专利名称：在浮萍中表达生物活性多肽的制作方法
技术领域：
本发明涉及由遗传改造的浮萍表达和分泌生物活性多肽的方法和组合物。
背景技术：
浮萍是水萍科单子叶类植物唯一成员。浮萍的四个属和34种都是小的，自由漂动的，淡水植物，其地理分布横跨全球(Landolt(1986)浮萍科的生物系统调查水萍科-专论研究GeobatanischenInstitut ETH，Stiftung Rubel，苏黎世)。尽管浮萍为已知的形态学最减化(reduced)的植物，但是多数的浮萍种类具有较大植物的所有组织和器官，包括根，茎，花，种子和叶。人们已经对浮萍种类进行广泛地研究，存在大量文献详细描述它们的生态学，系统，生活周期，代谢，疾病和害虫易感性，它们的生殖生物学，基因结构和细胞生物学。(Hillman(1961)Bot.Review 27221；Landolt(1986)浮萍科植物的生物系统调查水萍植物科-专论研究Geobatanischen Institut ETH，Stiftung Rubel，苏黎世)。
浮萍的生长习性对于微生物的培养方法是非常理想的。植物通过新叶的营养出芽快速增殖，宏观方式类似于酵母中无性生殖。通过从分生组织细胞营养出芽而进行增殖。分生组织区域很小，位于叶腹侧表面。分生组织细胞处于两个囊(pocket)中，两个囊分别位于叶中脉(midvein)两侧。小的中脉区域也是根发生及茎生长而将每篇叶子连接到母叶的地方。分生组织囊受到组织瓣保护。叶从囊中交替发芽。不同的的种类倍增时间不同，短至20-24小时(Landolt(1957)Ber.Schweiz.Bot.Ges.67271；Chang等人(1977)Bull.Inst.Chem.Acad.Sin.2419；Datko和Mudd(1970)Plant Physiol.6516；Venkataraman等人(1970)Z Pflanzenphysiol.62316)。
浮萍大量的培养导致单位时间生物量高速聚集(Landolt和Kandeler(1987)水萍科-专论研究，第二卷植物化学，生理学，应用，参考数目Veroffentlichungen des GeobotanischenInstitutes ETH，Stiftung Rubel，苏黎世)，干重累积为鲜重的6-15％(Tillberg等人(1979)Physiol.Plant.465；Landolt(1957)Ber.Schweiz.Bot.Ges.67271；Stomp，未发表数据)。已报道在不同条件下生长的大量浮萍种类的蛋白含量范围在干重的15-45％(Chang等人(1977)Bull.Inst.Chem.Acad.Sin.2419；Chang和Chui(1978)Z Pflanzenphysiol.8991；Porath等人(1979)Aquatic Botany 7272；Appenroth等人，(1982)Biochem.Physiol.Pflanz.177251)。使用这些数值，浮萍中每升培养基蛋白产量的水平和酵母基因表达系统处于相同数量级。
浮萍中的有性生殖受到培养基成分和培养条件的控制，包括光周期和培养密度。一些浮萍种类的花诱导为常规实验室步骤。植物通常自花授粉，在实验室中自花授粉可以通过轻轻摇动培养物来完成。通过这种方法发展了Lemna gibba的同系繁殖系。已经鉴定了自发突变体(Slovin和Cohen(1988)Plant Physiol.86，522)，且化学及伽马射线突变(使用EMS或者NMU)已经用来生产具有特定特征的突变体。L.gibba的异型杂交非常繁琐但是能够通过受控的人工授粉完成。浮萍的基因组大小为0.25-1.63pg DNA/2C染色体数目从20到80条，在浮萍科中(across the Lemnaceae)平均数目为40条。Landolt(1986)浮萍科植物的生物系统调查水萍植物科-专论研究Geobatanischen Institut ETH，Stiftung Rubel，苏黎世)。估计倍性水平为2-12C.Id。使用次生产物，同工酶和DNA序列调查水萍科植物内部的遗传多样性(McClure和Alston(1966)Nature4916311；McClure和Alston(1966)Amer.J.Bot.53849；Vasseur等人(1991)Pl Syst.Evol.177139(1991)；Crawford和Landolt(1993)Syst.Bot.10389)。
用含有目的核苷酸序列的表达盒能够有效的转化浮萍植物或者浮萍节结培养物，转化方法可以是包括土壤杆菌介导的基因转化，弹道轰击(ballistic bombardment)，或者电穿孔等大量方法中的任意一种方法。稳定的浮萍转化株可以通过用带有目的核苷酸序列和提供选择试剂抗性的基因转化浮萍细胞，然后将转化的细胞在含有选择试剂的培养基中培养而分离得到。见美国授予Stomp等人的专利6,040,498。
浮萍基因表达系统提供用于大量研究和商业应用的关键技术。对于植物分子生物学研究整体，以酵母的实验室便利性操作的分化的植物体系提供分析分离的基因的发育和生理学作用的非常快速体系。对于商业生产有价值的多肽，浮萍基础的体系相对于现存的微生物或者细胞培养体系具有很多优点。植物显示出其翻译后处理和哺乳动物相似，克服了微生物细胞生产生物活性哺乳动物多肽所具有的一个主要问题，其他方面(Hiatt(1990)Nature334469)显示植物系统具有装配多亚基蛋白的能力，这种能力在微生物系统中是缺乏的。浮萍生物量增加到重组蛋白商业生产水平比哺乳动物细胞类似的增加更快且成本效益更高，而且不同于其它建议的植物生产系统，例如大豆和烟草，浮萍可以在全满的而且完全受控制的生物质生产容器中生长，使得该系统更加容易整合到现存的蛋白生产工业的下部构造中。
这些特征使得浮萍成为开发作为生产重组蛋白的有效的植物基础体系的理想选择。因此，本发明提供增加作为生物活性多肽生产工具的浮萍基因表达系统有效性的方法和组合物。
发明概述本发明涉及使用浮萍作为表达系统的表达和回收生物活性重组多肽的方法和组合物。本发明的一方面提供提高生物活性多肽在浮萍中的表达水平的方法，导致多肽产量增加，并使得该系统能生产有用量的有价值的生物活性多肽。本发明的另外一个方面公开从遗传改造的浮萍植物或者浮萍节结培养物定向分泌生物活性多肽的方法。表达的多肽的分泌促进其回收并防止可能由机械摩擦或者浮萍组织酶的溶解导致的多肽活性丧失。
在一个实施方案中，本发明包含在浮萍植物培养物或者浮萍节结培养物中生产生物活性重组多肽的方法，包括步骤(a)在浮萍培养基中培养浮萍植物培养物或者浮萍节结培养物，其中浮萍植物培养物或者浮萍节结培养物稳定地被转化而表达生物活性重组多肽，其中生物活性重组多肽由含有多肽编码序列和操作性连接的指导多肽分泌入培养基的信号肽编码序列的核苷酸序列表达得到的；以及(b)从浮萍培养基中收集生物活性多肽。在该方法的一些实施方案中，核苷酸序列具有至少一种特征选自(a)多肽的编码序列中使用浮萍优选的密码子；(b)该信号肽的编码序列使用浮萍优选的密码子；(c)翻译起始密码子两侧为植物优选的翻译起始背景(context)核苷酸序列；以及(d)操作性连接的核苷酸序列含有插在编码序列上游的植物内含子。在该方法的一些实施方案中，生物活性重组多肽分泌到浮萍培养基中。
在另一个实施方案中，本发明包含在浮萍植物培养物或者浮萍节结培养物中分泌生物活性重组多肽的方法，包括步骤(a)在浮萍培养基中培养浮萍植物培养物或者浮萍节结培养物，其中浮萍植物培养物或者浮萍节结培养物稳定转化而表达生物活性重组多肽，其中生物活性重组多肽由含有多肽编码序列和操作性连接的指导多肽分泌入培养基的信号肽编码序列的核苷酸序列表达得到的；以及(b)从浮萍培养基收集生物活性多肽。在该方法的一些实施方案中，核苷酸序列具有至少一种特征选自(a)多肽的编码序列中使用浮萍优选的密码子；(b)该信号肽的编码序列使用浮萍优选的密码子；(c)翻译起始密码子两侧为植物优选的翻译起始背景核苷酸序列；以及(d)操作性连接的核苷酸序列含有插在编码序列上游的植物内含子。在该方法的一些实施方案中，生物活性重组多肽分泌到浮萍培养基中。
在以上方法的一些实施方案中，信号肽序列选自(a)人体α-2b-干扰素信号序列；(b)拟南芥(Arabidopsis thaliana)壳多糖质酶信号序列；(c)水稻α-淀粉酶信号序列；(d)改良的水稻α-淀粉酶序列；(e)浮萍信号序列；以及(f)生物活性重组多肽的天然的信号序列。本方法的一个实施方案中，信号肽为水稻α-淀粉酶信号肽，其序列为SEQ ID NO3所列。
以上方法的一些实施方案中，浮萍优选的密码子为浮萍属(Lemna-)优选的密码子。进一步的实施方案，浮萍优选的密码子为Lemna gibba优选的密码子或者浮萍(Lemna minor)优选的密码子。在进一步的实施方案，其中选自多肽编码序列和信号肽编码序列的编码序列中至少一种含有70％-100％的Lemna gibba-优选的密码子或者Lemna minor-优选的密码子。
在另一个实施方案中，本发明包含生产生物活性重组多肽的方法，包括步骤(a)培养浮萍植物培养物或者浮萍节结培养物，其中浮萍植物培养物或者浮萍节结培养物被稳定转化而表达生物活性重组多肽，其中编码生物活性重组多肽的核苷酸序列已经经过改进以提高在浮萍中的表达，以及(b)从所述浮萍植物培养物或者浮萍节结培养物中收集生物活性多肽。在该方法的一些实施方案中，已经改进核苷酸序列以提高在浮萍中的表达，其有至少一种特征选自(a)所述生物活性重组多肽的编码序列使用浮萍优选的密码子；(b)翻译起始密码子两侧为植物优选的翻译起始背景核苷酸序列；以及(c)操作性连接的核苷酸序列含有插在编码序列上游的植物内含子。
该方法的一些实施方案中，浮萍优选的密码子为浮萍属优选的密码子。进一步的实施方案，浮萍优选的密码子为Lemna gibba优选的密码子或者Lemna minor优选的密码子。在进一步的实施方案，编码序列含有70％-100％的Lemna gibba-优选密码子或者Lemna minor-优选密码子。
