专利名称：一种筛查唐氏综合征高危胎儿的方法
技术领域：
本发明涉及一种筛查唐氏综合征高危胎儿的方法。
背景技术：
唐氏综合征(D.S，又称21-三体综合征，先天愚型)是引起严重智力低下的最常见的先天性染色体数目异常性疾病，发生率约1/800；35岁以上高龄孕妇发生率更高。D.S.患者的21号染色体为2条，较正常人多出1条，即其“原始拷贝数”是正常人的1.5倍。对此病至今无有效治疗方法，给家庭和社会造成极大负担。产前筛查和基因诊断是避免此类病儿出生的有效手段。我国卫生部制定的《产前诊断技术管理办法》和北京市卫生局制定的《产前诊断技术管理办法》实施细则均规定了必须对唐氏综合征等进行产前筛查及相应的技术规范。现行唐氏综合征高危胎儿筛查(唐筛)临床应用较广的是用酶联免疫法测孕妇孕中期外周血血清中α-FP(甲胎蛋白)和hCG(人绒毛膜促性腺激素)、uE3(游离雌三醇，unconjugatedEstriol)，用计算机软件综合分析上述两-三项测定结果及孕妇年龄、体重及准确的孕周等，计算出胎儿患上D.S及神经管畸形(NTD)的风险率。筛出的“高危孕妇”，被建议进一步抽取羊水，作核型分析，以便准确查出D.S及可能的18三体，或13-三体等异常。此种方法能同时计算出NTD的风险。但据近几年国内大量筛查的结果看，普遍反映其假阳性率很高，(筛几千例竟未查出1例阳性)；并且还有一定的漏检率，即筛查为低风险的孕妇中产下了D.S患儿(孙念姑，唐氏筛查，中国的现状与对策，第五届全国产前诊断学术研讨会论文汇编，2005年9月，湖北武汉P38；刘子建，产前诊断，香港的经验和教训，第五届全国产前诊断学术研讨会论文汇编，2005年9月，湖北武汉P37)。另一种是用B超观察测量胎儿颈项透明层的厚度(NT)的异常作为D.S胎儿的辅助诊断指标。但这种指标对操作者的经验、技巧及仪器等要求均很高，灵敏度低，仅60-70％，受孕妇体重、糖尿病和吸烟等影响，误差也很大；正在进一步研究和总结经验之中(严英榴，遗传超声，第五届全国产前诊断学术研讨会论文汇编，2005年9月，湖北武汉P51)。吕时铭等用多重实时定量PCR技术对目标基因和内参分子标记进行同管扩增，通过二者ΔCT值来确定21号染色体数目并由此诊断21-三体综合征(吕时铭等，申请号CN200510049601.2，实时定量PCR技术检测人21号染色体数目的方法)。此技术较建立在标准曲线基础上的绝对定量方法(郑明明，胡娅莉等，实时荧光定量PCR技术在产前诊断唐氏综合征中的应用.中华妇产科杂志，2004，39678-681)更简便、更准确；但不能用于无创产前筛查。此外，刘敬忠还首创了运用SYBR Green 1实时荧光PCR结合融解曲线分析法对D.S作出诊断的技术(刘敬忠，申请号CN200510055338.8，唐氏综合征基因诊断新技术及其应用)。上述三种技术检测的都是羊水细胞，绒毛或白细胞DNA，都是用于对D.S的诊断或有创性产前诊断，而不是无创产前筛查。
近年来发现孕妇外周血血浆和血清中有游离DNA，且包含胎儿DNA，虽然后者占的比例很低(Lo YM，Corbetta N，Chamberlain PF et al，Presence of fetalDNA in maternal plasma and serum.Lancet 1997，350485-487)。进而Li Y等报道用凝胶电泳法将孕妇血浆总DNA分成不同长度的组份，发现在≤300bp的组份中，胎儿DNA占的比例最高，(占28.4％～68.7％)(Li Y，Zimmermann B，Rusterholz C et al，Size Seperation of circulatory DNA in maternal plasmapermits ready detection of fetal DNA polymorphisms.Clin.Chem，501002-1011，2004)。这样对原本浓度很低的胎儿DNA就起了一个富集的作用。从这一组份的DNA通过多重PCR扩增21号染色体上多个STR位点片段，然后经ABI310自动分析，从峰型中能很明确地诊断出男性胎儿，从而能进行性连锁单基因遗传病、RhD母婴血型不配的无创产前诊断；同时能查出胎儿是否继承了父亲的β-珠蛋白基因的突变或21号染色体上父源特异的多态性标志(STR)。