专利名称：微生物发酵生产低温纤维素酶的方法
技术领域：
本发明涉及微生物学、酶工程、发酵工程、生物化学等领域，具体涉及一种低温纤维素酶微生物发酵生产方法。该发明生产的低温纤维素酶主要应用于饲料行业、食品加工、中草药提取、造纸与纺织、原油开采、印染与洗涤、以及其它纤维素酶应用行业。可以提高原料的利用率、转化率和生产率，降低生产成本，改善并提高产品质量。
背景技术：
纤维素酶是指能降解纤维素生成纤维二糖和葡萄糖等小分子物质的一组酶的总称，是一种复合的诱导酶，包括多种水解酶(张启先，微生物学报，1974)。纤维素酶作为生物制剂，已经广泛应用于饲料、食品加工，中草药提取，原油开采，造纸及纺织、印染等行业中，但目前使用的纤维素酶主要为中温纤维素酶。虽然国内外对纤维素酶的研究有40多年，但主要是研究中温纤维素酶；有关低温纤维素酶的研究是起步阶段，主要是菌种选育和产酶条件优化、生长特性和酶学性质，以及相关基因的克隆等基础研究(王玢等，山东教育学院学报和海洋科学，2003；曾胤新等，高技术通讯，2005；游银伟，微生物学报，2005)；低温纤维素酶产业化、规模化生产及应用还未见报道。低温纤维素酶与高温、中温纤维素酶相比具有很大的应用优势，因为低温酶在低温下具有高酶活力及高催化效率，可大大缩短处理过程的时间并省却昂贵的加热或冷却费用；在节能方面有相当大的优势；经过温和的热处理即可使低温酶的活力丧失，而低温或适温处理不会影响产品的品质(孙谧等，海洋水产研究，2002)，这将有助于低温纤维素酶的推广和使用。低温纤维素酶的应用将对传统的农业、食品、医药、化工、能源和环保等领域产生深远的影响，利用微生物发酵生产的低温纤维素酶，按原料重量0.01‰～0.5‰的量添加于反刍动物纤维质粗饲料、农产品深加工和中草药提取等领域中，在8～25℃处理0.5～2小时，可以提高原料的转化率10.2％～18.5％，降低了生产成本，改善并提高产品质量。可以从根本上摆脱中温、高温酶的加热、冷却设备和工艺。低温纤维素酶将为人类摆脱生存和发展中所面临的诸如饥饿、资源、能源危机以及环境污染等困境提供现实的机遇。低温纤维素酶具有非常广阔的开发潜力和应用前景。
发明内容
本发明的目的是提供一种微生物发酵生产低温纤维素酶的方法，该方法主要是微生物经过低温驯化后，在10～16℃液体发酵生产低温纤维素酶的方法，这种生产方法获得的低温纤维素酶粗酶液活性可以达到180U/ml，如再经过分离和纯化，可以得到不同浓度和纯度的酶制剂。当该酶活性为1000U/ml或1000U/g，0.01‰～0.5‰的量应用于反刍动物纤维质粗饲料、农产品深加工和中草药提取等领域中，在8～25℃处理0.5～2小时，可以提高原料的转化率10.2％～18.5％。该酶制剂应用操作简单、方便、快捷、成本低。可以从根本上避免中温、高温酶的加热、冷却设备和工艺。
本发明所述的一种微生物发酵生产低温纤维素酶的方法具体包括以下步骤(1)将产生纤维素酶的微生物逐级低温驯化，驯化温度由高到低，25℃→22℃→20℃→18℃→16℃→14℃→12℃→10℃，使其在低温环境中生长良好；(2)按常规方法将低温驯化后的纤维素酶产生菌在10～16℃逐级扩大培养，制备成液体一级种子和二级种子；(3)将液体一级种子或二级种子，按发酵液体积的3～9％接种量接入液体发酵培养基中，在10～16℃培养72～144h时，即微生物发酵生产低温纤维素酶结束；(4)将(3)的发酵液在4,000～8,000rpm离心收集液体，收集到的液体即为粗酶液。
(5)根据不同需要和使用对象不同，还可以将(4)得到的粗酶液进一步浓缩、分离纯化，制备成不同活性、纯度和剂型的酶制剂。