在以上方法的一些实施方案中，植物优选的翻译起始背景核苷酸序列由核苷酸序列“ACC”或者“ACA”组成，其中背景位置紧接着翻译起始密码子5′末端。
在以上方法的一些实施方案中，操作性连接的含有所述植物内含子的核苷酸序列为SEQ ID NO1所列的序列。
在以上任何方法的一些实施方案中，浮萍叶培养物或者浮萍节结培养物表达并组装生物活性多聚蛋白所有亚单位。在进一步的实施方案中多聚蛋白选自胶原蛋白，血色素，P450氧化酶，以及单克隆抗体。
在以上任何方法的一些实施方案中，生物活性重组多肽为哺乳动物多肽。在进一步的实施方案，哺乳动物多肽为治疗性多肽。在一些实施方案中，哺乳动物多肽选自胰岛素，生长激素，α-干扰素，β-干扰素，β-葡糖脑苷脂酶，β-glucoronidase，成视网膜细胞瘤蛋白，p53蛋白，制管张素，leptin，单克隆抗体，细胞因子，受体，人体疫苗，动物疫苗，植物多肽，和血清白蛋白。
在以上任何方法的一些实施方案中，生物活性重组多肽为α-2b-干扰素。进一步的实施方案，α-2b-干扰素为人α-2b-干扰素。进一步的实施方案，人体α-2b-干扰素氨基酸序列为SEQ ID NO4或者SEQ ID NO5所列的序列。
在以上任何方法的一些实施方案中，生物活性重组多肽为α-2b-干扰素生物活性变体，其中所述生物活性变体序列和SEQ ID NO4或者SEQ ID NO5有80％序列一致性。
在以上任何方法的一些实施方案中，生物活性重组多肽为酶。
在其它实施方案中，本发明包括以上任何方法稳定转化的浮萍植物培养物或者浮萍节结培养物。进一步的实施方案中，稳定转化的浮萍植物培养物或者浮萍节结培养物选自紫萍(Spirodela)属，芜萍属，Wolfiella属和浮萍属。进一步的实施方案中，稳定转化的浮萍植物培养物或者浮萍节结培养物选自乳萍，Lemna miniscula，Lemnaaequinoctialis和Lemna gibba。
在其它实施方案中，本发明包括含有编码氨基酸序列的核苷酸序列的核酸分子，其中氨基酸序列选自(a)SEQ ID NO4所列的氨基酸序列；(b)SEQ ID NO5所列的氨基酸序列；(c)SEQ INNO4所示氨基酸序列的生物活性变体的氨基酸序列，其中生物活性变体氨基酸序列和SEQ ID NO4所列的序列具有至少80％的序列一致性；以及(d)SEQ IN NO5所示氨基酸序列的生物活性变体的氨基酸序列，其中生物活性变体氨基酸序列和SEQ ID NO5所列的序列具有至少80％的序列一致性；其中核苷酸序列包含浮萍优选的密码子。进一步的实施方案中，核苷酸序列为SEQ ID NO2所列的核苷酸序列。
在其它的实施方案中，本发明包括含有编码选自以下信号肽的核苷酸序列的核酸分子(a)SEQ ID NO6所列的水稻α-淀粉酶信号肽氨基酸序列；以及(b)SEQ ID NO7所列的改进的水稻-淀粉酶信号肽氨基酸序列；其中核苷酸序列包含浮萍优选的密码子。在进一步的实施方案中，核苷酸序列为SEQ ID NO3所列的核苷酸序列。
在其它的实施方案中，本发明包括用于在浮萍中表达和分泌人α-2b-干扰素的核酸分子，该核酸分子包含SEQ ID NO3给出的编码信号肽的核苷酸序列以及SEQ ID NO5给出的编码成熟人α-2b-干扰素的核苷酸序列，其中编码信号肽的核苷酸序列和编码成熟人α-2b-干扰素的核苷酸序列操作性相连接。在进一步的实施方案中，核酸分子，还包括SEQ ID NO1给出的包含内含子的核苷酸序列，其中该含有内含子的核苷酸序列与所述编码信号肽的核苷酸序列和所述编码成熟的人α-2b-干扰素的核苷酸序列操作性相连。
本发明的这些及其它方面更加详细的内容在以下给出的发明详述中公开。
附图简述
图1图1显示在转化的浮萍培养物的培养基和组织中的干扰素水平(通过固相夹心式(sandwich)免疫测定确定)，如实施例1所述。
图2图2显示在培养基和转化的浮萍培养物组织中的干扰素水平(通过固相夹心式免疫测定确定)，如实施例2所述。
发明详述本发明中，公开提高遗传改造的浮萍植物和浮萍节结培养物中生物活性多肽的表达和回收的方法。这些方法包括以下步骤(1)培养稳定转化的浮萍植物或者浮萍节结培养物，它们表达至少一种生物活性多肽，其中编码多肽的核苷酸序列已经经过改造以使其在浮萍中的表达提高，以及从浮萍培养物中回收生物活性多肽。本发明包含的核苷酸序列的改造包括，但并不限于，对编码序列采用浮萍优选的密码子，对翻译起始密码子采用植物优选的翻译起始背景核苷酸序列，以及在多肽编码序列的上游插入包含植物内含子序列的核苷酸序列。
(2)培养稳定转化的浮萍植物或者浮萍节结培养物，它们表达至少一种含有信号序列的生物活性多肽，该信号序列指导多肽分泌到培养基中，随后从培养基中回收生物活性多肽。该方法的一个实施方案，改造编码生物活性多肽的核苷酸序列用以提高其在浮萍中的表达。或者，在另一种实施方案中，改造编码信号肽的核苷酸序列用以提高浮萍中的表达。在一个实施方案中，改造生物活性多肽及信号肽的核酸编码序列以提高其在浮萍中的表达。
另一方面，本发明包括根据以上方法生产生物活性多肽的转化的漂浮植物或者浮萍节结培养物。
另一方面，本方面公开在浮萍中生产生物活性人α-2b-干扰素的方法的和核酸序列。
定义“多肽”是指单体或者多聚蛋白或者肽。
“生物活性多肽”是指具有一种或者多种生物功能或者一系列在生物学中多肽通常具有的活性的多肽。本领域的技术人员意识到术语“生物活性”包括和天然蛋白相比生物活性有所改变的多肽(例如活性受到抑制或者增加)，只要蛋白在用于工业或者化学处理或者作为治疗，疫苗，或者诊断试剂时具有充分的活性就是具有生物活性。可用本领域的任何方法来确定生物活性。例如，干扰素家族的蛋白成员的生物活性可通过很多方法来确定，包括它们和干扰素特异性抗体的相互作用，它们增加病毒感染抗性的能力，或者它们调节干扰素调控基因靶转录的能力。
此处使用的“目的核酸序列”是指任何诣在浮萍中表达的多肽的核苷酸编码序列。例如，可用根据本发明的转化的浮萍进行表达的治疗性(例如兽医用或者医用)或者免疫原性(例如用来接种)多肽的核苷酸编码序列。
术语“表达”或者“生产”是指基因产品的生物合成，包括转录，翻译和该基因产物的组装。术语“浮萍”是指水萍科成员。该科目前分为4个属和34个种的浮萍，如下浮萍属(L.aequinoctialis，L.disperma，L.ecuadoriensis，L.gibba，L.japonica，浮萍，L miniscula，L.obscura，稀脉浮萍(L.perpusilla)，L.tenera，品藻(L.trisulca)，L.turionifera，L.valdiviand)；紫萍属(S.intermedia，S.polyrrhiza，S.punctata)芜萍属(Wa.angusta，芜萍(Wa.arrhiza)，Wa.australina，Wa.borealis，Wa.brasiliensis，Wa.columbiana，Wa.elongata，Wa.globosa，Wa.microscopica，Wa.neglectd)和Wolfiella属(Wl.caudata，Wl.denticulata，Wl.gladiata，Wl.hyalina，Wl.lingulata，Wl.repunda，Wl.rotunda，和Wl.neotropica)。如果存在任何水萍科植物其它属或者种，也属于本发明方面。可以使用Landolt(1986)所述分类学方案对Lemna各种进行归类浮萍科生物系统调查水萍科-专论研究GeobatanischenInstitut ETH，Stiftung Rubel，苏黎世。
此处使用的术语“浮萍节结培养物”是指含有浮萍细胞的培养物，其中至少50％，55％，60％，65％，70％，75％，80％，85％，90％，95％，或者100％的细胞为分化的细胞。此处使用的“分化的细胞”为具有至少一种表型性状(例如，显著的细胞形态或者标记的核酸或者蛋白的表达)的细胞，该表型性状可以将其同未分化的细胞或者在其它组织类型中发现的细胞区分开来。此处描述的浮萍节结培养物的分化的细胞形成相互连接的细胞的平铺的光滑表面，相互连接的细胞在它们相邻的细胞壁处融合，开始组织成叶原基的节结分散于整个组织。节结培养物的组织表面具有通过原生质网(plasmadesmata)相互连接的表皮细胞。
此处使用的″浮萍优选密码子″是指在浮萍中使用频率大于17％的密码子。
此处使用的″浮萍属优选密码子″是指在浮萍属中使用频率大于17％的密码子。
此处使用的″Lemna gibba优选密码子″是指在Lemna gibba中使用频率大于17％的密码子。此处Lemna gibba中的密码子使用频率来自密码子使用数据库(GenBank Release 113，0；网址为http∥www.kazusa.or.jp/codon/cgibin/showcodon.cgi？species＝Lemna+gibba+[gbpln])。
“翻译起始密码子″是指启动从目的核苷酸序列转录得到的mRNA的翻译的密码子。
此处使用的″翻译起始背景核苷酸序列″是指紧接翻译起始密码子5′的三个核苷酸的特性。
此处使用的″分泌″是指多肽横跨宿主细胞的质膜和细胞壁的迁移。
此处使用的″操作性连接的″是指核苷酸序列彼此放置的位置处于功能关系。通常，操作性连接的DNA序列为相邻的，且其位置必需以符合阅读框连接两个蛋白的编码区域。
A.表达盒根据本发明，稳定转化的浮萍是通过用包含于表达盒内的目的核苷酸序列转化得到。表达盒包括连接有目的核酸或者基因的转录起始区。提供的表达盒具有多个可以插入一个或几个目的基因的(例如，一个目的基因，两个目的基因等等)限制性酶切位点，目的基因受到调控区域的转录调控。表达盒可以编码单个目的基因。在本发明的具体实施方案中，转移的核酸含有2个或者多个的表达盒，其中每个表达盒编码至少一个目的基因。