但由于不能辨别胎儿从母亲继承的STR峰究竟是一条还是二条(被孕妇DNA峰掩盖)，由此他们认为尚不能从孕妇外周血游离DNA检测出胎儿是否患有21-三体综合征(Li Y，Zimmermann B，Rusterholz C et al，Size Seperation of circulatoryDNA in maternal plasma permits ready detection of fetal DNA polymorphisms.Clin.Chem，501002-1011，2004)。从孕妇外周血分离获取胎儿有核红细胞继而用基于PCR的技术诊断D.S。胎儿虽然是无创性的技术(Samura O，Sohda S，JohnsonK，et al，Diagnosis of trisomy 21 in fetal nucleated erythrocytes frommaternal blood by use of short tandem repeat sequences.Clin.Chem.2001，471622-1626)，但由于获得的胎儿有核红细胞数目太少，需要昂贵的仪器设备，单细胞PCR的高难度等，故仍处于个别实验室的研究阶段。
实时荧光定量PCR(real-time Q-PCR)技术实现了PCR从定性到定量的飞跃，它以其特异性强、灵敏度高、重复性好、定量准确、速度快、全封闭反应等优点成为了分子生物学研究中的重要工具。所谓real-time Q-PCR技术，是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累积实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。在real-time Q-PCR中，对整个PCR反应扩增过程进行了实时的监测和连续地分析扩增相关的荧光信号，随着反应时间的进行，监测到的荧光信号的变化可以绘制成一条曲线。在PCR反应早期，产生荧光的水平不能与背景明显地区别，可以在PCR反应处于指数期的某一点上来检测PCR产物的量，并且由此来推断模板分子最初的拷贝数。首先需设定一定荧光信号的域值，一般这个阈值(域值)(threshold)是以PCR反应的前15个循环的荧光信号作为荧光本底信号(baseline)，域值的设置是3～15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍。如果检测到荧光信号超过阈值被认为是真正的信号，它可用于定义样本的域值循环数(Ct)。Ct值的含义是每个反应管内的荧光信号达到设定的域值时所经历的循环数。研究表明，每个PCR反应的Ct值与该PCR模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多，Ct值越小。利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，因此只要测得未知样品的Ct值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。最常用的Real-time Q-PCR是Taqman探针技术。
发明内容
本发明的目的是提供一种筛查唐氏综合征高危胎儿的方法。
本发明所提供的筛查唐氏综合征高危胎儿的方法，是用实时荧光定量PCR同时检测孕妇外周血血浆或血清游离DNA中小于500bp的DNA组份中非21号染色体上在进化和功能上稳定的基因片段的Ct值、21号染色体上与唐氏综合征的发生相关的基因片段的Ct值，计算出所述两个Ct值之差的绝对值，得到待测孕妇的|ΔCt|；和用所述实时荧光定量PCR检测至少20份怀正常胎儿孕妇外周血血浆或血清游离DNA中小于500bp的DNA组份中非21号染色体上在进化和功能上稳定的基因片段的Ct值、21号染色体上与唐氏综合征的发生相关的基因片段的Ct值，计算出所述两个Ct值之差的绝对值的平均值，得到怀正常胎儿孕妇的|ΔCt|的平均值；如待测孕妇的|ΔCt|大于怀正常胎儿孕妇的|ΔCt|的平均值与2SD之和(阈值)，则该待测孕妇怀的胎儿为高风险唐氏综合征胎儿；所述2SD为怀正常胎儿的孕妇的|ΔCt|的二倍标准差。
