专利名称：与油脂代谢调控相关的转录因子GmDofC及其编码基因与应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及植物转录因子及其编码基因与应用，特别是涉及一个来源于大豆的与油脂代谢调控相关的转录因子GmDofC及其编码基因与其在调控植物油脂成份中的应用。
背景技术：
人类饮食中71％的油脂来自于植物。在世界上的几种主要产油作物中，大豆总产油量约占30％，居世界植物油产量的第一位，棕榈油及油菜子油分别位居第二及第三(如表1所示)。
表1世界上主要的产油作物
脂肪酸的合成是植物体中最重要的代谢途径之一，它存在于植物体的任何一个细胞中，是生长发育所必须的。对它的阻断会导致细胞的死亡，因而至今为止还没有发现一个阻断脂肪酸合成的植物突变体。
植物中脂肪酸的合成主要是在质体中进行，而动物及真菌的脂肪酸合成发生于胞质。因此植物需要存在一种不同于动物及真菌的机制—从质体运出脂肪酸到细胞的其它部位。从而推断在细胞中必定存在脂肪酸生产和运输的控制机制，但是迄今尚不清楚在脂肪酸的合成中质体内外是如何联系的。
植物同其它真核生物在参与脂肪酸合成途径的酶上有很大差异。从乙酰CoA和丙二酰CoA合成16或18个碳原子的脂肪酸至少需要30个不同的酶催化的反应来完成这一过程，而在动物、真菌及一些细菌中，以上反应是由一个存在于胞质中的多酶复合体来完成的。植物中，参加脂肪酸合成的酶分别以可溶的形式独立存在于质体的胞质中。尽管植物中参与脂肪代谢的酶很容易被分离，但问题是这些酶是否在体内也可形成一个多酶复合体。
脂肪酸合成途径中最重要的碳源是由ACCase合成的丙二酰CoA，在进入脂肪酸合成途径之前，丙二酰由CoA转移到酰基载体蛋白(ACP)上，从此脂肪酸合成都需要ACP的参与，直到形成16或18个碳原子的脂肪酸，并被用于合成甘油或被运出质体。ACP是一个分子量为9KD的酸性蛋白，它具有一个可以通过硫酯化结合乙酰基的基团。当丙二酰由CoA转移到ACP后，硫酯化的丙二酰由CoA进行一系列的聚合反应，接受乙酰ACP或乙酰CoA的乙酰基团。这一聚合反应是通过释放一个CO2分子来形成一个C-C键，CO2的释放使这一反应变得不可逆，从而使聚合反应不断进行。
大多数植物中，油脂都以三酰甘油(Triacylglycerols，TAG)的形式储藏，它的含量是一个非常重要的农艺性状，TAG的生物合成称之为Kennedy途径，如同真核生物中合成膜甘油酯的途径，脂肪酸去除CoA后被转移到3-磷酸甘油的1和2位，形成中间产物PA。PA去磷酸化产生DAG。在TAG合成的最后一步，第三个脂肪酸分子被转移到空的DAG 3’-OH位置，这一步反应是由二酰甘油乙酰转移酶(diacylglycerolacyltransferase，DGAT)催化的，此反应被认为是TAG生物合成中唯一的限速步骤。
人们已对脂类合成途径有了认知，并且已经克隆了很多参与脂类合成的酶基因。然而，对脂类合成的调控机理及其相关基因仍然知之甚少。
启动子是基因的编码区前面的一段DNA序列，它保持转录精确而有效地起始。真核生物的启动子除了含有TATA盒、CAAT盒、GC盒外，还有一些特定的作用元件通过与转录因子相互作用调控基因表达的时空特异性。分析这些反式作用元件有助于初步推测一个基因可能的调控基因。
发明内容
本发明的目的是提供大豆中一个与油脂代谢调控相关的转录因子。
本发明所提供的与油脂代谢调控相关的转录因子，名称为GmDofC，来源于大豆属大豆(Glycine max(L.)Merrill)，是具有下述氨基酸残基序列之一的蛋白质1)序列表中的SEQ ID №1；2)将序列表中SEQ ID №1的氨基酸残基序列经过一至十个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有转录激活功能的调控植物油脂代谢的蛋白质。
序列表中的SEQ ID №1由285个氨基酸残基组成，自氨基端(N端)第30-79位氨基酸残基为Dof结构域。
编码大豆中与油脂代谢调控相关转录因子GmDofC的基因(GmDofC)，是下述核苷酸序列之一1)序列表中SEQ ID №2的DNA序列；2)编码序列表中SEQ ID №1的DNA序列；3)在高严谨条件下可与序列表中SEQ ID №2限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。
所述高严谨条件为在6×SSC或(6×SSPE)，0.1％SDS，2×Denhardt溶液中，65℃条件下杂交；在0.1×SSC，0.1％SDS溶液中，65℃条件下洗膜。
序列表中的SEQ ID №2由1369个碱基组成，其编码序列为自5’端第214-1071位碱基，编码具有序列表中SEQ ID №1的氨基酸残基序列的蛋白质，自5’端第301位到第450位碱基编码Dof结构域，自5’端第1072位到第1369位碱基为3’端非翻译区。
含有本发明基因的表达载体、转基因细胞系和宿主菌均属于本发明的保护范围。
扩增GmDofC中任一片段的引物对也在本发明的保护范围之内。
本发明的另一个目的是提供一种调控植物中，特别是植物种子中油脂成份的方法。
