR/8/34 的片段5的NCRs。将该GFP小基因组以有义和反义的方向克隆，并且 在紧接着pT7的下游包含0/2/3个额外的G残基(图1)。
为将流感病毒A/PR/8/34的基因片段克隆入pSP72-pT7-H5 Vrib-tT7， de WU等人(4 )描述的双向流感病毒A/PR/8/34构建体 被用作PCR的模板(第4个3，核苷酸对应着国家流感序列数据库中 报道的流感病毒A/PR/8/34的序列)。将包含Aarl限制性位点的引 物用于克隆片段l、 2、 3、 4、 6、 7、 8，并对片段5使用平末端连接； 将基因片段以反义方向克隆入Bbsl位点并在pT7之后包含2个额外的
G残基。
通过克隆tT7下游的CMV启动子(pCMV )产生双向载体 pSP72-pT7-H5 Vrib-tT7-pCMV (MS65，图1)，从而允许从相应的基因 片段产生fflRNA。使用含有Asel限制性位点的引物通过PCR扩增 pCMV 。用Asel部分消化pSP72-pT7-H5 Vrib-tT7并以合适的方向 将pCMV连接在tT7的下游，从而从基因片段产生mRNA.
再次克隆流感病毒A/PR/8/34片段以获得各双向T7pol驱动的流 感病毒A/PR/8/34构建体。
我们也产生了其中删除了 tT7的一组双向载体。通过用 BamHI-BpeEI消化pSP72-pT7-H 5 Vrib-tT7-pCMV、用klenow酶进行 处理、和再连接以产生pSP72-pT7- H5 Vrib-pCMV (MS90,图l)来制 备该双向栽体。再次克隆流感病毒A/PR/8/34的片段以获得各双向 T7po1驱动的流感病毒A/PR/8/34构建体。
按照厂商说明书，使用 Big Dye Terminator v3. 1 Cycle Sequencing试剂盒(Applied Biosystems) 和3100 Genetic Analyser (Applied Biosystems)对所有质粒进行测序。 用基于T7po1的系统产生重组病毒
如上所述，用5 |ig包含PR/8/34的基因片段的各单向质粒、表 达质粒HMG-PB2、HMG-PB1、HMG-PA、HMG-NP各5 jig和15 jigpAR3132 转染293 T细胞。或者，我们用5jag包含PR/8/34的基因片段的各 双向质粒和15 m g PAR3132进行转染。转染72小时后收集上清液并用 lml感染汇合的MDCK细胞单层。
病毒的感染和滴定
在接种之前，用PBS清洗MDCK细胞2次，并用lml 293T上清液 接种6孔板中的MDCK细胞汇合单层；在感染期间加入40iig胰蛋白 酶(2.5%， Bio Whittaker).将板在37 。 C ]1&存1小时并用PBS 清洗两次，之后加入2ml含有4%BSA、 100 IU/迈1青霉素、100 p g/ml 链霉素、2 mM谷氨酰胺、1.5 mg/ml碳酸氢钠、10 mM Hepes、非 必需氨基酸和20 !ig/ml胰蛋白酶的EMEM (BioWhittaker)(感染培
养基)。在感染后3天，收集培养物的上清液并检测作为细胞感染指标 的HA的活性。如前面所述(26)进行病毒滴定。筒而言之，在感染培 养基中制备转染细胞的十倍系列稀释。在接种之前，用PBS清洗细胞 两次。将100 jn 1稀释的培养上清液用于接种96孔板中的MDCK细 胞汇合单层。在37 。 C温育1小时后再次用PBS清洗细胞，并向各孔 中加入200jnl新鲜感染培养基。感染后3天，就各孔中作为细胞感染 指示剂的HA活性对培养物的上清液进行检测。根据Spearman-Karber (26)的方法从10个重复实验中计算感染性滴度。
结果
