专利名称：一种酶解小麦麸皮制备阿魏酰低聚糖的方法
技术领域：
一种酶解小麦麸皮制备阿魏酰低聚糖的方法，属于农副产品资源开发、功能性食品添加剂和营养保健品技术领域。
背景技术：
小麦是世界上最重要的粮食作物之一，特别是在发达国家，是人类膳食的重要组成部分。我国小麦产量居世界前列。近几年来，我国每年加工的小麦麸皮约在2000万吨左右。小麦麸皮是人类膳食纤维的很好来源，作为饲料组分的经济价值已经明显下降，在国外已有很多文献报道小麦麸皮作为人类膳食纤维对机体健康有益。近年来，对小麦麸皮研究的注意力集中在麦麸的生理活性物质上，如阿拉伯木聚糖、植酸和阿魏酸上，尤其是阿拉伯木聚糖和阿魏酸。小麦麸皮主要由细胞壁多糖组成，富含半纤维素，其中阿拉伯木聚糖占40％，在木聚糖骨架链上木糖残基的O-3、O-2或O-3和O-2位上通常被-L-阿拉伯糖取代。另一个显著特征就是阿魏酸通过酯键连接在阿拉伯糖残基上。在植物学领域，利用多糖水解酶水解植物细胞壁多糖制备阿魏酰低聚糖，主要是为了研究植物细胞壁的结构。到目前为止，从禾本科植物细胞壁上制备的阿魏酰阿拉伯糖基低聚木糖在结构上显示出了很好的一致性，即-L-呋喃型阿拉伯糖残基连接在以-1，4-糖苷键连接的D-木聚糖骨架链上的木糖O-3位上，阿魏酸与阿拉伯糖残基上的O-5位上相连。
阿魏酰低聚糖的抗氧化活性，阿魏酰低聚糖具有卓越的生物活性，能够有效地抑制低密度脂蛋白的氧化，在防止或减轻动脉硬化进程方面可能具有重要意义，在这一点上，游离阿魏酸是无法与其相比的。
抗氧化剂是21世纪人类健康的物质保障之一。由于人工合成的抗氧化剂，如丁羟基茴香醚(BHA)、丁羟基甲苯(BHT)、叔丁基氢醌(TBHQ)被怀疑会对人体造成负面影响，在国外，上述合成抗氧化剂在食品中应用受到严格的限制。近年来逐渐将注意力转向植物中蕴藏丰富的天然抗氧化剂，特别是那些存在于日常食品、蔬菜、水果中的抗氧化成分，其中植物酚酸化合物就是研究较多的一类，可望成为新型抗氧化剂的重要源泉。阿魏酸是植物界普遍存在的一种酚酸，尤其是在禾本科植物中。谷物中的阿魏酸通过酯键与细胞壁中多糖相连，以结合态的形式存在。Rondini等人报道，以结合态存在的阿魏酸比游离的阿魏酸具有更好的生物利用度。所以对结合态的阿魏酸(包括阿魏酰低聚糖)的研究已引起了极大的兴趣。到目前为止，有关阿魏酰低聚糖方面的研究国内还没有报道。众所周知，低聚木糖是一种性能优越的双歧因子。阿魏酰低聚糖除含有阿魏酰基外，还含有亲水性的低聚木糖体，它是否具有促进双歧杆菌增殖的作用，国内外均没有报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种酶解小麦麸皮制备阿魏酰低聚糖的方法，实现小麦麸皮的有效增值和利用，所制备的阿魏酰低聚糖具有卓越的生物活性，能够促进双歧杆菌生长和抑制自由基诱导的血红细胞氧化性伤害，对人体健康非常有益，具有很大的经济效益和社会效益。
本发明的技术方案本发明是以小麦麸皮为原料，经高温淀粉酶、蛋白酶、糖化酶依次处理，混合物进行离心得沉淀，所得沉淀用热蒸馏水、体积分数95％乙醇和丙酮进行洗涤后得到小麦麸皮不溶性膳食纤维，再用木聚糖酶进行酶解反应，酶解上清液经浓缩、喷雾干燥制备阿魏酰低聚糖粗品。酶解反应所用木聚糖酶为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)木聚糖酶。酶解底物为小麦麸皮不溶性膳食纤维，底物质量浓度为90～120g/L，体系中酶质量浓度为2～5g/L，酶解温度为30～50℃，酶解时间为20～40h，酶解体系pH为4.5～5.5。
小麦麸皮不溶性膳食纤维酶解反应的优化条件经中心组合旋转设计方案的优化模型得出酶解反应优化条件为底物质量浓度为120g/L，体系中酶质量浓度为4.8g/L，酶解温度为42℃，酶解时间为35h，酶解体系pH为5.2。