本发明所提供的调控植物油脂成份的方法，是将所述与油脂代谢调控相关转录因子基因GmDofC导入植物组织或细胞，植物中的油脂成份得到调控。
所述与油脂代谢调控相关转录因子基因GmDofC可通过含有所述与油脂代谢调控相关转录因子基因GmDofC的植物表达载体导入外植体；用于构建所述植物表达载体的出发载体可为任意一种双元农杆菌载体或可用于植物微弹轰击的载体等，如pBin438、pCAMBIA1302、pCAMBIA2301、pCAMBIA1301、pCAMBIA1300、pBI121、pCAMBIA1391-Xa或pCAMBIA1391-Kb(CAMBIA公司)。
使用GmDofC构建植物表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型、组成型、组织特异型或诱导型启动子，如花椰菜花叶病毒(CAMV)35S启动子、泛生素基因Ubiquitin启动子(pUbi)等，它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用；此外，使用本发明的基因构建植物表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。
为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因(GUS基因、萤光素酶基因等)、具有抗性的抗生素标记物(庆大霉素标记物、卡那霉素标记物等)或是抗化学试剂标记基因(如抗除莠剂基因)等。从转基因植物的安全性考虑，可不加任何选择性标记基因，直接以逆境筛选转化植株。
以pBin438为出发载体，构建的含有所述与油脂代谢调控相关转录因子基因GmDofC的植物表达载体为pBin438-GmDofC。
携带有本发明GmDofC的植物表达载体可通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化植物细胞或组织，并将转化的植物细胞或组织培育成植株。被转化的植物宿主既可以是单子叶植物，如水稻、小麦、玉米等，也可以是双子叶植物，如大豆、烟草、拟南芥或棉花等。
本发明提供了大豆中的一个与油脂代谢调控相关的转录因子GmDofC及其编码基因。转基因实验表明GmDofC是可以影响油脂含量这一性状的多基因之一，GmDofC的活性高低同大豆含油量、油脂积累速率成正相关。该基因的克隆及功能鉴定对提高和改良作物油脂成份、特别是对于提高大豆油脂成份，培育高油脂大豆品种具有重要的理论和现实意义。
下面结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。
图1为GmDGAT基因部分启动子序列的序列分析结果图2为GmDofC基因在叶、花及开花20天豆荚中的表达特征RT-PCR分析结果图3为pBin438-GmDofC的部分物理图谱图4为GmDofC转基因拟南芥植株的RT-PCR鉴定结果图5为GmDofC转基因拟南芥与野生型拟南芥种子中油脂含量的比较结果具体实施方式
下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法，所用引物均由上海生工合成。
实施例1、大豆与油脂代谢调控相关的转录因子GmDofC编码基因的筛选及其cDNA的克隆一、Dof家族与油脂代谢调控的相关性分析根据已知的GmDGAT的cDNA序列(参见本发明人申请的专利号为200410049633.8的专利)的5’端设计一对嵌套引物，引物序列如下GmDGAT GP1(上游引物)5’-CAGTGGCTACAGTTTCAGGCTCATC-3’；GmDGAT GP2(下游引物)5’-CGCAGGGAAGAGTGGTTGAGAG-3’提取大豆品种8904的基因组DNA，然后用限制性内切酶EcoR I、Hind III、PstI和BamH I对其进行酶切，将酶切产物与TaKaRa公司的VITRO-PCR试剂盒中的相应接头连接，以此连接产物为模板，在特异引物GmDGAT GP1和通用引物primer C1(5’-GTACATATTGTCGTTAGAACGCGTAATACGACTCA-3’)的引导下进行第一次扩增，然后将产物稀释50倍并以此为模板，在特异引物GmDGAT GP2和通用引物primer C2(5’-CGTTAGAACGTAATACGACTCACTATAGGGAGA-3’)的引导下进行第二次扩增，PCR扩增结束后，对扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，回收长度约为696bp的DNA片段，将其克隆入载体pMD-18(TaKaRa公司)中，筛选阳性克隆，提质粒进行测序，结果获得了长度为696bp的GmDGAT部分启动子序列，利用Genomatix软件分析此启动子序列中可能的转录因子结合位点，分析结果如图1所示(图中右边数字表示可能的DNA结合位点距离ATG的碱基数；可能的Dof结合位点、TATA盒及CCAAT盒标注在序列上方)，该序列包含数量较多的Dof基因结合序列AAAG(反式为CTTT)，其中正向结合序列出现8次，反式结合序列出现6次，此出现概率远大于四碱基序列出现的平均概率(1次/256bp)；另外可能的TATA盒位于ATG的-173bp位置，可能的CCAAT盒出现在离ATG-270bp处；除较多的Dof结合位点外，还存在如Myb、Prolamin box、TCP class I、等22类调控位点存在，但它们的数量都较少，出现次数最多的Myb结合位点为4次。