使用基于单向T7po1的反向遗传学系统的GFP小基因组测定法 构建包含pT7、 Vrib和tT7的单向载体。以有义(S)和反义 (AS )方向将GFP开放阅读框克隆入pSP72-pT7-H 5 Vrib-tT7并且具 有0、 2或3个额外的G残基(图1和附录2和3 )，所迷开放阅读框 侧翼连接有流感病毒A/PR/8/34的片段5的非编码区(NCRs)。这些 构建体分别称为S-0G、 S-2G、 S-3G、 AS-0G、 AS-2G和AS-3G 。我 们检测这些选择中产生最佳表现的选择。
我们用GFP小基因组(S-OG、 S-2G、 S-3G、 AS-0G、 AS-2G、 AS-3G)、 T7po1表达质粒(pAR3132)和4种表达PB2， PB1， PA和NP蛋白的质 粒(pHMG-PB2， pHMG-PBl， pHMG-PA， pHMG-NP)之一转染293T细胞。 作为对照，我们用省去pHMG-NP从而导致GFP小基因复制丧失的质粒 进行相同的转染。转染后30小时，在FACSCalibur中对细胞进行荧 光分析。
图2描述了所述结果。从左图可看出在以反义方向排列的、具有 两个额外的G残基的GFP小基因的转染中观察到最高比例的GFP阳性 细胞。
其它的GFP小基因组构建体也产生了稍小比例的GFP阳性细胞。 当将GFP阳性细胞的平均荧光值进行比较(图2，右图)时，具有两 个额外G残基以反义方向排列的GFP小基因组再次显示最佳的表现。
在该实验中，具有两个额外G残基以有义方向排列的GFP小基因组显 示最差的表现，而其它构建体表现适中。
尽管我们在不同的实验中在表达GFP的细胞的比例上和不同GFP 小基因组质粒之间的GFP表达水平上观察到一些变化(数据未显示)， 但具有两个额外G残基以反义方向排列的GFP小基因组总体上表现最 佳，因此选用该构建体进行随后的实验。
细胞核与细胞质T7po1表达的比较。
我们潜在地需要解决的一个问题是T7po1的表达。对于副粘病毒 反向遗传学，使用主要在细胞质中表达的T7po1，这是想要的，因为 副粘病毒的复制也发生在细胞质中。流感病毒在细胞核中复制，因此 在细胞质中表达T7po1可能不是最佳选择。因此当使用细胞质版本的 T7po1 (质粒AR3126)或包含核定位信号(NLS，质粒pAR3132)的T7po1 时，我们希望比较GFP表达水平。
该实验的结果显示于图3。当使用野生型T7po1表达质粒时，阳 性细胞中的平均GFP荧光强度是521。通过使用包含核定位信号的 T7po1可显著增加GFP的表达水平(平均荧光1106)。当将具有和不 具有核定位信号的T7po1 —起使用(1: 1比例，保持转染质粒的总量 不变)时，观察到中等的GFP表达水平(平均荧光强度为775 )。在 大量的独立实验中，使用多种GFP小基因组质粒，这些结果是可重复 的；当使用细胞核版本的T7po1时观察到GFP的表达增加2至IO倍(数 据未显示)。因此，在随后的实验中，我们使用包含核定位倌号的 T7po1,
瞬时和稳定的T7po1表达的比较
对于几种副粘病毒反向遗传学系统，不是通过质粒转染而是通过 使用允许T7po1稳定表达的细胞系提供T7po1。为进行该目的，可获 得幼年仓鼠肾细胞(BSR-T7)。我们检测BSR-T7是否能用于流感病毒 GFP小基因组的转录，所述GFP小基因组随后可被流感病毒聚合酶复 合体复制，从而导致GFP表达(图4 )。
从图4中可看到，293T细胞中高度GFP荧光强烈地依赖于T7po1
的表达。在BSR-T7细胞中，与用其中省去pHMG-NP质粒的材料的转染 相反，在用GFP小基因组与流感病毒聚合酶复合体共转染时观察到相 对较高水平的GFP表达。当加入表达细胞核版本的T7pol后，发现GFP 的表达水平甚至更高。BSR-T7细胞中相对高水平的GFP表达暗示着 T7po1的稳定表达比通过转染进行的瞬时表达更有效。然而，其中由 转染提供细胞核T7po1的实验表明对于流感病毒反向遗传学，表达 细胞核T7po1而非野生型T7po1的稳定细胞系将更有效。 用基于单向T7po1的反向遗传学系统产生重组病毒 然后，将流感病毒A/PR/8/34的基因片段克隆入pSP72-pT7-H 5 Vrib-tT7载体中以产生重组流感病毒A/PR/8/34。
