具有干燥的基因沉默组合物的仪器和系统的制作方法

专利名称：具有干燥的基因沉默组合物的仪器和系统的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种用于RNA干扰的仪器和系统。具体来说，本发明涉及一种包括多孔板的仪器和系统，该多孔板具有含有siRNA的干燥的基因沉默组合物。
2.相关的技术 最近，发现了一种使用转录的微小RNA(“miRNA”)来控制蛋白质生产的天然细胞调控通路。该miRNA包括一个有义和反义RNA组成的双链区域。这个调控通路使用miRNA来靶向互补的mRNA以抑制该编码蛋白质的生产。相应地，一个复杂系列的蛋白质参与到这个RNA干扰通路中以抑制或者阻止由mRNA编码蛋白质的生产。因而，该过程被称为RNA干扰或者RNAi。
另外，已经发现该RNAi通路能够使用合成的dsRNA(例如，siRNA)来沉默基因和抑制蛋白质的表达。这样就可以制造具有特异序列的siRNA以靶向编码特定蛋白质的互补DNA和/或mRNA。该siRNA可以与天然的RNAi通路相互作用以沉默靶基因并且抑制其编码多肽的生产。该沉默特异基因并抑制其编码蛋白质生产的能力已经被用于基础研究，例如基因功能、基因定位、细胞通路的分析以及其它与基因相关的研究。
为了诱导基因沉默，需要将siRNA导入细胞。尽管将核酸导入细胞的最常用方法是正向转染(forward transfection)，但新近开发出的反向转染(“RTF”)已经用来代替正向转染方法。在某些的RTF操作方案中，可以制备脂质-核酸的复合物(例如，lipoplex)并且引入到多孔板上的测试孔中。将细胞引入具有脂质-核酸复合物的测试孔中，温育就可以使siRNA进入细胞。一些RTF操作方案的例子可以在下述文献中找到Palsson的美国专利号5,811,274，Palsson的5,804,431以及Sabatini的6,544,790，Sabatini的已经公布的美国申请2002/0006664以及Caldwell等人的2003/070642。正如这些参考文献所描述的，用于核酸的RTF方法通常可以具有比传统的正向转染更少的步骤并且有益于分离已被转染的细胞至单一表面--例如载玻片--的特定区域。然而用于siRNA的RTF方法还没有优化到实际应用的程度，并且仍需要对基因沉默功效进行改进，尤其在那些使用多钟不同的siRNAs、不同的基因靶目标、或者不同的细胞系的情形更是如此。
因此，获得一种用于将siRNA转运入细胞并通过RNAi途径产生基因沉默的改良RTF操作方案是有益的。另外，将RTF方式(包括RNAi)调配成提高基因沉默功效的方式是有益的。
发明概述 总的来说，本发明的具体实施方案中包括多孔板、试剂盒、系统以及相应的使用方法以在细胞中引起基因沉默。相应地，本发明提供多孔板、试剂盒以及系统，其构成了用于递送siRNA进入细胞并通过RNAi途径引起基因沉默的改进的RTF操作方案。另外，该多孔板、试剂盒以及系统可包括在RTF操作方案中应用的以在反向转染期间提高稳定性的方式而配置的siRNA。此外，本发明包括使用所述的多孔板、试剂盒以及系统的方法。
在一个具体实施方案中，本发明包括一个被配置用于引导siRNA进入细胞以引起基因沉默的反向转染仪器。此仪器包括一个多孔板，该多孔板具有配置用于转染细胞的孔。该孔包括一个基本上干燥的基因沉默组合物，其具有至少一种用于沉默至少一种第一靶基因的第一siRNA。该基因沉默组合物是按照使siRNA能够以足够转染孔中细胞的量溶解或者悬浮于含水培养基中配置的。可选择地，基因沉默组合物中siRNA的总量足以用于在一个孔中进行反向转染。另外，可选择地该siRNA可具有带有一个环的发卡结构、修饰或者结合物中的至少一种。并且，可以合理地(rationally)设计siRNA使之以不会诱导对非靶基因的显著沉默的有效方式特异地沉默靶基因，而。此外，该基因沉默组合物可以包括一个siRNAs库，其靶向同一靶基因的不同多核苷酸。
在一个具体实施方案中，本发明提供一试剂盒或者系统，其包括一个具有与上述任意特性一致的多孔板。另外，这样的一个试剂盒或者系统可以包括多核苷酸载体。该多核苷酸载体可以是阳离子脂质体、多聚体、多肽、脂多聚体(lipopolymer)、脂质-多肽复合物等等。另外，该试剂盒或者系统包括多种增溶的溶液、试剂、细胞培养基等等，在此将更详细地论述。
在一个具体实施方案中，本发明包括一种以用于将siRNA引入细胞而引起基因沉默的反向转染方法。此方法包括提供一个具有上文表征的多孔板。可向该孔中添加一种含水培养基以便悬浮或者溶解该基因沉默组合物和/或siRNA于该溶液。另外，细胞在允许siRNA进入细胞的条件下被添加至该孔中。例如，细胞可以每大约0.3平方厘米至大约0.35平方厘米细胞生长表面积大约1×103至大约3.5×104个细胞添加至96孔板的不同孔中，或更优选的是2×103至大约3×104个细胞。
在一个具体实施方案中，该方法包括向孔中添加一个多核苷酸载体以便形成siRNA-载体复合物。该siRNA-载体复合物可以是悬浮或者溶解在含水培养基中，并且可以与细胞接触并可通过任意的内吞作用过程来诱导进入该细胞。因此，该多核苷酸载体可以作为含水培养基的一部分或者另外添加至该孔中。该多核苷酸载体可以是阳离子脂质，多聚体，脂多聚体，多肽，抗体-多肽结合物等等。另外，还可以使用其他多核苷酸转运方法将siRNA转运入细胞，包括电穿孔法，沉淀法，物理轰击，光穿孔(optoporation)等等。
在孔中细胞与siRNA组合物结合之后，将多孔板在一定条件下温育，使细胞生长、分裂和/或发生基因沉默。所述的一定条件即是本领域公知的常用的普通细胞培养条件。这样，siRNA可以沉默靶基因并且抑制至少50％，更优选地至少70％，并且最优选地至少90％的靶多肽的生产。
这些及其它具体实施方案以及本发明的特征将在下面的说明书和所附的权利要求中得到充分体现，或者可以通过下文所述的本发明的实例中获悉。
附图简述 为了更进一步地阐明本发明的以上所述的及其它的优点和特征，通过参考附图所说明的特定具体实施方案可以提供一份更详细的本发明的描述。值得注意的是这些附图仅仅描述的是本发明的典型具体实施方案并不限定本发明的范围。通过使用附图，本发明可以用附加的特性和细节来描述和解释，其中

图1A是显示一个将siRNA安装在多孔板上的具体实施方案的示意图，其中siRNA库(“P1”)与组成该库(例如，1A-1N，2A-2N，3A-3N)的单独siRNA一起被置于多孔板上。
图1B是显示一个将siRNA安装在多孔板上的具体实施方案示意图，其中多于一个的库(P1和P2)与组成该库(例如，1A-1N，2A-2N，等等)的单独siRNA和对照(例如，Tc1，Tc2，和Tc3)一起被置于多孔板上。
图2A-2F是通过细胞生活力和基因沉默功效来比较DNA和RNA的RTF的具体实施例的图示。图2A是在正向转染操作方案中的荧光素酶表达的具体实施方案，其中HeLa细胞以每孔10,000个的数量置于PLL板中并且用LIPOFECTAMINETM2000-pCMV-Luc复合物转染以证明该pCMV-Luc表达载体的功能。图2B是在图2A描述的条件下来研究细胞生活力的一个具体实施方案，其中Y轴代表存活率的相对水平，1.0表示100％生活力。图2C是用使用多种脂质(LIPOFECTAMINETM 2000，OLIGOFECTAMINETM，Transit TKO，和siRNA168(168))和质粒浓度的pCMV-Luc质粒反向转染操作方案的具体实施方案，其中HeLa细胞是每孔10,000个细胞，并且荧光素酶表达水平是在利用STEADYGLOWTM试剂盒24小时后测定的。图2D是是在图2C描述的条件下研究细胞生活力的一个具体实施方案，其中1.0表示100％生活力。图2E是利用LIPOFECTAMINETM 2000，OLIGOFECTAMINETM，TKO或siRNA168脂质进行基因沉默的环3siRNA(cyclo 3 siRNA)的反向转染的具体实施方案，其中Y轴代表与对照相比的基因表达水平，1.0是100％表达。图2F是由图2E中所描述的条件下的细胞生活力结果的具体实施方案。
图3A-3F是关于在siRNA RTF中siRNA功能的效果的具体实施方案的图示。四种具有不同的沉默功能(例如，分别为95％，90％，75％，和＜50％的沉默)的不同siRNA(例如，cyclo 3，14，28，和37)以不同的浓度涂布用于RTF。加入不同量的DharmaFECTTM1脂质使得每100微升(“μL”)含有0-0.5微克(“μg”)的脂质。siRNA的溶解以及复合之后，每孔添加10,000个HeLa细胞并培养(例如，1、2或4天)。以RTF方式进行的siRNA的功能的效果是通过分析在图3A、3C和3E中的亲环素B沉默，以及在图3B、3D和3F中细胞生活力来评价的。对于细胞存活率测量，Y轴代表存活率的相对水平，1.0是100％生活力。对于基因沉默，Y轴代表与对照相比的基因表达水平，1.0是100％表达。
图4通过微阵列分析确定siRNA诱导的非靶向沉默的具体实施方案的热图(heatmap)。由括号区域突出显示的顶部浅色线代表下调的基因，其被未修饰的IGFR1-73 siRNA非目标靶向。该底线表明当IGFR1-73 siRNA进行化学修饰后非靶向的数目显著地减少。
图5是化学修饰的siRNA对细胞生活力的影响的具体实施方案的图示。
图6是溴化乙锭染色凝胶显示修饰的和未修饰的siRNA降解率的具体实施方案的图像，其中包括用重叠线来更好地显示非降解siRNA。
图7提供了通过显示四种不同的修饰的和未修饰的siRNA的降解动力学来评估血清中的RNA酶是否具有降解未修饰的和修饰的siRNA能力的具体实施方案的图示。
图8是未修饰的和稳定修饰的siRNA的沉默持久性的具体实施方案的图示，其中DF1是DharmaFECTTM1。
图9A是使用LIPOFECTAMNETM 2000以及稳定的和不稳定的siRNA的细胞生活力的具体实施方案的图示。
图9B是图9A所示条件下基因沉默的具体实施方案的图示。
图10A是使用TKO以及稳定的和不稳定的siRNA的细胞生活力的具体实施方案的图示。
图10B是图10A所示条件下基因沉默的具体实施方案的图示。
图11A是使用DharmaFECTTM1以及稳定和不稳定的siRNA的细胞生活力的具体实施方案的图示。
图11B是图11A所示条件下基因沉默的具体实施方案的图示。
图12是使用单个和成库的siRNA进行多基因沉默具体实施方案的图示。
图13A是多种DharmaFECTTM1(“DF1”)浓度和对照siRNA浓度的siRNA RTF对实验第2天的每个孔中5,000个HeLa细胞产生基因沉默的具体实施方案的图示。
图13B是图13A条件下细胞生活力的图示。
图14A是多种DharmaFECTTM1(“DF1”)浓度和对照siRNA浓度的siRNA RTF对实验第4天的每孔中5,000个HeLa细胞产生基因沉默的一个具体实施方式
的图示。
图14B是图14A条件下细胞生活力的图示。
图15A是多种DharmaFECTTM1(“DF1”)浓度和对照siRNA浓度的siRNA RTF对实验第8天的每孔中5,000个HeLa细胞产生基因沉默的一个具体实施方式
的图示。。
图15B是图15A条件下细胞生活力的图示。
图16A是多种DharmaFECTTM1(“DF1”)浓度和对照siRNA浓度的siRNA RTF对实验第1天的每个孔中10,000个HeLa细胞产生基因沉默的一个具体实施方式
的图示。。
图16B是图16A条件下细胞生活力的图示。
图17A是多种DharmaFECTTM1(“DF1”)浓度和对照siRNA浓度的siRNA RTF对实验第2天的每个孔中10,000个HeLa细胞产生基因沉默的一个具体实施方式
的图示。。
图17B是图17A条件下细胞生活力的图示。
图18A是多种DharmaFECTTM1(“DF1”)浓度和对照siRNA浓度的siRNA RTF对实验第4天的每个孔中10,000个HeLa细胞产生基因沉默的一个具体实施方式
的图示。。
图18B是图18A条件下细胞生活力的图示。
图19A是多种DharmaFECTTM1(“DF1”)浓度和对照siRNA浓度的siRNA RTF对实验第1天的每个孔中20,000个HeLa细胞产生基因沉默的一个具体实施方式
的图示。
图19B是图19A条件下细胞生活力的图示。
图20A是多种DharmaFECTTM1(“DF1”)浓度和对照siRNA浓度的siRNA RTF对实验第2天的每个孔中20,000个HeLa细胞产生基因沉默的一个具体实施方式
的图示。
图20B是图20A条件下细胞生活力的图示。
图21A是多种DharmaFECTTM1(“DF1”)浓度和对照siRNA浓度的siRNA RTF对实验第1天的每个孔中40,000个HeLa细胞产生基因沉默的一个具体实施方式
的图示。
图21B是图21A条件下细胞生活力的图示。
图22是具有不同LIPOFECTAMINETM2000浓度和对照siRNA浓度(例如修饰的siRNA和未修饰的)的细胞培养基和缓冲液的siRNA RTF对细胞生活力影响的具体实施方式
的图示。
图23A是使用多种LIPOFECTAMINETM2000和DharmaFECTTM1(“DF1”)浓度以及多种对照siRNA浓度(例如靶向SRD5al基因的修饰的siRNA和未修饰的siRNA)的siRNA RTF对细胞生活力的一个具体实施方式
的图示。
图23B是图23A条件下基因沉默的具体实施方案的图示。
图24A-24C是在siRNA RTF操作方案中比较针对不同浓度的GAPDH、MAP2K2以及MAP2K1的单个siRNA和siRNA库的效力的具体实施方式
的图示。
图25A-25C是在siRNA RTF操作方案中比较针对不同浓度的接GAPDH、MAP2K2以及MAP2K1的单个siRNA和siRNA库的效力的具体实施方式
的图示。图25A显示在有GAPDH双链体1、MAP2K2双链体1以及MAP2K1双链体1(1，1&1)存在的情况下GAPDH的敲低(knockdown)；以及在有GAPDH双链体2、MAP2K2双链体2以及MAP2K1双链体2(2，2&2)存在的情况下GAPDH的敲低；以及在有GAPDH双链体4、MAP2K2双链体4以及MAP2K1双链体3(4，4&3)存在的情况下GAPDH的敲低；以及在有GAPDH双链体5、MAP2K2双链体7以及MAP2K1双链体4(5，7&4)存在的情况下GAPDH的敲低；以及在有由之前提到所有的双链体组成的GAPDH、MAP2K2以及MAP2K1库存在的情况下GAPDH的敲低。图25B显示在所有图25A中描述的双链体组合存在条件下MAP2K2的敲低。图25C显示在所有图25A中描述的双链体组合存在条件下MAP2K1的敲低。
优选实施方案的详述 总的来说，本发明涉及一种用于在细胞中实现基因沉默的仪器和系统。其仪器包括孔中具有包含有siRNA的干燥基因沉默组合物的多孔板，此组合物在用于RTF操作方案中时可以是溶解或者是悬浮的。其系统，可以以试剂盒形式提供，包括多孔板和多核苷酸载体，该载体可以与siRNA结合从而形成能够进入细胞的转染复合物，从而转运siRNA。另外，试剂盒包括siRNA的增溶用含水培养基或者悬浮用含水培养基、在相应载体溶液中的多核苷酸载体以及细胞培养基等等。
本发明的多孔板、系统、试剂盒以及方法可以配置而在使用或不使用实验室自动化设备的高容量筛选(“HCS”)和高通量筛选(“HTS”)中使用。并且，该多孔板、系统、试剂盒和方法还可以和自动化系统一起使用，例如机器人系统。然而，该多孔板、系统、试剂盒和方法也可以在没有自动化递送系统或者机器人的辅助下用于RTF操作方案，这样便为手工操作的实验室提供了一种有效替代昂贵机器人递送系统的方法。因而，该多孔板、系统、试剂盒以及方法提供多种选择使得高通量筛选可通过更经济的方式实现。
在本文定义的下列术语用辞是用于阐明描述本发明具体实施方案所使用的术语而不用来限制其范围。因此提供的下列术语用辞是用于帮助相关领域技术人员对这些词语的理解。
在本文使用的术语”2’修饰”是指发生在核苷酸第二位原子上的化学修饰。因此，2’修饰可以包括化学修饰基团与核苷酸的核糖环的2’碳的结合，或者与寡核苷酸或多核苷酸中的核苷酸的2’碳相结合。因此，2’修饰发生在核苷酸的2’位原子上。
在本文使用的术语“脂肪族的”是指一种烃基部分，例如一种烷基，其可以是直链的或者支链的、饱和的或者非饱和的、和/或取代的或者未被取代的，其主链上具有二十个或更少的碳或者杂原子。脂肪族基团可以包括直链的、支链的、环状的和/或杂环的基团，可以包括功能性基团例如醚、酮、醛、羧化物等等。在脂肪族基团内的取代可以包括任意脂肪族基团可容许原子或者基团，包括但不限于卤素、硫、硫醇、硫醚、硫酯、胺(伯、仲或者叔)、酰胺、醚、酯、醇、氧等等。而且，脂肪族基团也可以容纳异种取代，其是通过例如氮、氧、磷或者硫等杂原子对于碳原子的取代。
在本文使用的术语“烷基”是指在一条链上兼备碳和氢的烃基部分。优选地，烷基部分仅仅由氢和碳组成。烷基部分可以是直链性的、分枝的和/或环状的。优选地该烷基部分是非支链的和非环状的，是完全地饱和的，并且是未被取代的。
示例性的烷基包括但是不局限于以下部分，例如，甲基、乙基、丙基、丁基、戊基、己基、庚基、辛基、壬基、癸基、十一基、十二烷基、十三烷基、十四烷基、十五烷基、十六烷基、十七烷基、十八烷基、十九烷基、二十烷基和具有更多碳原子数的烷基，以及2-甲基丙基、2-甲基-4-乙基丁基、2，4-二乙基丙基、3-丙基丁基、2，8-二丁基癸基、6，6-二甲基辛基、6-丙基-6-丁基辛基、2-甲基丁基、2-甲基戊基、3-甲基戊基、2-乙基己基、异丙基、异丁基、异戊基等等。术语烷基也包括烯基基团，例如乙烯基、烯丙基、芳烷基和炔基基团。可以用任意合适的原子置换烷基，只要这样的置换不会与烷基被替换分子的功能发生实质上的抵触。