此外，在Genbank中检索得到AtDGAT(GenBank号AC005917)、OsDGAT(GenBank号AC135427)、LcDGAT(GenBank号AP006408)的启动子序列，同样用Genomatix软件分析这些启动子序列中可能的Dof结合位点，发现在长度为1.5Kb的AtDGAT、OsDGAT、LcDGAT启动子序列中AAAG和CTTT分别出现27次、14次、25次。Duan等人通过对水稻种子发育过程中特异表达的转录因子启动子序列分析发现很多种子特异表达基因的启动子部分也都含有较多的Dof基因结合作用元件(Duan K，Luo YH，Luo D，Xu ZH，Xue HW.(2005)New insights into the complex andcoordinated transcriptional regulation networks underlying rice seeddevelopment through cDNA chip-based analysis.Plant Mol Biol.2005Apr；57(6)785-804)因此，推断Dof家族中的某些成员可能与植物的油脂代谢调控相关。
二、大豆与油脂代谢调控相关的转录因子GmDofC编码基因的筛选及其cDNA的克隆对约32万条大豆EST序列(Tian，A.G.，Wang，J.，Cui，P.，Han，Y.J.，Xu，H.，Cong，L.J.，Huang，X.G.，Wang，X.L.，Jiao，Y.Z.，Wang，B.J.，Wang，Y.J.，Zhang，J.S.，Chen，S.Y.(2004)Characterization of soybean genomic featuresby analysis of its expressed sequence tags.Theor Appl Genet，108903-913)进行分析，用Phrap软件(P.Green，http//www.phrap.com)将其聚类成contig基因序列，通过BLAST检索Genbank数据库对已获得的可能为Dof家族的转录因子编码基因的contig序列进行验证及拼接延长，并用DNASTAR中的Editseq软件翻译上述序列，结果27个contig序列中具有Dof结构域，将这些基因统称为GmDof。为了分析上述GmDof的表达情况，根据27个GmDof的核苷酸序列分别设计引物。分别以栽培大豆8904叶、花、开花后20天豆荚的cDNA为模板，进行RT-PCR分析，以βTublin基因(5’-AACCTCCTCCTCATCGTACT-3’和5’-GACAGCATCAGCCATGTTTCA-3’)为对照，结果如图2所示，其中GmDofC在叶、花、和开花后20天的豆荚中均见表达。最后经过RACE获得了GmDofC的cDNA全长序列，RACE引物序列为GmDofC RACE P15’-GAGACTTCGCAATTTGCATGACTC-3’；GmDofC RACE P2 5’-CTAGCTACTGCTAGAGTGAAGTCATTG-3’。该序列具有序列表中SEQ ID №2的核苷酸序列，序列表中的SEQ ID №2由1369个碱基组成，其编码序列为自5’端第214-1071位碱基，编码具有序列表中SEQ ID №1的氨基酸残基序列的蛋白质，自5’端第301位到第450位碱基编码Dof结构域，自5’端第1072位到第1369位碱基为3’端非翻译区。
实施例2、GmDofC转基因拟南芥的获得一、GmDofC植物表达载体的构建以克隆有全长GmDofC基因的pMD-18载体为模板，用含有BamH I和Kpn I接头序列的特异引物(DofC 438-P15’-TGATTGGATCCATGAATCCTTCTAGTGGACAACCCCAG-3’；DofC 438-P25’-TGGCGGGTACCCTACATTAGAGGACTTTGGAGAAAC-3’)扩增GmDofC的cDNA序列，扩增结束后进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，扩增出880bp的目的片段，与预期结果相符，回收并纯化该片段，用限制性内切酶BamH I和Kpn I对其双酶切后克隆到植物双元表达载体pBin438(李太元，田颖川，秦晓峰等，高效抗虫转基因烟草的研究，中国科学(B辑)，1994，24(3)276-282)中的CaMV 35S启动子下游，得到GmDofC的植物表达载体，命名为pBin438-GmDofC，该载体的部分物理图谱如图3所示。