上述实时荧光定量PCR为多重实时荧光定量PCR。
所述多重实时荧光定量PCR检测待测孕妇外周血血浆或血清的PCR模板为待测孕妇外周血血浆或血清中小于500bp的DNA组份。
为了提高筛查的灵敏度，所述多重实时荧光定量PCR检测待测孕妇外周血血浆或血清的PCR模板为待测孕妇外周血血浆或血清中小于等于300bp的DNA组份。
在实际应用中，所述非21号染色体上在进化和功能上稳定的基因可为GAPDH基因，所述21号染色体上与唐氏综合征的发生相关的基因可为DSCR3基因。所述怀正常胎儿孕妇的|ΔCt|的平均值与2SD之和在本发明的实验条件下为1.62。该数值在使用同一试剂盒的条件下是固定的；但在使用不同试剂盒时可以有所不同。
所述实时荧光定量PCR中，扩增DSCR3基因的引物具有序列表中序列1和序列2的核苷酸序列，检测DSCR3基因的探针具有序列表中序列3的核苷酸序列。
所述实时荧光定量PCR中，扩增GAPDH基因的引物具有序列表中序列4和序列5的核苷酸序列，检测GAPDH基因的探针具有序列表中序列6的核苷酸序列。
在实际应用中，所述非21号染色体上在进化和功能上稳定的基因可为RABIF基因，所述21号染色体上与唐氏综合征的发生相关的基因可为D21S1437。此时所述怀正常胎儿孕妇的|ΔCt|的平均值与2SD之和在本发明的实验条件下为1.86.该数值在使用同一试剂盒的条件下是固定的；但在使用不同试剂盒时可以有所不同。
所述实时荧光定量PCR中，扩增D21S1437基因的引物具有序列表中序列7和序列8的核苷酸序列，检测D21S1437基因的探针具有序列表中序列9的核苷酸序列。
所述实时荧光定量PCR中，扩增RABIF基因的引物具有序列表中序列10和序列11的核苷酸序列，检测RABIF基因的探针具有序列表中序列12的核苷酸序列。
为了提高筛查结果的可靠性，对同一份标本还可以同时检测两个非21号染色体上在进化和功能上稳定的基因，如GAPDH和RABIF基因，两个21号染色体上与唐氏综合征的发生相关的基因，如DSCR3和D21S1437基因；当待测孕妇的GAPDH基因片段和DSCR3基因片段的Ct值之差的绝对值大于怀正常胎儿孕妇的|ΔCt|的平均值与2SD之和、待测孕妇的RABIF基因片段和D21S1437基因片段的Ct值之差的绝对值大于怀正常胎儿孕妇的|ΔCt|的平均值与2SD之和，则该待测孕妇怀的胎儿为高风险唐氏综合征胎儿；所述2SD为怀正常胎儿的孕妇的|ΔCt|的二倍标准差。
本发明的筛查唐氏综合征高危胎儿的方法可直接从孕妇外周血血浆或血清检测出高风险唐氏综合征胎儿，该方法无创，准确度和灵敏度高；假阳性率假阴性率低。
具体实施例方式
下述实施例中的实验方法，如无特别说明，均为常规方法。
实施例1、用实时荧光定量PCR检测模拟的孕妇外周血血浆或血清游离DNA中小于500bp-300bp的DNA组份的DNA标本的ΔCT1、DNA抽提从2个正常人(血细胞中有2条21号染色体)和2个已为临床及核型分析诊断为D.S的患儿的外周血细胞用酚-氯仿抽提法得到基因组DNA。用紫外分光光度法，琼脂糖凝胶电泳法和实时荧光定量PCR法(检测)GAPDH基因片段精确地定出DNA浓度，并稀释至0.05μg/μl。
2、模拟的孕妇外周血血浆或血清游离DNA中小于500bp-300bp的DNA组份的DNA标本的配制以不同比例配制正常DNA与D.S患儿DNA(D.S.DNA)的混合溶液，按表1进行表1
表1中2号DNA标本相当于怀了一个D.S胎儿的孕妇外周血血浆或血清游离DNA中小于500bp的DNA组份，其胎儿的DNA占50％。同理，表1中3号，4号及5号标本相当于一位怀了一个D.S胎儿的孕妇外周血血浆或血清游离DNA中小于500bp的DNA组份，其胎儿的DNA依次占40％，30％，和20％。
3、扩增21号染色体上的与D.S.有关的基因DSCR3片段(序列表中序列13的自5′端第28位至第149位脱氧核苷酸序列)的引物及探针如下上游引物序列5’TAG CAA GTC AGA GGT TTC CTT 3’(序列1)，下游引物5’AAC ATT GAC TGT GGC TCT TGC 3’(序列2)检测DSCR3基因片段的探针5’FAM-CAC TCT CCA GCA AGC TCA AACTGC-Tamra 3’(序列3)。