在本文使用的术语“反义链”是指一个至少基本上(例如，大约80％以上)互补于或者100％互补于所感兴趣的靶核酸的多核苷酸或者多核苷酸区域。并且，dsRNA的反义链和其有义链是互补的。反义链可以由一个多核苷酸区域组成，该多核苷酸是RNA、DNA或者嵌合的RNA/DNA。另外，在反义链之内的任意核苷酸可以通过包括与其偶联的取代基(例如2’修饰)而被修饰。反义链可以被不同类的小分子和/或结合物来修饰。例如，反义链可以是完全或者部分地互补于信使RNA(“mRNA”)分子，非mRNA的RNA序列包括非编码RNA(例如，tRNA和rRNA)，或者编码或非编码的DNA序列。术语“反义链”和“反义区域”是同等的并且可互换地使用。
在本文使用的术语“互补(的)”和“互补性”是指多核苷酸相互间形成碱基对的能力。碱基对一般地是由在反向平行多核苷酸链上的核苷酸单位之间形成氢键而形成的。互补的多核苷酸链可以按照Watson-Crick方式(例如，A对T，A对U，C对G)，或者其它任意允许二聚体形成的方式形成碱基对。正如所属技术领域的技术人员所熟知的，当使用RNA与DNA相对应时，尿嘧啶是与腺嘌呤核苷的互补碱基，而不是胸腺嘧啶。
完全互补或者100％互补是指那种一个多核苷酸链的每个核苷酸单元都可以与反向平行的多核苷酸链的核苷酸单元形成氢键的情况。不够理想的互补是指那种两个链的一些而不是所有的核苷酸单元可以互相形成氢键的情况。例如，对于两个20单体的多核苷酸链，如果只有每个链的两个碱基对可以互相形成氢键，该多核苷酸链展现出10％的互补性。在相同的例子中，如果每个链的18个碱基可以互相形成氢键，该多核苷酸链展现出90％的互补性。“基本互补”是指多核苷酸链展现79％或者更高的互补性，其中排除多核苷酸链中的一些区域，例如突出端，该突出端是经过挑选以造成非互补性的。相应地，互补性并不考虑经挑选出来的且不与反向平行链的核苷酸相似或互补的突出端。
在本文使用的术语“结合物”是指一个分子、大分子或者大分子结构，其与siRNA的有义链或者反义链偶联。也就是说，与siRNA偶联在一起的部分被认为是结合物。为了澄清的目的，siRNA可以包括通过共价键、离子相互作用等偶联的结合物。通常，结合物结合至siRNA是为了赋予功能，而不是增加稳定性或者靶特异性。例如，结合物如胆固醇，可用于提高siRNA进入细胞的能力。其他的结合物可以是用于检测转染或者细胞中siRNA的标签。通常，结合物是通过接头基团与siRNA偶联在一起。
在本文使用的术语“脱氧核苷酸”是指在其糖基部分2’位置上缺乏一个羟基(例如，OH基团)的核苷酸。作为替代，一个氢结合到2’碳。因此，包含一或多个脱氧核苷酸的RNA分子是指在糖基部分中2’的位置缺乏OH基团，并且有一个氢直接地结合至2’位碳。相似地，术语“脱氧核糖核苷酸”和“DNA”包括至少一个在2’位置具有一个氢的糖基部分的核糖核苷酸或者多核糖核苷酸。
在本文使用的用于表述基因沉默组合物相关的术语“干燥的”或者“干”是指一种非液体的并且非流动的组合物。然而，这并未排除少量的水或者其它的溶剂，并且包括保留在RNA制品中的水，该制品已在标准或环境条件下平衡，例如在一个大气压，室温，并且环境湿度下，以使得该制品基本上不是一种液态，反而在孔中是“干燥的”。例如，siRNA制品是“干燥的”或者基本上“干燥的”是指比如在大约一个大气压，在大约20到40摄氏度，以及大约50到95％湿度条件下，该制品是平衡的，并且当多孔板翻转或者从水平位置倾斜例如90度时，该RNA制品在孔内不会移动或者流动。这是与倾斜时会流动或流出的液体制品相比较而言的。在不同的具体实施例中，使用该干基因沉默组合物进行转染的方法包括在合适的含水培养基中溶解或者悬浮该干制品以形成混合物。另外，合适的含水培养基包含一种多核苷酸载体，其能够促进引导该siRNA进入细胞并且将一或多个细胞暴露于该混合物中以实现转染。
在本文使用的术语“双链体区域”是指在两个互补的或者基本上互补的多核苷酸中通过Watson-Crick碱基配对或者其它任意可以在多核苷酸链之间形成稳定双链的方式彼此形成碱基对的区域。例如，一个具有21个核苷酸单元的多核苷酸链可以同另一个具有21个核苷酸单元的多核苷酸进行碱基配对，而每个链上仅有19个碱基是互补，所以其“双链体区域”具有19个碱基对。该剩余的碱基可以出现在例如5’和/或3’突出端。此外，在双链体区域内，并不需要100％互补，双链体区域基本互补便可。基本互补是指79％或者更高的互补，其原因可以是错配和/或凸起。例如，在一个由19个碱基对组成的双链体区域中，单一错配导致94.7％的互补，将该双链体区域称为基本上互补。
在本文使用的术语”功能性”是指siRNA诱导的基因特异性沉默的水平。通常，功能性是用基因沉默百分比来表示。这样，一个基因的90％沉默(例如，F90)是指该基因的表达仅有正常水平的10％。相似地，一个基因的80％沉默(例如，F80)是指该基因的表达仅有正常水平的20％。
在本文使用的术语”基因沉默”是指一种通过减轻、减弱和/或终止来抑制特定基因产物表达的方法。基因沉默可以通过多种途径产生。例如，基因沉默可以指由RNAi途径导致的基因产物表达的减少，其中siRNA与宿主蛋白质(例如，RISC)以序列依赖的方式协力降解mRNA。另外，基因沉默可以指由siRNA介导的翻译抑制所产生的基因产物表达减少。再另外一种情况，基因沉默可以指由siRNA介导的转录抑制所产生的基因产物表达减少。基因沉默的水平可以通过各种方法来测量，其中包括通过Northern印迹分析、B-DNA方法、转录-敏感的报告子构建体、表达谱(例如，DNA芯片)以及相关技术和分析来测量转录本水平。另外，基因沉默的水平可以通过估量特定基因所编码并由相应mRNA翻译的蛋白质的水平来测量。这可以通过许多方法来完成，其中包括Western分析、测量报告蛋白质的表达水平，例如其比色或者荧光性质(例如，GFP)，酶活性(例如，碱性磷酸酯酶)或者其它公知的分析方法。
在本文使用的术语“核苷酸间连接”是指一个多核苷酸中的两个核苷酸单元之间的一种键或者链接，其中该链接可以是修饰的或者未修饰的。短语“修饰核苷酸间链接”包括所有现在已知的或者以后开发的经修饰的核苷酸间连接。核苷酸间连接可以具有相关的平衡离子，并且该短语意味着包括这样的平衡离子和任意的可以在核苷酸间形成连接的配位复合物。
在本文使用的术语“错配”包括有义链的核苷酸与反义链的核苷酸之间并不产生Watson-Crick碱基配对的情况，其中该未配对核苷酸的两侧是双链体，其包含位于直接开始于该未配对核苷酸之后(例如，在5’方向)的错配的5’方向上的碱基对以及位于直接开始于该未配对核苷酸之后(例如，在3’方向)的错配的3’方向上的碱基对。错配的例子是A和G相对应、C和A相对应、U和C相对应、A和A相对应、G和G相对应、C和C相对应等等。错配也意味着包括非碱基残基和核苷酸或者修饰的核苷酸对应、非环形残基和核苷酸或者修饰的核苷酸对应、缺口或者不成对的环。广义而言，在此使用的错配包括在给定位置的任意变更，其减少了该位置或其附近的热力学稳定性，这样使得该特定位置的的双链体热力学稳定性低于该位置形成Watson-Crick碱基对时的热力学稳定性。
在本文使用的术语“核苷酸”是指核糖核苷酸、脱氧核糖核苷酸或者它们的修饰形式，以及它们的类似物。核苷酸包括嘌呤，例如腺嘌呤、次黄嘌呤、鸟嘌呤以及它们的衍生物和类似物，而且还包括嘧啶，例如胞嘧啶、尿嘧啶、胸腺嘧啶以及它们的衍生物和类似物。核苷酸是本领公知的。核苷酸类似物包括具有对碱基、糖和/或磷酸盐的化学结构进行修饰的核苷酸，包括但不限于5’-位置的嘧啶修饰、8’-位置的嘌呤修饰、胞嘧啶环外的胺的修饰、5-溴尿嘧啶的取代，和2’-位置的糖基修饰(例如，2’修饰)。这样的修饰包括糖基修饰的核糖核苷酸，其中2’-OH被下述基团所取代H，或者，R、卤素、SH、SR、NH2、NHR、NR2或者CN，其中R是烷基或者脂肪族的部分。核苷酸类似物也包括具有例如次黄嘌呤核苷、Q核苷、黄嘌呤等的碱基，如2’-甲基核糖等的糖基，如膦酸甲酯、硫逐磷酸酯等非天然的磷酸二酯键和多肽的核苷酸。并且，位于第一位置的核苷酸或者第一核苷酸是指核苷酸双链体区域的5’-端位置的核苷酸，有鉴于此，第二核苷酸是第一核苷酸3’端的下一个核苷酸。在双链体区域延伸至siRNA末尾的情况中，其5’末端核苷酸是第一核苷酸。
在本文使用的术语“修饰的碱基”是指下述的核苷酸碱基，例如已经通过置换或添加一个或多个的原子或者基团进行修饰的腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶、尿嘧啶、黄嘌呤、次黄嘌呤核苷和Q核苷。碱基部分修饰类型的一些例子包括但是不局限于单独地或者组合式地烷基化、卤化、硫醇化、氨化、酰胺化或者乙酰化的碱基。更具体的例子包括，例如，5-propynyluridine、5-propynylcytidine，6-甲基腺嘌呤、6-甲基鸟嘌呤、N，N-二甲基腺嘌呤、2-丙基腺嘌呤、2-丙基鸟嘌呤、2-氨基腺嘌呤、1-甲基肌苷、3-甲基尿嘧啶核苷、5-甲基胞苷、5-甲基尿嘧啶核苷及其他具有5位置修饰核苷酸，如5-(2-氨基)丙基尿嘧啶核苷、5-卤代胞苷、5-卤代尿苷、4-乙酰胞苷、1-甲基腺苷、2-甲基腺苷、3-甲基胞苷、6-甲基尿嘧啶核苷、2-甲基鸟苷、7-甲基鸟苷、2，2-二甲基鸟嘌呤核苷、5-甲基氨基乙基尿苷、5-甲氧基尿苷、脱氮核苷酸例如7-脱氮-腺嘌呤核苷、6-偶氮尿苷、6-偶氮胞苷、6-偶氮胸苷、5-甲基-2-硫尿核苷，其它的含硫的碱基例如2-硫尿核苷和4-硫尿核苷以及2-巯基胞苷、二氢尿嘧啶核苷、假尿嘧啶核苷、Q核苷、古嘌苷、萘基和取代萘基基团、O-和N-烷基化的嘌呤和嘧啶例如N6-甲基腺苷、5-methylcarbonylmethyluridine、尿嘧啶核苷5-氧乙酸(oxyacetic)、吡啶-4-酮、吡啶-2-酮、苯基和修饰的苯基例如氨基苯酚或者2，4，6-三甲氧基苯，修饰的胞嘧啶其作为G-螺旋夹核苷酸，8-取代腺嘌呤和鸟嘌呤、5-取代的脲嘧啶和胸腺嘧啶、氮杂嘧啶、carboxyhydroxyalkyl核苷酸，carboxyalkylaminoalkyl核苷酸和alkylcarbonylalkylated核苷酸。修饰的核苷酸也包括糖基部分被修饰的核苷酸，以及其中具有糖基或者类似物如非核糖基的核苷酸。例如，糖部分可以是，或者基于，甘露糖、阿拉伯糖、吡喃(型)葡萄糖、吡喃(型)半乳糖、4’-硫代核糖和其他糖类、杂环、或者碳环。
另外，术语“核苷酸”包括本领域所公知的所有通用碱基。例如，通用碱基包括但是不局限于3-硝基吡咯、5-硝基吲哚或者水粉蕈素。术语“核苷酸”也包括由胺基置换核糖基3’氧而产生的N3’-P5’是氨基磷酸酯。
在本文使用的术语“非靶向”和“非靶向效应”是指下任意述情形，即siRNA(例如合成的siRNA或shRNA)是针对于一个给定的靶mRNA的，但是其通过与其他mRNA、DNA、细胞蛋白质、或者其它部分直接地或者间接地相互作用而引起一种非靶蛋白表达减少的非期望效果。经常地，当siRNA与具有和其相同或者相似多核苷酸序列的非靶向mRNA相互作用时就会发生上述情况。例如，当由于其它非靶向mRNA和siRNA有义和/或反义链之间部分同源或者互补而导致非靶向mRNA同时降解的时候，“非靶向效应”也就发生了。
在本文使用的术语“靶向”(on-target)是指siRNA的一组修饰，其增加了siRNA优先地靶向并与靶mRNA或者DNA相互作用以抑制其所编码多肽的生产的可能性。这些增加了siRNA沉默目标基因时的特异性。例如，一种靶向修饰包括一种siRNA，其中有义区域的第一和第二核苷酸各自具有一个2’-O-甲基部分，并且反义链在它的5’末端是磷酸化的，其中这样一种导向修饰也是指一种专用的修饰，并被命名为On-TargetTM(D harmacon，Inc.)。无论如何，靶向修饰可用于帮助减少外非靶向效应。并且，siRNA可以具有一个与该siRNA的反义区域具有互补性有义区域，并且其中该反义区域是与靶mRNA具有互补性的区域。
在此使用的术语“多核苷酸”是指通过核酸间链接连接在一起的核苷酸多聚体。并且，多核苷酸包括DNA、RNA、DNA/RNA、杂合物(其包括具有规则地和/或不规则地替换的脱氧核糖部分以及核糖部分(例如，其中替换的核苷酸单元在糖基部分的2’位置具有一个-OH，然后-H，然后一个-OH，然后一个H等等)的多核苷酸链)、以及这些种类的多苷酸的修饰形式。此外，多核苷酸包括具有不同修饰的核苷酸或者在任何位置连接多种实体或部分的核苷酸。
在此使用的术语“多聚核糖核苷酸”是指包含两个或更多修饰的或者未修饰的核糖核苷酸和/或它们的类似物的多核苷酸。术语“多聚核糖核苷酸”可以和术语“寡核糖核糖核苷酸”互换使用。
在此使用的术语“合理设计”以及“合理设计的”是指一个或更多用于基因沉默的siRNA的选择和设计该设计或选择是基于一个或多个独立于靶序列的标准的。因此，选择合理设计的siRNA进行特异地与所选mRNA相互作用并且抑制所选mRNA的多肽的翻译。这样，针对任何一个的靶mRNA可能有许许多多潜在的具有18到31个碱基对的siRNA可以与靶mRNA 100％互补。部分原因是因为一个mRNA可能具有多个可以被siRNA特异地靶向的序列。然而，似乎并不是所有siRNA都具有同等的功能。通过实验研究，一些其它的因素可以影响特定的siRNA的功能，其中包括在特定位置上某些特定的含氮碱基的存在或者缺少、相对的GC含量等等。合理设计的siRNA相关的其他信息可以在下述文件中找到美国专利申请10/714,333,提交于2003年11月14日，相关的PCT申请PCT/US03/36787，作为WO2004/045543 A2公布于2004年6月3日，美国专利申请10/940,892，提交于2004年9月14日，作为美国专利申请公布2005/0255487，相关的PCT申请PCT/US04/14885，提交于2004年5月12日，以及美国专利申请公布2005/0246794，其中每个文献以引用的方式并入本文。
在此使用的术语“反向转染”以及缩写“RTF”都是指一种用于介导核酸，例如siRNA，进入细胞的方法。这种引导siRNA进入细胞的方法可以通过在一个孔中混合核酸和细胞而进行，其中细胞没有预先在生长面上粘附或者培养。该反向转染通过核酸与细胞表面接触的方式使核酸能够进入细胞。通常，siRNA在与细胞接触之前与脂质或者其它的多核苷酸载体复合在一起。反向转染不同于正向转染，因为在添加siRNA之前细胞没有在孔或者其它贮存容器中的细胞生长表面上接种并培养。
在此使用的术语“核糖核苷酸”、“核糖核酸”和“RNA”是指修饰的或者未修饰的包含至少一个核糖核苷酸单元的核苷酸或者多核苷酸。一般地，所有的核苷酸单元都是核糖核苷酸。未修饰的核糖核苷酸单元包含连接于核糖基部分2’位置的羟基，该核糖基部分具有一个连接在核糖基部分1’位置的N-糖苷键链接的碱基，以及一个可以或者阻止连接到另一个核苷酸的部分。核糖核苷酸、核糖核酸和RNA是本领域熟知的短语。
在此使用的术语“有义链”是指一个多核苷酸或者区域，其具有和靶核酸(例如信使RNA或者DNA序列)完全地或者部分地相同的核苷酸序列。术语“有义链”包括与另一个多核苷酸的反义区域形成了双链体的多核苷酸的有义区域。此外，有义链可以是与同一个单分子多核苷酸上的第二多核苷酸序列形成双链体的第一多核苷酸序列同，该单分子多核苷酸同时包括所述的第一以及第二多核苷酸序列。因此，有义链可以包括能够形成发夹结构的单分子siRNA的一部分，例如shRNA。按照惯例每次提到一段序列，除非另有指示，都是有义链或者有义区域，并且互补的反义链或者区域不再提及。“有义链”以及‘有义区域“是同等的并且是可互换使用的。
在此使用的术语“siRNA”是指小的抑制性的RNA双链体，其通过RNA干扰(“RNAi”)途径诱导基因沉默。这些siRNA是dsRNA，其可以在长度方面有差异，并且可以包括在反义和有义链之间以及在反义链和目标序列之间不同程度的互补性。每个siRNA包括17到31个碱基对，更优选地是18到26个碱基对，并且最优选地是19到21个碱基对。对于一些siRNA(而不是所有的siRNA)，其在有义链和/或反义链的5’和/或3’末端上具有未配对的突出核苷酸。另外，术语“siRNA”包括具有两个独立链的双链体，也包括可以形成含有双链体区域的发夹结构的单链，后者可以被称为短的发夹RNA(“shRNA”)。
在此使用的术语“siRNA文库”或者“RTF siRNA文库”是指一系列用于分析特定的生物学途径或者靶基因的siRNAs。siRNA文库包含多种的用于分析特定的途径或者靶基因的siRNA库试剂。库一般地包含两个或更多非同一的针对单一靶基因的siRNA。通常一个库包括四个以上非同一的合理设计的siRNA。siRNA文库的示例性的列表在下面的表1中提供。用于某些特定的siRNA文库的序列，包括库试剂，在并入本文的临时申请的表1和表2中提供。
在此使用的术语“siRNA库”、“库”、“siRNAs的库”以及“库试剂”是指两个或更多siRNA，一般地4个siRNA，其针对于单一靶基因、mRNA、和/或蛋白质的翻译。库试剂的siRNA可以通过根据非靶特异性的标准进行挑选而合理地设计。例如使用100nM的siRNA浓度，两个纳摩的各个库试剂足够转染大约96-孔板上总共200个孔中的细胞。库试剂可以以一组的形式涂布(例如，两个或更多的Dharmacon’s SMARTpool@试剂在单个siRNA转染孔中)。包括SMARTpool@试剂的单独的siRNAs，有时在此是指SMARTselectionTMsiRNA(Dharmacon，Inc.)，还可以如同SMARTpool@试剂一样单独地被涂布到同一个板上。