我们用编码流感病毒A/PR/8/34的基因片段的8个构建体、 pT7po1 (pAR3132)、 pHMG-PBl、 pHMG-PB2、 p腦-PA和pHMG-NP转 染"3T细胞。转染后，向培养基中加入胰蛋白酶以使产生的病毒能够 复制。转染后72小时，收集上清液并用于接种MDCK细胞。接种后3 天，对这些MDCK细胞的上清液进行HA检测，其作为病毒复制的指示。 HA检测呈阳性。接着，确定293T和MDCK上清液的病毒滴度。293T 上清液中的病毒滴度显示为1.6xl(^TCID5。/ml; MDCK上清液中的病毒 滴度为2.0x107 TCID5。/ml。当转染后不向293T细胞中加入胰蛋白酶 时，在293T细胞和MDCK细胞中获得稍微下降的病毒滴度(数据未显 示)。因此这代表了第一个只是质粒重组流感A病毒的拯救，所述拯 救不使用Poll启动子。
双向T7系统
然后我们希望发展在pT7控制下的双向反向遗传学系统。通过将 pCMV克隆入pSP72-pT7-H 5 Vrib-tT7，导致载体pSP72-pT7-H 5 Vrib-tn-pCMV (图l)的产生。将侧翼连接流感病毒A/PR/8/34的片 段5的非编码区(NCRs)的GFP开放阅读框(具有2个额外G残基) 以反义方向克隆在pSP72-pT7-H 5 Vrib-tT7-pCMV内。因为我们预期该 质粒在无需通过流感聚合酶复合体复制小基因组的情况下产生GFP表
达(相对于所述小基因组，pCMV是以有义方向排列)，我们也制备了 相似的包含小基因组(0 G残基)的构建体，所述小基因组相对pT7 以有义方向排列，从而与pCMV形成反义方向排列)。将小基因组质粒 和表达细胞核T7po1的质粒和pHMG-PBl、 pHMG-PB2、 pHMG-PA和 pHMG-NP转染293T细胞。30小时后通过FACS分析细胞(图5 )。
用不完整的流感病毒聚合酶复合体和有义GFP小基因组(S-OG) 进行转染导致非常少的具有非常低的GFP表达(图5，右图)的GFP 阳性细胞(图5,左图)。在完整的流感病毒聚合酶复合体存在的情 况下，大约7%的细胞是具有平均荧光强度大约为1200的GFP阳性细 胞。通过使用反义GFP小基因组质粒，在缺少完整流感病毒聚合酶复 合体的情况下，相对较大比例的细胞(大约10%)表达GFP,但只以低 水平表达(平均GFP荧光强度为182)。当用完整的流感病毒聚合酶 复合体共转染时，表达GFP的细胞的比例不增加，但是每个细胞的GFP 表达水平显著增加(平均GFP荧光强度为1205 )。因此，从这个实验 我们可以得出结论双向表达载体是有功能的；我们观察到作为来自 pCMV的GFP mRNA产生的结果，在无需流感病毒聚合酶复合体的情况 下GFP表达水平较低。很明显，这可以通过单独地使用AS-2G GFP小 基因组质粒转染293T细胞来证实，所述转染导致相似的GFP表达水平 (约19%细胞以128的平均荧光值表达)(数据未显示)。此外，我 们观察到作为从pT7转录的小基因组的复制的结果，在流感病毒聚合 酶复合体存在的情况下GFP表达水平增加。因此，双向pT7-pCMV表达 质粒是有功能的。
用基于双向T7po1的反向遗传学系统产生重组病毒
然后，将流感病毒A/PR/8/34的基因片段克隆入载体 pSP72-pT7-貼Vrib-tT7-pCMV中以产生重组流感病毒A/PR/8/34。
我们用编码流感病毒A/PR/8/34的基因片段和pT7po1 (pAR3132) 的8个构建体转染293T细胞。转染后，向培养基中加入胰蛋白酶以允 许所产生的病毒复制。转染后72小时，收集上清液并用于接种MDCK 细胞。接种后3天，对这些MDCK细胞的上清液进行HA检测，其作为