本发明中使用的菌种来源于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，初期活化和生长条件按菌种保藏单位提供的说明进行。纤维素酶产生菌(例如，CGMCC菌种编号3.316或3.3005或3.3010或3.2942或3.3744或3.4033等)，菌株先活化、再经过逐级低温驯化后发酵生产低温纤维素酶时按本发明产酶条件进行培养，低温驯化后的菌株在4℃环境中可保存2个月，用10～25％甘油制成的菌悬液、在零下80℃条件下可以长期保藏。
具体实施例方式实施例一(1)、培养基制备①菌种活化培养基马铃薯200.0g，葡萄糖20.0g，琼脂20.0g，蒸馏水1.0L，pH值自然，121℃高压蒸气灭菌30min。
②菌种低温驯化培养基马铃薯50.0～100.0g，新华滤纸粉5.0～8.0g，麸皮2.0～6.0g，琼脂20.0g，蒸馏水1.0L，pH值自然，121℃高压蒸气灭菌30min。
③液体种子培养基水稻秸秆粉3.0～5.0g，蛋白胨0.5～1.0g，Tween800.1～0.3g，(NH4)2SO40.8～1.2g，KH2PO41.2～1.8g，尿素0.2～0.4g，MgSO40.2～0.3g，CaCl20.1～0.2g，ZnSO4·7H2O 1.2mg，MnSO4·H2O 1.6mg，CoCl21.8mg，自来水1.0L，pH值自然，121℃高压蒸气灭菌30min。
④产酶培养基水稻秸秆粉7.0～12.0g，麸皮1.0～5.0g，Tween800.1～0.4g，(NH4)2SO41.0～1.5g，KH2PO41.4～2.0g，尿素0.2～0.6g，MgSO40.1～0.4g，CaCl20.2～0.3g，ZnSO4·7H2O 2.4mg，MnSO4·H2O 3.2mg，CoCl23.6mg，自来水1.0L，pH值6.0，121℃高压蒸气灭菌30min。
(2)将产生纤维素酶的菌种，按中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC)提供的菌株说明进行初始活化；(3)将(2)活化好的菌种逐级低温驯化，驯化温度由高到低，25℃→22℃→20℃→18℃→16℃→14℃→12℃→10℃，使其在低温环境中生长良好；(4)按常规方法将低温驯化后的纤维素酶产生菌在10～12℃培养48～72h而后按5％的接种量进行逐级扩大培养，制备成液体一级种子和二级种子；(5)将(4)制备的二级种子按发酵液体积3～5％的接种量接入10L的产酶培养基中，在10～12℃培养120～144h时，即微生物发酵生产低温纤维素酶结束。
(6)将(5)的发酵液在4,000～8,000rpm离心收集液体，收集到的液体即为粗酶液。
(7)根据不同需要和使用对象不同，还可以将(6)得到的粗酶液进一步浓缩、分离纯化，制备成不同活性、纯度和剂型的低温纤维素酶制剂。
实施例二(1)、培养基制备①菌种活化培养基马铃薯200.0g，葡萄糖20.0g，琼脂20.0g，蒸馏水1.0L，pH值自然，121℃高压蒸气灭菌30min。
②菌种低温驯化培养基马铃薯50.0～100.0g，新华滤纸粉5.0～8.0g，麸皮2.0～6.0g，琼脂20.0g，蒸馏水1.0L，pH值自然，121℃高压蒸气灭菌30min。
③液体种子培养基水稻秸秆粉3.0～5.0g，蛋白胨0.5～1.0g，Tween800.1～0.3g，(NH4)2SO40.8～1.2g，KH2PO41.2～1.8g，尿素0.2～0.4g，MgSO40.2～0.3g，CaCl20.1～0.2g，ZnSO4·7H2O 1.2mg，MnSO4·H2O 1.6mg，CoCl21.8mg，自来水1.0L，pH值自然，121℃高压蒸气灭菌30min。