在此使用的术语“靶”在本文件中以各种不同的形式使用，其使用是根据上下文来定义的。术语“靶基因”是指所编码蛋白质被siRNA沉默的基因以及编码生成靶mRNA的基因。术语“靶mRNA”是指一种给定的siRNA直接沉默其多肽产物转录的mRNA。术语“靶序列”以及“靶位置”是指在mRNA、miRNA或者DNA编码或启动子区域之内的一段序列，siRNA的有义链对其展现出不同程度的同源性并且反义链对其展现出不同程度的互补性。术语“靶多肽”或者“靶蛋白”是指该靶基因、靶mRNA、和/或靶序列编码的基因产物。术语“siRNA靶”是指siRNA所要沉默的基因、mRNA、或者蛋白质。相似地，“靶沉默”是指基因或者相应mRNA或者蛋白质的沉默状态。
在此使用的术语“转染”是指一种将核酸引入细胞方法。可以转染的核酸清单是巨大的，其包括但是不局限于siRNA、shRNA、有义和/或反义序列、DNA、RNA等等。有许多模式可用于转染核酸进入细胞，包括但不限于电穿孔法、粒子轰击、磷酸钙转运、二乙氨乙基葡聚糖转运、脂质转运、多聚体转运、分子结合物转运(例如，聚赖氨酸-DNA或-RNA结合物、抗体-多肽结合物、抗体-多聚体结合物、或肽结合物)、显微注射、激光-或光-辅助的显微注射、具有可见的和/或不可见的电磁辐射波长的光穿孔或光穿孔等等。转染可以是“正向转染”，其中细胞首先涂布于孔中然后用核酸处理，或者可以是“反向转染”(RTF)其中核酸在涂布之前或涂布期间与细胞结合和/或附着于孔的底部。任意如同上面描述的转染细胞模式，能通过下述方式被本发明使用，即在siRNA溶解或悬浮于含水培养基中以诱导核酸进入细胞，从而实现反向转染。关于反向转染的一个模式的细节将在下面更详细地描述。
在此使用的术语“多孔板‘是指一种基质其被分成不同的区域以防止从一个特定区域到另一个特定区域的移动，其中的特定区域是孔。例如，一个多孔板的每个孔可以具有曲线的或平坦的水平底面，而且具有侧壁。另外地，该侧壁可以特定的角度或曲率聚集以使得离散的水平底面部分不出现。正如下面所述的，具有平坦的或基本上平坦的水平底面的多孔板在本发明的许多具体实施方案中是优选的，尤其在使用粘附细胞的时候。不管其形式如何，最重要的是多孔板上的每个孔是完全地与其它孔隔开的。孔一般在顶端开放以易于添加和除去原料。普通多孔板一般地包括48、96、384或1356个孔并且由聚苯乙烯、聚丙烯、聚碳酸酯玻璃或其等同的材料组成。板上的孔可以涂上多种化合物或者用物理方法处理以提高siRNA和/或细胞的附着。在板上的孔还可以用来容纳大量液体体积并且提供大片的表面积，尤其沿着水平的底面。图中的孔是用示意图并仅仅为了简化起见显示为正方形，但是其可以是任意合适的形状。另外，多孔板已经为本领域所熟知。
为了定义可测量的物质数量而使用的单位，例如浓度、重量以及体积，都是本领域技术人员通常地使用的。另外，单位优选地与国际公制一致。此外，“μ”正如在“μg”或“μL”中是指“百万分之一”，例如正如微克以及微升。
另外地，上文的术语定义是用来补充本领域技术人员的知识，并没有定义本文件中所有的术语。因此，未定义的术语可用本领域技术人员的知识和/或该术语的普通意思来解释。另外，上文的术语不是用来通过提供实施例而进行限制的，然而只是为了有助于理解和使用本文描述的本发明。
I、反向转染 通常，本发明提供用于实现siRNA反向转染的多孔板、系统、试剂盒、和方法。本发明提供改良的以及更有效的siRNA反向转染操作方案。这些改善是特别地有益于手工分析以及高通量筛选的。
在一个具体实施方案中，本发明包括一种引导siRNA进入细胞以引起基因沉默的反向转染方法。这一方法包括提供一个多孔板，其包括含有基本上干燥的基因沉默组合物的孔。该基因沉默组合物包括一种沉默靶基因从而使相应基因产物的生产被抑制或停止的siRNA。该siRNA作为干燥的基因沉默组合物的一部分置于孔中，使得多孔板可以在实施RTF操作方案前进行制备、密封的、储藏、和/或运输。部分地，这是因为该干燥的基因沉默组合物可以稳定地保持siRNA在孔中处于具有功能的状态，并且可以在RTF操作时再悬浮或再溶解在水溶液中。因此含有基因沉默组合物的多孔板可以在惰性的环境中制造并且密封，其中该板可以包括含有针对于特定基因靶而定制的siRNA的不同的孔。这样的siRNA以及用于沉默的预定基因靶将在下面更详细地描述。
可以添加含水培养基至每个包含基因沉默组合物的孔中以使siRNA悬浮或溶解于溶液中。该含水培养基可以使siRNA在一段足够的持续时间处于溶解状态。另外，该含水培养基或附加的培养基包含一种多核苷酸载体。因此，可以添加多核苷酸载体至每个含有基因沉默组合物的孔中，再将多孔板温育足够的时间以形成siRNA-载体复合物。然而，一些具体实施方案并不需要多核苷酸载体，可以使用其它的转染模式将该siRNA转染进入细胞。
在siRNA充分地溶解或悬浮之后，在siRNA可被引导进入细胞的条件下将细胞添加至该孔中。添加细胞的数量可以是每约0.35cm2到约0.35cm2的细胞生长表面面积上约1×103到约3.5×104个细胞。促进siRNA进入细胞的条件可以通过本领域公知的用于涂布细胞的典型细胞培养技术而描述。也就是说，该细胞可以类似于普通的涂布方式被添加至包含siRNA的孔中。将包含siRNA和细胞的孔温育足够的时间以发生基因沉默，其一般是不到72小时，更优选的是不到48小时，并且最优选的是大约24小时或更少。
在一个具体实施方案中，RTF操作方案包括向孔中增添一种多核苷酸载体以形成siRNA-载体复合物，其中该siRNA-载体复合物悬浮或溶解于溶液中。在添加细胞之后，siRNA-载体复合物可以与细胞接触以诱导对该复合物的内吞作用。因此，该多核苷酸载体可以作为水溶液的一部分或另外的附加物而被添加。因此，该多核苷酸载体可以溶解或者悬浮状态存在于该含水培养基中。该多核苷酸载体可以是一种脂质、阳离子聚合物、脂多聚体等等。
在细胞与siRNA结合之后，将多孔板置于可使细胞生长、细胞分裂、和/或发生基因沉默的条件下。通常，在测定基因沉默之前，细胞在siRNA存在的情况下培养大约6到大约72小时，更优选的是大约12到大约36小时，并且最优选的是大约24到大约48小时。然而，应该认识到细胞是与siRNA共同培养一段足以沉默基因的时间从而导致相应基因产物减少。因此，靶多肽的生产可以被沉默至少大约50％，更优选的是至少大约70％，更加优选的是至少大约80％，和最优选的是至少大约90％。
在悬浮生长的细胞就是靶细胞的情况下，这些细胞可以以适当的细胞密度添加至孔中，然后将多孔板在不会损害到细胞生活力的低重力下旋转，从而使细胞以及脂质接近孔的底部。
在一个具体实施方案中，测定通过RTF方式被siRNA转染的细胞的细胞生活力、基因沉默等等。细胞生活力研究可以依照公知的方法在多孔板中完成。另外，基因沉默还可以通过使用本领域公知的多种技术来分析孔中内含物，从而分析靶蛋白质的存在或缺少的存在与否。另外地，基因沉默的量度可以通过利用公知的方法将内含物从孔中移出而测定。在不同的具体实施方案中，孔是与光学检测系统相适应的，例如，UV、冷光、荧光或光散射检测系统。在与光学检测系统相适应的具体实施方案中，孔的壁可以是不透明的，或者尽量减少或最小化能妨碍光学探测的光散射。
在一个具体实施方案中，RTF操作方案诱导基因沉默的结果可以通过用于高容量筛选(“HCS”)或高通量筛选(“HTS”)的系统来检测或监测。HCS分析可用于测量特异性的易位以及形态学变化、受体运输、细胞毒性、细胞运动性、细胞伸展等等。HCS研究可以在ArrayScan@HCS Reader上或KineticScan@HCSReader(Cellomics，Inc.)上完成。关于HCS的其他信息可在如下文献中找到美国专利号6,902,883，6,875,578，6,759,206，6,716,588，6,671,624，6,620,591，6,573,039，6,416,959，5,989,835，其中每个文献都在此通过引用的方式并入本文。HTS分析可以利用各种可用的阅读器来完成，一般地对于每个孔的荧光都作为一个测量。
在一个具体实施方案中，本发明包括多孔板，其配置用于将一个孔中的内含物转移到某一位置、装置、或系统中，其中在所述位置、装置或系统中检测siRNARTF操作方案的结果。因此，可以使用湿式转移检测系统(wet transfer detectionsystem)，其包括将细胞从孔转移到如硝化纤维这样的基质上。在将孔中内含物转移到该基质后，就可以进行检测。这样的多孔板转移系统的一个实例包括硝化纤维，其中孔中内含物经过处理使得细胞膜被透化或者被破坏，从而使其与胞内物质接触。可以通过包括重力或真空装置(vacuum manifold)的使用在内的任意合适的方法而实现孔中内含物转移到硝化纤维。该硝化纤维包含了孔中的内含物能因此更进一步地接受探测操作规程，该规程运用基于抗体的检测系统等等，以检测包含在一个特定孔中的一种或以上的细胞内含物。
II.优化siRNA RTF 由于RNAi通路独特而且高度灵敏的性质，已经开发出对引导siRNAs库进入细胞特别有用的方法。相应地，已开发了新的RTF方法来使用siRNAs库(“siRNARTF”)。因此，近来开发的用于实现siRNA RTF的操作方案利用基于合理设计、siRNA稳定、siRNA目标特异性、以及siRNAs库的近来开发出的siRNA技术进行改进，从而得到了增强。因此，在此描述了用于通过siRNA RTF操作方案而实现基因沉默的改进方法。
在一个具体实施方案中，本发明可以被用于来自植物和动物界中不同种的不同类型的细胞。优选地，该细胞来自于哺乳动物包括来自人的细胞、其他的灵长类、马、猪、以及老鼠。例如，细胞可以是HT-29细胞、LNCaP-FGC细胞A549细胞、MDA-MB453细胞、HepG2细胞、THP-1细胞、miMCD-3细胞、HEK293细胞、3T3细胞、HeLaS3细胞、MCF7细胞、Cos-7细胞、CHO-K1细胞、BxPC-3细胞、DU-145细胞、Jurkat细胞、PC-3细胞、Capan-1细胞、HuVEC细胞、HuASMC细胞等等。另外，任意种的植物可以用来测定基因沉默效应。
每孔的细胞数目，其被称为细胞密度，是成功的siRNA RTF的一个重要参数。已经发现，与使用DNA的RTF操作方案相比，具有较低的细胞密度的siRNA RTF操作方案可以具有更有好的结果。例如，96-孔板可以具有的细胞密度为大约每孔1,000-35,000个细胞，更优选地大约每孔2,000-30,000个细胞，更加优选的细胞密度是大约2,500-20,000个细胞每孔，更加优选地大约每孔3,000-15,000个细胞，以及最优越的细胞密度是大约每孔3,500-10,000个细胞。此外，每孔的细胞数目可以外推至具有不同的细胞培养面积的孔。一个可用于计算放入一个给定孔中的适当的细胞数目方程式是基于具有大约0.3cm2至大约0.35cm2细胞培养面积的96-孔板，其中孔#2是该96-孔板，方程式如下所示 孔#1中的细胞＝(孔#1的面积/孔#2的面积)×孔#2中的细胞 另外，siRNA RTF操作方案可以优化以便确定一个特定的转染模式是否可以用于或提供最佳的结果。相应地，任何的转染模式都可以用于在此描述的siRNARTF操作方案。通过使用强有力的并且已熟知的(well-characterized)siRNA(例如阳性对照siRNAs)转染的细胞系(例如，HeLa)多核苷酸载体在很宽的浓度范围内可以适用于超过通常使用的细胞密度以及总siRNA浓度的范围。相应地，细胞生活力以及转染功效可以用上述浓度梯度分析。因此，最优化研究可以通过特定的转染模式或多核苷酸载体浓度梯度来完成，以便测定哪个转染模式可以产生高效率的基因沉默并且不会诱导有害的细胞毒性。
在一个具体实施例中，本发明是要最优化用于通过RNAi途径实现基因沉默的siRNA RTF方案。因此，siRNA RTF的最优化可以包括任何下列步骤(1)选择多孔板的种类；(2)选择适当的溶液以溶解或悬浮用于在孔中沉淀和干燥的siRNA；(3)选择特定的siRNA以沉默特异基因；(4)鉴别可以用于单独siRNA的修饰或结合物，以便提高siRNA稳定性和/或特异性；(5)在固体表面上使用并干燥siRNA以便它可以溶解或悬浮在适当的含水培养基中；(6)选择适当的转染模式；(7)为siRNA选择多核苷酸载体，例如脂质；(8)溶解或悬浮siRNA；(9)络合该siRNA和多核苷酸载体以形成siRNA-载体复合物；以及(10)将该siRNA-载体复合物与选择出的细胞种类混合。因此，最优化siRNA RTF方案可以产生相对于早先的正向和反向转染方法的显著改善。
在一个具体实施方案中，本发明可以包括siRNA RTF操作方案与上述优化一起施行，其可以包括任何下列步骤(a)将至少一种siRNA点样至一个多孔板上的两个或更多孔中，其中该siRNA是靶向标准基因的对照siRNA；(b)在每个孔的底部干燥该siRNA；(c)添加水溶液例如培养基或缓冲液至每个孔中的siRNA以便溶解或悬浮该siRNA，并且选择性地该溶液包括一个多核苷酸载体以便可以形成siRNA-载体复合物；(d)添加适当数目的细胞至每个孔，其中siRNA是已经单独地或作为一种siRNA-载体复合物而存在于溶液中；(e)在已经添加细胞之后，可以通过任意的转染模式使得该siRNA进入该细胞；并且(f)在利用该siRNA的细胞转染可以发生的条件下温育该板。转染之后，该细胞置于下述条件下，例如含水培养基、温度、气体分压等等，其中细胞生长和/或细胞分裂可以发生并且基因沉默可能发生。这些条件可以是，而不是必要地，与发生转染的条件相同，并且是本领域所公知的。
III.多孔板 在一个具体实施方案中，本发明包括对干燥于多孔板孔底部的基因沉默溶液的利用。本发明使用的该孔板优选地是已格式化并且是离散的孔阵列(例如，48,96,384，或1536-孔板)，其可以购买自许多商业来源的细胞培养板及其他包含表面的细胞培养装置，包括下述产品如NUNCTM，NUNCLONTM，MICROWELLTM以及FLUORONUNCTM板(例如，每个都可以是从Nalge Nunc International of Rochester，NY，以及Nunc A/S of Denmark获得)，COSTAR THERMOWELLTM以及CORNINGTM板(例如，每个都可获自Corning)，BD FALCONTM以及OPTILUXTM板(例如，可以从Becton，Dickinson and Company获得)以及GREINERTM，CELL COATTM和CELLSTARTM板(例如，可以从Greiner Bio-Bio-One获得)。
在一个具体实施方案中，该多孔板的特征可为经配置而适合于细胞生长和繁殖。多孔板可由玻璃、聚苯乙烯、其它的聚合材料或任意同类的原料制成，并且可以具有圆的和/或平坦的孔底。当然，当使用平底表面时某些分析设备可以具有增强功能。另外，具有基本上平坦的底面的孔可以提供统一的细胞空间和单层构造。因此优选的孔底面具有基本上平坦的底部表面。孔的底面可以进行物理的或化学的处理，例如辐照、电晕放电、等离子区放电、或对于聚苯乙烯的微波等离子区放电。在组织培养表面的这种处理可以是常规的，在这样的表面上附着的真核细胞可以粘附并且生长。另外，孔可以不经过任意化学涂层的修饰，或它们可以包被上聚L-L-赖氨酸(“PLL”)、层粘连蛋白、胶原、或等效物，以改善细胞的粘附。
另外，每个板优选地具有6到2000个之间的孔，并且更优选地具有1536孔，384孔，或96孔。此外，孔优选地具有大约5至2000微升(“μL”)之间的容积，并且由孔底面或细胞底面所代表的总的培养面积，介于大约0.02cm2至大约4.2cm2之间，并且对于96-孔板而言大约0.3cm2至大约0.35cm2。
此外，在有些情况下，孔优选地没有用例如MATRIGELTM(Beckinson Dickerson)等原料包被，或没有用类似于惯常构建CELLBINDTM板(Corning)的方法制造。部分原因是这两个技术是通常用于增强细胞附着，然而已经发现在RTF操作方案中其会减低或减少siRNA吸收和/或基因沉默。
此外，虽然由单一原料形成多孔板，例如处理过的聚苯乙烯形成的多孔板可用于本发明，但由两个或更多种的原料形成的板也可以用于本发明。这样的复合材料多孔板可在下述文献中论述美国专利6,514,464，5,457,527，RE38，214以及5,487,872，其中每个文献在此引作为参考用。相应地，该复合原料多孔板可以提供合乎需要的结构特性，其包括适于组织培养以及RNAi沉淀的孔底表面，其中孔壁是不适合于组织培养以及RNAi沉淀的。此外，该孔底面可以具有适于某些下游分析的光学特性。例如，孔底面之下的塑料或玻璃是对可见光和/或紫外线而言是透光的，并且围绕每个孔侧壁的塑料阻挡光线通过邻近的孔。
在一个具体实施方案中，该板包含一个可移动的底部。因此，该可移动的底部可利于转移孔中内含物至另外的基质上。此外，具有可移动底部的板可和在此描述的任何具体实施方案同时使用。一个具有可移动底部的板的具体实施方案的例子是具有可移动的薄膜作为底部的板。可移动的薄膜可由任意合适的原料制成，例如聚烯烃。该可移动的薄膜可以和光学探测系统相适合(例如，可以透过一种或多种波长的电磁辐射，例如，可透过可见光或紫外光)。在包含可移动薄膜具体实施方案中，孔中的内含物可以缩减体积以使得在薄膜从该板移开之前该孔中的至少一些内含物能粘附在薄膜上。从板上移走之后，该薄膜包括粘附在薄膜特定位置上的原板中的内含物，该位置与孔的位置相对应。因此该薄膜能用于任意合适的检测方法。在一个实施例中，该薄膜可用于转移孔中的内含物至另一个基质，例如，硝化纤维。此外，可以破坏每个孔中的细胞以便在将薄膜从板移开之前暴露它们的胞内内含物。一旦转移至另一个基质，该基质便包括该孔的内含物并且可以进行任意合适的检测方法。一些检测方法的实例包括Western印迹法、蛋白质-蛋白质印迹法、配体印迹法、以及核酸杂交。一个将板上内含物粘附至薄膜上的方法是蒸发该孔的内含物，或者减低该孔的水分含量。