病毒复制的指示。所述HA检测呈阴性，表明没有重组病毒被回收。 根据使用双向载体表达PB2、 PB1、 PA和NP基因的小基因组报道
测定，我们获得证据来自这些质粒的蛋白表达非常低(数据未显示)。 我们假设tT7序列干扰从pCMV的转录，导致被编码的基因的产量较低。 因此我们产生新的双向质粒，在该质粒中tT7序列-陂除去 (pSP72-pT7-H5Vrib-pCMV)。将流感病毒A/PR/8/34的基因片段克 隆入载体pSP72-pT7-H 5 Vrib-pCMV以产生重组流感病毒A/PR/8/34。 在最初的努力中，再次未产生重组病毒。然而，当对用于转染的质粒 量进行一些优化后，我们成功地产生了重組病毒。用于该实验的质粒 的量是编码PB2、 PB1、 PA和HA的各构建体各10jig和编码NP、 NA、 MA和NS的各构建体各5pg。尽管不能检测到293T细胞中的重组 病毒滴度，但随后MDCK细胞的接种产生具有1.3 x 105 TCID50/ml 的初始滴度的病毒。
MDCK细胞中的T7po1系统
为给基于T7po1的反向遗传学系统的通用特性提供进一步的证 据，我们检测MDCK细胞而非293T细胞中的GFP小基因组的复制。尽 管使用BSR-T7细胞的实验已提供了证据T7po1反向遗传学系统在非 灵长类动物来源的细胞中发挥作用(图4)，但MDCK更广泛地用于流 感病毒研究和疫苗生产。
如可在图6中看到的，发现基于T7po1的反向遗传学系统在MDCK 细胞中具有功能。与BSR-T7细胞(图4)中的结果相结合，这些实验 表明T7po1反向遗传系统确实代表着"通用"系统，可用于广泛的细 胞类型.根据该实验，可以认为可以从非灵长类动物细胞中生产重组 流感病毒。
此处我们已第一次显示，使用基于T7po1的系统可在293T细胞 中产生重组流感病毒A/PR/8/34 (MDCK-适应性NIBSC林系)。然而， 并不假定将这些方法的应用限定于流感病毒A/PR/8/34;其可用于所 有A、 B和C型流感病毒以及其它片段化负链RNA病毒。也没有假定将 这些方法的应用限定于293T细胞、BSR-T7细胞和MDCK细胞；可通
过例如广泛的细胞系的转染来提供T7po1，在所述细胞系中可产生重 组病毒。
用于该基于T7pol的反向遗传学系统技术学的质粒栽体和其包含 的元件也具有明显的灵活性。此处，我们使用噬菌体T7的RNA聚合酶 产生vRNA或cRM样RNA分子，但也可使用各种其它的RNA聚合酶例 如噬菌体SP6 RNA聚合酶。在此处显示的实验中，T7RNA聚合酶经修 饰包含SV40大T抗原的核定位信号，但可使用各种其它核靶向信号(例 如，hnRNPK蛋白的核耙向信号)修饰RNA聚合酶。我们在此使用S型 肝炎病毒的核酶序列，但已描述了其它可选择使用的核酶序列。最后， 此处描述的系统不依赖于流感病毒聚合酶蛋白质表达栽体的应用，所 述表达载体基于小鼠羟基甲基戊二酰辅酶A还原酶启动子(pHMG构建 体)；可使用来自广泛的流感病毒的聚合酶蛋白，并且可使用广泛的 表达载体表达所述聚合酶蛋白。
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实施例2
如上所述基于相关流行性病毒(例如A/Moscow/10/99)的HA和NA 基因和高生产能力的病毒主链(例如来源于疫苗林系A/PR/8/34)生 产重组病毒。在通过转染产生重组病毒后，在合适的细胞基质(例如， 鸡蛋、MDCK细胞、Vero细胞)中扩增所述病毒以达到足够高的量。当 在含胚鸡蛋中扩增时，通过在1000x g下离心IO分钟和通过O. 45微 米的过滤器过滤来清除尿囊液体。通过在4t:下在150. OOOx g下离心 1. 5小时沉淀所述病毒并重新悬浮于磷酸緩冲盐溶液(PBS)中。然后 用2%的癸酰基-N-曱基葡糖胺(MEGA)处理病毒，将病毒加在一层25% 的PBS中的蔗糖上并在4"C下在250. OOOx g下离心1. 5小时。