转录起始区域，(例如启动子)可以是宿主本身或者和宿主同源的或者外来的或者异源的，或者可以是天然序列或合成的序列。外来的转录起始区域就意味在野生型的宿主中不存在这种转录起始区，而是向其中引入的。此处使用的嵌合基因包含操作性连接与其异源的转录起始区的编码序列。
根据本发明可以应用本领域已知的合适的启动子(包括细菌，酵母，真菌，昆虫，哺乳动物和植物的启动子)。例如，可以使用植物启动子，包括浮萍启动子。典型的启动子包括但并不仅限于花椰菜花叶病毒35S启动子，冠瘿碱合成酶启动子(例如，nos，mas，ocs，等等)，泛素启动子，肌动蛋白启动子，核酮糖双磷酸(RubP)羧化酶小亚基启动子，和乙醇脱氢酶启动子。浮萍RubP羧化酶小亚基启动子为本领域已知(Silverthorne等人(1990)Plant Mol.Biol.1549)。感染植物(优选感染浮萍)的病毒的其它启动子也是合适的，这些启动子包括但是并不仅限于芋头(Dasheen)花叶病毒，小球藻(Chlorella)病毒(例如，小球藻病毒腺嘌呤甲基转移酶启动子；Mitra等人(1994)Plant Mol.Biol.2685)，番茄点状萎蔫病毒，烟草脆裂病毒，烟草坏死病毒，烟草环斑病毒，番茄环斑病毒，黄瓜花叶病毒，花生残株(stump)病毒，紫花苜蓿花叶病毒，甘蔗杆状badnavirus等病毒分离出来的启动子。
最终，选择启动子达到要求的调控水平。例如，在一些实例中，使用导致组成型表达的启动子是有利的，(例如来自根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)的甘露碱合成酶)。或者，在另外一种情况下，对特异性环境刺激反应而激活的诱导型启动子是有利的(例如，热休克基因启动子，干燥诱导型基因启动子，病原体诱导型基因启动子，创伤诱导型基因启动子，和光/暗诱导型基因启动子)或者使用对植物生长调节剂反应而激活的启动子是有利的(例如，受到脱落酸，植物生长素，细胞分裂素，和赤霉素诱导的基因启动子)。作为进一步的选择，可以选择导致组织特异性表达的启动子(例如，根，叶，花特异的启动子)。
给定启动子的总强度受到顺式作用核苷酸序列的组合及空间组织的影响，这种核苷酸如上游激活序列。例如，根癌土壤杆菌章鱼碱合成酶基因的激活核苷酸序列能够提高根癌土壤杆菌甘露碱合成酶基因的启动子(见Gelvin等人的美国专利5,955,646)的转录。本发明中，表达盒能包括启动子序列上游插入的激活核苷酸序列，以增强目的核苷酸序列的表达。在一个实施方案中，表达盒包括来自根癌土壤杆菌章鱼碱合成酶基因的3个上游的激活核苷酸序列，该序列操作性连接于根癌土壤杆菌甘露碱合成酶基因的启动子(见美国专利5,955,646，此处引作参考)。
转录盒包括5′-3′方向的转录，转录和翻译起始区，目的核苷酸序列，以及植物中转录和翻译终止功能区。根据本发明，可以使用任何本领域已知的合适的终止序列。终止区可以对转录起始区是天然的(be native with)，可以对目的基因是天然的，也可以来自另外的来源。合宜的终止区来自根癌土壤杆菌Ti-质粒，例如章鱼碱合成酶和胭脂碱合成酶的终止区。见Guerineau等人(1991)Mol.Gen.genet.262141；Proudfoot(1991)Cell 64671；Sanfacon等人(1991)Genes Dev.5141；Mogen等人(1990)Plant Cell21261；Munroe等人(1990)Gene 91151；Ballas等人(1989)Nucleic Acids Res.177891；和Joshi等人(1987)Nucleic Acids Res.159627。另外典型的终止序列为豌豆RubP羧化酶小亚基终止序列和花椰菜花叶病毒35S终止序列。对于本领域技术人员其它适当的终止序列是显而易见的。
或者，也可在本领域已知的任何其它合适的表达盒上提供目的基因。
表达盒可以含有超过一个转移并在转化的植物中表达的基因或者核酸序列。这样，每个核酸序列可以操作性连接5′和3′调节序列。或者，也可以提供多个表达盒。
通常，表达盒包括用于选择转化的细胞或者组织的选择性标记基因。选择性标记基因包括编码抗生素抗性的基因，例如编码新霉素磷酸转移酶lI(NEO)和潮霉素磷酸转移酶(HPT)的基因，以及提供对除草剂化合物抗性的基因。除草剂抗性基因通常编码对除草剂不敏感的经过修饰的靶蛋白，或者编码在除草剂起作用之前降解除草剂或者除去其毒性的酶。见DeBlock等人(1987)EMBOJ.62513；DeBlock等人(1989)Plant Physiol.91691；Fromm等人(1990)BioTechnology 8833；Gordon-Kamm等人(1990)Plant Cell2603。例如，使用编码突变靶酶5-烯醇丙酮酰莽草酸(enolpyruvylshikimate)-3-磷酸合成酶(EPSPS)和乙酰乳酸合成酶(ALS)的基因获得磷酸甘氨酸或者磺酰脲除草剂抗性。通过使用编码去除相应除草剂毒性的phosphinothricin乙酰转移酶，一种腈水解酶或者2，4-二氯苯氧基乙酸单加氧酶的细菌的基因获得glufosinate铵，boromoxynil，和2，4-二氯苯氧基乙酸(2，4-D)的抗性。
本发明的各种用途中，选择性标记基因包括但是并不仅限于编码新霉素磷酸转移酶II的基因(Fraley等人(1986)CRC CriticalReviews in Plant Science 41)；氨腈水合酶(Maier-Greiner等人(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 884250)；天氡氨酸激酶；二氢吡啶二羧酸(dihydrodipicolinate)合成酶(Peri等人(1993)Biotechnology 11715)；bar基因(Toki等人(1992)Plant Physiol.1001503；Meagher等人(1996)Crop Sci.361367)；色氨酸脱羧酶(Goddijn等人(1993)Plant Mol.Biol.22907)；新霉素磷酸转移酶(NEO；Southern等人(1982)J.Mol.Appl.Gen.1327)；潮霉素磷酸转移酶(HPT或者HYG；Shimizu等人(1986)Mol.Cell.Biol.61074)；二氢叶酸还原酶(DHFR；Kwok等人(1986)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 834552)；hosphinothricin乙酰转移酶(DeBlock等人(1987)EMBOJ.62513)；2，2-二氯丙酸脱卤素酶(Buchanan-Wollatron等人(1989)J.Cell.Biochem.13D-.330)；乙酰羟酸(acetohydroxyacid)合成酶(Anderson等人的美国专利4,761,373 Haughn等人(1988)Mol.Gen.Genet.221266)；5-烯醇丙酮酰莽草酸-磷酸合成酶(aroA；Comai等人(1985)Nature317741)；卤代芳基腈水解酶(haloarylnitrilase)(WO 87/04181Stalker等人)；乙酰辅酶A羧化酶(Parker等人(1990)PlantPhysiol.921220)；二氢孕酮合成酶(sull；Guerineau等人(1990)Plant Mol.Biol.15127)；和32kDa光系统II多肽(psbA；Hirschberg等人(1983)Science 2221346(1983)。
也包括所有编码以下抗性的基因庆大霉素(例如，aacCI，Wohlleben等人(1989)Mol.Gen.Genet.217202-208)；氯霉素(Herrera-Estrella等人(1983)EMBOJ.2987)；甲氨蝶呤(Herrera-Estrella等人(1983)Nature 303209；Meijer等人(1991)Plant Mol.Biol.16807)；潮霉素(Waldron等人(1985)Plant Mol.Biol.5103；Zhijian等人(1995)Plant Science108219；Meijer等人(1991)Plant Mol.Bio.16807)；链霉素(Jones等人(1987)Mol.Gen.genet.21086)；大观霉素(Bretagne-Sagnard等人(1996)Transgenic Res.5131)；博来霉素(Hille等人(1986)Plant Mol.Biol.7171)；磺胺药物(Guerineau等人(1990)Plant Mol.Bio.15127)；bromoxynil(Stalker等人(1988)Science 242419)；2，4-D(Streber等人(1989)BioTechnology7811)；phosphinothricin(DeBlock等人(1987)EMBO J.62513)；大观霉素(Bretagne-Sagnard和Chupeau，Transgenic Research 5131)。