在一个具体实施方案中，这样的薄膜可由选择性渗透原料制成，其中该选择渗透性基于，例如分子大小。在这个具体实施方案中，该薄膜可以是一个分子筛。在一个实施例中，该薄膜可以由分子筛组成并且在施加正压力(例如，从孔的上方)或者负压力(例如，从孔的下方)时其允许小于大约10kDa的分子穿过该膜。其中，薄膜由分子筛组成，孔内含物可以通过分子筛而汲取可渗透的液体以降低含水量并且留下组成该孔内含物的大分子。
在一个实施例中，由分子筛组成的薄膜可以用在板的顶端。该板可以翻转以使得孔中内含物接触该分子筛。该板的底部可以是被刺穿的或，如果薄膜处于板的底部，则移除该薄膜。可以施加正压力以强迫孔中内含物压附在分子筛上。另外，也可以从分子筛下方施加负压力。照这样，将孔中内含物转移至分子筛表面的同时孔中的水份将被移除。该分子筛于是将包含板上的孔中内含物，其位置与原来板上的相对的位置完全一致。如果需要，该分子筛能接着用于将该孔中内含物，以已知位置转移到一个合适的基质例如硝化纤维上。
在一个具体实施方案中，薄膜可以用于与板同时使用以带来某些光学特性。在这些具体实施方案中，一个板的顶端和/或底部的至少一部分可以施加到薄膜上，该薄膜对于特定波长的电磁辐射是有选择地不透光或有选择地透光。该薄膜被用作针对电磁辐射的一或多个波长或波长区域的薄膜滤波器。例如，该薄膜可以对紫外线是不透光的，而对可见光是透光的，或与此相反。该薄膜可以放置在该板的顶部，或可以放置于该板的底部。在电磁辐射从下面到达样品的具体实施方案中，该薄膜滤波器可以位于板的底部。在电磁辐射从上面到达样品的具体实施方案中，该薄膜滤波器可以位于板的顶部。该薄膜滤波器一般地接触该板基质。两个外加的薄膜可一起使用。使两个或更多的薄膜彼此靠近以使用到板上(例如，先使用第一薄膜，然后在第一薄膜上使用第二薄膜)。
在此描述的用于任何具体实施方案中的薄膜可由任意合适的可用于特定应用的原料制造。该薄膜可以是薄的并且有弹性的，或薄的并且刚性的。该薄膜还可以与机器人系统相配合而制造。一般地，与机器人系统相配合的薄膜将是相对刚性的以便它们在从板上移开时不会打乱孔中内含物的格式或位置。
IV.基因沉默板 在本发明的一个具体实施方案中，依照上文的多孔板可以配置成为一个基因沉默板。相应地，该多孔板可以在一或多个孔中包括基因沉默组合物。该基因沉默组合物包括至少一种第一siRNA，其靶向至少一种第一基因以用于沉默。此外，该基因沉默组合物可以具有直接针对于相关基因家族的单一siRNA。另外，该多孔板可以在一个孔中含有靶向至单一基因的多种siRNAs，或靶向多个基因的多种siRNAs。通过将一种包含siRNA的溶液添加到至少一个孔中，然后移除溶液以留下干燥基因沉默组合物的方式进行干燥，使多孔板成为基因沉默板。
在有些情况下在施加、沉淀、和/或点样siRNA溶液到孔的底面上以及在板上干燥该材料之前，将该siRNA溶解在这些种类的溶液中的一个里。通常，siRNA溶于蒸馏水来除去核糖核酸酶污染，蒸馏水是利用本领域公知的任意方法处理的，例如超滤。另外地，siRNA可以是溶于几种生理学相容的、没有核糖核酸酶的缓冲液之一，包括但不限于磷酸盐缓冲液、Hanks BSS、Earl’s BSS、或生理盐水。这些溶液可以包含一或多种附加的试剂其增强siRNA的稳定性(例如，核糖核酸酶抑制剂)或改变该溶液的粘稠度以提高点样或干燥的效率(例如，蔗糖)，同时不会改变siRNA的性质或损害在RTF方法中的后续阶段添加的细胞。
在又一个其它的案例中，siRNA可以溶解在溶液或培养基中，这将促进点样、干燥、或粘附到选择出的板上。任选地，可使用与siRNA相容的挥发性的溶剂。一个实施例包括通过利用醇，例如乙醇，其与水混合便形成一种挥发性溶剂从而容易干燥并将干燥基因沉默组合物存留于孔底面上。在有些情况下siRNA溶液不包含脂质，在操作期间脂质很容易被氧化或可以毒害细胞。在其它情况中，siRNA在沉淀以及干燥至孔底面之前，是与多核苷酸载体在溶液中预先复合的。
相应地，将预定量的siRNA加入到孔中以便当它被干燥然后再悬浮的时候，就有已知数量或浓度的对照siRNA可用于基因沉默。沉淀在每个孔底部的siRNA溶液的体积，依赖于储备溶液的浓度、siRNA的功能、以及有效基因沉默需要的siRNA的数量或浓度。通常，在转染期间有效地沉默目标基因所需要的siRNA浓度是依赖于该siRNA的功能的。例如，在转染期间siRNA的浓度可以从针对高度功能性的siRNA(例如，在50-100nM下沉默＞90％的目标表达)的皮摩(例如，300、900pM)，到针对中等功能性(例如，在50-100nM下沉默70-90％的目标表达)的纳摩(例如100nM)，以及到针对低功能性的微摩(例如，1μM)。例如，针对一个96孔板，沉淀5-50μL的包含1μMsiRNA的溶液足够产生RTF操作方案可接受的siRNA浓度。对于较小或较大的孔，可以调整siRNA的体积以及数量以补偿每个孔中的最终浓度。
在一个具体实施方案中，基因沉默组合物的总量可以是转染其所在孔中的细胞所需的量。因此，当在RTF期间溶解或悬浮在含水培养基中的时候siRNA的总浓度可以是小于大约100nM。更优选地，当在RTF期间溶解或悬浮在含水培养基中的时候siRNA的总浓度可以是小于大约50nM。更加优选地，当在RTF期间溶解或悬浮在含水培养基中的时候siRNA的总浓度可以是小于大约25nM。在更加优选的情况下，当在RTF期间溶解或悬浮在含水培养基中的时候siRNA的总浓度可以是小于大约10nM。最优选地，当在RTF期间溶解或悬浮在含水培养基中的时候siRNA的总浓度可以是小于大约1nM。例如，在一个96孔板中的siRNA数量可以从每孔0.1皮摩尔(“pm”)到大约100pm，更优选的是大约1pm到大约75pm，以及最优选的是大约10pm到大约62.5pm，其中siRNA的相应数量可以适合于具有其它数目孔的多孔板。
另外，加到每个孔中的siRNA的量足够在该孔内进行一次RTF操作方案。也就是说，在基因沉默组合物中的siRNA可以是仅用于加到该孔中的细胞所需的量。因此，干燥在孔中的siRNA的量可以是不够在两个不同的孔中完成两个RTF操作方案的。这是因为该基因沉默组合物所提供的siRNA的量是配置用于单次RTF操作方案以产生最佳结果的。此外，这也取消了制造转移进入多个孔所需的siRNA储存溶液的需要，因此减低RTF操作方案的复杂性并且增加了其功效。
包含siRNA的溶液可以利用多种的本领域公知的沉淀含水进入多孔板孔中的方法来沉淀进入孔中，其可以包括手工的以及自动化的工序。多种方法可用于干燥该包含siRNA的溶液以形成基因沉默组合物。在一个具体实施方案中，多孔板可以在室温下无菌的环境中干燥，该环境允许蒸发该沉淀溶液以保存下siRNA以及其他的内含化合物，例如盐，糖类等等。干燥的板优选地进行真空-密封或在无菌容器内存在惰性气体的条件下进行密封，并且在从-80℃到37℃的温度范围内储藏一段延续较长的时间而不损失沉默功能。因此，在至少一个孔中具有基本上干燥的基因沉默组合物的多孔板可以在室温下储藏以及通过传统的方式运输并且仍然维持该siRNA的完整性以及功能性。
在一个具体实施方案中，多孔板可以具有多种的其它的孔用于对照和校准作用。因此，多孔板可以具有至少一个缺少或基本上缺少siRNA的孔。此外，多孔板可以具有至少一个包括至少一个第一对照siRNA的孔，其可以是转染对照、阳性对照或阴性对照。例如，对照siRNA可以包括至少一个如下的成分(a)能够沉默一个已知基因的一种siRNA；(b)转染对照siRNA；(c)具有荧光标记的一种siRNA；(d)具有至少一个有毒基序的siRNA；(e)一种无功能的siRNA；或(f)一种siRNA，其抑制RISC通路。
V.siRNA 在一个具体实施方案中，上述干燥的基因沉默组合物包括至少一个第一siRNA，其沉默至少一种第一靶基因。配置该基因沉默组合物以使得该siRNA能够以足以转染孔中细胞的量溶解或悬浮在含水培养基中。选择性地，该孔中siRNA的总量足够完成仅用于该孔的反向转染。另外，该siRNA可选择地具有带有环的发卡结构、修饰或结合物中的至少一个。此外，该siRNA可以合理地用来靶向至该基因。此外，该基因沉默组合物可以包括一个siRNAs库。
在一个具体实施方案中，筛选siRNA以优化沉默靶基因的功能。优选地，siRNA具有50％到100％之间的基因沉默功能。更优选地，siRNA具有70％到100％之间的基因沉默功能。更优选地，siRNA具有80％到100％之间的基因沉默功能。最优选地，siRNA具有90％到100％之间的基因沉默功能。功能性基因的设计可以基于以下的修饰，包括增加靶向性、减少非靶向性、增加稳定性、合理地设计用于特定的mRNA目标，以及它们的组合。
另外，siRNA反义链可以具有与其靶序列(例如，mRNA)不同水平的互补性。也就是说，反义链是具备诱导靶序列基因沉默功能的。因此，有义链可以是基本上与靶序列一致的。优选地，反义链可以与其靶序列具有50-100％的互补性。更优选地，反义链可以与其靶序列具有70-100％的互补性。更加优选地，反义链可以与其靶序列具有80-100％的互补性。更进一步优选地，反义链可以与其靶序列具有90-100％的互补性。最优选地，反义链可以与其靶序列具有100％的互补性。
具有小于100％互补性的序列可以有一个或多个核苷酸的凸起、突出端、或包含一个或多个错配。另外，siRNA可以在其有义或反义链的3’和/或5’末端具有一到六个核苷酸的突出端。另外，应该认识到计算互补性时是排除突出端的，然而突出端可以与靶序列具有同源性或互补性。化学修饰、凸起、或错配可以指引RNase-III Dicer在特定的位置切开siRNA或shRNA。两个核苷酸的3’突出端可以模拟天然的siRNAs并且经常被使用，然而不是必要的。优选地，该突出端可以包括两个核苷酸，最优选地是dTdT或UU。此外，该突出端可以包括位于有义和/或反义链3’末端的两个核苷酸，该有义和/或反义链具有与目标序列的同源性或互补性。siRNA可以具有两个核苷酸的突出端，其中对于内部位置具有C＞U＞G＞A的次序，并且对于末端位置具有A＞G＞U＞C的次序是优选的。对于siRNA结构以及Dicer酶的特异性的其他信息可以在Vermeulen A，et.al；The contributions of dsRNAstructure to Dicer specificity and efficiency；和RNA(2005)，11674-682中获得。
在一个具体实施方案中，优选地从已经识别自合理地设计的列表中选择siRNA。因此，该siRNA可以是从表I中选出来，该表引自美国临时的申请系列号60/678,165。表I题为“用于人siRNA的siGENOME序列”并且由“基因名称”、“登录号”、“序列”以及“SEQ.ID NO.”栏组成。表I列举了大约92,448个19-mer siRNA有义链序列，其中为了清楚将反义链序列省略。列在表I中的siRNA序列包括SEQ.ID NOs.1到大约92,448，其中每个优选地还可以在该有义链和/或反义链上包括一个3’UU突出物。表I中大约92,448个序列的每一个还可以包含一个在反义链上的5’磷酸酯。在表I中列举的引自临时申请的大约92,448个序列中，大约19,559个具有一系列靶向的修饰。具有靶向修饰的通过SEQ.ID NO识别的序列名单列于题为“通过SEQ.ID NO识别的具有靶向修饰的表I序列的清单”的表II中。靶向修饰在SEQ.ID NOs.1-22,300上。基因沉默组合物中的siRNA可以是单独地使用(例如，每孔中一种siRNA序列)或作为库的一部分使用。
在一个具体实施方案中，siRNA可以配置为短的发夹siRNA(“shRNA”)。这是因为shRNA是一种包括一个环状结构的siRNA，其环状结构连接有义区域与反义区域并形成一个发夹结构。此外，shRNA可以具有与其它的类型的siRNA基本上相似的功能。另外，shRNA不被认为是修饰的siRNA，除非其核苷酸包括如下详述的修饰。siRNA作为发夹shRNA存在的例子中，该链的大小和方向可以变化。优选地，存在于基因沉默组合物中的shRNA具有一个有义链或有义区域以及一个反义链或反义区域。shRNA的有义区域以及反义区域是一个较长的单分子结构的一部分，该结构具有一个大约18-31个碱基对的主干。该有义区域以及反义区域通过一个环状结构连接，该结构可以由多核苷酸或其它的连接基团组成，也可以是由其组合组成。优选地该多核苷酸环包含4到10个核苷酸。更优选地，主干在26到31个碱基对之间并且所述环源自于人miRNA hsa-mir-17(序列5’-＞3’AUAUGUG，SEQ ID No1)。shRNA还可以包含与其它类型的siRNA相似的3’和/或5’突出端。该突出端如果存在，可以是dTdT、UU、或可以具有针对目标序列的同源性或互补性。
shRNA可以包括右旋性的或者左旋性的发夹结构，以及断裂的发卡结构。一个右旋性的shRNA是指一个在它的5’-＞3’方向具有一个有义区域，一个环状区域，然后一个反义有义区域的单分子的序列。相似地一个左旋性的shRNA是指一个在它的5’-＞3’方向具有一个反义区域，一个环状区域，然后一个有义区域的单分子的序列。最优选地，shRNA是(1)以反义-环-有义模式组织；(2)具有一个长度为26-31个核苷酸的主干；并且(3)具有一个来源于人类miRNA hsa-mir-17的环状结构。具有发夹结构的siRNA的描述以及更进一步的例子参见美国临时的专利申请号60/666,474，题为“发夹构造”提交于2005年3月29日，以及美国申请2004/0058886，其以引用的方式并入本文。
A.化学修饰 在一个具体实施方案中，该基因沉默组合物中的s iRNA可以通过本领域已知的多种方法之一而产生，这些方法包括化学合成(例如，美国专利号5,889,136的2’-ACE化学处理，其以引用的方式并入本文)，利用酶促过程的合成(例如，长dsRNA的体外Dicer消化)，或来自质粒或载体构建物的表达。在使用ACE化学处理制备siRNA的情况中，优选的用于溶解siRNA的溶液具有适合于保存2’-ACE保护基团的pH。因此优选的该溶液具有高于6.0的pH，更优选地，在大约7.0和大约8.0之间，以及最优选地在大约7.5以及大约8.0之间。在缺少ACE基团，然而有另一个化学修饰存在的情况下，该pH可以在大约7.0以及大约7.3之间。
正如所简要描述地，基因沉默组合物中的siRNA可以被修饰以增加特异性和/或稳定性。相应地，特异性修饰可以被引入任意siRNA，以便减少非靶向。这样的特异性修饰可以是靶向的一个方面。另外，siRNA可以兼备特异性和稳定性修饰。对于提高特异性的修饰的更进一步描述包括在PCT专利申请号PCT/US04/10343，提交于2004年4月1日、PCT申请与公布号WO2005/097992以及美国临时的专利申请系列号60/542,668和60/543,661之中，其内容以引用的方式并入本文。
可以减少非靶效应的化学修饰的例子包括多种的在siRNA核糖基团上的2’修饰，并且还包括5’磷酰基修饰，其包括一个磷酸基。这样的化学修饰的例子包括对有义链第一位置和第二位置核苷酸的2’修饰，它们分别是双链体区域的第一个5’有义核苷酸以及第二个5’有义核苷酸。另外，该化学修饰可以包括对反义链第一位置和第二位置上核苷酸的2’修饰，它们分别是双链体区域的第一个5’反义核苷酸以及第二个5’反义核苷酸。该化学修饰还可以包括一个磷酰基部分，例如一个磷酸基，在该反义链5’末端核苷酸的5’碳上。此外，该修饰可以用氢替换5’-OH基团以抑制激酶磷酸化作用。
提高特异性的化学修饰的一个例子包括在第一和第二有义核苷酸上的2’修饰以及可包括在反义5’末端核苷酸的5’碳上的磷酰基部分。第二个例子可包括在第一和第二有义核苷酸以及在第一和第二反义核苷酸上的2’修饰，并且可包括在反义5’末端核苷酸的5’碳上的磷酰基部分。第三个例子可包括在第一和第二有义核苷酸以及在第二反义核苷酸上的2’修饰，并且可以包括在反义5’末端核苷酸的5’碳上的磷酰基部分。第四个例子可以包括在有义5’末端核苷酸上的5’脱氧基团修饰，以及在第一和/或第二反义核苷酸上的2’修饰同时有或者没有在第一和第二有义核苷酸上的2’修饰，以及在反义5’末端核苷酸的5’碳上的磷酰基部分。此外，在没有任何2’修饰的情况下包括对于在第一个反义核苷酸的5’上的磷酸基团的修饰可以有益于减少非靶向。在有些情况下优选地在有义5’末端核苷酸的5’碳上不具有磷酸基团。
例如，靶向修饰可以包括在有义链第一位置和第二位置核苷酸(例如，5’末端的第一位置和第二核苷酸)上的2’-O-甲基以及在反义链上的5’磷酸。另外，靶向修饰可包括在反义链第一位置和/或第二位置的核苷酸(例如，来自反义链5’末端的第二个核苷酸))))))上的2’修饰，以及在该反义链5’末端核苷酸的5’位置上磷酸部分。优选的修饰包括在第一个和第二个有义核苷酸以及在第二个反义核苷酸上2’修饰，以及在反义5’末端核苷酸上的磷酸。
在一个具体实施方案中，本发明包括具有提高稳定性修饰的siRNA。因此，稳定性修饰可以通过附加于或者替换特异性修饰的方式而使用。另外，具有稳定性修饰的siRNA的优势是它们可以防止核酸酶的降解。相应地，该稳定性修饰可以增加siRNA可能的储存期限，并且增加制造以及在较长时间内储藏具有干燥基因沉默组合物的多孔板的能力。此外，稳定性修饰可用于在较长时间内诱导靶沉默。这样的稳定性修饰描述于美国专利申请系列号60/542,646，60/543,640，以及60/572,270，美国申请号2004/0266707以及2004/0198640，以及国际的公布号WO2005/097992，以及WO2004/090105之中，每个文献以引用的方式并入本文。在细胞中，延长的基因沉默具有多个优点。在有些情况下，靶基因的蛋白质具有长半衰期(例如大于24-48小时)，其需要延长基因沉默以使得蛋白质的量减少。