二、转化拟南芥及转基因植株的鉴定将步骤一构建的质粒pBin438-GmDofC用电击法导入农杆菌GV3101中，用菌落PCR的方法获得阳性重组子，然后用抽真空法将重组农杆菌转化野生型拟南芥(col-O)中，经培育后收获种子，将种子播于含卡那霉素(50mg/L)的MS筛选培养基上，待筛选得到的T1代植株长至4-6叶时移到蛭石上生长，收获T1代单株，各单株种子分别播种，用相同的MS筛选培养基继续筛选以观察T2代的分离情况，如此重复数代直至获得遗传稳定的转基因纯合株系。对其中6个转基因株系(Line2、Line4、Line6、Line8、Line10)的2星期苗用DofC 438-P1和DofC 438-P2的引物进行RT-PCR鉴定，以野生型拟南芥(col-O)为对照，结果如图4所示，表明除Line8外，均有GmDofC基因的表达，获得了GmDofC转基因拟南芥阳性植株。
实施例3、GmDofC转基因拟南芥种子脂肪组分及含量分析选取实施例2获得的GmDofC转基因拟南芥Line2、Line4和Line6植株的种子，用下述方法对其脂肪组分及含量进行分析，其中脂肪酸的测定方法参照Pritam等(Pritam S.Sukhija and D.L.Palmquist(1988)Rapid Method for Determinationof Total Fatty Acid Content and Composition of Feedstuffs and Feces J.Agric.Food Chem.，361202-1206)的方法进行种子经充分研磨后，称重，加入盐酸甲醇溶液，再加入正己烷及内标液，80℃水浴2h，取出加入K2CO3溶液中和产生的酸，最后取上清液用气相色谱(AGILENT 6890GC)法进行测定，以Sigma公司的脂肪酸甲酯作为标准对照，测定结果如图5所示(空心柱为野生型拟南芥，实心柱为转基因植株Line2(L2)、Line4(L4)和Line6(L6))，结果显示GmDofC转基因拟南芥种子的脂肪酸含量较野生型植株显著提高，证明GmDofC是与植物的油脂代谢调控相关的基因。
序列表<160>2<210>1<211>285<212>PRT<213>大豆属大豆(Glycine max(L.)Merrill)<400>1Met Asn Pro Ser Ser Gly Gln Pro Gln Gln Met Ser Ser Gln Ser Val1 5 10 15Glu Lys Lys Pro Lys Pro His Pro Glu Gln Ala Leu Lys Cys Pro Arg20 25 30Cys Asp Ser Thr Asn Thr Lys Phe Cys Tyr Tyr Asn Asn Tyr Ser Leu35 40 45Ser Gln Pro Arg Tyr Phe Cys Lys Ser Cys Arg Arg Tyr Trp Thr Lys50 55 60Gly Gly Thr Leu Arg Asn Val Pro Val Gly Gly Gly Cys Arg Lys Lys65 70 75 80Arg Ser Ser Ser Leu Lys Arg Ala Gln Gly Gln Thr Leu Thr Pro Asn85 90 95Leu Asn Pro Leu Thr Thr Leu Pro His Leu Ser Tyr Asp Ser Asn Asp100 105 110Phe Thr Leu Ala Val Ala Arg Phe Gln Lys Gln Ser Ser Gly Gln Leu115 120 125Gly Tyr Asn Asp Arg Asp Leu Ser Thr Leu Gly Asn Pro Thr Thr Gly130 135 140Ser Phe Cys Asp Ile Leu Gly Asn Ser Gly Met Asn Pro Ser Ser Ala145 150 155 160Asn Pro Ser Phe Leu Asp Ala Ile Arg Thr Gly Phe Leu Glu Thr Gln165 170 175
Asn His Leu Gln Asn Leu Tyr Cys Met Tyr Gly Asn Gly Asp Leu Gly180 185 190Glu Val Asp Asn Gly Asn Ser Gly Val Val Gly Val Ser Gly Glu Met195 200 205Met Leu Pro Tyr Asp Gln Val Ile Met Ser Asn Ala Thr Thr Gln Ser210 215 220Val Ser Val Met Lys Gln Glu Met Cys Ser Arg Arg Glu Gln Ser Glu225 230 235 240Arg Arg Val Leu Gly Gly Phe Pro Trp Gln Ile Asn Ala Asp Thr Asn245 250 255Ile Gly Glu Leu Asp Ser Gly Arg Thr Ile Ala Ser Trp Asn Ser Phe260 265 270Thr Asn Ser Trp His Gly Phe Leu Gln Ser Pro Leu Met275 280 285<210>2<211>1369<212>DNA<213>大豆属大豆(Glycine