Bar基因提供对glufosinate-类型除草剂(例如phosphinothricin(PPT)或者bialaphos，等等)的除草剂抗性。正如上述，其它可以在载体构建中使用的选择性标记基因包括但并不仅限于pat基因，也用于bialaphos和phosphinothricin抗性，用于咪唑啉酮抗性的ALS基因，用于潮霉素抗性的HPH或者HYG基因，用于glyphosate抗性的EPSP合成酶基因，用于Hc-毒素抗性的Hml基因和其它常规使用以及本领域普通技术人员已知的选择试剂。见Yarranton(1992)Curr.Opin.Biotech.3506；Chistopherson等人(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 896314；Yao等人(1992)Cell 7163；Reznikoff(1992)Mol.Microbiol.62419；Barkley等人(1980)操纵子The Operon 177-220；Hu等人(1987)Cell 48555；Brown等人(1987)Cell 49603；Figge等人(1988)Cell 52713；Deuschle等人(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 865400；Fuerst等人(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 862549；Deuschle等人(1990)Science 248480；Labow等人(1990)Mol.Cell.Biol.103343；Zambretti等人(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 893952；Baim等人(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 885072；Wyborski等人(1991)Nuc.Acids Res.194647；Hillenand-Wissman(1989)Topics in Mol.And Struc.Biol.10143；Degenkolb等人(1991)Antimicrob.Agents Chemother.351591；Kleinschnidt等人(1988)Biochemistry 271094；Gatz等人(1992)Plant J.2397；Gossen等人(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 895547；Oliva等人(1992)Antimicrob.Agents Chemother.36913；Hlavka等人(1985)药物学实验手册78；和Gill等人(1988)Nature334721.这些公开内容此处引入作为参考。
以上选择性标记基因列表并不意在限制，任何选择性标记基因都可以在本发明中使用。
B.修饰核苷酸序列以提高其在浮萍中的表达本发明提供表达的核苷酸序列的修饰以增加其在浮萍中的表达。一种修饰为使用浮萍优选的密码子合成的目的核苷酸序列。本领域中有用植物优选密码子合成核苷酸序列的方法。见例如，美国专利5,380,831和5,436,391；Perlak等人(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 153324；lannacome等人(1997)Plant Mol.Biol.34485；及Murray等人，(1989)Nucleic Acids.Res.17477，此处引入作为参考。优选密码子由在浮萍表达蛋白中最高使用频率的密码子来决定。例如，Lemna gibba密码子的使用频率可以在以下网页找到http∥www.kazusa.or.jp/codon/cgi-bin/showcodon.cgi？species＝Lemna+gibba+[gbpln]，而Lemnaminor密码子使用频率可以在以下网页找到http∥www.kazusa.or.jp/codon/cgibin/showcodon.cgi？species＝Lemna+minor+[gbpln]。在浮萍和其它单子叶植物中表达经过优化的基因被认为可以在本发明的方法中使用。见例如，EP 0 359 472，EP 0 385 962，WO 91/16432；Perlak等人(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 883324；lannacome等人(1997)Plant Mol.Biol.34485；和Murray等人(1989)Nuc.Acids Res.17477，等等，此处引入作为参考。进一步认为所有基因序列或者基因序列的任何部分都可以优化或者合成。换言之，可以使用完全优化或者部分优化的序列。例如，40％，45％，50％，55％，60％，65％，70％，75％，80％，85％，87％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％，或者100％的密码子可为浮萍的优选密码。在一个实施方案中，有90至96％密码子为浮萍优选密码子。目的核苷酸序列的编码序列可包含在Lemna gibba使用频率至少为17％的密码子。在一个实施方案中，修饰的核苷酸为在SEQ ID NO2显示的人α-2B-干扰素的编码核苷酸序列，其中包含了93％的浮萍优选的密码子。
目的核苷酸也进行其它的修饰以提高其在浮萍中的表达。这些修饰包括但是并不仅限于，去掉编码的假多腺苷酸化信号的核苷酸序列，外显子-内含子拼接位点信号的序列，转座子类重复序列，以及其特征已知为可能不利于基因表达的其它序列。序列的G-C含量可以调节到给定细胞宿主的平均水平，该水平由参考该宿主细胞内表达的已知基因计算而得。如果可能，可以修饰序列以避免预测的发夹二级mRNA结构。
在动物和植物中翻译起始密码子的最佳的翻译起始背景核苷酸序列之间存在已知的差别，这些翻译起始背景核苷酸序列的组成影响翻译起始的效率。见例如，Lukaszewicz等人(2000)Plant Science15489-98；和Joshi等人(1997)；Plant Mol.Biol.35993-1001。在本发明中，用于目的核苷酸序列翻译起始密码子的翻译起始背景核苷酸序列可以修饰以提高在浮萍中的表达。在一个实施方案中，这样修饰核苷酸序列，而使目的核苷酸序列的翻译起始密码子上游紧接的三个核苷酸为“ACC”。在另一个实施方案中，这些核苷酸为“ACA”。
通过使用5′前导序列也能提高浮萍中转基因的表达。该前导序列也能产生增强翻译的效果。翻译前导序列在本领域是已知的，包括但是并不仅限于，微小RNA病毒前导序列，例如，EMCV前导序列(脑心肌炎5′非编码区；EIroy-Stein等人，(1989)Proc.Natl.Acad.Sci USA 866126)；马铃薯Y病毒前导序列，例如，TEV前导序列(Tobacco Etch Virus；Allison等人(1986)Virology 1549)；人免疫球蛋白重链结合蛋白(BiP；Macajak and Sarnow(1991)Nature35390)；苜蓿花叶病毒外壳蛋白mRNA不翻译的前导序列(AMVRNA4；Jobling和Gehrke(1987)Nature 325622)；烟草花叶病毒前导序列(TMV；Gallie(1989)Molecular Biology of RNA，2356)；马铃薯蚀刻病毒前导序列(Tomashevskaya等人(1993)J.Gen.Virol.742717-2724)；Fed-1 5′非翻译区(Dickey(1992)EMBO J.112311-2317)；RbcS 5′非翻译区(Silverthorne等人(1990)J.Plant.Mol.Biol.1549-58)；以及玉米萎黄斑点病毒前导序列(MCMV；Lommel等人(1991)Virology 81382)。并见文献，DellaCioppa等人(1987)Plant Physiology 84965。包括植物内含子序列的前导序列也显示增加植物中的翻译效率，其中植物内含子序列包括来自玉米脱氢酶1基因的，来自蓖麻子过氧化氢酶基因或者拟南芥属色氨酸途径基因PAT1的内含子序列。(Callis等人(1987)GenesDev.11183-1200；Mascarenhas等人(1990)Plant Mol.Biol.15913-920)。本发明的一个实施方案中，将SEQ ID NO1中所列玉米乙醇脱氢酶1基因(GenBank编号X04049)核苷酸1222-1775对应的核苷酸序列插入到目的核苷酸序列上游以增加其翻译效率。
以上描述的任何一种增加浮萍表达的核苷酸序列修饰都可以在本发明中使用，包括任何一种修饰或者任何可能的修饰的组合。此处使用的短语″修饰用于提高浮萍中表达″是指含有任何一种修饰或者任何几种修饰组合的核苷酸序列。
C.信号肽分泌蛋白通常从含有“信号肽”的前体多肽开始翻译，前体肽包括一种和内质网膜(ER)上受体相互作用来指导正生成的多肽链跨膜位移且进入内质网膜进行细胞分泌的“信号肽”。通常从前体肽切下信号肽产生缺乏信号肽的“成熟”多肽。在本发明的一个实施方案中，在浮萍中表达的生物活性多肽的核苷酸序列和编码信号肽的的核苷酸序列连接，信号肽指导多肽分泌入培养基。在本领域中指导目标蛋白移位到内质网(用于向胞外分泌)的植物信号肽是已知的。见例如，Lee等人的美国专利6,020,169。在本发明中，使目标多肽表达到ER中可以使用任何植物信号肽。在一些实施方案中，信号肽为拟南芥(Arabidopsis thaliana)碱性内切壳多糖酶(basicendochitinase)信号肽(SEQ ID NO8；NCBI蛋白质编号BAA82823的氨基酸14-34)，伸展蛋白信号肽(Stiefel等人(1990)Plant Cell 2785-793)，水稻α-淀粉酶信号肽(SEQ ID NO6；NCBI蛋白质编号AAA33885的氨基酸1-31)，或者经修饰的水稻α-淀粉酶信号序列(SEQ ID NO7)。在另外一个实施方案中，信号肽对应于分泌的浮萍蛋白的信号肽。