小麦麸皮主要由细胞壁多糖组成，其中阿拉伯木聚糖占绝大多数，在木聚糖骨架链上木糖残基的O-3、O-2或O-3和O-2位上通常被-L-阿拉伯糖取代，另外，在某些O-2位上阿拉伯糖残基上还连有阿魏酸。要制备阿魏酰低聚糖，在小麦麸皮不溶性膳食纤维的制备过程中，必须不能破坏阿魏酸与细胞壁多糖间的酯键，使得酯化在多糖上的阿魏酸全部保留下来，以有利于内切木聚糖酶的催化水解。在研究过程中，我们一方面采用通常方法利用耐高温α-淀粉酶、碱性内切蛋白酶和精制糖化酶对原料进行脱淀粉、除蛋白质；另一方面，专门对酶处理过的样品再利用乙醇和丙酮等有机溶剂进行洗涤，以除去部分色素、游离的酚酸类化合物等，因而获得了酯化阿魏酸含量较高的小麦麸皮不溶性膳食纤维。
小麦麸皮和小麦麸皮不溶性膳食纤维的基本化学组成分析结果(％)如表1所示。
表1
a未测定。
将小麦麸皮用高压蒸汽在121℃处理45min，以使其内源性酶失活。将处理过的小麦麸皮悬浮在一定体积的水中，60℃下连续搅拌16h，使其充分溶胀，接着加入75mL/kg麸皮的耐温α-淀粉酶后，混合物在沸水浴中搅拌40min。悬浮液冷却至60℃后，调pH至7.5，再加入30mL/kg麸皮的水解蛋白酶Alcalase，60℃下连续搅拌30min，调pH至4.5，再加入35mL/kg麸皮的精制糖化酶，60℃下连续搅拌30min，混合物离心，弃去上清液，沉淀用热蒸馏水反复洗涤，直至用冷蒸馏水洗涤时悬浮液无浑浊，再用热蒸馏水、体积分数95％乙醇和丙酮依次重复地洗涤两次，离心所得沉淀物在40℃下真空干燥24h，得到小麦麸皮不溶性膳食纤维。耐温α-淀粉酶、水解蛋白酶和精制糖化酶均由Novozymes公司提供。
枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)木聚糖酶(简称木聚糖酶)由武汉新华扬生物有限公司提供。
温度对微生物酶的影响情况很复杂，它不仅影响酶蛋白质的天然构象、参与酶促反应功能性基团的解离状态，而且还影响到酶与底物的亲和力、酶-底物络合物的分解，甚至还影响酶与激活剂、抑制剂的亲和力等。pH也是决定酶催化活性的一个重要参数，除影响酶的构象、酶活性部位催化基团和结合基团的解离状态外，还影响底物的带电状态。因此，温度和pH对酶的催化反应速度影响非常明显。
在较低温度范围内(30℃～50℃)，木聚糖酶酶活力随温度升高而增大；在较高温度范围内(60℃～80℃)，木聚糖酶酶活力随温度升高而迅速降低，因为温度升高，酶蛋白的热变性失活速度加快；该酶反应的最适温度为50℃，60℃时该酶具有97％的活力，而在80℃时酶的活力仅有6％。适当稀释的酶液在不同温度下保温1h，取出后立即冷却，按常规方法测定相对酶活。结果表明该酶在50℃以下最稳定，60℃时能维持38％的酶活，80℃时酶基本完全失活。
木聚糖酶在pH3.0时，相对活力为37％；在pH6.0时，相对活力为91％；在pH9.0时，相对活力仅为26％；该酶反应时最适pH值为5.0。将酶用不同pH缓冲液适当稀释，在室温下保温1h，按常规方法测定相对酶活，该酶的pH稳定范围为4.0～6.0。
枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)木聚糖酶能够水解小麦麸皮不溶性膳食纤维，随意断开膳食纤维中阿拉伯木聚糖主链上的糖苷键，释放阿魏酰低聚糖。随着酶浓度的增大，阿魏酰低聚糖的浓度也不断增加。当酶量达到4.0g/L时，阿魏酰低聚糖的浓度增加比较平缓。
在低底物浓度10g/L时，阿魏酰低聚糖浓度的最大值相对较小，仅有0.090mmol/L。然而，当底物浓度超过50g/L时，阿魏酰低聚糖的最大浓度增加相对较快，在底物浓度70g/L时，阿魏酰低聚糖浓度的最大值达到1.217mmol/L。
B.subtilis木聚糖酶最适反应温度在50℃；最适反应pH值为5.0；该酶在50℃下保温酶活基本稳定，其稳定pH范围为pH4.0～pH6.0。
选择反应温度45℃，pH5.5，反应时间36h，酶量3.0g/L，底物浓度50g/L作为中心组合旋转设计的中心条件。
各因子的中心组合旋转设计方案与实验结果如表2。
表2 5水平，5因子的中心组合旋转设计方案与实验结果a
a平均绝对相对偏差为5.75％，**FOs表示阿魏酰低聚糖。