max(L.)Merrill)<400>2cgccaagcta tttaggtgac actatagaat actcaagcta tgcatccaac gcgttgggag 60ctctcccata tggtcgacct gcaggcggcc gcactagtga ttgtcaagta ctaccactta 120gacactcaga tagatacacc cacatataaa agcacgcctt tgaaattcta ataaccttag 180tgtgttgtgc ttagtccgat tctgattgta tgaatgaatc cttctagtgg acaaccccag 240caaatgtcta gccagtcagt ggagaagaag ccaaagcctc atccagaaca agctctgaaa 300tgcccaagat gtgactccac caacacaaaa ttttgctact acaacaatta tagtctttct 360cagccaagat atttctgcaa gtcttgtagg agatattgga caaaaggagg aacactgagg 420aatgttccag tgggaggagg atgcaggaag aagagatcat catcattaaa gagggctcaa 480ggtcaaacat tgacacccaa tcttaatcca ctcactacac tccctcattt gtcttatgac 540tccaatgact tcactctagc agtagctagg tttcaaaaac aatcaagtgg acaattgggt 600tacaatgatc gtgatctttc aactttgggg aaccccacca caggctcatt ttgtgacatt 660
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权利要求
1.与油脂代谢调控相关的转录因子，是具有下述氨基酸残基序列之一的蛋白质1)序列表中的SEQ ID №1；2)将序列表中SEQ ID №1的氨基酸残基序列经过一至十个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有转录激活功能的调控植物油脂代谢的蛋白质。
2.根据权利要求1所述的转录因子，其特征在于所述蛋白具有序列表中SEQ ID№1的氨基酸残基序列。
3.编码权利要求1所述的与油脂代谢调控相关的转录因子的基因，是下述核苷酸序列之一1)序列表中SEQ ID №2的DNA序列；2)编码序列表中SEQ ID №1的DNA序列；3)在高严谨条件下可与序列表中SEQ ID №2限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。
4.根据权利要求3所述的基因，其特征在于所述基因具有序列表中SEQ ID №2的DNA序列。
5.含有权利要求3所述基因的表达载体、转基因细胞系和宿主菌。
6.一种调控植物油脂成份的方法，是将权利要求3所述的与油脂代谢调控相关转录因子基因导入植物组织或细胞，植物的油脂成份得到调控。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于所述与油脂代谢调控相关转录因子基因通过含有所述与油脂代谢调控相关转录因子基因的植物表达载体导入植物组织或细胞。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于用于构建所述植物表达载体的出发载体为pBin438、pCAMBIA1302、pCAMBIA2301、pCAMBIA1301、pCAMBIA1300、pBI121、pCAMBIA1391-Xa或pCAMBIA1391-Xb。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于所述植物表达载体为pBin438-GmDofC。
10.根据权利要求6所述的方法，其特征在于所述植物宿主为大豆、水稻、小麦、玉米、烟草、拟南芥或棉花。
全文摘要
本发明公开了一个与油脂代谢调控相关的转录因子及其编码基因与应用，特别是涉及一个来源于大豆的与油脂代谢调控相关的转录因子GmDofC及其编码基因与其在调控植物油脂代谢中的应用。该转录因子是具有下述氨基酸残基序列之一的蛋白质1)序列表中的SEQ ID №1；2)将序列表中SEQ ID №1的氨基酸残基序列经过一至十个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有转录激活功能的调控植物油脂代谢的蛋白质。本发明基因的克隆及功能鉴定对提高和改良作物油脂成分、特别是对于提高大豆油脂成分，培育高油脂大豆品种具有重要的理论和现实意义。
文档编号C12N15/82GK1821408SQ20061005876
公开日2006年8月23日 申请日期2006年3月6日 优先权日2006年3月6日
发明者陈受宜, 张劲松, 王会文, 田爱国, 何锶杰, 杜保兴 申请人:中国科学院遗传与发育生物学研究所