4、扩增做为内参照的12号染色体上的管家基因GAPDH片段(序列表中序列14的自5′端第41位至第191位脱氧核苷酸序列)的引物及探针如下上游引物5’CTG TCC AGT TAA TTT CTG ACC 3’(序列4)，下游引物5’CTT TGT ACA TGG TAT TCA CCA C 3’(序列5)，检测GAPDH基因片段的探针5’VIC-AAT GCT TGC TGC TGC CTA GCTCAG-Tamra 3’(序列6)。
5、表1中的6管DNA每管DNA单独一个反应体系。PCR反应混合物总体积25μl，含表1中DNA溶液1μl，上述2对引物各0.2μmol/L，检测DSCR3基因的探针为0.04μmol/L，检测GAPDH基因的探针为0.2μmol/L，购自ABI公司的TaqManUniversal Master Mix 12.5μl。每个管号的DNA做3只平行管。
6、热循环在ABI Prism 7000荧光定量PCR仪上进行先50℃2分钟；然后95℃10分钟；最后按如下条件进行40个循环95℃15秒，60℃，1分钟。
基线(Baseline)定在6-21，阈值0.2，仪器自动给出各反应曲线的Ct值。
7、计算出ΔCt如下ΔCt＝CtGAPDH-CtDSCR3。
结果如表2所示，表明随待测混合DNA溶液中D.S.DNA百分比从20％增加到50％时，靶基因与内参照基因间的ΔCt也在增加，并且都大于正常ΔCt平均值+2SD＝1.42±2SD，(见实施例2)。当孕妇怀上一个D.S.胎儿的时候，其外周血血浆或血清游离DNA中小于500bp-300bp的DNA组份中，就会含有约至少20％至50％，甚至70％的D.S胎儿DNA。这样以这一组份的DNA为模板测得的ΔCt值就会明显高于怀正常胎儿的孕妇(正常ΔCt平均值±2SD＝1.42±2SD；反过来说，如果测得一未知标本的ΔCt值≥1.42±2SD，即可判断该未知标本为“高风险D.S胎儿”。
表2.以正常DNA与D.S.DNA混合溶液为模板用实时荧光定量PCR检测21号染色体的DSCR3基因与12号染色体上GAPDH基因得到的Ct值及ΔCt值
*从另一份正常DNA和另一份D.S.DNA混合溶液测得的Ct值计算出的ΔCt*。
实施例2、用本发明的方法筛查D.S高风险的胎儿用琼脂糖凝胶电泳分步分离得到小于500bp的DNA组份后，检测16位用酶联免疫法(测AFP，hCG)筛查为D.S高风险的孕妇及24位用酶联免疫法(测AFP，hCG)筛查为D.S低风险的孕妇的DSCR3与GAPDH基因Ct值及ΔCt值，具体步骤如下1、取血前，与每位孕妇签署知情同意书。每份EDTA抗凝血标本各10ml取自用酶联免疫法(测AFP，hCG)检测为D.S胎儿高风险的孕妇16名及筛查为D.S低风险的孕妇24名，经2次离心(1600g，10分钟，上清再经16000g，10分钟)获得血浆。
2、血浆DNA提取用德国QIAamp mini Kit方法提取血浆中DNA，按厂家说明书进行，用紫外分光法测定浓度，稀释至0.50μg/μl备用。
3、孕妇外周血血浆游离DNA中小于500bp的DNA组份的制备上述共40份血浆DNA，用1％琼脂糖凝胶电泳，各加DNA溶液15μl，同时加DNA长度标准物100bp ladder和Lamda DNA/Hind III酶切物。电泳在80伏1小时。将含有500～80bp DNA的凝胶切下，用Qiagen公司QIAEX II Gel Extraction Kit回收纯化其中DNA，溶解于15μl Tris-Hcl pH 8.0buffer中。
4、20个D.S.患儿外周血细胞的基因组DNA的提取同实施例1的步骤1。
5、用实时荧光定量PCR测定24位用酶联免疫法(测AFP，hCG)检测为D.S胎儿低产风险的孕妇外周血血浆游离DNA中小于500bp的DNA组份及20个D.S.患儿外周血细胞的基因组DNA的ΔCt值。PCR反应体系除模板DNA不同外，其余同实施例1的步骤5。
6、PCR反应和ΔCt值的计算方法同实施例1的步骤6和7。