④产酶培养基水稻秸秆粉7.0～12.0g，麸皮1.0～5.0g，Tween800.1～0.4g，(NH4)2SO41.0～1.5g，KH2PO41.4～2.0g，尿素0.2～0.6g，MgSO40.1～0.4g，CaCl20.2～0.3g，ZnSO4·7H2O 2.4mg，MnSO4·H2O 3.2mg，CoCl23.6mg，自来水1.0L，pH值6.0，121℃高压蒸气灭菌30min。
(2)将产生纤维素酶的菌种，按中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC)提供的菌株说明进行初始活化；(3)将(2)活化好的菌种逐级低温驯化，驯化温度由高到低，25℃→22℃→20℃→18℃→16℃→14℃→12℃→10℃，使其在低温环境中生长良好；(4)按常规方法将低温驯化后的纤维素酶产生菌在12～14℃培养48～72h而后按5％的接种量进行逐级扩大培养，制备成液体一级种子和二级种子；(5)将(4)制备的二级种子按发酵液体积5～7％的接种量接入50L的产酶培养基中，在12～14℃培养96～120h时，即微生物发酵生产低温纤维素酶结束。
(6)将(5)的发酵液在4,000～8,000rpm离心收集液体，收集到的液体即为粗酶液。
(7)根据不同需要和使用对象不同，还可以将(6)得到的粗酶液进一步浓缩、分离纯化，制备成不同活性、纯度和剂型的低温纤维素酶制剂。
实施例三(1)、培养基制备①菌种活化培养基马铃薯200.0g，葡萄糖20.0g，琼脂20.0g，蒸馏水1.0L，pH值自然，121℃高压蒸气灭菌30min。
②菌种低温驯化培养基马铃薯50.0～100.0g，新华滤纸粉5.0～8.0g，麸皮2.0～6.0g，琼脂20.0g，蒸馏水1.0L，pH值自然，121℃高压蒸气灭菌30min。
③液体种子培养基水稻秸秆粉3.0～5.0g，蛋白胨0.5～1.0g，Tween800.1～0.3g，(NH4)2SO40.8～1.2g，KH2PO41.2～1.8g，尿素0.2～0.4g，MgSO40.2～0.3g，CaCl20.1～0.2g，ZnSO4·7H2O 1.2mg，MnSO4·H2O 1.6mg，CoCl21.8mg，自来水1.0L，pH值自然，121℃高压蒸气灭菌30min。
④产酶培养基水稻秸秆粉7.0～12.0g，麸皮1.0～5.0g，Tween800.1～0.4g，(NH4)2SO41.0～1.5g，KH2PO41.4～2.0g，尿素0.2～0.6g，MgSO40.1～0.4g，CaCl20.2～0.3g，ZnSO4·7H2O 2.4mg，MnSO4·H2O 3.2mg，CoCl23.6mg，自来水1.0L，pH值6.0，121℃高压蒸气灭菌30min。
(2)将产生纤维素酶的菌种，按中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC)提供的菌株说明进行初始活化；(3)将(2)活化好的菌种逐级低温驯化，驯化温度由高到低，25℃→22℃→20℃→18℃→16℃→14℃→12℃→10℃，使其在低温环境中生长良好；
(4)按常规方法将低温驯化后的纤维素酶产生菌在14～16℃培养48～72h而后按5％的接种量进行逐级扩大培养，制备成液体一级种子和二级种子；(5)将(4)制备的二级种子按发酵液体积7～9％的接种量接入100L的产酶培养基中，在14～16℃培养72～96h时，即微生物发酵生产低温纤维素酶结束。
(6)将(5)的发酵液在4,000～8,000rpm离心收集液体，收集到的液体即为粗酶液。
(7)根据不同需要和使用对象不同，还可以将(6)得到的粗酶液进一步浓缩、分离纯化，制备成不同活性、纯度和剂型的低温纤维素酶制剂。
实施例四按实施例一、二和三方法生产的低温纤维素酶，平均酶活性为800U/ml，如再经过分离和纯化，可以得到不同活性、纯度和剂型的酶制剂。将活性为1000U/ml或1000U/g的低温纤维素酶，按原料重量0.01‰～0.5‰的量添加于反刍动物纤维质粗饲料、农产品深加工和中草药提取等领域中，在8～25℃处理0.5～2小时，可以提高原料的利用率、转化率和生产率，降低生产成本，改善并提高产品质量。低温纤维素酶应用部分实验结果见下表。