或者，使用哺乳动物信号肽在遗传改造的浮萍中引导表达的重组多肽进行分泌。已经证明植物细胞识别哺乳动物中以内质网为靶位点的信号肽，而且这些信号肽能够指导多肽分泌不仅能够通过质膜而且也能够通过植物细胞壁。见Hiatt等人美国专利5,202,422和5,639,947。在本发明的一个实施方案中，引导多肽分泌的哺乳动物信号肽为人α-2b-干扰素信号肽(NCBI蛋白质编号AAB59402的氨基酸1-23和SEQ ID NO4)。
在一个实施方案中，编码信号肽的核苷酸序列经过修饰用来提高浮萍中的表达，使用B部分公开的目的核酸序列的任何一种修饰或者几种修饰的组合。在另外一个实施方案中，水稻α-淀粉酶信号肽由SEQ ID NO3所列修饰核苷酸序列编码，该序列含有大约93％浮萍优选的密码子。
用本领域已知的常规方法从培养基中收获分泌的生物活性多肽并通过层析，电泳，透析，溶剂-溶剂萃取，等方法来纯化。
D.转化的浮萍植物和浮萍节结培养物本发明使用的稳定转化的浮萍是通过本领域已知的任何方法获得的。在一个实施方案中，通过Stomp等人的美国专利6,040,498，(此处引入作为参考)公开的基因转移方法之一获得稳定转化的浮萍。这些方法包括用包有含目的核苷酸序列的核酸的微射弹进行弹道轰击来转移基因，电穿孔转移基因，和用含由目的核苷酸序列组成的载体的土壤杆菌介导的基因转移。在一个实施方案中，通过任何一种在Stomp等人的美国专利6,040,498中公开的土壤杆菌介导的方法获得稳定转化的浮萍。使用的土壤杆菌为根癌土壤杆菌或者发根土壤杆菌。
优选使用这些方法稳定转化的浮萍植物表现正常的形态，并可通过有性生殖增殖。优选的，本发明转化的植物含有单拷贝转化的核酸，以及转化的核酸中间没有明显的重排。也优选在浮萍中转化的核酸以低拷贝数存在(即，每个转化的细胞内核酸不超过5个拷贝，或者，不超过3个拷贝，进一步作为选择，核酸少于3个拷贝)。
稳定转化的浮萍表达生物活性蛋白激素，生长因子，或者细胞因子，胰岛素，或者生长激素(尤其是人生长激素)。或者，浮萍表达生物活性β-葡糖醛酸糖苷酶。浮萍可以表达生物活性的α-2b-干扰素，例如人α-2b-干扰素前体(NCBI蛋白质编号AAB59402；SEQ IDNO4所列)或者成熟的人α-2b-干扰素(NCBI蛋白质编号AAB9402第24-188位氨基酸；SEQ ID NO5所列)或者其生物活性变体。
人的α-2b-干扰素“生物活性变体”是指通过在天然蛋白的N-末端和/或C-末端删除(也称为截短)或增加一个或者几个核苷酸；在天然蛋白的一个或者多个位点删除或者增加一个或者多个氨基酸；或在天然蛋白的一个或者多个位点替换一个或者多个氨基酸而从天然多肽衍生的得到的多肽。本发明包括的生物活性变体α-2b-干扰素多肽具有生物活性，即，它们继续拥有所需的天然α-2b-干扰素生物活性，包括增加对病毒感染抗性的能力，调节受α-2b-干扰素调节的靶基因转录的能力。如基因多态性或者人为操作可产生这种生物活性变体。本发明的天然α-2b-干扰素的生物活性变体和SEQ ID NO4或者SEQ ID NO5显示的氨基酸序列至少具有50％，60％，65％，70％，一般至少为约75％，80％，85％，优选地至少为约90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，更加优选至少约98％，99％或者更高的序列一致性。这样，本发明的α-2b-干扰素的生物活性变体和该蛋白的区别小至1-15个氨基酸残基，小至1-10个氨基酸残基，如6-10个，小至5个，小至4个，3个，2个，甚至一个氨基酸残基。人α-干扰素的生物活性变体在本领域是已知的。见例如，欧洲专利EP211148B1，和美国专利 4,748,233，4,801,685，4,816,566，4,973,479，4,975,276，5,089,400，5,098,703，5,231,176，和5,869,293；此处引入作为参考。
序列的比较和一致性百分比的确定以及两种序列的相似性百分比的确定可通过数学运算法则得到。在优选的实施方案中，使用Needleman和Wunsch(1970)J.Mol.Biol.45444-453运算法则确定两个氨基酸序列间的一致性百分比，在GCG软件包(网站www.accelrys.com可下载)的GAP程序包含该法则，或者使用BLOSSUM62矩阵或者PAM250矩阵，并且16，14，12，10，8，6，或者4的缺口重量(gap weight)以及1，2，3，4，5，或者6的长度重量(length weight)。在另外一个优选的实施方案中，两个核苷酸序列的一致性百分比用GCG软件包中的GAP程序来确定，使用BLOSUM62记分(scoring)矩阵(见Henikoff等人(1989)Proc.Nati Acad Sci.USA 8910915)以及缺口重量为40，50，60，70，或者80及长度重量的1，2，3，4，5，或者6。特别优选的一套参数(而且也是当技术人员不能确定应该选择哪些参数来确定分子是否在本发明的序列一致性限制范围之内时使用的参数)是使用BLOSUM62记分矩阵，以缺口长重量为60以及长度重量为3)。
氨基酸或者核苷酸序列的一致性百分比还可以通过E.Meyers和W.Miller(1989)CABIOS 411-17的法则来确定。该法则包含在ALIGN程序中(版本2.0)，使用PAM120重量残基(weight residue)表，缺口长度罚分(penalty)为12和缺口罚分为4。
在一个实施方案中，稳定转化的浮萍或者浮萍节结培养物表达由于受到成本或者合理性或者这两者共同的限制，现存的基因表达系统不能有效地进行商业生产的生物活性多肽。例如，由于蛋白在哺乳动物细胞内干扰细胞生存，细胞生殖，细胞分化或者蛋白质组装，一些蛋白不能在哺乳动物系统中表达。这些蛋白包括但是并不仅限于成视网膜细胞瘤蛋白，p53，制管张素，和leptin。可以有利地应用本发明来生产哺乳动物调节蛋白；由于高等植物和哺乳动物之间具有大的进化距离这些蛋白不可能干扰浮萍中的调控过程。转基因浮萍也用来生产大量的蛋白如血清白蛋白(尤其是人血清白蛋白)，血色素，和胶原蛋白，挑战现存的表达系统的生产能力。
最终，可以改造高等植物系统，使之要比哺乳动物系统更加容易地生产生物活性多聚体蛋白(例如，单克隆抗体，血色素，P450氧化酶和胶原蛋白等等)。一种在浮萍中生产生物活性多聚体蛋白典型的方法为使用含有所有多肽亚基编码基因的表达载体。例如.During等人(1990)Plant Mol.Biol.15281和van Engelen等人(1994)Plant Mol.Biol.261701。将这种载体通过任何已知方法，例如弹道轰击或者土壤杆菌介导的转化方法引入到浮萍细胞。这种方法导致表达所有装配多聚体蛋白所必需的多肽的无性细胞系。这种方法的变化为构建单基因构建体，将这些构建体的DNA混合在一起，然后用弹道轰击或者土壤杆菌介导的转化将DNA的混合物打入植物细胞。作为进一步的改变，一些或者所有载体可以编码多聚体蛋白的一个以上的亚基(即，以便交叉的浮萍克隆要少于多聚体蛋白亚基的数量)。在另一个实施方案中，每个浮萍克隆至少表达多聚体蛋白的一个亚基，且分泌每个亚基的浮萍克隆在一起培养，由不同的分泌的亚基的在培养基中组装成多聚体蛋白。在一些情况中，需要在浮萍植物或者浮萍节结培养物中产生的亚基要少于多聚体蛋白所有的亚基，或者仅仅产生单个蛋白亚基，例如，用于工业或者化学处理或者用于诊断，治疗，或者接种疫苗目的。
实验提供以下实施例用于说明目的，而不是为了限制。
表达载体在一些实施例中使用的表达载体pBMSP-1在美国专利5,955,646中做过描述，此处引入作为参考。pBMSP-1转录盒包含来自根癌土壤杆菌章鱼碱合成酶的转录激活核苷酸序列，和额外的来自根癌土壤杆菌甘露碱合成酶基因的转录激活核苷酸序列，来自根癌土壤杆菌甘露碱合成酶基因的启动子区域，用于插入编码目的多肽的核苷酸序列的多接头位点，以及来自土壤杆菌根癌胭脂碱合成酶基因的终止序列。pBMSP-1表达载体也含有作为可选标记的编码新霉素磷酸转移酶II的核苷酸序列。选择性标记序列的转录由来自根癌土壤杆菌胭脂碱合成酶基因的启动子驱动。
也用于以下实施例的表达载体pBMSP-3含有以上所述的pBMSP-1表达载体的成分并附加含有和玉米乙醇脱氢酶基因(GenBank编号X04049)核苷酸1222-1775位相对应的核苷酸序列，该基因插于启动子和多接头之间。
用于在浮萍中生产人α-2b-干扰素的表达构建体以下表达构建体使用本领域熟知的方法构建。见例如Sambrook，J.，Fritsh，E.F.，和Maniatis，T.分子克隆实验手册第二版，冷泉港实验室，冷泉港实验室发行，冷泉港，纽约，1989。
表1
*编码经过修饰的水稻α-淀粉酶信号肽的核苷酸序列对应GenBank编号M24286的第34-126位核苷酸，只是将97-102位核苷酸从″CTTGGC″改变为″ATCGTC″。
浮萍转化使用上述的表达构建体用土壤杆菌介导的转化方法转化浮萍叶或者浮萍节结培养物(在这些实施例中来自浮萍株8627)。根癌土壤杆菌株C58Z707，一种解除毒性的(disarmed)，广泛宿主范围的C58株(Hepburn等人(1985)J.Gen.Microbiol.1312961-2969)用于这些实施例的转化。上述的表达构建体通过电穿孔或者三亲株杂交程序转移到根癌土壤杆菌，三亲株杂交程序使用含有移动(mobilizing)质粒pRK2013的大肠杆菌MM294(Hoekema等人(1983)Nature 303179-180；Ditta等人(1980)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 777347-7350)。含有上述表达构建体的C58Z707株在AB最小培养基(Chilton等人，(1974)Proc.Nat.Acad.Sci.USA 713672-3676)或者含有链霉素500mg/L，奇大观霉素50mg/L以及硫酸卡那霉素50mg/L的YEB培养基(1g/L酵母提取物，5g/L牛肉汁提取物，5g/L蛋白胨，5g/L蔗糖，0.5g/LMgSO4)上划线，并在28℃过夜培养。