7、用实时荧光定量PCR测定16个所述用酶联免疫法(测AFP，hCG)检测为D.S高危孕妇外周血血浆游离DNA中小于500bp的DNA组份的ΔCt值上述16份DNA标本PCR反应体系除模板DNA标本外，其余同实施例1的步骤5；8、PCR反应和ΔCt值的计算方法同实施例1的步骤6和7。
结果表明24位用酶联免疫法检测为D.S低风险孕妇外周血血浆游离DNA中小于500bp的DNA组份标本的ΔCt值的绝对值的平均值为1.42±0.20。20个D.S.患儿外周血细胞的基因组DNA的ΔCt值的绝对值的平均值为2.58±0.20。16份所述用酶联免疫法检测为D.S高风险的孕妇外周血血浆游离DNA中小于500bp的DNA组份标本的ΔCt值如表3表3 16份用酶联免疫法检测为D.S高风险孕妇外周血血浆游离DNA中小于500bp的DNA组份标本的ΔCt值
表3表明6#和13#的ΔCt明显高出正常值范围(1.42+0.20)，因此这二例孕妇可判断为真正的D.S高风险。这与用羊水核型分析的结果一致。同时表明，16份用酶联免疫法(测AFP，hCG)检测为D.S高风险的孕妇中，有14例为假阳性(假阳性率81.5％)。
实施例3、用本发明的方法筛查D.S高风险的胎儿用琼脂糖凝胶电泳分步分离小于等于300bp的DNA组份后，检测21号染色体上另一与D.S密切有关的基因片段D21S1437与1号染色体上无多态性无三体可能性的另一内参照基因RABIF的Ct值及ΔCt，具体步骤如下1、取血前，与每位孕妇签署知情同意书。每份EDTA抗凝血标本各10ml，取自用酶联免疫法(测AFP，hCG)检测为D.S胎儿高风险的孕妇16名及筛查为D.S低风险的孕妇24名，经2次离心(1600g，10分钟，上清再经16000g，10分钟)获得血浆。同实施例2。
2、血浆DNA提取同实施例2步骤2。
3、孕妇外周血血浆游离DNA中小于等于300bp的DNA组份的制备同实施例2步骤3。
4、20个D.S.患儿外周血细胞的基因组DNA的提取同实施例1的步骤1。
5、扩增21号染色体上靶基因D21S1437片段(序列表中序列15的自5′端第157位至第280位脱氧核苷酸序列)的引物及探针如下上游引物序列5’ATG TAC ATG TGT CTG GG AAG 3’(序列7)，下游序列5’CTC TAC ATA TTT ACT GCC AAC 3’(序列8)；检测D21S1437基因的探针5’Fam-CTTCCTTCCTTCCTTCCTTCCTTC-Temra 3’(序列9)。
6、扩增1号染色体上的RABIF基因片段(序列表中序列16的自5′端第6位至第68位脱氧核苷酸序列)的引物和探针如下上游引物5’CTCAACATGGGCCCCACAT 3’(序列10)；下游引物5’AAGCCAGTGTGCCTGAAGCA 3’(序列11)；检测RABIF基因的探针5‘VIC-TCCTAGTTTCCCCGGCTCATTATG-Temra(序列12)。
7、用实时荧光定量PCR测定24位用酶联免疫法(测AFP，hCG)检测为D.S胎儿低产风险的孕妇外周血血浆游离DNA中小于等于300bp的DNA组份及20个D.S.患儿外周血细胞的基因组DNA的ΔCt值。PCR反应体系除2对引物和探针为上述步骤5和6的引物和探针外，其余同实施例2的步骤5。上述2对引物各0.2μmol/L，探针浓度为0.04μmol/L。PCR反应同实施例1的步骤6。ΔCt＝CtRABIF-CtD21S1437。
8、用实时荧光定量PCR测定16个所述用酶联免疫法(测AFP，hCG)检测为D.S高危孕妇外周血血浆游离DNA中小于等于300bp的DNA组份的ΔCt值上述16份DNA标本PCR反应体系除模板DNA标本外，其余同步骤7；ΔCt＝CtRABIF-CtD21S1437。
结果表明以24位用酶联免疫法检测为D.S低风险的孕妇外周血血浆游离DNA中小于等于300bp的DNA组份为模板进行实时荧光定量PCR(各做3个平行管)，检测1号染色体上的RABIF基因片段与21号染色体上靶基因D21S1437片段得到的ΔCt值的绝对值的平均值为1.62±0.20。