在一个具体实施方案中，本发明所包括的siRNA中包含了用来提高有义链、反义链、和/或siRNA双链体稳定性的化学修饰模式。例如，稳定的siRNA可以包含在第一和第二有义核苷酸上的2’修饰，在所有的嘧啶型有义核苷酸中至少一个上的2’修饰，在第一和/或第二反义核苷酸上的2’修饰，在所有嘧啶型反义核苷酸中至少一个上的2’修饰，和/或在该有义或反义5’末端核苷酸的5’碳上具有的磷酸盐修饰。该2’修饰可以是2’-O-脂肪族的修饰或2’卤素修饰。稳定性修饰还可以包括核苷酸间的磷硫酰或甲基膦酸酯修饰。
在第一个例子中，稳定的siRNA可包括在第一有义和第二有义核苷酸上的2’-O-脂肪族的修饰，在所有的有义嘧啶核苷酸中都没有2’-O-脂肪族的修饰或至少一个上有2’-O-脂肪族修饰，在所有的反义嘧啶核苷酸中至少一个上的2’卤素修饰，以及在反义5’末端核苷酸上的5’碳磷酰基修饰。第二个例子可包括在第一有义和第二有义核苷酸上的2’-O-脂肪族的修饰，在所有的有义嘧啶核苷酸上都没有2’-O-脂肪族的修饰或在至少一个上有2’-O-脂肪族的修饰，在所有的反义嘧啶核苷酸中至少一个上的2’-卤素修饰，在反义5’末端核苷酸上的5’碳磷酰基修饰，以及在第一有义核苷酸5’碳上的胆固醇结合物。第三个例子可以包括在第一有义和第二有义核苷酸上的2’-O-脂肪族的修饰，在所有的有义嘧啶核苷酸上都没有2’-O-脂肪族的修饰或在至少一个上有2’-O-脂肪族的修饰，在所有的反义嘧啶核苷酸中至少一个上的2’-卤素修饰，在反义5’末端核苷酸上的5’碳磷酰基修饰，以及在第一有义核苷酸5’碳上的荧光标签结合物，其中该荧光标签可以使用任何公知的荧光基团例如cy3。第四个例子可包括在第一有义和第二有义核苷酸上的2’-O-脂肪族的修饰，在所有的有义嘧啶核苷酸上都没有2’-O-脂肪族的修饰或在至少一个上有2’-O-脂肪族的修饰，在所有的反义嘧啶核苷酸上都没有2’-O-脂肪族的修饰或在至少一个上有2’-O-脂肪族的修饰，在第一和/或反义核苷酸上的2’-O-脂肪族的修饰，以及在第一有义核苷酸5’碳上的荧光标签结合物。第五个例子可包括在第一有义和第二有义核苷酸上的2’-O-脂肪族的修饰，在所有的有义嘧啶核苷酸上都没有2’-O-脂肪族的修饰或在至少一个上有2’-O-脂肪族的修饰，在所有的反义嘧啶核苷酸上都没有2’-O-脂肪族的修饰或在至少一个上有2’-O-脂肪族的修饰，在所有的反义嘧啶核苷酸上都没有2’卤素修饰或在至少一个上有2’卤素修饰，以及在该反义5’末端核苷酸上的5’碳磷酰基修饰。另外，在2’或3’原子上的任何2’-卤素可以替换为磷硫酰基团。此外，任何siRNA可以包括在该反义链3’末端的突出端。选择性地，第二反义核苷酸可以包含一个2’-O-烷基基团例如2’-O-甲基，并且第一反义核苷酸可以包含一个2’-OH或2’-O-甲基。另一个选择是，突出端核苷酸可以包括2’修饰。
依照上文，2’修饰可以是2’-O-脂肪族修饰。此外，2’-O-脂肪族修饰可以存在于有义链和/或反义链的任意核苷酸上。该脂肪族基团可以包括饱和的或非饱和的、取代的或未被取代的、以及支链的或直链的链，其具有从1到20个碳或异种原子。更优选地，该脂肪族基团具有小于10个碳或杂原子，最优选地小于5个碳或杂原子，或是一个烷基。在一种选择中，该2’-O-脂肪族的修饰可以替换为2’-O-芳香族取代基，或包括一个芳族基团。在另一个选择中，该脂肪族基团可以是环状的。例如，该2’-O-烷基可以选自以下基团2’-O-甲基、2’-O-乙基、2’-O-丙基、2’-O-异丙基、2’-O-丁基、2’-O-异丁基、2’-O-乙基-O-甲基(例如，-CH2CH2OCH3)、2’-O-乙基-OH(例如，OCH2CH2OH)、2’-原酸酯、2’-ACE基团原酸酯，以及由此的组合。最优选地，该2’-O-烷基修饰是2’O-甲基部分。另外，当该siRNA包括具有修饰的许多核苷酸时，在每一修饰的核苷酸上的修饰没有必要是相同的。然而，对于就合成本发明分子的实用性而论，始终使用相同的修饰可能是可取的。
在一个具体实施方案中，优选地该2’修饰是一个原酸酯。因此，该2’修饰可以是一个2’-ACE基团。该2’ACE基团修饰参考于美国专利号6,590,093，6,008,400，以及5,889,136中，其中每个以引用的方式并入本文。
另外，该2’-卤素修饰可以选自以下的组氟、氯、溴、或碘；然而，氟是优选的。与特异性修饰相似，每个链始终使用相同修饰可能是可取的。例如，2’-O-甲基能被使用在有义链上，并且2’-氟能被使用在反义链上。然而，不同的2’修饰能被使用在相同链内的不同核苷酸上。
B.结合物 在本发明的一个具体实施方案中，siRNA包括与有义和/或反义链偶联在一起的结合物。该结合物可以实现多种功能或为siRNA提供附加的功能。例如，结合物可以增加siRNA与或者没有与载体复合时对细胞膜的穿透性。另外，该结合物可以是标签从而可以被监测或识别以便确定标记的siRNA是否进入了细胞。
例如，结合物包括氨基酸、肽、多肽、蛋白质、抗体、抗原、毒素、激素、脂质、核苷酸、核苷、多核苷酸、糖类、激素、碳水化合物、聚糖、聚二醇例如聚乙二醇以及聚丙二醇、胆固醇、磷脂、二和三酰甘油酯、脂肪酸、脂族化合物、酶作用物、生物素、异羟基洋地黄毒甙元、硫醚例如己基-S-tritylthiol、硫胆固醇(thiocholesterol)，酰基链例如十二基或十一基基团、双-十六烷基-rac-甘油、三乙基铵基、1，2-双-O-十六烷基-rac-甘油基-3-H-膦酸酯、聚胺例如聚赖氨酸以及聚乙烯亚胺、金刚烷乙酸、棕榈基部分、十八烷基胺部分、己基氨基羰基-羟胆甾醇、法呢基、geranyl geranylgeranyl部分、荧光标记部分例如若丹明以及发荧光的、放射性的标记，酶的标记等等。优选的结合物包括胆固醇以及荧光的标记。
结合物，例如胆固醇、聚乙二醇、或多肽可以促进转运siRNA进入细胞。优选地，当该结合物是脂质时，该脂质与siRNA的联合不会诱导细胞毒性。另外，多肽或脂质结合物例如脂肪酸或胆固醇有可能消除对形成siRNA-载体复合物(例如，lipoplex)的需要。部分原因是该多肽或脂质可以用来运输siRNA穿过细胞膜。
例如，可以使用胆固醇结合物以改善siRNA作为沉默剂的潜力。这种改善可以由修饰的和未修饰的siRNA以及shRNA得到。将胆固醇偶联至有义链可以减轻对于有义链进行2’修饰而造成的负效应。有时候，胆固醇可以不利用多核苷酸载体而将siRNA被动地递送进入细胞；然而，多核苷酸载体，例如脂质，能与胆固醇结合物一起使用。相应地，该siRNA-胆固醇可以通过形成一个可通过siRNA的孔而递送，或通过结合到质膜随后通过内吞作用途径或质膜再生而被送到细胞中。
另外，标记物，例如荧光结合物，可用于监测siRNA进入细胞的转运。该荧光标记可用于光度测定监测对照siRNA进入细胞的转运。优选地，该荧光标记是若丹明或荧光素；然而，其它可以结合siRNA的荧光分子也能被使用。荧光标记的具体例子包括Cy3TM，Cy5TM(Amersham)，其他的蓝色素衍生物，FITC，ALEXATMor BODIPYTM染料(分子探针，Eμgene，OR)中的一个，二甲氨基偶氮苯甲酰部分(dabsyl moiety)等等。也可能使用荧光微粒，例如无机的荧光粒子只要该粒子具有不影响转染效率的大小。该标记可用来实现对在转染细胞内的标记siRNA的显像。另外，该标记可用于从非转染的细胞中区分出转染的细胞。因此，可以使用该标记的siRNA转染一群细胞并且通过FACS(流式细胞仪)进行分选。此外，该荧光标记特别适合于HCS以及HTC分析方法。例如，已经转染的细胞可以被识别，然后利用HCS分析进行更进一步的检验。
对标记的核苷酸的使用是本领域普通技术人员所公知的，并且除了荧光标记之外，例如，酶促的、质量、或放射性的标记可以在应用中使用，而且这些标记将是有益的。可应用到siRNA反向转染上的对于标记分子更进一步的描述参见美国临时的专利申请号60/542,646，60/543,640，以及60/572,270和PCT申请系列号PCT/US04/10343，其中每个以引用的方式并入本文。
结合物可以直接地或通过接头连接至siRNA。结合物可以连接至siRNA内部的任意有义或反义核苷酸，然而，优选地偶联至3’末端核苷酸和/或5’末端核苷酸。一个内部的结合物可以是直接地或间接地通过接头连接至核苷酸核糖基团的2’位置，或者其他合适的位置。例如，该结合物可以偶联至5’-氨基丙稀尿嘧啶核苷。优选地，该结合物可以连接至有义3’末端核苷酸，反义3’末端核苷酸，和反义5’末端核苷酸。
例如，接头可以包含修饰的或未修饰的核苷酸、核苷、多聚体、糖类、碳水化合物、聚烯烃基例如聚乙二醇和聚丙二醇、多元醇、聚丙烯、乙烯和丙二醇的混合物、聚烷基胺、聚胺例如聚赖氨酸和亚精胺、聚酯例如聚(丙烯酸乙酯)、聚磷酸二酯、脂族化合物和烯烃基。结合物和它的接头的一个例子是胆固醇-TEG-亚磷酰胺，其中该胆固醇是结合物，四甘醇(“TEG”)和磷酸盐充当接头。
另外，用于阐明结合物、结合物的运用、以及制造包含结合物的dsRNAs的方法在下面的参考文献中揭露美国专利申请系列号10/406,908，提交于2003年4月2日，公布为美国专利申请号2004/0198640；美国专利申请系列号10/613,077，提交于2003年7月1日，2004年12月30日公布为美国专利申请号2004/0266707；以及PCT/US04/10343，国际提交日2004年4月1日，在2004年10月21日公布为WO2004/090105 A2，其中每一上述的申请以引用的方式并入本文。然而，包含结合物的s iRNA可以通过本领域公知的任意方法合成。
VI.减少非靶向 当用来靶向并且沉默一个基因的siRNA无意地靶向并且沉默一或多个另外的基因时就发生了非靶向。这样的非靶向的发生是由于siRNA的有义和/或反义链和非靶mRNA之间互补水平的变化。由非靶向引起后果包括对关键基因的沉默，并引起多种表型(例如，细胞死亡，细胞分化)。此外，非靶向可以在多种的表型筛选中产生假阳性。因此，非靶向的后果代表了实行大规模的、基因组范围的基于siRNA的表型筛选要面临的挑战性障碍。相应地，减少以及消除任意的非基因沉默是有益的。
在一个具体实施方案中，可以通过利用siRNAs库减少或抑制将非靶向的后果。与单一的siRNA相比siRNAs库已经显示出可以引起较少的非靶效应。如上所述，该库可能包含两个或更多siRNAs，它们基本上与一个靶mRNA的不同的子序列互补或与不同的靶mRNAs的子序列互补。例如，第一siRNA和第二siRNA可以包含基本上与一种靶mRNA的第一和第二子序列互补的反义序列。第一和第二子序列可以是互不重叠的或重叠的。基因沉默组合物可以包括具有二，三、四，五个或更多不同siRNAs的库。当至少两种siRNA直接针对相同目标时，由于使用了siRNAs库而减少非靶效应的好处是特别显著的。此外，修饰的siRNA库，具有发夹结构的siRNA库，或者具有结合物的siRNA库是具有优势的。利用siRNA库的益处在下述文献中描述美国专利申请，10/714,333，提交于2003年11月14日，相关的PCT申请PCT/US03/36787，作为WO2004/045543 A2公布于2004年6月3日，美国专利申请10/940,892提交于2004年9月14日，作为美国专利申请公布2005/0255487和美国专利申请公布2005/0246794，其中每个文献以引用的方式并入本文。
非靶向的减少或者特异性的增加还可以通过使用低于诱导非靶效应的siRNA浓度而实现。例如，转染100nM的单一siRNA可以诱导90％的沉默，然而高浓度的该siRNA可能同时诱导非靶效应。相反，四种siRNAs(例如，总浓度100nM，每个25nM)组成的库可以相似地诱导产生90％的沉默。因为每个siRNA是四分之一的浓度，非靶的总量是较少的。因此，为了获得带有抑制的非目靶效应或者没有非靶效应的沉默，可在低浓度使用高度功能性的siRNA，或者靶向至相同基因的siRNA库，库中每种siRNA具有足够低的浓度以尽量减少非靶效应。优选地，siRNAs的总量可以以小于或等于100nM的浓度进行转运。更优选地，siRNAs的总量可以以小于或等于50nM的浓度进行转运.更加优选地，siRNAs的总量可以以小于或等于25nM的浓度进行转运。更加优选地，siRNAs的总量可以以小于或等于10nM的浓度进行转运。最优选地，siRNAs的总量可以以小于或等于1nM的浓度进行转运。
在另一个具体实施方案中，抑制或者终止非靶效应的另一个方法是将热力学不稳定性引入至第二反义核苷酸上的该双链体碱基配对中。例如，这可以通过在siRNA反义核苷酸和其靶mRNA上应该与之互补的核苷酸之间的错配而实现。另外地，在siRNA反义链或者有义链上插入或者删除一个核苷酸可以在双链体中产生一个凸起，该双链体形成于siRNA反义链或者有义链和靶mRNA或者非靶序列之间。另外，还可以将热力学不稳定性引入从5’末端起的第三、第四、第五、第六、和/或第七个反义核苷酸。然而，产生的热力学不稳定性可以导致对于其它序列的沉默(例如，其它的或者次要的非靶效应)，但是可以通过使用合理设计的热力学不稳定性而避免。
VII.多核苷酸载体 在一个具体实施方案中，本发明包括可以与siRNA相互作用，并且运输该siRNA穿过细胞膜的多核苷酸载体。然而，在本发明转染模式的其它具体实施方案中可以以没有载体的方式实施，例如通过电泳、沉淀、粒子轰击、光穿孔、以及显微注射。通常，多核苷酸载体包括正电荷，其与在多核苷酸主链上带负电荷的磷酸相互作用。多核苷酸载体是在细胞核酸转运领域内是公知的。优选的多核苷酸载体包括多聚体、脂质、脂多聚体、脂质-肽混合物等等，其能够络合siRNA并且以保持基因沉默功能且不会过度有毒的方式将siRNA转运进入细胞。因此，可根据在此描述的通过优化RTF以鉴别用于某种的系统或者细胞的最佳的多核苷酸载体方法来实施常规试验。
在一个具体实施方案中，脂质或者脂质-肽混合物优选的用于引导siRNA进入靶细胞。一般地，该脂质是阳离子脂质。可用于引导siRNA进入细胞的阳离子脂质特征为具有很少毒性或没有毒性(例如，定义为小于15-20％毒性)，其可以通过AlamarBlue或等效的细胞生活力分析而测量。另外，脂质可以转运足够量的siRNA进入细胞以便诱导基因沉默。脂质是可以从各种商业的资源中获得，包括而不局限于Invitrogen(LIPOFECTAMINETM，LIPOFECTAMINETM2000)，Ambion(siPORTTM)，B-Bridge International(siFECTORTM)，Mirus(TransIT-TKOTM)，以及Qiagen(RNAiFECTTM)。然而，并非所有的脂质是功能等效的并且某些脂质可以更适合于特定的细胞系。因此，可以使用上述最优化过程以确定用于转运siRNA至特定细胞系的适当脂质以及脂质浓度。此外，脂质-肽混合物可以增强转运siRNA进入细胞。与一个或多个蛋白质、脂质、脂质-聚糖、或者其它的细胞膜组分具有亲合性的肽可以与siRNA结合，并且可以独立于脂质使用，或者更有效地同一种或多种脂质相结合以形成多核苷酸载体使用。这样的脂质-肽混合物可以提高siRNA的RTF。胆固醇结合物可以相似地与siRNA偶联在一起并且独立于多核苷酸载体使用或者有效地与其联合而使用。
简要地，为了鉴别一个给定的脂质是否适用于siRNA RTF，可以在各种脂质、培养基、以及siRNA浓度下使用在此描述的优化RTF方法来检验两个或更多个孔中的siRNAs。随后，使用本领域公知的方法量化对于该靶基因沉默的水平以及细胞死亡的水平。用于siRNA RTF的合适脂质包括但是不局限于OLIGOFECTAMINETM，TransIT-TKOTM，或者TBIO Lipid 6TM(Transgenomic part#24-1001-05).更优选地，本发明使用LIPOFECTAMINETM2000(Invitrogen)。最优选地，本发明使用脂质DharmaFECTTM1，DharmaFECTTM2，DhaxmaFECTTM3，DharmaFECTTM4(Dharmacon，Inc.)其已经特异地设计用于递送siRNA。术语“DharmaFECTTM”(后面是任何数码1，2，3，或者4)或者短语“DharmaFECTTM转染试剂”，是指一或多种基于脂质的转染试剂，其已经最优化用于转染siRNA而不是较大的核酸(例如，质粒)。
功能性的siRNA-脂质复合物的形成可以通过混合siRNA以及脂质而制备。因此，在选定浓度下适当体积的脂质可以与一定体积的培养基和/或缓冲液结合以形成具有合适的脂质浓度的脂质-培养基或者脂质-缓冲液。例如，体积大约为5-50微升(“μL”)的脂质培养基可以包括大约0.03-2微克(“μg”)脂质以用来置于96-孔板中的每个孔中，并且脂质的量可以根据其他孔的大小而变化。对用于siRNA RTF的培养基和/或缓冲液的选择可以改善RTF操作方案的效率。一些培养基包含一种或多种在RTF期间诱导细胞毒性和/或非特异性基因调节的添加剂。优选的培养基或者缓冲液的例子包括Opti-MEMTM(GIBCO，Cat.#31985-070)，HyQ-MEM-RSTM(HyClone，Cat.#SH30564.01)，Hanks Balanced Salt SolutionTM，或功能相同的培养基。合适的培养基可以通过使用在此描述的最优化操作方案来鉴别。