尽管可以使用任何浮萍属株，但在这些实施例中使用浮萍株8627来转化。叶子在液体Schenk和Hildebrandt培养基(Schenk andHildebrandt(1972)Can.J.Bot.50199)中生长，该培养基含有1％蔗糖和10μM吲哚乙酸，培养温度23℃，光周期为光照下培养16小时/阴暗条件下培养8个小时，光强度大约为40μM/m2sec。用于接种，将单个叶子从丛中分开并漂浮在接种培养基上持续大约2-20分钟。接种培养基为Schenk和Hildebrandt培养基(pH5.6)，附加0.6M甘露醇和100μM乙酰基丁香酮，适当的根癌土壤杆菌株包含表达构建体的浓度为1×109细胞/毫升。然后将这些叶子转移到含有1％蔗糖，0.9％琼脂以及20mg/L乙酰丁香酮的Schenk和Hildebrandt培养基(pH5.6)并在23℃于阴暗处共培养3-4天。
共培养之后，转移叶子到Schenk和Hildebrandt培养基或者附加200μg/ml硫酸卡那霉素的Murashige和Skoog培养基(Murashige和Skoog(1962)Physiol.Plant.15473)用以回收。每隔2-4天将感染的组织转移到含有抗生素的新鲜的培养基中来去除叶子感染土壤杆菌的污染。叶子在低光强(1-5μM/m2sec)的条件下在该培养基上培养大约4周。
用于转化的浮萍节结培养物生产如下。分离浮萍叶子，用无菌手术刀切去根，将叶子腹侧面朝下置于附加5μM2，4-二氯苯氧基乙酸，0.5μM 1-苯基-3(1，2，3-thiadiazol-5-基)脲thidiazuron(SigmaP6186)，3％蔗糖，0.4 Difco Bacto-琼脂(Fisher Scientific)，和0.15％ Gelrite(Sigma)的Murashige和Skoog培养基中(目录号M-5519；Sigma化学公司，St.Louis，MO)pH5.6。叶子生长5-6周。此时，节结(小的微黄色细胞团)出现，通常从腹侧中心部分出现。将节结组织从母叶中分离并在附加3％蔗糖，0.4％ DifcoBacto-琼脂，0.15％ Gelrite，1μM2，4-二氯苯氧基乙酸，和2μM苄基腺嘌呤的Murashige和Skoog培养基中进行培养。
浮萍节结培养物转化如下。合适的根癌土壤杆菌株在马铃薯葡萄糖琼脂或者含有50mg/L卡那霉素和100μM乙酰丁香酮的YEB琼脂上生长，并在附加0.6M甘露醇和and 100μM乙酰丁香酮的Murashige和Skoog培养基中重悬。通过将重悬的细菌浸入溶液1-2分钟，移去剩余的液体，并铺于共培养培养基中来接种节结培养组织，该培养基含有Murashige和Skoog培养基并附加植物生长素和优化的促进节结生长细胞分裂素和100μM乙酰丁香酮。
用于选择，将节结培养物组织转移到再生培养基Murashige和Skoog培养基含有3％蔗糖，1μM2，4-二氯苯氧基乙酸，2μM苄基腺嘌呤，0.4％ Difco Bacto-琼脂，0.15％ Gelrite，500mg/L头孢氨噻，和200mg/L硫酸卡那霉素，并在连续光照(20-40μM/m2sec)下培养大约4周。每7天将结节组织转移到新鲜培养基中。当结节组织在筛选剂中生长旺盛时，筛选结束。在某些实施例中，直接将转化的浮萍结节组织培养物转移到用于筛选的再生培养基中，而不是在共培养培养基中进行筛选。
对于转化浮萍的再生，将筛选得到的结节培养物转移到再生培养基(0.5×Schenk和Hildebrandt培养基添加1％的蔗糖和200mgs/L的卡那霉素)中组织并产生植物。结节培养物在再生培养基上以充足的光照孵育约3周时间，直到叶出现。将充分组织好的叶转移到加有1-3％蔗糖的液体Schenk和Hildebrandt培养基中并在充足的光照下孵化进行克隆增殖。
检测由浮萍叶或者浮萍结节培养物产生的生物活性干扰素利用多种分析方法检测生物活性干扰素，包括Staehlin等人(1981年)酶学方法(Methods Enzymol.)79589-594和Kelder等人(1986年)酶学方法(Methods Enzymol.)119582-587，描述的固相夹心式免疫实验，此处引入作为参考，以及Tovey等人(1978年)自然(Nature)276270-272所描述的细胞病变作用抑制实验(cytopathic effect inhibition assay)，此处引入作为参考。从浮萍培养基中收集分泌型干扰素，从浮萍植物或者浮萍结节组织的研磨或者裂解物中收集非分泌型干扰素。
根据生产商的使用说明使用PBL实验室(New Brunswick，新泽西州)的试剂盒进行干扰素的固相夹心式免疫分析。简而言之，干扰素被结合在微量滴定板孔中的抗体捕获。接着用二抗显示结合的抗体。然后使用结合有辣根过氧化物酶(HRP)的抗二抗标记干扰素。四甲基对二氨基联苯(TMB)启动过氧化物酶催化的颜色变化以便可以观察干扰素的水平并与标准比较。在本实施例中使用对α-2b-干扰素特异的单克隆抗体(目录号11105，PBI实验室)进行此项分析。
按照Tovey等人(1978年)自然(Nature)276270-272的方法进行细胞病变作用抑制分析。简而言之，将待分析的样品的连续两倍稀释样用100微升添加2％的胎牛血清的Eagles基本培养基(Life Technologies公司)稀释到96孔微量滴定板(Falcon公司)中，使用美国国家卫生研究院人IFNα国际参考样品(G-002-901-527)的连续两倍稀释样进行平行实验。然后，在包含100微升有2％的胎牛血清的培养基的微量滴定板的每个空中加入2万个人羊膜细胞(WISH系)。将细胞在5％CO2和37℃的条件下培养过夜，用200微升有2％的胎牛血清并且含有感染复制指数为0.1的水泡性口炎病毒的培养基换液。将细胞进一步在5％CO2和37℃的条件下培养过夜，然后在光学显微镜下估计由于病毒复制的细胞病变作用。干扰素的滴度表示为能够对病毒的细胞病变作用提供50％的保护的IFN的稀释度的倒数。通过参考参照样品的滴度，干扰素的滴度用国际参考单位的形式表示。
如下实施例说明在浮萍中表达生物活性干扰素。
实施例1进行这一研究旨在确定同一批培养物中在不同时间点存在于培养基和组织中的培养的IFN的水平。第0天在一套24至30毫升175盎司的培养瓶中接种20片同一品系经先预鉴定为表达可检测水平的人α-2b-干扰素(IFN)的叶。培养物在自给营养，缓冲环境中生长并且由植物/水生物荧光生长灯泡提供连续的强光。在每一时间点-第5、7、13、15和18天-测量四个培养物的鲜重和培养基体积。对于每一培养物，取其培养基和组织样品并且加入植物蛋白酶抑制剂混合物。将组织样品研磨并且冷冻离心。收集上清液。培养基和组织提取物保存在零下70℃直到准备好所有的样品。在同一天使用上述固相夹心式免疫实验测定培养基和组织提取物中的IFN的水平。将测量的IFN的浓度分别乘以培养基的体积和培养物的鲜重计算培养基和组织中培养的IFN的总量。图1表示了在第7、13、15和18天与第5天相比的相对IFN水平。在最后一个时间点，由于失去一个培养物，所表示的是三个培养物的平均值而不是四个培养物的平均值。
实施例2进行这一研究旨在确定同一批培养物中在不同时间点存在于培养基和组织中的培养IFN的水平。第0天在一套24至30毫升175盎司的培养瓶中接种20片同实施例1中同一品系的叶。培养物在自给营养，非缓冲液环境中生长并且由植物/水生物荧光生长灯泡提供连续的强光。在每一时间点-第7、10、12、14、17和19天-测量四个培养物的鲜重和培养基体积。对于每一培养物，取其培养基和组织样品并且加入一植物蛋白酶抑制剂混合物。将组织样品研磨并且冷冻离心。收集上清液。培养基和组织提取物保存在零下70℃直到准备好所有的样品。在同一天使用上述固相夹心式免疫实验测定培养基和组织提取物中的IFN的水平。将测量的IFN的浓度分别乘以培养基的体积和培养物的鲜重计算培养基和组织中培养IFN的总量。图2表示了在第14、17和19天与第12天相比的相对IFN水平。在第7天和第10天培养基中的IFN水平低于进行免疫实验流程的延伸范围的范围。
实施例3表1中所列表达载体转化的浮萍用上述方法产生。转化的浮萍系在自给营养的条件下生长14天。生长培养基中包括浓度为0.2毫克/毫升的牛血清白蛋白。在第14天，如实施例1中所述准备培养基和组织提取物，并用上述的固相夹心式免疫实验方法测定这些提取物中干扰素的水平。
表2给出了所分析的克隆浮萍系的数量和每个表达载体的平均培养基干扰素浓度。表3表示了对于经不含信号肽的干扰素表达载体(IFN01，IFN10和IFN12)转化的浮萍系，在其组织中干扰素的水平。并且表示了所分析的全部克隆品系对指定构建体的平均干扰素水平，以及最高表达品系的干扰素水平。
表2
表3
这些转化的浮萍系生产的干扰素的生物活性使用上述细胞病变作用实验方法检测。表4给出了每个构建体的高表达系的结果。并且表明了那些包含信号肽的构建体的培养基中的干扰素的活性和那些无信号肽的构建体在组织中的干扰素的活性。
表4
由此实施例中的数据可以注意到如下特征(1)仅在转化有包含信号肽的表达构建体的浮萍系中检测到干扰素的分泌。例如，将IFN02，IFN03，IFN05，IFN07，IFN08，IFN09和IFN011培养基中的干扰素浓度与IFN01，IFN10，和IFN12的相比较。(2)对于所有包含信号肽的表达构建体，均检测到干扰素的分泌，而加入天然的人干扰素信号肽序列的产生最高水平的分泌型干扰素。例如，将IFN02产生的干扰素水平与IFN03和IFN05产生的那些相比较。(3)使用浮萍优选的密码子可以增强干扰素的表达。例如，将IFN09产生的干扰素水平与IFN05产生的相比较。(4)不仅仅对信号肽优化密码子获得更高的表达水平。例如，比较IFN08和IFN09。(5)包含玉米乙醇脱氢酶的内含子序列的表达构建体可以产生更高水平的干扰素表达。例如，比较IFN09和IFN11，及IFN10和IFN12。(6)比较包含修饰的α-淀粉酶信号肽(IFN05)与含有野生型α-淀粉酶信号肽(IFN07)构建体的干扰素表达水平，没有观察到统计学显著的差异。