综上分析，使用优化模型可得出阿魏酰低聚糖浓度最大时木聚糖酶水解小麦麸皮不溶性膳食纤维的条件，酶解反应温度42℃，pH5.2，酶解反应时间35h，酶量4.8g/L，底物浓度120g/L，在优化条件下，模型预测阿魏酰低聚糖的最大浓度为1.497mmol/L。在优化条件下获得的阿魏酰低聚糖由酯化的阿魏酸、阿拉伯糖和木糖所组成。
本发明的有益效果以小麦麸皮为原料，利用酶法脱淀粉、除蛋白质制备小麦麸皮不溶性膳食纤维，再利用枯草芽孢杆菌木聚糖酶水解小麦麸皮不溶性膳食纤维制备阿魏酰低聚糖，在反应温度42℃，pH5.2，反应时间35h，酶量4.8g/L，底物浓度120g/L的条件下，阿魏酰低聚糖浓度达到1.497mmol/L。
阿魏酰低聚糖不仅能够体外促进双歧杆菌生长，而且还具有独特的抗氧化活性，能够有效地保护人红细胞免受AAPH引发的氧化性应激伤害，与红细胞内源性抗氧化剂协同抵抗AAPH所诱导的伤害。
本发明实现了小麦麸皮的有效增值和利用，所制备的阿魏酰低聚糖具有卓越的生物活性，能够促进双歧杆菌生长和抑制自由基诱导的血红细胞氧化性伤害，对人体健康非常有益，具有很大的经济效益和社会效益。
经查新未见相关公开文献报道。
具体实施例方式
将小麦麸皮用高压蒸汽在121℃处理45min，以使其内源性酶失活。将处理过的小麦麸皮悬浮在一定体积的水中，60℃下连续搅拌16h，使其充分溶胀，接着加入75mL/kg麸皮的耐温α-淀粉酶后，混合物在沸水浴中搅拌40min。悬浮液冷却至60℃后，调pH至7.5，再加入30mL/kg麸皮的水解蛋白酶Alcalase，60℃下连续搅拌30min，调pH至4.5，再加入35mL/kg麸皮的精制糖化酶，60℃下连续搅拌30min，混合物离心，弃去上清液，得沉淀，即为通常的脱淀粉、除蛋白质制备小麦麸皮不溶性膳食纤维的常用方法，本发明专门采取将沉淀用热蒸馏水反复洗涤，直至用冷蒸馏水洗涤时悬浮液无浑浊，再用热蒸馏水、体积分数95％乙醇和丙酮依次重复洗涤两次以除去部分色素、游离的酚酸类化合物等，离心所得沉淀物在40℃下真空干燥24h，得到小麦麸皮不溶性膳食纤维。小麦麸皮不溶性膳食纤维再用枯草芽孢杆菌木聚糖酶进行酶解，酶解条件为反应温度42℃、pH5.2、反应时间35h、酶量4.8g/L、底物浓度120g/L时，阿魏酰低聚糖的浓度为1.546±0.037mmol/L(实验重复3次)。
权利要求
1.一种酶解小麦麸皮制备阿魏酰低聚糖的方法，包括小麦麸皮经高温淀粉酶、蛋白酶、糖化酶依次处理，混合物进行离心得沉淀，其特征是所得沉淀用热蒸馏水、体积分数95％乙醇和丙酮进行洗涤后得到小麦麸皮不溶性膳食纤维，再用木聚糖酶进行酶解反应，酶解上清液经浓缩、冷冻干燥制备阿魏酰低聚糖粗品；酶解反应所用木聚糖酶为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)木聚糖酶，酶解底物为小麦麸皮不溶性膳食纤维，底物质量浓度为90～120g/L，体系中酶质量浓度为2～5g/L，酶解温度为30～50℃，酶解时间为20～40h，酶解体系pH为4.5～5.5。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征是小麦麸皮不溶性膳食纤维酶解反应的优化条件为底物质量浓度为120g/L，体系中酶质量浓度为4.8g/L，酶解温度为42℃，酶解时间为35h，酶解体系pH为5.2。
全文摘要
一种酶解小麦麸皮制备阿魏酰低聚糖的方法，属于农副产品资源开发、功能性食品添加剂和营养保健品技术领域。本发明是以小麦麸皮为原料，利用酶法脱淀粉、除蛋白质制备小麦麸皮不溶性膳食纤维，再利用枯草芽孢杆菌木聚糖酶水解小麦麸皮不溶性膳食纤维制备阿魏酰低聚糖，在优化反应条件下，阿魏酰低聚糖浓度达到1.497mmol/L。本发明实现了小麦麸皮的有效增值和利用，所制备的阿魏酰低聚糖具有卓越的生物活性，能够促进双歧杆菌生长和抑制自由基诱导的血红细胞氧化性伤害，对人体健康非常有益，具有很大的经济效益和社会效益。
文档编号C12R1/07GK1840673SQ20061003795
公开日2006年10月4日 申请日期2006年1月19日 优先权日2006年1月19日
发明者姚惠源, 袁小平, 陈正行, 马晓军 申请人:江南大学