脂质-培养基或者脂质-缓冲液可以通过多种方法被引入孔中，包括手持式单一移液器及多通道移液器，或者更先进的自动化的移液系统，其可以注射所定体积的脂质溶液进入孔中。该脂质溶液可以在包含干燥基因沉默组合物的孔中培养一段足够溶解或者悬浮该siRNA的时间，并且形成siRNA-脂质复合物(例如，lipoplexes)。通常，siRNA溶解以及lipoplex形成的过程需要大约20分钟，但是通常至多120分钟。该复合物形成过程一般来说在室温下完成，但是也可以在4-37℃范围下完成。在有些情况下，可以通过短暂(例如，几秒-几分钟)搅动多孔板)以混合该脂质以及siRNA，从而提高siRNA溶解以及复合物形成。
VIII.孔的排列 在一个具体实施方案中，包括许多具有不同的干燥基因沉默组合物的孔的siRNA RTF板可以按预定排列安排这些孔。这样的排列可以与siRNA RTF板所使用的分析类型相一致。也就是说，当研究一个基因家族时，靶向至相同基因的siRNA可以安排在同一列或者行中，同时靶向至不同基因siRNA可以安排在不同的列或者行中。因此，孔可以根据预先选出的排列进行安排以便特定的siRNAs在板上以预先选出的模式放置。该预先选出的模式包括对照孔，例如那些包括一种或多种阴性的和/或阳性的siRNA对照，以及转染对照。此外，该预先选出的模式包括没有或基本上没有siRNA的孔，其可以作为对照和用于校准。
在不同多孔板的孔中具有预先干燥的siRNA以便多个板可以同时制备，这是有益的。这可以允许多孔板在标准位置上具有含标准量siRNA的基因沉默组合物，这有利于在多重实验中使用标准化的多孔板，该多重试验可以在不同时间实施并且不会引起板间的多变性。标准化板排列的使用可以提供一系列的板，其能在一段时间内使用后一起进行数据分析。
例如，一个包含许多列的孔的板可以包括位于第一列的转染对照，位于第二列的用于RNAi的阳性对照，位于第三列的用于RNAi的阴性对照，位于第四列的直接针对单一靶的siRNAs库，以及位于随后列的包含第四列的siRNA库的特定成员，例如从第五直到第十二列。另外地，该第五列直到第十二列可以包含处于第四列库中的不同浓度的每种siRNA，孔到孔之间siRNA的量增加或者减少。每个孔可以包括库中每种siRNA的一个浓度，或者库中每种siRNA的二、三、四、五、或更多个浓度可以出现在不同的孔中。可以使用的siRNA浓度的数目仅仅由板上孔的数目所限制；然而，多个板可以通过推广至所有板的预定模式配置从而一起使用。
相应地，siRNA浓度梯度的预先选出模式可以作为一个可被观测的模式使用，以便可以通过观测在特定浓度下的特定siRNA引发的沉默水平而确定库中每种siRNA的最佳量。例如，在第四列的连续的每行中具有连续地增加或者减少的总库siRNA量。另外，连续的列可以包括连续地增加或者减少的特定库siRNA的量。
图IA和IB显示了与上述浓度排列相似的板排列的具体实施方案。虽然孔显示为正方形，但应该认识到它们可以是任意形状。此外，该多孔板可以包括许多孔，并且描述的孔的数目仅仅用于举例。在图中孔按照如下的定义“Tc”表示转染对照多孔，其中逐渐增加的相应数字区分不同的转染对照；空白孔表示没有或基本上没有任意siRNA的孔；“+”表示阳性对照；“-”表示阴性对照；“P1”直到“P1N”表示在一个浓度梯度下沉默第一基因的第一库；“P2”直到“P2N”表示在一个浓度梯度下沉默第二基因的第二库；“1A”直到“1N”表示在一个浓度梯度下的第一库的第一特定的siRNA；“2A”直到“2N”表示在一个浓度梯度下的第一库的第二特定的siRNA；“3A”直到“3N”表示在一个浓度梯度下的第一库的第三特定的siRNA；“4A”直到“4N”表示在一个浓度梯度下的第二库的第一特定的siRNA；“5A”直到“5N”表示在一个浓度梯度下的第二库的第二特定的siRNA；以及“6A”直到“6N”表示在一个浓度梯度下的第二库的第三特定的siRNA。因此，图IA显示了分析单一库的多孔板，并且图IB显示了分析多重库的多孔板。另外，多孔板可以包括超过两个库。此外，该库以及单一siRNA可以是合理地设计的，和/或具有修饰或者结合物。
另外，可以组织关于板排列的具体实施方案以使得该板包含的siRNA针对单一生物学相关途径、细胞代谢过程、细胞事件、调控的蛋白质、胚胎的过程，特定染色体位置、细胞周期、有机体或者器官发育、细胞分化、炎性过程、增殖的过程、血管生成等等。在另一个具体实施方案中，可以在板上排列siRNAs的靶基因，它们是已知的和/或猜测的和疾病或者失调或者先于疾病或者失调的生物过程有牵连。在另一个具体实施方案中，多孔板包括作为miRNA抑制剂的siRNA。在另一个具体实施方案中，用于研究具有和已知的或者猜测的上游和下游效应相关的siRNA的生物学途径的板排列的原则可以是蛋白质，而不是激酶。关于这些及用于多种研究的其他板排列的附加描述可以参见所引用的美国临时申请系列号60/678,165。
在另一个具体实施方案中，可以将siRNA排列在多孔板中，该siRNA靶向至具有一或多个单核苷酸多态性(“SNP”)的基因。可以制备这样的多孔板以便评定特定的SNP对表型、生物学功能、疾病状态、或者其它的事件的影响。例如，SNP板可能包含具有不同的siRNA(s)的孔，包括下述的(i)针对第一目标的第一siRNA；(ii)和与第一siRNA相差一个碱基对的第二siRNA，其包括一个SNP；(iii)由第一siRNA和第二siRNA组成siRNA库；和(iv)对照siRNA。此外，第一目标和第二目标可以编码用于潜在地致死对(lethal pair)。
在另一具体实施方案中，多孔板可以包含一种siRNA的排列，该siRNA直接针对于一个或多个基因，并已经知道敲低这些基因会诱导特定的疾病状态。这样的孔可以编制起来以便通过靶向这样基因的连续siRNA促进特定疾病的研究。用这种方法，科研工作者可以研究各种疾病状态，所包括的状态与下述疾病相关癌、神经病学疾病、糖尿病、新陈代谢病、骨、软骨、肌肉、心脏、肾、肝脏、前列腺、胃肠道疾病等等。这些板的孔可以包含单独的siRNA或者siRNA库。
另外，可以排列多孔板以在不同的孔中包括大量不同的修饰的和/或未修饰的siRNAs。例如，一个96-孔板可能包含下列内容10-12孔的未修饰的第一siRNA；10-12孔的修饰的第一siRNA；10-12孔的未修饰的第二siRNA；10-12孔的修饰的第二siRNA；10-12孔的未修饰的第三siRNA；10-12孔的修饰的第三siRNA；10-12孔的未修饰的第四siRNA；10-12孔的修饰的第四siRNA。第一、第二、第三和第四siRNAs可以是针对同一靶mRNA的不同区域，其可以是重叠的或者不重叠的，或者它们可以针对编码不相关蛋白质的不同mRNA，或者具有相似的功能或者在相同生物学途径中起作用的蛋白质。
在另一个具体实施方案中，可以排列多孔板以使一些孔包含库，同时一些孔包含单一种类的siRNA。因此，该多孔板可以具有不同的孔，其包含下列物质(i)第一siRNA，第二siRNA，第三siRNA，第四siRNA，和第五siRNA，其中任意一个可以是修饰的或者未修饰的；(ii)第一siRNA，第二siRNA，第三siRNA，和第四siRNA，其中任意一个可以是修饰的或者未修饰的；(iii)第一siRNA，第二siRNA，第三siRNA，和第五siRNA，其中任意一个可以是修饰的或者未修饰的；(iv)第一siRNA，第二siRNA，第四siRNA，和第五siRNA，其中任意一个可以是修饰的或者未修饰的；(v)第一siRNA，第三siRNA，第四siRNA，和第五siRNA，其中任意一个可以是修饰的或者未修饰的；(vi)第二siRNA，第三siRNA，和第四siRNA，第五siRNA，其中任意一个可以是修饰的或者未修饰的；(vii)第五siRNA，其可以是修饰的或者未修饰的；(vii)第六siRNA，其可以是修饰的或者未修饰的；(viii)第七siRNA，其可以是修饰的或者未修饰的；(ix)第八siRNA其可以是修饰的或者未修饰的；(x)第九siRNA，其可以是修饰的或者未修饰的；和/或(xi)对照siRNA. 另外，可以编制多孔板的排列以便研究siRNAs文库，其可以以阵列格式提供。优选地，该阵列包含RTF siRNA文库。siRNA文库可用于研究整个基因家族或者调控通路。这些siRNA文库包含预先选定的多组合理设计的siRNA试剂库，该siRNA试剂靶向被证实的与特定的通路有关的或者从系统发生上与所示基因家族有关的基因。另外，这样的siRNA文库的例子可以参见表1。
表1 siRNA文库 表1中描述了组成siRNA文库的siRNAs，美国临时申情系列号60/678,165提供了关于利用基因沉默以研究表格1中鉴别出的途径更完整的说明，以及关于板排列和可以使用siRNA库研究的基因种类的附加描述。
实施例 所提供的下列实施例用来以本领域技术人员能够实现本发明的方式描述本发明的一些具体实施方案。另外，以下实施例包括实际上已实行的以及预言性的实验。用于以下实施例的另外的实施例以及附加信息可参见下述参考文献律师记录号16542.1.2，题为“APPARATUS AND SYSTEM HAVING DRY GENE SILENCINGPOOLS”，发明者为Barbara Robertson，Ph.D.等人；律师记录号16542.1.3，题为“APPARATUS AND SYSTEM HAVING DRY CONTROL GENE SILENCING COMPOSITIONS”，发明者为Barbara Robertson，Ph.D.等人；以及美国临时申请系列号60/678,165。用于实施例的多核苷酸序列可以参见美国临时申请系列号60/678,165的表I-IV。
实施例1 本发明的多核苷酸可以通过现在已知的或者将来开发的任意可用于制备能形成siRNA的多核苷酸的方法来合成。在此描述的包含修饰的siRNA双链体的一条链，可以利用下述文献描述的物质以及方法而进行化学合成，这些文献是Scaringe，S.A.(2000)Advanced 5’-silyl-2’-orthoester Approach to RNAOligonucleotide Synthesis，Methods Enzymol.，317，3-18；Scaringe，S.A.(2001)RNA Oligonucleotide Synthesis via 5’-silyl-2’-orthoester Chemistry，Methods，23，206-217；美国专利号5,889,136；美国专利号6,008,400；美国专利号6,111,086；以及美国专利号6,590,093；每个文献以引用的方式并入本文。简要地说，合成法可以利用保护核苷碱基的5’-O-甲硅烷基-2 ’-O-原酸酯-3’-O-亚磷酰胺或者其它的保护基团以便将修饰的或者未修饰的核苷酸引入具有特定的siRNA序列的多核苷酸中。该合成是按典型方式进行的，从而该多核苷酸以3’到5’的方向从固体支持介质上延伸。
实施例2 如实施例1所描述的，siRNA双链体的有义链以及反义链是在分开的反应过程中化学合成的。简要地，每个合成方法是相似的并且开始于核苷酸从固体聚苯乙烯支持物上的连续延伸，3’-最末端核苷已经共价地连接于该支持物上，其中该有义核苷X21和反义核苷Y21是连接在该支持物上。然后利用重复循环以从3’到5’方向的序列-特异性的方式连续地添加核苷至该结合支持物的样品(support boundspecies)上上。该反应循环是这样实行的第一个循环添加该有义核苷X20至X21或者反义核苷Y20至Y21；第二个循环添加有义核苷X19至X20X21或者反义核苷Y19到Y20Y21，并且延伸直到该整个有义或者反义链完成。每个循环由四个步骤组成结合支持物的样本的5’-羟基的脱保护；待引入的核苷的反应偶联基团结合至结合支持物的样本的5’-羟基；未反应的5’-羟基的加帽；以及该核苷酸间连键的氧化。一般地，该反应偶联基团是5’-甲硅烷基-2’-原酸酯-3’亚磷酰胺例如5’-O-二苯甲基氧基(benzhydroxy)-双(三甲基硅烷基氧基trimethyl silyloxy)甲硅烷基-2’-O-双(2-乙酰基氧基乙基)邻位甲酸基-3’-O-(N，N-二异丙基)甲基亚磷酰胺(例如，结构1)。可以合成在位置1和2(例如，mXq，q＝1和2)具有2’-O-甲基核苷的有义链。利用序列-适合的5’-甲硅烷基-2’-O-甲基3’-亚磷酰胺将这些修饰的核苷引入进来，特别地，利用5’-O-二苯甲基氧基(benzhydroxy)-双(三甲基硅烷基氧基)-甲硅烷基-2’-O-甲基-3’-O-(N，N-二异丙基)甲基亚磷酰胺(例如结构2)。结构1和2有如下特征B是一个核苷碱基例如腺嘌呤核苷、鸟嘌呤核苷、胞嘧啶核苷或者尿嘧啶核苷；Z是一个用于环外胺的保护基团(例如，异丁酰用于A和G，乙酰基用于C)。可以合成在5’-末端核苷酸上(例如，位置1)具有一个磷酸基的反义链。通过化学手段利用N，N-双异丙基氨基-双(2-氰乙基)亚磷酰胺(例如，结构3))将这些磷酸基团引入进来。完整的有义链如下5’＞HO-mX1mX2X3X4X5X6X7X8X9X10X11X12X13X14X15X16X17X18X19X20X21-OH＜3’。完整的反义链如下3’＞HO-Y21Y20Y19Y18Y17Y16Y15Y14Y13Y12Y11Y10Y9Y8Y7Y6Y5Y4Y3Y2Y1-PO4＜5’。Xq以及Yq核苷包括A，C，G，或U。mXq核苷是2’-O-甲基核苷包括2’-O-甲基-A，2’-O-甲基-C，2’-O-甲基-G，2’-O-甲基-U。该有义链以及反义链可以形成双链体siRNA。

结构1
结构2
结构3 实施例3 另一个siRNA双链体是用与实施例2所描述的基本上相同的合成过程来制备的。更特别地，有义链是根据实施例2中的描述而制备的，并且反义链除了核苷mY1以及mY2包括2’-O-甲基核苷之外也是同样地制备的。相应地，在反义链上的2’-O-甲基核苷是根据实施例2中的描述与有义链相合并。完整的有义链如下5’＞HO-mX1mX2X3X4X5X6X7X8X9X10X11X12X13X14X15X16X17X18X19X20X21-OH＜3’。完整的反义链如下3’＞HO-Y21Y20Y19Y18Y17Y16Y15Y14Y13Y12Y11Y10Y9Y8Y7Y6Y5Y4Y3mY2mY1-PO4＜5’。Xq以及Yq核苷包括A，C，G，或U。mXq和mYq核苷是2’-O-甲基核苷包括2’-O-甲基-A，2’-O-甲基-C，2’-O-甲基-G，2’-O-甲基-U。该有义链以及反义链可以形成如实施例2所描述的双链体siRNA。
实施例4 另一个siRNA双链体是用与实施例2所描述的基本上相同的合成过程来制备的。更特别地，有义链是根据实施例2中的描述而制备的，并且反义链除了核苷mY2包括2’-O-甲基核苷之外也是同样地制备的。相应地，在反义链上的2’-O-甲基核苷是根据实施例2所描述的用于有义链的方式而引入的。完整的有义链如下5’＞HO-mX1mX2X3X4X5X6X7X8X9X10X11X12X13X14X15X16X17X18X19X20X21-OH＜3’。完整的反义链如下3’＞HO-Y21Y20Y19Y18Y17Y16Y15Y14Y13Y12Y11Y10Y9Y8Y7Y6Y5Y4Y3mY2Y1-PO4＜5’。Xq以及Yq核苷包括A，C，G，或U。mXq和mYq核苷是2’-O-甲基核苷包括2’-O-甲基-A，2’-O-甲基-C，2’-O-甲基-G，2’-O-甲基-U。该有义链以及反义链可以形成如实施例2所描述的双链体siRNA。
实施例5 在下列实施例中，使用细胞培养物来研究基因沉默、mRNA探测、细胞毒性、转染效率等等。相应地，该细胞培养物可以通过本领域公知的方法维持和培养。可以通过分支DNA(“B-DNA”)分析(Genospectra，Fremont，CA)或等效的本领域已知的技术来研究表达和基因沉默的水平。基因沉默研究的细胞毒性评估可以使用AlamarBlue分析(Biosource International，Camarillo California)，由此来评估由实验程序产生的细胞死亡的程度。
实施例6 反向转染(“RTF”)操作方案是使用DNA和siRNA来确定是否一种配置用于DNA的RTF程序可以直接交叉地应用于siRNA。相应地，使用多种脂质、脂质浓度、以及质粒或者siRNA浓度将DNA和siRNA反向转染进入细胞。质粒DNA的RTF是利用96-孔聚-L-赖氨酸板实施的，其中将在50μL体积中含有62.5-250ng pCMV-Luc(例如，公知的荧光素酶表达质粒)的溶液加入孔中并干燥。随后，在不同的孔中用LIPOFECTAMINETM2000培养基，OLIGOFECTAMINETM培养基，以及TRANSIT-TKOTM培养基(Opti-MEMTM)溶解并且复合该pCMV-Luc，其中在30μL的总体积下向每孔添加0.125-1微克(“μg”)的脂质。在加入含10,000个Hela细胞的70μL培养基以获得100μL总体积之前，使复合物在30-60分钟内形成。该板温育48小时然后用STEADYGLOWTM试剂盒(Promega)检测荧光素酶的表达。
作为对照，利用正向转染程序将pCMV-Luc引入细胞。特别地，以每孔10,000个细胞的密度将Hela细胞涂覆在96-孔板中。第二天，用LIPOFECTAMINETM2000与不同量的pCMV-Luc在室温下复合20分钟，再与Opti-MEMTM(例如，每20μLLIPOFECTAMINETM2000质粒混合物使用80μL Opti-MEMTM)混合。从每个孔中移除培养基，然后顺序添加50μL Opti-MEMTM，50μL脂质-CMV-Luc质粒-培养基复合物。这些程序完成后，CMV-Luc质粒和脂质最终量分别在每孔5-50ng和0.125-1.0μg之间。