在说明书中提及的所有的出版物和专利申请资料指示本发明相关领域技术人员的水平。所有出版物和专利申请资料在此引入作为参考，程度等同于特定并单独指出每份单独出版物或者专利申请资料在此引入作为参考。
为了清楚的理解尽管前述发明通过图例和实施例在某些细节上做过描述，但是在附加的权利要求范围内进行某些改变和修饰是显而易见的。
序列表<110>Biolex，Inc.
Stomp，Anne-MarieDickey.LynnGasdaska，John<120>在浮萍中表达生物活性多肽<130>40989/237187<150>US 60/293,330<151>2001-05-23<150>US 60/221,705<151>2000-07-31<160>8<170>FastSEQ for Windows Version 4.0<210>1<211>554<212>DNA<213>玉蜀黍<400>1gatcaagtgc aaaggtccgc cttgtttctc ctctgtctct tgatctgact aatcttggtt 60tatgattcgt tgagtaattt tggggaaagc ttcgtccaca gttttttttt cgatgaacag 120tgccgcagtg gcgctgatct tgtatgctat cctgcaatcg tggtgaactt atgtctttta 180tatccttcac taccatgaaa agactagtaa tctttctcga tgtaacatcg tccagcactg 240ctattaccgt gtggtccatc cgacagtctg gctgaacaca tcatacgata ttgagcaaag 300atctatcttc cctgttcttt aatgaaagac gtcattttca tcagtatgat ctaagaatgt 360tgcaacttgc aaggaggcgt ttctttcttt gaatttaact aactcgttga gtggccctgt 420ttctcggacg taaggccttt gctgctccac acatgtccat tcgaatttta ccgtgtttag 480caagggcgaa aagtttgcat cttgatgatt tagcttgact atgcgattgc tttcctggac 540ccgtgcagct gcgg 554<210>2<214>98<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>由浮萍密码子优化的人a-2B-干扰素的核苷酸编码序列<221>CDS<222>(1)...(498)<400>2tgc gac ctc ccc cag acc cac agc ctc ggg tcc cgc cgc acc ctc atg 48Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Gly Ser Arg Arg Thr Leu Met1 5 10 15ctg ctg gcg cag atg cgc cgc atc tcg ctc ttc agc tgc ctg aag gac 96Leu Leu Ala Gln Met Arg Arg Ile Ser Leu Phe Ser Cys Leu Lys Asp20 25 30cgc cac gac ttc ggc ttc ccg cag gag gag ttc ggc aac cag ttc cag 144Arg His Asp Phe Gly Phe Pro Gln Glu Glu Phe Gly Asn Gln Phe Gln35 40 45aag gcc gag acg atc ccc gtg ctc cac gag atg atc cag cag atc ttc 192Lys Ala Glu Thr Ile Pro Val Leu His Glu Met Ile Gln Gln Ile Phe50 55 60aac ctg ttc agc acc aag gac agc tcg gcc gcc tgg gac gag acc ctg 240Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asp Ser Ser Ala Ala Trp Asp Glu Thr Leu65 70 75 80ctc gac aag ttc tac acc gag ctg tac cag cag ctc aac gac ctg gag 288Leu Asp Lys Phe Tyr Thr Glu Leu Tyr Gln Gln Leu Asn Asp Leu Glu85 90 95gcg tgc gtg atc cag ggg gtt ggg gtt acg gag acg ecg ctg atg aag 336Ala Cys Val Ile Gln Gly Val Gly Val Thr Glu Thr Pro Leu Met Lys100 105 110gag gac agc atc ctc gcc gtg cgc aag tac ttc cag cgc atc acg ctc 384Glu Asp Ser Ile Leu Ala Val Arg Lys Tyr Phe Gln Arg Ile Thr Leu115 120 125tac ctc aag gag aag aag tac agc ccg tgc gcc tgg gag gtc gtt cgc 432Tyr Leu Lys Glu Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val Val Arg130 135 140
gcc gag atc atg cgc tcc ttc agc ctg agc acc aac ctc cag gag agc480Ala Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser Leu Ser Thr Asn Leu Gln Glu Ser145 150 155 160ctc cgc tcc aag gag taa498Leu Arg Ser Lys Glu *165<210>3<211>96<212>DNA<213>稻<400>3accatgcagg tcctgaacac gatggtcaac aagcacttcc tctccctgtc cgtcctcatc60gtcctcctcg ggctgagcag caacctcacc gccggc 96<210>4<211>188<212>PRT<213>人<400>4Met Ala Leu Thr Phe Ala Leu Leu Val Ala Leu Leu Val Leu Ser Cys1 5 10 15Lys Ser Ser Cys Ser Val Gly Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu20 25 30Gly Ser Arg Arg Thr Leu Met Leu Leu Ala Gln Met Arg Arg Ile Ser35 40 45Leu Phe Ser Cys Leu Lys Asp Arg His Asp Phe Gly Phe Pro Gln Glu50 55 60Glu Phe Gly Asn Gln Phe Gln Lys Ala Glu Thr Ile Pro Val Leu His65 70 75 80Glu Met Ile Gln Gln Ile Phe Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asp Ser Ser85 90 95Ala Ala Trp Asp Glu Thr Leu Leu Asp Lys Phe Tyr Thr Glu Leu Tyr100 105 110Gln Gln Leu Asn Asp Leu Glu Ala Cys Val Ile Gln Gly Val Gly Val115 120 125Thr Glu Thr Pro Leu Met Lys Glu Asp Ser Ile Leu Ala Val Arg Lys130 135 140Tyr Phe Gln Arg Ile Thr Leu Tyr Leu Lys Glu Lys Lys Tyr Ser Pro145 150 155 160