实验结果表明低温纤维素酶应用于反刍动物纤维质粗饲料、农产品深加工和中草药提取等领域中，可以提高原料的利用率、转化率和生产率，降低生产成本，改善并提高产品质量；同时也说明低温酶在低温下具有高酶活力及高催化效率，可大大缩短处理过程的时间并省却昂贵的加热或冷却费用；在节能方面有相当大的优势；该酶制剂应用操作简单、方便、快捷、成本低可以从根本上避免中温、高温酶的加热、冷却设备和工艺。
权利要求
1.一种微生物发酵生产低温纤维素酶的方法，其包括以下步骤(1)将产生纤维素酶的微生物逐级低温驯化，驯化温度由高到低，25℃→22℃→20℃→18℃→16℃→14℃→12℃→10℃，使其在低温环境中生长良好；(2)按常规方法将低温驯化后的纤维素酶产生菌在10～16℃逐级扩大培养，制备成液体一级种子和二级种子；(3)将液体一级种子或二级种子，按发酵液体积的3～9％接种量接入液体发酵培养基中，在10～16℃培养72～144h时，即微生物发酵生产低温纤维素酶结束；(4)将(3)的发酵液在4,000～8,000rpm离心收集液体；收集到的液体即为粗酶液。(5)根据不同需要和使用对象不同，还可以将(4)得到的粗酶液进一步浓缩、分离纯化，制备成不同活性、纯度和剂型的酶制剂。
2.根据权利要求1所述的方法，在步骤(5)之后进一步包括将步骤(5)得到的粗酶液进一步浓缩、分离纯化，制备成不同活性、纯度和剂型的酶制剂。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中菌种低温驯化培养基、液体种子培养基、产酶培养基分别为(1)菌种低温驯化培养基马铃薯50.0～100.0g，新华滤纸粉5.0～8.0g，麸皮2.0～6.0g，琼脂20.0g，蒸馏水1.0L，pH值自然，121℃高压蒸气灭菌30min。(2)液体种子培养基水稻秸秆粉3.0～5.0g，蛋白胨0.5～1.0g，Tween80 0.1～0.3g，(NH4)2SO40.8～1.2g，KH2PO41.2～1.8g，尿素0.2～0.4g，MgSO40.2～0.3g，CaCl30.1～0.2g，ZnSO4·7H2O 1.2mg，MnSO4·H2O 1.6mg，CoCl21.8mg，自来水1.0L，pH值自然，121℃高压蒸气灭菌30min。(3)产酶培养基水稻秸秆粉7.0～12.0g，麸皮1.0～5.0g，Tween80 0.1～0.4g，(NH4)2SO41.0～1.5g，KH2PO41.4～2.0g，尿素0.2～0.6g，MgSO40.1～0.4g，CaCl20.2～0.3g，ZnSO4·7H2O 2.4mg，MnSO4·H2O 3.2mg，CoCl23.6mg，自来水1.0L，pH值6.0，121℃高压蒸气灭菌30min。
全文摘要
本发明所述的一种微生物发酵生产低温纤维素酶的方法是将产生纤维素酶的微生物逐级低温驯化，使其在低温环境中生长良好；将低温驯化后的纤维素酶产生菌在10～ 16℃逐级扩大培养，按发酵液体积的3～9％接种量接入液体发酵培养基中，在10～16℃培养72～144h时，即微生物发酵生产低温纤维素酶结束；发酵液在4,000～8,000rpm离心收集液体，收集的液体即为粗酶液；根据不同需要和使用对象不同，可以将粗酶液进一步浓缩、分离纯化，制备成不同活性、纯度和剂型的酶制剂。
文档编号C12N1/00GK1807610SQ20061000201
公开日2006年7月26日 申请日期2006年1月23日 优先权日2006年1月23日
发明者迟乃玉, 张庆芳 申请人:迟乃玉, 张庆芳