将对照siRNA反向转染入相同的细胞系以便和DNA RTF相对比。将具有25μL体积内含大约62.5-250纳克的亲环素B siRNA(例如，环3)加入96-孔聚L-赖氨酸板上并且干燥。在不同的孔中用LIPOFECTAMINETM2000培养基，OLIGOFECTAMINETM培养基，TRANSIT-TKO培养基或″siRNA168″-培养基(Opti-MEMTM)溶解并且复合该SiRNA，其中在总体积为25μL下向每孔添加0.156-1.25μg的脂质。“siRNA168”是-种定制用于siRNA转运的脂质。在加入含10,000个Hela细胞的75μL培养基以获得100μL总体积之前，使复合物在30-60分钟内形成。该板温育48小时然后用B-DNA分析测定人亲环素B mRNA的下调水平。
这些研究的结果在图2A-2F中提供，其是显示RTF程序功效的图表。该图表表明RTF程序对DNA和siRNA具有不对等的转运水平。使用正向转染方案，pCMV-Luc容易转染和在细胞中表达，而RTF操作方案则转运不佳。与此相反，已确定利用LIPOFECTAMINETM2000对环3siRNA成功进行RTF的情况，并且其提供了极好的基因沉默。这些结果证明DNA和siRNA在RTF方案中的具有完全不同的性质。另外，数据表明脂质在siRNA RTF中的效力显著地变化。
实施例7 研究与siRNA功能相关的RTF操作方案以实现基因沉默的能力。在单一细胞密度或者每孔10,000个细胞的条件下利用每100mL 0.031-0.5μg脂质的脂质浓度反向转染不同siRNAs的功能性(例如，F50-F95)。特别地，分别具有95、90、75、和50的沉默功能的环3、环14、环28、和环37以不同浓度悬浮在无RNA酶的水中然后沉淀并干燥在96-孔板的孔底面上。添加大约25μL的DharmaFECTTM1-OptiMEMTM至每个孔中以获得最终每100μL0.031-0.5μg的脂质浓度，用以在加入每孔10,000个Hela细胞之前在室温下溶解并复合该siRNA30-60分钟。四天后研究该基因沉默。
图3A-3F是从基因沉默分析中获得结果的图示。正如在该图表中显示的，同种等功能性的siRNA(例如，环28，2天)或者较弱功能性的siRNA(例如，环37，0天)相比，高度功能性的siRNAs(例如，环3和14)表现出较长时间(例如，4天)的沉默。因此，选择通过合理设计的功能性siRNA可以大大地改善基因沉默的持久性。
实施例8 利用正向转染操作方案分析siRNA诱导产生非靶效应的能力。特别地，以正向转染方式转染修饰的和未修饰的IGF1R-73siRNAs进入细胞，然后从细胞裂解物中纯化mRNA并利用Agilent微阵列进行分析。该修饰包括在第一和第二有义核苷酸添加2’-O-甲基，还有在第二反义核苷酸添加2’-O-甲基，还有在反义5’末端核苷酸的5’位置上添加磷酸基。简要地，将从未经处理的或者siRNA处理的细胞中分离的μg总RNA进行扩增，然后使用Agilent’s Low Input RNA FluorescentLinear Amplification Kit标记Cy5TM或者Cy3TM(Perkin Elmer)。依照标准操作规程使用Agilent’s人类IA(V2)寡量微阵列(例如，22,000序列)实行杂交，其中用每个Cy-3TM和Cy-5TM标记的原料添加750纳克到每个阵列上。载片使用6X和0.06X含有0.025％N-十二酰甲甘氨酸的SSPE冲洗，再使用Agilent’s无水干燥和稳定溶液进行干燥。在Agilent微阵列扫描器(G2505B型)上扫描每个样品阵列的生物复制物，并且使用特征提取(Feature Extraction)软件(v6.1.1或v7.5.1)加工原始图象。使用Spotfire Decision Site 7.2软件和Spotfire功能性基因组模数实行更进一步的分析。在自身与自身(self-self)的杂交中，具有小于2.8的低信号基因从该分析中移除，该得分通过计算自以10为底的绿色和红色加工信号总和的对数值而获得的。2倍参数截止值(例如，对数比率＞0.3或者＜-0.3)被应用于进行比较分析的基因上。不使用逸出值标志(outlier flagging)。
图4是表明这些实验结果的图像，并且显示siRNA IGF1R-73下调了多组基因。在图4中，非靶向在图像右侧顶端以较浅的颜色线显示，其是未修饰的siRNA。另一方面，修饰的siRNA没有显示实质上的非靶向。这些非靶效应是高度有害的，因为在基因组siRNA筛选是它们可以产生假阳性。
实施例9 用具有毒性基序的siRNA研究修饰的siRNA减少非靶效应和减少非靶效应产生的表型的能力。该毒性siRNA是经过如下修饰的在第一和第二有义核苷酸添加2 ’-O-甲基，以及在第二反义核苷酸添加2 ’-O-甲基，还有在反义5’末端核苷酸的5’位置添加磷酸基。这些修饰显著地减少了经过双链体产生的非靶效应。
图5是当毒性siRNA被修饰后所出现的细胞毒性的图示。该图表显示八个单独的未修饰的毒性siRNA(例如，MAP2K2 d3、SRD5A1 d1、SRD5A1 d2、SRD5A1 d4、SRD5A2 d3、PDE8A、STKI 13和CHD4)都减少细胞生活力到低于75％。与此相反，化学修饰的八个双链体显著地减少siRNA-诱导的毒性同时没有显著地改变靶特异性的沉默。这些发现证明对siRNA添加化学修饰可以消除非靶效应产生的表型。
实施例10 通过用100％人类血清温育的siRNA来研究s iRNA抗核酸酶的稳定性。然后在溴化乙锭染色的琼脂糖凝胶上检验该siRNA。图6是该凝胶的图像，其显示了未修饰的siRNA在有RNA酶存在的情况下迅速地降解并且具有按分钟计量的半衰期。如所示，在可见的多核苷酸带的位置上划线以使其清晰。相应地，修饰的siRNA能在研究过程中保持其完整性。因此，该结果指出修饰的siRNA可以在长时间内保持其完整性。这是重要的，因为本发明的板包含干燥的siRNA，这些板可能需要几周到几月的贮藏期限，其间存在RNA酶污染和siRNA降解的可能。
实施例11 研究了稳定修饰的siRNA抵抗RNA酶降解的能力。该稳定siRNA具有下列修饰在第一和第二有义核苷酸上的2’-O-甲基；在所有的有义嘧啶核苷酸(例如，C和U)上的2’-O-甲基；在所有的反义嘧啶核苷酸上的2’-F修饰；以及在反义5’末端核苷酸的5’上磷酸基。图7包括了四个修饰的siRNA(例如，M1-M4)和四个未修饰的siRNA(例如，U1-U4)的图示。该图表显示与未修饰的siRNA相比，修饰的siRNA显著地抗降解。修饰模式将siRNA清半衰期从几分钟增加到了大于100小时。
实施例12 研究了稳定修饰的siRNA经受通过RNA酶的降解仍保持功能性的能力。该功能性试验是用如实施例11描述的修饰siRNA经过正向转染来进行的并且与未修饰的siRNA作比较。图8显示了在较长的一段时间后能保存对于预定目标的功能性沉默的化学修饰模式。当通过未修饰siRNA产生的沉默持续了4-5天时，修饰的siRNA可沉默该既定目标超过7天。因此，该化学修饰应该也能提高使用RTF方式的沉默功效。
实施例13 研究了与未修饰的siRNA相比，在RTF操作方案中使用稳定修饰的siRNA的能力。该稳定修饰的siRNA具有与实施例11描述的靶向人亲环素B(环3)的siRNA上相同的修饰。水溶液中的该siRNA干燥在经聚L-赖氨酸处理的96-孔板的孔中以便在添加125μL脂质-培养基和细胞时得到61.5、125、或者250nM的浓度。脂质溶液LIPOFECTAMINETM2000-Opti-MEMTM，TKO-Opti-MEMTM，or DharmaFECTTM1-Opti-MEMTM以每100μL含0.125、0.25、或者0.5μg总脂质的浓度添加至该孔中以溶解并复合siRNA30-60分钟。每个孔中添加大约10,000个Hela细胞，并且在分析毒性以及亲环素B mRNA沉默之前培养48小时。
图9A显示了修饰的以及未修饰的siRNA执行相似操作，每100μL的LIPOFECTAMINETM2000中仅仅0.125μg就产生了可接受程度的细胞生活力。虽然更高水平的脂质会产生不能接受的细胞死亡水平，但是可以看出在每100μL0.25μg脂质条件下，修饰的双链体比未修饰的双链体诱导较低的毒性。这一观测提示该修饰模式具有一种额外的、限制经RTF引入的siRNA所产生的细胞毒性的益处。图9B显示了通过使用LIPOFECTAMINETM2000的修饰的以及未修饰的双链体诱导的基因沉默是几乎相同的。
图10A显示了TKO脂质浓度在每100μL0.125-0.5μg脂质之间没有改变细胞生活力，其中所述的生活力为低于大约在对照中观测到的80％。不幸地，如图10B所示在这些条件下siRNA的沉默效果更加受限，其中几乎所有浓度的siRNA在每100μL0.125μg脂质的条件下仅仅沉默了40％的亲环素B，在每100μL0.25μg脂质的条件下沉默了大约50-70％，在每100μL0.5μg脂质的条件下沉默了大约80-90％。这些结果显示化学修饰一点都没有显著改变该siRNA的毒性或者沉默效率。此外，由此可见并非所有的脂质都在RTF模式中提供相等的转运。
图11A显示了在每100μL0.125μg的条件下，DharmaFECTTM1对于修饰的以及未修饰的siRNA的毒性是相似的，并且与LIPOFECTAMINETM2000和TKO相比是毒性较低的。另外，与未修饰的siRNA相比DharmaFECTTM1对于修饰的siRNA有较低的毒性。图11B表示在每100μL0.125μg条件下基因沉默的效率是相似的。因此，在这些条件下，添加所描述的化学修饰至siRNA没有改变双链体的沉默效率。
实施例14 用靶向G6PD、GAPDH、PLK、和UQC的siRNA研究合理设计的siRNA库沉默四个单独基因的能力。在总siRNA浓度为100nM、每种siRNA浓度为6.25nM的条件下，使用LIPOFECTAMINETM2000正向转染siRNA库(例如，每个基因4种siRNA)进入细胞中，并且二十四小时后通过B-DNA进行分析。图12是该结果的图示，其显示出由合理地设计的分子组成的库能够同时地沉默四个不同的基因。在一个RTF方式中靶向多个基因的能力将显著地简化使用RTF筛选大(例如，基因组规模的)规模siRNA的能力。
实施例15 研究了在RTF操作方案中细胞密度的重要性。环3、环14、环28、和环37 siRNA的溶液沉淀然后干燥在聚L-赖氨酸涂铺的96-孔板的底部上，得到最后浓度为4nM，8nM、15.5nM、31nM、62.5nM、125nM、和250nM。25μL DharmaFECTTM1-Opti-MEMTM的脂质溶液添加至每个孔中以获得每100μL0.015μg、0.031μg、0.063μg、0.125μg，或者0.25μg脂质的最终浓度。在每孔添加5,000、10,000、20,000、或者40,000个Hela细胞之前，使该DharmaFECTTM1-Opti-MEMTM混合物溶解并且与该干燥的siRNA复合30-60分钟。“可接受的生活力”定义为大约80％或者更高的生活力。“可接受的沉默”定义为大约80％或更高的沉默。
图13A是在每孔5,000个细胞的细胞密度条件下，第2天基因沉默的图解说明。该图表显示最多每100μL0.031μg脂质和125-250nM siRNA条件下，四个经检验的siRNA中的三个(例如，环3和环14，以及环28)提供了可接受水平的沉默。图13B是毒性的相应图示，其显示直到脂质增加到每100μL0.125μg脂质情况下的最低水平的毒性。所有其它的情况在所有检验的siRNA集合内产生了不能接受的沉默和/或细胞死亡水平。
图14A是在每孔5,000个细胞的细胞密度条件下，第4天基因沉默的图解说明。该图表显示最多每100μL0.063μg脂质以及15.5nM-62.5nM的siRNA条件下，四个经检验的siRNA中的两个(例如，环3和环14)提供了可接受程度的沉默。图14B是毒性的相应图示，其显示除环37外，每100μL0.063μg脂质和15.5nM-62.5nM siRNA提供了可接受的毒性。所有的其它的情况在所有检验的siRNA集合内产生了不能接受的沉默和/或细胞死亡水平。
图15A是在每孔5,000个细胞的细胞密度条件下，第8天基因沉默的图解说明。该图表显示了没有一个检验水平是合格的。图15B是毒性的图解说明，其显示所有的情况是过度有毒的，其更多地是持续时间的作用而不是所述情况的真实毒性。
图16A是在每孔10,000个细胞的细胞密度条件下，第1天基因沉默的图解说明。该图表显示最多每100μL0.063μg脂质的情况下，四个经检验的siRNA中的两个(例如，环3和环14)提供了可接受程度的沉默。图16B是毒性的相应图示，其在最佳的沉默条件下具有最小值。所有的其它的情况在所检验的siRNA集合内产生了不能接受的沉默和/或细胞死亡水平。
图17A是在每孔10,000个细胞的细胞密度条件下，第2天基因沉默的图解说明。该图表显示最多每100μL0.063μg脂质的情况下，四个经检验的siRNA中的两个(例如，环3和环14)提供了可接受程度的沉默。图17B是毒性的相应图示，其在最佳的沉默条件具有最小值。所有的其它的情况在所检验的siRNA集合内产生了不能接受的沉默和/或细胞死亡水平。
图18A是在每孔10,000个细胞的细胞密度条件下，第4天基因沉默的图解说明。该图表显示最多每100μL0.063μg脂质和4-31nM siRNA的情况下，四个经检验的siRNA中的两个(例如，环3和环14)提供了可接受程度的沉默。图18B是毒性的相应图示，其在最佳的沉默条件下具有最小值。所有的其它的情况在所检验的siRNA集合内产生了不能接受的沉默和/或细胞死亡水平。
图19A是在每孔20,000个细胞的细胞密度条件下，第1天基因沉默的图解说明。该图表显示最多每100μL0.125μg脂质和125-250nM siRNA的情况下，四个经检验的siRNA中的一个(例如，环14)提供了可接受程度的沉默。图19B是毒性的相应图示，其在最佳的沉默条件下具有最小值。所有的其它的情况在所检验的siRNA集合内产生了不能接受的沉默和/或细胞死亡水平。
图20A是在每孔20,000个细胞的细胞密度条件下，第2天基因沉默的图解说明。该图表显示最多每100μL0.125μg脂质的情况下，四个经检验的siRNA中的两个(例如，环3和环14)提供了可接受程度的沉默。图20B是毒性的相应图示，其在最佳的沉默条件具有最小值。所有的其它的情况在所检验的siRNA集合内产生了不能接受的沉默和/或细胞死亡水平。
图21A是在每孔40,000个细胞的细胞密度条件下，第1天基因沉默的图解说明。该图表显示没有一种情况是可接受的。另外，图21B显示不可接受的毒性。该结果暗示反向转染过程对细胞密度是极端敏感而且在此方式下小于每孔40,000个细胞(在一个96-孔板)的密度对于成功的基因敲低是优选的。
实施例16 通过siRNA RTF研究涉及激酶途径的基因以确定与细胞生活力相关的基因。合理设计的靶向激酶家族的779个成员的siRNAs溶解在无RNA酶的水中然后干燥在PLL涂铺的96-孔板的每个孔中。对于125μL的总溶液每，个siRNA的量是大约25nM。添加在25μL总体积的Hanks平衡的盐缓冲液中具有0.1μg DharmaFECTTM1脂质的脂质溶液至每个孔中，然后在添加含10,000个Hela细胞的培养基以获得125μL最终体积之前，温育20-40分钟以溶解并且复合该siRNA。该板温育24至72小时，然后用分析于细胞生活力。对单独的脂质(例如，对照孔)处理的培养物和用激酶siRNA阵列的独立成员处理的培养物的细胞生活力比较可以鉴别对HeLa细胞生活力不可缺少的基因。
实施例17 通过siRNA RTF研究涉及细胞因子受体家族的基因以确定对细胞生活力有作用的基因。合理设计的靶向该细胞因子受体家族中166个成员的siRNAs溶解在无RNA酶的水中然后干燥在PLL涂铺的96-孔板的每个孔中。对于125μL的总溶液，每个siRNA的量大约是25nM。添加在25μL总体积的Hanks平衡盐水缓冲液中具有0.1μg DharmaFECTTM1脂质的脂质溶液至每个孔中，然后在添加含10,000个HT-29细胞的培养基以获得125μL最终体积之前温育20-40分钟以溶解并复合该siRNA。该板温育24到72小时然后用于分析细胞生活力。对单独的脂质(例如，对照孔)处理的培养物和用细胞因子受体siRNA阵列的独立成员处理的培养物的细胞生活力比较可以鉴别对HT-29细胞生活力不可缺少的基因。
实施例18 用具有毒性基序的siRNA研究了不同的包含脂质的基于水的溶液，在siRNARTF操作方案中减少或者抑制细胞毒性的能力。当单独给药或者和其它的压力诱导因子(例如，毒性小分子、脂质溶液、脂质)联合给药进行研究时，一组包含基序AAA/UUU或者GCCA/UGGC的siRNAs可以诱导细胞压力或者死亡。特别地，将直接针对于SRD5al(有义，5’CCGGAAATTTGAAGAGTAT SEQ.ID NO.2)基因的毒性siRNA干燥在PLL涂铺的板上。在这些研究中使用的毒性siRNA是未修饰的或者修饰的。第一种修饰包括在第一以及第二有义核苷酸上的2 ’-O-甲基，在第二反义核苷酸上的2 ’-O-甲基，以及在反义链(Mod T1)反义5’末端核苷酸5’碳上的磷酸基。第二种修饰包括在有义5’末端核苷酸上的5’脱氧核苷酸，在第二反义核苷酸上的2 ’-O-乙醇基团，以及在反义5’末端核苷酸(Mod T2)5’碳上的磷酸基。
图22是关于在Opti-MEMTM和HBSS中使用LIPOFECTAMINETM2000的细胞生活力的图示。在Opti-MEMTM中未修饰的毒性siRNA在所有条件(例如，10nM以及100nM siRNA)之下不依赖脂质浓度的诱导大于20％细胞死亡。然而，每100μL0.04μg脂质具有大概80％的细胞生活力。另外，两种修饰的siRNA都具有大于80％的细胞生活力。在HBSS中未修饰的毒性siRNA在每100μL总溶液0.04和0.06μg脂质条件下不会诱导细胞毒性。仅仅在每100μL总溶液0.1μg脂质下，100nM未修饰的siRNA的情况下观测到大于20％的细胞毒性。所有的修饰的siRNA显示出最小的毒性。这些结果显示HBSS可以在RTF操作方案中减少毒性。此外，这些结果显示化学修饰的siRNA是适合于RTF操作方案的并且可以限制产生压力和毒性的非靶效应。