Cys Ala Trp Glu Val Val Arg Ala Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser Leu165 170 175Ser Thr Asn Leu Gln Glu Ser Leu Arg Ser Lys Glu180 185<210>5<211>165<212>PRT<213>人<400>5Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Gly Ser Arg Arg Thr Leu Met1 5 10 15Leu Leu Ala Gln Met Arg Arg Ile Ser Leu Phe Ser Cys Leu Lys Asp20 25 30Arg His Asp Phe Gly Phe Pro Gln Glu Glu Phe Gly Asn Gln Phe Gln35 40 45Lys Ala Glu Thr Ile Pro Val Leu His Glu Met Ile Gln Gln Ile Phe50 55 60Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asp Ser Ser Ala Ala Trp Asp Glu Thr Leu65 70 75 80Leu Asp Lys Phe Tyr Thr Glu Leu Tyr Gln Gln Leu Asn Asp Leu Glu85 90 95Ala Cys Val Ile Gln Gly Val Gly Val Thr Glu Thr Pro Leu Met Lys100 105 110Glu Asp Ser Ile Leu Ala Val Arg Lys Tyr Phe Gln Arg Ile Thr Leu115 120 125Tyr Leu Lys Glu Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val Val Arg130 135 140A1a Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser Leu Ser Thr Asn Leu Gln Glu Ser145 150 155 160Leu Arg Ser Lys Glu165<210>6<211>31<212>PRT<213>稻<400>6Met Gln Val Leu Asn Thr Met Val Asn Lys His Phe Leu Ser Leu Ser1 5 10 15
Val Leu Ile Val Leu Leu Gly Leu Ser Ser Asn Leu Thr Ala Gly20 25 30<210>7<211>31<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>改造的水稻a-淀粉酶信号肽<400>7Met Gln Val Leu Asn Thr Met Val Asn Lys His Phe Leu Ser Leu Ser1 5 10 15Val Leu Ile Val Leu Thr Val Leu Ser Ser Asn Leu Thr Ala Gly20 25 30<210>8<211>21<212>PRT<213>拟南芥<400>8Met Lys Thr Asn Leu Phe Leu Phe Leu Ile Phe Ser Leu Leu Leu Ser1 5 10 15Leu Ser Ser Ala Glu20
权利要求
1.在浮萍植物培养物或者浮萍节结培养物中生产生物活性重组多肽的方法，其包括以下步骤(a)在浮萍培养基中培养浮萍植物培养物或者浮萍节结培养物，其中该浮萍植物培养物或者该浮萍节结培养物被稳定转化以表达所述的生物活性重组多肽，且其中生物活性重组多肽由含有多肽编码序列和操作性连接的指导多肽分泌入培养基的信号肽的编码序列的核苷酸序列表达。(b)从浮萍培养基收集所述生物活性多肽。
2.权利要求1的方法，其中生物活性多肽分泌到浮萍培养基中。
3.权利要求1的方法，其中核苷酸序列有至少一种特征选自(a)该多肽的编码序列中有浮萍优选的密码子；(b)该信号肽的编码序列中有浮萍优选的密码子；(c)翻译起始密码子两侧为植物优选的翻译起始背景核苷酸序列；以及(d)操作性连接的核苷酸序列含有插入编码序列上游的植物内含子。
4.根据权利要求3的方法，其中所述浮萍优选密码子为Lemnagibba-优选的密码子或者浮萍(Lemna minor)-优选的密码子。
5.根据权利要求4的方法，其中选自所述多肽编码序列和所述信号肽编码序列的至少一种编码序列含有70％-100％的Lemnagibba-优选的密码子或者浮萍-优选的密码子。
6.根据权利要求3的方法，其中所述植物优选的翻译起始背景的核苷酸序列由核苷酸序列“ACC”或者“ACA”组成，其中该背景定位紧接着翻译起始密码子5′末端。
7.根据权利要求3的方法，其中包含所述植物内含子的操作性连接的核苷酸序列为SEQ ID NO1所列序列。
8.生产生物活性重组多肽的方法，包括以下步骤(a)培养浮萍植物培养物或者浮萍节结培养物，其中该浮萍植物培养物或者该浮萍节结培养物被稳定转化以表达所述生物活性重组多肽，且其中生物活性重组多肽由核苷酸序列编码，该核苷酸序列经过修饰而提高其在浮萍中的表达，以及(b)从所述浮萍植物培养物或者浮萍节结培养物收集生物活性多肽。
9.权利要求8的方法，其中经过修饰以提高其在浮萍中表达的核苷酸序列有至少一种特征选自(a)该生物活性重组多肽的编码序列中有浮萍优选的密码子；(b)翻译起始密码子两侧为植物优选的翻译起始背景核苷酸序列；以及(c)操作性连接的核苷酸序列包含被插入编码序列上游的植物内含子。
10.根据权利要求9的方法，其中该浮萍优选密码子为Lemnagibba-优选的密码子或者浮萍优选的密码子。
11.根据权利要求10的方法，其中编码序列含有70％-100％的Lemna gibba-优选的密码子或者浮萍-优选的密码子。
12.根据权利要求9的方法，其中所述植物优选的翻译起始背景核苷酸序列由核苷酸序列“ACC”或者“ACA”组成，其中背景定位紧接着翻译起始密码子5′末端。
13.根据权利要求9的方法，其中包含所述植物内含子的操作性连接的核苷酸序列为SEQ ID NO1所列序列。
14.根据权利要求1的方法，其中该浮萍叶培养物或者浮萍节结培养物表达并装配生物活性多聚蛋白所有的亚基。
15.根据权利要求14的方法，其中该生物活性多聚蛋白选自胶原蛋白，血色素，P450氧化酶，以及单克隆抗体。
16.根据权利要求1的方法，其中生物活性重组多肽为哺乳动物多肽。
17.根据权利要求16的方法，其中哺乳动物多肽为治疗多肽。
18.根据权利要求16的方法，其中哺乳动物多肽选自胰岛素，生长激素，α-干扰素，β-干扰素，β-葡糖脑苷脂酶，β-glucoronidase，成视网膜细胞瘤蛋白，p53蛋白，制管张素，leptin，单克隆抗体，细胞因子，受体，人用疫苗，动物疫苗，植物多肽，和血清白蛋白。
19.根据权利要求1的方法，其中生物活性重组多肽为α-2b-干扰素。
20.根据权利要求19的方法，其中所述α-2b-干扰素为人α-2b-干扰素。
21.根据权利要求20的方法，其中所述人α-2b-干扰具有SEQID NO4或者SEQ ID NO5所列素氨基酸序列。
22.根据权利要求1的方法，其中生物活性重组多肽为α-2b-干扰素的生物活性变体，其中所述生物活性变体和SEQ ID NO4或者SEQ ID NO5有至少80％的序列一致性。
23.根据权利要求1的方法，其中生物活性重组多肽为酶。
24.根据权利要求1的方法，其中所述信号肽序列选自(a)人α-2b-干扰素信号肽；(b)拟南芥壳多糖酶信号肽；(c)水稻α-淀粉酶信号肽；(d)修饰的水稻α-淀粉酶肽；(e)浮萍信号肽；以及(f)生物活性重组多肽的本身的信号肽。
25.根据权利要求24的方法，其中信号肽为具有SEQ ID NO3所列序列的水稻α-淀粉酶的信号肽。
26.根据权利要求1的稳定转化的浮萍植物培养物或者浮萍节结培养物。
27.根据权利要求26的稳定转化的浮萍植物培养物或者浮萍节结培养物，其中该浮萍植物培养物或者浮萍节结培养物选自紫萍属，芜萍属，Wolfiella属和浮萍属。
28.根据权利要求27的稳定转化的浮萍植物培养物或者浮萍节结培养物，其中该浮萍植物培养物和浮萍节结培养物选自浮萍，Lemnaminiscula，Lemna aequinoctialis和Lemna gibba。
29.核酸分子，其包括编码选自以下氨基酸序列的核苷酸序列(a)SEQ ID NO4所列氨基酸序列；(b)SEQ ID NO5所列氨基酸序列；(c)SEQ IN NO4所示氨基酸序列的生物活性变体的氨基酸序列，其中该生物活性变体和SEQ ID NO4所列序列具有至少约80％的序列一致性；以及(d)SEQ IN NO5所示氨基酸序列的生物活性变体的氨基酸序列，其中该生物活性变体和SEQ ID NO5所列序列具有至少约80％的序列一致性；其中该核苷酸序列包含浮萍优选的密码子。
30.权利要求29的核酸分子，其中该核苷酸序列为SEQ ID NO2所列核苷酸序列。
31.核苷酸分子，其包括编码选自以下信号肽的核苷酸序列(a)SEQ ID NO6所列的水稻α-淀粉酶信号肽的氨基酸序列；以及(b)SEQ ID NO7所列的修饰的水稻-淀粉酶信号肽的氨基酸序列；其中该核苷酸序列包含浮萍优选的密码子。
32.权利要求31的核酸分子，其中该核苷酸序列为SEQ ID NO3所列核苷酸序列。
33.权利要求29的核酸分子，其中该核酸分子包括SEQ ID NO5所列核苷酸序列并进一步包括SEQ ID NO3给出的编码信号肽的核苷酸序列且SEQ ID NO5所述的核苷酸序列和SEQ ID NO3给出的该编码信号肽的核苷酸序列操作性相连接。
34.权利要求33的核酸分子，额外包括SEQ ID NO1给出的包含内含子的核苷酸序列，其中所述含有内含子的核苷酸序列，所述编码信号肽的核苷酸序列和所述编码成熟的人α-2b-干扰素的核苷酸序列操作性相连接。
全文摘要
本发明提供用于从遗传改造的浮萍表达和分泌生物活性多肽的方法，核酸序列和转化的浮萍植物或者浮萍节结的培养物。通过修饰编码多肽的表达盒的核苷酸序列来提高在浮萍中的表达，改进重组多肽在浮萍中的表达。通过将生物活性多肽连接到指导多肽向培养基分泌的信号肽改善从浮萍中回收生物活性多肽。
文档编号C12N15/67GK1840667SQ20061005968
公开日2006年10月4日 申请日期2001年7月26日 优先权日2000年7月31日
发明者A-M·斯汤普, L·迪奇, J·加斯达斯卡 申请人:比奥莱克斯公司