以20个D.S.患儿外周血细胞的基因组DNA为模板进行实时荧光定量PCR(各做3个平行管)，检测1号染色体上的RABIF基因片段与21号染色体上靶基因D21S1437片段得到的ΔCt值的绝对值的平均值为2.70±O.20。
以16份所述用酶联免疫法检测为D.S高风险的孕妇外周血血浆游离DNA中小于等于300bp的DNA组份为模板进行实时荧光定量PCR(各做3个平行管)，检测1号染色体上的RABIF基因片段与21号染色体上靶基因D21S1437片段的Ct值，计算每份标本的ΔCt，结果示于表4表4.16份用酶联免疫法检测为D.S高风险孕妇外周血血浆游离DNA中小于等于300bp的DNA组份标本的ΔCt值
表4结果表明，6#和13#ΔCt明显高出正常值范围(1.62+0.20)，属D.S高风险胎儿。12#ΔCt1.81接近正常ΔCt值的绝对值的平均值的上限(1.82)，但仍在正常范围内(对未知标本为慎重起见可重复作一次；并建议2-3周后复查)。可见，运用检测21号染色体上D21S1437基因与1号染色体上RABIF基因的实时荧光定量PCR与实施例2测定DSCR3及GAPDH基因得出的结果一致，即在16例孕妇中，6#和13#是D.S高风险胎儿，其它14位均是低风险。运用本发明的方法无创筛查D.S.胎儿的准确度和灵敏度都达到十分满意的程度，在这16例中没有发现假阳性和假阴性。
在实际应用中，对同一份标本还可以同时运用实施例2和实施例3所述的两种实时荧光定量PCR系统进行检测，综合两个结果作出最终筛查结论更为可靠。
序列表<160>16<210>1<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
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<400>1tagcaagtca gaggtttcct t21<210>2<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
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<212>DNA<213>人工序列<220>
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<400>4ctgtccagtt aatttctgac c21<210>5<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
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<400>6aatgcttgct gctgcctagc tcag 24<210>7<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
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<400>9cttccttcct tccttccttc cttc 24<210>10<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
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<400>10ctcaacatgg gccccacat 19<210>11<211>20<212>DNA
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权利要求