实施例19 用具有毒性基序的siRNA研究了在siRNA RTF方案中不同的脂质减少或者抑制细胞毒性的能力。通过添加化学修饰清除了经由这些分子产生的毒性，该修饰防止、限制、或者改变与非靶分子之间不完全结合。特别地，直接针对于SRD5al基因(有义，5’CCGGAAATTTGAAGAGTAT，SEQ ID NO.2)的毒性siRNA被沉淀并且干燥在PLL涂铺的96-孔板的孔底面上以获得10或100nM的最终浓度。用于这些研究的毒性siRNA正如在实施例18一样，是未修饰的或者修饰的，。
图23A是针对不同脂质的细胞生活力图示。LIPOFECTAMINETM2000-Opti-MEMTM未修饰的毒性的siRNA在所有条件(例如，10nM和100nM siRNA)下，不管脂质浓度如何(例如，0.04、0.06、0.08、和0.1μg每100μL溶液)都诱导大于20％的细胞死亡。在每100μL0.04μg时观察到一个处于边界值的特例，其中培养物生活力在80％左右。另外，修饰的siRNA减少了细胞毒性。DharmaFECTTM1-Opti-MEMTM未修饰的毒性siRNA在每100μL0.04和0.06μg脂质总溶液中具有10nM siRNA的情况下是没有毒性的。在每100μL0.04和0.06μg脂质总溶液下，具有10nM和100nMsiRNA情况下观察到细胞毒性大于20％。所有修饰的siRNA表现出最小毒性。
图23B图示了每个条件下所提供的沉默水平，其表明在所有的样品中是大致相等的。因此，这些结果显示DharmaFECTTM1通过尽量减少经由序列诱导的毒性水平提供了对RTF操作方案的改善，该毒性在很宽的脂质浓度范围内压迫细胞。此外，这些实验表明化学修饰的siRNA适合于所描述的反向转染方式并且在消除产生压力和毒性的非靶效应中是有效的。
实施例20 在RTF操作方案中，研究了直接针对一选定基因的siRNA库的能力。为测定针对一个靶的siRNA库的效力，针对GAPDH，MAP2K1，or MAP2K2基因的单个siRNAs和3或4个siRNAs组成的库通过使用DharmaFECTTM 1反向转染进入Hela细胞。在这个研究中，siRNA按照如下设计并且包括如下的序列(例如，有义链，按5’-＞3’)GAPDH siRNA双链体1(CAACGGAUUUGGUCGUAUU，SEQ.ID NO.3)，双链体2(CAACGGAUUUGGUCGUAUU，SEQ.ID NO.3)，双链体3(GAAUUUGGCUACAGCAACA，SEQ.ID NO.4)，以及双链体4(GAAAUCCCAUCACCAUCUU，SEQ.ID NO.5)；MAP2K1siRNA双链体1(GCACAUGGAUGGAGGUUCU，SEQ.ID NO.6)，双链体2(GCAGAGAGAGCAGAUUUGA，SEQ.ID NO.7)，双链体4(GAGCAGAUUUGAAGCAACU，SEQ.ID NO.8)，以及双链体5(CCAGAAAGCUAAUUCAUCU，SEQ.ID NO.9)；MAP2K2siRNA双链体1(CAAAGACGAUGACUUCGAA，SEQ.ID NO.10)，双链体2(GAUCAGCAUUUGCAMGGAA，SEQ.ID NO.11)，双链体4(GGAAGCUGAUCCACCUMGA，SEQ.ID NO.12)，以及双链体7(GAAAGUCAGCAUCGCGGUU，SEQ.ID NO.13)。
图24A是关于GAPGH沉默的具体实施方案结果的图示，其表明库与单独的siRNA相比起到了相同或更好的作用。图24B是关于MAP2K2沉默的具体实施方案结果的图示，其表明库与单独的siRNA相比起到了相同或更好的作用。图24C是关于GAPGH沉默的具体实施方案结果的图示，其表明库与单独的siRNA相比起到了相同或更好的作用，其中在10nM条件下该库提供了优于任何单独的siRNA的沉默。在所有检验过的例子中，使用单独的siRNA或者库的基因沉默不会改变总体的细胞毒性(数据未显示)。库的另一个益处包括性能的一致性。例如，当靶向至GAPDH和MAP2K2的单独双链体有足够的功能时(例如，在在1nM和100nM浓度之间的所有的8种siRNA条件下的大于80％沉默)，单一浓度(例如，50nM)下的单个的siRNA(例如，双链体4)只能提供针对MAP2K1的大于80％的沉默。与此相反，靶向所有三个目标的siRNA库在10nM，50nM和100nM的浓度下产生80％或者更高的沉默。这些结果显示库可以在RTF方式下增加基因沉默的一致性。
实施例21 在RTF操作方案中研究了siRNA库针对于选定基因的能力。为了评估针对单个靶的siRNA库的效力，组合针对多重目标的单独siRNAs。使用DharmaFECTTM1将针对GAPDH、MAP2K1、或者MAP2K2的siRNAs反向转染进入Hela细胞。用于这些分析的siRNA和在实施例20中的相同。
图25A-25C是显示多基因敲低兼容性的图示。图25A显示了在有GAPDH双链体1，MAP2K2双链体1，和MAP2K1双链体1(1，1&1)存在的情况下GAPDH的敲低；以及在有GAPDH双链体2，MAP2K2双链体2，和MAP2K1双链体2(2，2&2)存在的情况下GAPDH的敲低；在有GAPDH双链体4，MAP2K2双链体4，和MAP2K1双链体3(4，4&3)存在的情况下GAPDH的敲低；在有GAPDH双链体5，MAP2K2双链体7，和MAP2K1双链体4(5，7&4)存在的情况下GAPDH的敲低；以及在由之前提到所有的双链体组成的GAPDH，MAP2K2，和MAP2K1库存在的情况下GAPDH的敲低。图25B显示在有图25A描述的双链体组合存在的情况下MAP2K2的敲低。图25C显示在有图25A描述的所有双链体组合存在的情况下MAP2K1的敲低。所有检验过的GAPDH siRNA都能实现大于75％的沉默，即使是有直接针对于MAP2K1和MAP2K2靶的竞争siRNA存在。相似地，可以实现针对MAP2K2的大于75％的沉默，即使有直接针对于GAPDH和MAP2K1的siRNAs存在。对于MAP2K1，没有一种单独的siRNA提供大于75％的沉默，但是靶向至siRNA的MAP2K1库能够在有靶向至GAPDH和MAP2K2的siRNA库存在的情况下充分地发挥功能(在1-100nM)。本发明对多基因靶向方式的兼容性有显著的改善，并且允许用户简化大型的基因组规模的筛选。
实施例32 上述实施例使用的一些示例性的siRNA序列在下面的表2中显现。所有的序列是指有义链并且是定向为5’-＞3’方向。除非在上面的说明书正文中另有陈述，所有的反义链被假定为在双链体区域与下面提供的有义链100％地互补。任一个dTdT突出端不是双链体区域的一部分。另外的siRNA序列可以参见所引用的临时申请中的表I-IV。
实施例31 在一个实施例中，可以设计一个多孔RTF板或者系列多孔RTF板以便最优化用于siRNA的RTF。相应地，可以配置该板以包括任何下列变量(1)单独siRNA或者库siRNA的浓度在0.01-250nM之间，更优选地在0.05和100nM之间，更加优选地在0.1和50nM之间，进一步更加优选地在0.5和25nM之间，以及最优选地在0.75和10nM之间或者大约1nM；(3)多核苷酸载体的类型是脂质例如DharmaFECTTM1、DharmaFECTTM2、DharmaFECTTM3、或者DharmaFECTTM4、；(3)脂质多核苷酸载体的浓度为每100μL溶液0.05-1μg，更优选地每100μL溶液0.05-0.5μg脂质，更加优选地100μL溶液0.05-0.25μg脂质每，以及最优选地每100μL溶液0.05-0.1μg。(4)用于复合脂质的培养基和/或缓冲液的种类优选地是Opti-MEMTM，更优选地是HyQ-MEMTM，以及最优选地是缓冲盐溶液例如Hanks缓冲盐溶液或等效混合物；以及(5)细胞的种类和数量是密度为每大约0.3cm2至大约0.35cm2有1,000至35,000个细胞，优选的密度是2,000-30,000个细胞，更优选地2,000-20,000个细胞，更加优选地2,000-15,000个细胞，以及最优选地每大约0.3cm2至大约0.35cm2有2,000-10,000个细胞。该siRNA可用于研究选定目标基因的沉默，或者对照siRNA可用于以一种可重复的方式沉默已知的基因。
不背离其精神或者必要特征的前提下本发明可以其它特定的形式予以实施。所描述的具体实施方案在各个方面仅仅作为说明性的而不是限制性的。因此，本发明的范围是由所附权利要求所限定而不是通过上述描述来限定。在与权利要求等效的方法以及范围内的所有改变都包括在其范围内。
序列表
<110>Dharmacon，Inc.
Robertson，Barbara
Leake，Devin
Robinson，Kathryn
Marshall，William S.
Khvorova，Anastasia S.
<120>具有干燥的基因沉默组合物的仪器和系统(APPARATUS AND SYSTEMHAVING DRY GENE SILENCING COMPOSITIONS)
<130>律师记录号(Attorney Docket No.)16542.1.1
<150>60/630320
<151>2004-11-22
<150>60/678165
<151>2005-05-04
<160>34
<170>PatentIn version 3.3
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<211>7
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<213>人类
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auucacgagu ccugcauga19
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<222>(1)..(19)
<223>IGF1R-73siRNA
<400>34
ugcugaccuc uguuaccuc19
权利要求
1.一种用于引导siRNA进入细胞以引起基因沉默的反向转染仪器，该仪器包含
多孔板，其具有用于转染细胞的孔；以及
孔中的基本上干燥的基因沉默组合物，该基因沉默组合物至少具有至少沉默第一靶基因的第一siRNA，该基因沉默组合物的配置使得至少第一siRNA能够以足以转染该孔中的细胞的量溶解或悬浮在含水培养基中，该至少第一siRNA具有发夹结构、修饰、或者结合物中的至少一个。
2.根据权利要求1所述的仪器，其中所述修饰以下列中的至少一个为特征具有磷酸基的5’反义末端核苷酸；具有2’修饰的有义核苷酸；具有2’修饰的反义核苷酸；或者具有2’卤素修饰的反义核苷酸。
3.根据权利要求2所述的仪器，其中所述修饰进一步地以下列中的至少一个为特征
所述2’修饰选自由2’-O-脂肪族、2’-O-烷基、2’-O-甲基、2’-O-乙基、2’-O-丙基、2’-O-异丙基、2’-O-丁基、2’-O-异丁基、2’-O-CH2CH2OCH3、2’-O-CH2CH2OH、2’-原酸酯、2’-ACE基原酸酯及其组合所组成的组；或者
所述2’卤素修饰包括卤素，该卤素选自由氟、氯、溴、碘、及其组合组成的组。
4.根据权利要求3所述的仪器，其中所述修饰以下列中的至少一个为特征具有2’修饰的第一和第二有义核苷酸；具有2’修饰的第一和第二反义核苷酸；或者具有2’修饰的第二反义核苷酸。
5.根据权利要求4所述的仪器，其中所述修饰进一步地以下列中的至少一个为特征至少一个有义嘧啶核苷酸具有2’修饰；至少一个反义嘧啶核苷酸具有2’修饰；或者至少一个反义嘧啶核苷酸具有2’卤素修饰。
6.根据权利要求5所述的仪器，其中在第一位置以及第二位置的有义核苷酸包括2’-O-烷基修饰，在第二位置的反义核苷酸包括2’-O-烷基修饰，且5’反义末端核苷酸具有磷酸基。
7.根据权利要求1所述的仪器，其中所述结合物选自由氨基酸、肽、多肽、蛋白质、抗体、抗原、毒素、激素、脂质、核苷酸、核苷、糖类、碳水化合物、聚乙二醇、聚丙二醇、甾体、胆固醇、磷脂、二酰基甘油以及三酰基甘油、脂肪酸、取代的碳氢化合物、未取代的碳氢化合物、酶、生物素、异羟基洋地黄毒甙元、多糖、硫醚、己基-S-三苯甲基硫醇、硫胆固醇、十二烷二元醇、十一烷基、磷脂、双-十六烷基-rac-甘油、三乙基铵1，2-双-O-十六烷基-rac-甘油基-3-H-膦酸酯、聚胺、金刚烷乙酸、棕榈基部分、十八烷基胺部分、己基氨基羰基-oxycholexterols、法呢基、香叶基、geranylgeranyl、标记物、荧光标记物、质量标记物、以及放射性标记物组成的组。
8.根据权利要求7所述的仪器，其中所述结合物选自由胆固醇以及荧光标记物组成的组。
9.根据权利要求8所述的仪器，其中所述结合物与有义链或者反义链的5’末端核苷酸或者3’末端核苷酸结合。
10.根据权利要求7所述的仪器，其中所述结合物是通过接头而连接的，所述接头选自由修饰的核苷酸、未修饰的核苷酸、聚醚、聚乙二醇、多元醇、聚丙烯、聚烷基胺、聚胺、亚精胺、聚酯、聚丙烯酸乙酯、聚磷酸二酯、碳水化合物、糖、丙二醇、乙二醇、烯烃、及其组合组成的组。
11.根据权利要求1所述的仪器，其进一步包含至少一个没有siRNA的孔。
12.根据权利要求1所述的仪器，其进一步包含其中至少具有第一对照siRNA的至少一个孔。
13.根据权利要求12所述的仪器，其中所述对照siRNA包括能够沉默已知基因的siRNA、转染对照siRNA、具有荧光标记的siRNA、具有至少一个毒性基序的siRNA或者无功能的siRNA中的至少一个。
14.根据权利要求1所述的仪器，其中所述基因沉默组合物包括siRNAs库。
15.根据权利要求1所述的仪器，其中所述至少第一siRNA是合理设计的。
16.根据权利要求1所述的仪器，其中在基因沉默组合物中siRNA的总量是以足以转染仅该孔中的细胞的量而存在的。
17.根据权利要求16所述的仪器，其中当溶解或者悬浮在含水培养基中时，siRNA的总浓度小于大约100nM。
18.根据权利要求17所述的仪器，其中当溶解或者悬浮在含水培养基中时，siRNA的总浓度小于大约1nM。
19.根据权利要求1所述的仪器，其中该孔具有基本上平坦的底面。
20.根据权利要求19所述的仪器，其中该板由聚苯乙烯组成，并且该平坦的底部基本上用阳离子聚合物覆盖。
21.一种用于引导siRNA进入细胞以引起基因沉默的反向转染仪器，该仪器包含
多孔板，其具有为转染细胞而配置的孔；以及
孔中的基本上干燥的基因沉默组合物，该基因沉默组合物至少具有至少沉默第一靶基因的第一siRNA，该基因沉默组合物的配置使得至少第一siRNA能够以足以转染该孔中的细胞的量溶解或悬浮在含水培养基中。
22.一种包括权利要求21所述的仪器的用于引导siRNA进入细胞以引起基因沉默的系统，该系统包含
权利要求21的多孔板；以及
多核苷酸载体，其被配置用于与该至少第一siRNA复合。
23.根据权利要求22所述的系统，其中所述至少第一siRNA包括发夹结构、修饰、或者结合物中的至少一个。
24.根据权利要求22所述的系统，其中所述siRNAs库是合理设计的。
25.根据权利要求22所述的系统，其中在基因沉默组合物中siRNA的总量是以足以转染仅该孔中的细胞的量而存在的。
26.一种用于引导siRNA进入细胞以引起基因沉默的反向转染方法，该方法包含
提供包含基本上干燥的基因沉默组合物的孔，该基因沉默组合物至少具有第一siRNA，该siRNA包括发夹结构、修饰、或者结合物中的至少一个；
添加水溶液至该孔中以悬浮或者溶解该至少第一siRNA在溶液中；并且
在允许至少第一siRNA被引入细胞的条件下添加细胞至该孔中。
27.根据权利要求26所述的方法，其进一步包含
添加多核苷酸载体至该孔中以形成一种siRNA-载体复合物，其中该siRNA-载体复合物被悬浮或者溶解在溶液中；并且
将siRNA-载体复合物与细胞接触。
28.根据权利要求27所述的方法，其中所述多核苷酸载体是脂质。
29.根据权利要求26所述的方法，其进一步包含在允许细胞生长、细胞分裂、和/或基因沉默发生的条件下维持该孔。
30.根据权利要求29所述的方法，其进一步包含沉默至少50％的目标多肽的产量。
31.根据权利要求30所述的方法，其进一步包含沉默至少80％的目标多肽的产量。
32.根据权利要求31所述的方法，其中所述细胞以每0.35cm2的细胞生长表面积含大约2×103至大约3×104细胞的量添加。
全文摘要
一种可用于引导siRNA进入细胞产生基因沉默效果的反向转染仪器。本仪器包括一个具有用于转染细胞的孔的多孔板。该孔包括一个基本上干燥的基因沉默组合物，其至少具有沉默第一目标基因的第一siRNA。配置该基因沉默组合物至少使第一siRNA能够以足以转染该孔中细胞的量溶解或悬浮在液体培养基中。另外，该第一siRNA至少可以包括一个修饰或一个结合物。该反向转染仪器可以附加细胞，多核苷酸载体，反向转染试剂等等的试剂盒或系统的形式提供。
文档编号C12N15/87GK101107352SQ200580047054
公开日2008年1月16日 申请日期2005年11月21日 优先权日2004年11月22日
发明者芭芭拉·罗伯逊, 德温·利克, 凯瑟琳·鲁滨逊, 威廉·S·马歇尔, 阿纳斯塔西娅·赫沃罗瓦 申请人:达尔马科恩有限公司