然后将含有HA和NA蛋白的最上层对PBS进行透析并用12. 5%的 经考马斯亮蓝染色的SDS聚丙烯酰胺凝胶确定蛋白制剂的纯度和量。 用大约IO微克HA/NA蛋白肌内免疫白鼬。如果想要，可使用连续多剂 或使用佐剂(MF59、 ISCOM)进行接种。使用血凝抑制测定法、神经氨酸 酶抑制测定法、ELISA、病毒中和测定法等确定接种前和接种后收集的 血清样品中的抗HA和NA抗体的滴度。在接种后6周，使用1 x 10E5 50%组织培养半感染剂量(TCID-50 )的流感病毒A/Moscow/10/99或异 源病毒分离林攻击接受接种的动物和对照动物。攻击后，IO天内每天 从动物收集鼻或咽拭抹样品，通过定量PCR分析或病毒滴定确定由接 受感染的动物分泌的病毒量.因此，通过对抗体滴度和抗所述攻击病 毒感染的保护水平的增加进行定量来确定获得的疫苗诱导的免疫性。
权利要求
1. 包含流感基因片段和噬菌体聚合酶启动子的核酸或所述核酸的互补链。
2. 权利要求l的核酸，其不包含噬菌体聚合酶终止子。
3. 权利要求1或2的核酸，在其与启动子相邻的位置被提供以 至少一个额外的鸟嘌呤残基。
4. 权利要求3的核酸，在其与启动子相邻的位置被提供以两个 额外的鸟嘌呤残基。
5. 权利要求1至4中任一项的核酸，所述核酸包含来源于流感 病毒的基因片段，所述流感病毒由WHO推荐用于疫苗目的。
6. 权利要求1至5中任一项的核酸，所述核酸包含A型流感病 毒基因片段。
7. 权利要求1至6中任一项的核酸，其中所述噬菌体聚合酶是 T7聚合酶。
8. 被提供以至少一个权利要求1至7中任一项的核酸的细胞。
9. 被额外地提供以噬菌体聚合酶的权利要求8的细胞。
10. 权利要求9的细胞，其中所述聚合酶包含核定位信号。
11. 权利要求8至10中任一项的非灵长类动物细胞。
12. 权利要求ll的细胞，所述细胞是MDCK细胞或CEF细胞。
13. 权利要求8至12中任一项的细胞，所述细胞未提供以辅助病毒。
14. 权利要求8至13中任一项的细胞，其中所述噬菌体聚合酶是 T7聚合酶。
15. 包含权利要求1至7中任一项的核酸的病毒颗粒。
16. —种组合物，所述组合物包含权利要求8至14中任一项的细 胞或来自所述细胞的材料或来自权利要求15的病毒颗粒的病毒或材 料。
17. 权利要求16的组合物用于生产药物组合物的用途，所述药物 组合物用于产生抵抗流感病毒感染受试者的免疫学保护作用。
18. 用于产生抵抗流感病毒感染受试者的免疫学保护作用的方 法，其包括为有此需要的受试者提供权利要求16的组合物。
19. 被提供以噬菌体聚合酶，优选T7聚合酶的Madin Darby犬肾 (MDCK)或鸡胚成纤维(CEF)细胞。
20. 被提供以核酸或所述核酸的互补链的权利要求19的细胞，所 述核酸包含流感基因片段和噬菌体聚合酶启动子。
全文摘要
本发明涉及流感疫苗生产领域。流感疫苗已在含胚鸡蛋中生产了50多年，但近来对发展用于疫苗生产的细胞培养系统作出了相当多的努力。本发明提供了核酸或所述核酸的互补链以及细胞，所述核酸包含流感基因片段和噬菌体聚合酶启动子，所述细胞包含这样的能够产生想要的流感病毒的核酸。此外，本发明提供了组合物，所述组合物包含细胞或来自本发明的细胞的材料以及来源于本发明的病毒颗粒的病毒或材料。
文档编号C12N7/00GK101379183SQ200580044751
公开日2009年3月4日 申请日期2005年12月22日 优先权日2004年12月24日
发明者A·D·M·E·奥斯特霍斯, E·德维特, M·I·J·斯普隆肯, R·A·M·福切尔 申请人:索尔瓦药物有限公司;伊拉斯谟大学鹿特丹医药中心