1.一种筛查唐氏综合征高危胎儿的方法，是用实时荧光定量PCR同时检测孕妇外周血血浆或血清游离DNA中小于500bp的DNA组份中非21号染色体上在进化和功能上稳定的基因片段的Ct值、21号染色体上与唐氏综合征的发生相关的基因片段的Ct值，计算出所述两个Ct值之差的绝对值，得到待测孕妇的|ΔCt|；和用所述实时荧光定量PCR检测至少20份怀正常胎儿孕妇外周血血浆或血清游离DNA中小于500bp的DNA组份中非21号染色体上在进化和功能上稳定的基因片段的Ct值、21号染色体上与唐氏综合征的发生相关的基因片段的Ct值，计算出所述两个Ct值之差的绝对值的平均值，得到怀正常胎儿孕妇的|ΔCt|的平均值；如待测孕妇的|ΔCt|大于怀正常胎儿孕妇的|ΔCt|的平均值与2SD之和，则该待测孕妇怀的胎儿为高风险唐氏综合征胎儿；所述2SD为怀正常胎儿的孕妇的|ΔCt|的二倍标准差。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述实时荧光定量PCR为多重实时荧光定量PCR。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述多重实时荧光定量PCR检测待测孕妇外周血血浆或血清的PCR模板为待测孕妇外周血血浆或血清中小于500bp的DNA组份。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于所述多重实时荧光定量PCR检测待测孕妇外周血血浆或血清的PCR模板为待测孕妇外周血血浆或血清中小于等于300bp的DNA组份。
5.根据权利要求1至4中任一所述的方法，其特征在于所述非21号染色体上在进化和功能上稳定的基因为GAPDH基因，所述21号染色体上与唐氏综合征的发生相关的基因为DSCR3基因。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于所述实时荧光定量PCR中，扩增DSCR3基因片段的引物具有序列表中序列1和序列2的核苷酸序列，检测DSCR3基因片段的探针具有序列表中序列3的核苷酸序列。
7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于所述实时荧光定量PCR中，扩增GAPDH基因片段的引物具有序列表中序列4和序列5的核苷酸序列，检测GAPDH基因片段的探针具有序列表中序列6的核苷酸序列。
8.根据权利要求1至4中任一所述的方法，其特征在于所述非21号染色体上在进化和功能上稳定的基因为RABIF基因，所述21号染色体上与唐氏综合征的发生相关的基因为D21S1437。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于所述实时荧光定量PCR中，扩增D21S1437基因片段的引物具有序列表中序列7和序列8的核苷酸序列，检测D21S1437基因片段的探针具有序列表中序列9的核苷酸序列；扩增RABIF基因片段的引物具有序列表中序列10和序列11的核苷酸序列，检测RABIF基因片段的探针具有序列表中序列12的核苷酸序列。
10.根据权利要求1至4中任一所述的方法，其特征在于所述非21号染色体上在进化和功能上稳定的基因为GAPDH和RABIF基因，所述21号染色体上与唐氏综合征的发生相关的基因为DSCR3和D21S1437基因；当待测孕妇的GAPDH基因片段和DSCR3基因片段的Ct值之差的绝对值大于怀正常胎儿孕妇的|ΔCt|的平均值与2SD之和、待测孕妇的RABIF基因片段和D21S1437基因片段的Ct值之差的绝对值大于怀正常胎儿孕妇的|ΔCt|的平均值与2SD之和，则该待测孕妇怀的胎儿为高风险唐氏综合征胎儿；所述2SD为怀正常胎儿的孕妇的|ΔCt|的二倍标准差。
全文摘要
本发明公开了一种筛查唐氏综合征高危胎儿的方法。该方法用实时荧光定量PCR同时检测孕妇外周血血浆或血清游离DNA中小于500bp的DNA组份中非21号染色体上在进化和功能上稳定的基因片段的Ct值、21号染色体上与唐氏综合征的发生相关的基因片段的Ct值，计算出所述两个Ct值之差的绝对值；和用所述实时荧光定量PCR检测至少20份怀正常胎儿孕妇外周血血浆或血清游离DNA中小于500bp的DNA，计算出所述两个Ct值之差的绝对值的平均值，进行比较；如待测孕妇的|ΔCt|大于怀正常胎儿孕妇的|ΔCt|的平均值与2SD之和，则该待测孕妇怀的胎儿为高风险唐氏综合征胎儿。该筛查唐氏综合征高危胎儿的方法无创，准确度和灵敏度高；假阳性率假阴性率低。
文档编号C12Q1/68GK1844408SQ20061000310
公开日2006年10月11日 申请日期2006年2月10日 优先权日2006年2月10日
发明者刘敬忠, 肖白 申请人:首都医科大学附属北京朝阳医院