专利名称：：一种低热原重组人白细胞介素1受体拮抗剂(rhIL－1ra)及其高效制备方法
技术领域：
：本发明涉及生物工程制药领域，具体地说是涉及一种重组人白细胞介素1受体拮抗剂(rhIL-1ra)及其高效制备方法和用途。
背景技术：
：白细胞介素-1受体拮抗剂(interleukin-1receptorantagonist，IL-1Ra)是从经IgG刺激后的人单核细胞培养上清液中发现的一种蛋白质，能特异性地与IL-1受体结合，竞争性地阻止IL-1与其受体的结合，通过阻断IL-1的靶器官受体后信号通路的激活，使IL-1无法发挥生物学效应，可用于类风湿性关节炎的治疗。1990年科学家Eisenberg，S.P.等人首先克隆其基因(cDNA)，并在大肠杆菌中获得表达([1]CaterD.B.，etal.NatureVol344.12April1990，633-637)。完整人IL-1ra是由152个氨基酸组成，分子量为22KD。糖基对其生物活性不是必要的，所以可以用大肠杆菌进行表达生产([2]Gubler，U.andHoffman，B.J.1983，25263)。重组人白细胞介素-1受体拮抗剂(r-metHu-IL-1ra，rhIL-1ra)是人源性的IL-1受体拮抗剂的重组产品，由153个氨基酸组成，分子量大约为17.3KD，其氨基酸序列为mrpsgrksskmqafriwdvnqktfylrnnqlvagylqgpnvnleekidvvpiephalflgihggkmclscvksgdetrlqleavnitdlsenrkqdkrfafirsdsgpttsfesaacpgwflctameadqpvsltnmpdegvmvtkfyfqede，仅在天然IL-1Ra的N-末端加了一个甲硫氨酸残基。现有表达重组il-1ra的方法中主要是采用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG，isopropy-β-D-thiogalactoside)诱导，大规模生产成本较高。目前人们正在探索采用提高培养温度高效率诱导il-1ra的方法生产il-1ra，以降低生产成本，以利于大规模生产。有报道以E.coliPOP2136/pKpL-3a工程菌为起始菌株，其优化培养条件为以2YT培养基为发酵培养基，诱导时A600×100为0.15-0.30，诱导温度和时间分别为42℃、3h，培养结果菌体湿重可达20g/L-30g/L，目的蛋白含量为24.5％(康文力季祖晓人白细胞介素I受体拮抗剂工程菌表达山西大学学报(自然科学版)2001年第3期)，其表达效率仍然较低。另外，众所周知，药物中热原的含量直接影响药物使用的安全性，而基因工程药物、微生物来源药物以及其它生化药物由于其来源的特殊性，其中的热原去除和控制一直是其生产和使用中的关键问题。多数方法都很难将主要的热原物质内毒素一次性彻底去除，甚至经过多个步骤后，仍达不到临床要求。而且由于内毒素的性质极不均一，很难找到一种针对性的去除热原的方法(陈听下游层析工艺中热原的去除中国生物工程杂志2002年第4期100-104)。当前基因工程药物生产中热原去除的主要原则是在目标产物纯化过程中尽可能将内毒素除去，尽量不添加额外的除热原步骤和化学制剂。当前低热原的重组人白细胞介素-1受体拮抗剂及其制备方法还未见报道。由上可知，为了克服现有技术的不足，本领域目前急需获得高纯度，低热原，低成本的人白细胞介素I受体拮抗剂以投入临床应用；同时也需要建立一整套能达到高产率、高纯度、低热原、适合大规模生产应用等要求的人白细胞介素I受体拮抗剂的制备方法。
发明内容本发明的第一个目的是提供一种重组人白细胞介素1受体拮抗剂(rhIL-1ra)。该重组人白细胞介素1受体拮抗剂(rhIL-1ra)的内毒素含量小于1Eu/mgrhIL-1ra(“Eu/mgrhIL-1ra”表示每mg的rhIL-1ra中的内毒素的含量)。进一步的，该重组人白细胞介素1受体拮抗剂(rhIL-1ra)的内毒素含量等于或小于0.5Eu/mgrhIL-1ra。更进一步的，该重组人白细胞介素1受体拮抗剂(rhIL-1ra)的HPLC纯度等于或大于99％。第二个目的是提供一种高效制备上述重组人白细胞介素1受体拮抗剂(rhIL-1ra)的方法。该方法包括以下步骤a、以具有如SEQNO.1所示的核苷酸序列的引物1和具有如SEQNO.2所示的核苷酸序列的引物2，扩增重组人白细胞介素1受体拮抗剂的cDNA序列，再用平端连接的方式，构建含编码重组人白细胞介素1受体拮抗剂的cDNA序列的重组质粒pBV220-IL-1ra；b、将构建的重组质粒转化大肠杆菌，获得转化子；c、从转化子表达重组人白细胞介素1受体拮抗剂，纯化、除热原即得产物。其中，上述方法步骤a中所述的重组质粒pBV220-IL-1ra为IL-1racDNA序列连接于质粒pBV220中的PL启动子后制备得到的。其中，上述方法步骤b中所述的大肠杆菌为大肠杆菌DH5α。其中，上述方法步骤c中所述的重组人白细胞介素1受体拮抗剂的表达条件为以TB培养基为发酵用培养基，接种量为7-13％，发酵时溶氧值(D.O值)控制在30-50％，pH控制在7.0，在30℃下培养至OD600达到5左右时，将温度升至42℃诱导，4.5-5.5小时后停止发酵培养，收获细菌。其中，上述方法步骤c中的重组人白细胞介素1受体拮抗剂的纯化、除热原过程为a、将细菌菌体均匀的悬浮于BufferA中，高压匀浆破菌，将破菌液离心后弃沉淀留上清液；b、将步骤a所得上清液上用BufferA平衡好的SP-SepharoseF.F.凝胶层析柱，用BufferE洗脱，收集目标洗脱峰溶液；c、将步骤b所得洗脱峰溶液超滤脱盐至溶液电导小于2ms/cm，上以BufferA平衡的，串联的DEAE-SepharoseF.F.层析柱和SP-SepharoseF.F.层析柱，样品上完且平衡完成后将DEAE-SepharoseF.F.柱拆下，用BufferB洗脱SP-SepharoseF.F.层析柱并收集目标洗脱峰溶液，其中，串联时DEAE-SepharoseF.F.层析柱在前、SP-SepharoseF.F.层析柱在后；d、将步骤c所得洗脱峰溶液上用BufferB平衡好的Q-SepharoseF.F.凝胶柱，用BufferB洗至基线后再用BufferC洗脱3-5个柱床体积，再用BufferF洗脱，收集BufferF的目标洗脱峰溶液，超滤浓缩，交换缓冲液成BufferG，即得；上述各步骤中的BufferA为5mM磷酸盐缓冲液、pH6.0，BufferB为20mMTris.Cl溶液、pH8.0，BufferC为BufferB添加0.05MNaCl，BufferE为BufferA添加0.5MNaCl，BufferF为BufferB添加0.10MNaCl，BufferG为按重量百分比含0.8％NaCl、0.018％Na2EDTA、0.2％Na3C6H5O7的溶液、pH6.5。上述各步骤中洗脱时的流速为2～20ml/min。本发明的第三个目的是提供一种治疗类风湿性关节炎的药物组合物，它是由上述的重组人白细胞介素1受体拮抗剂(rhIL-1ra)添加药学上可以接受的辅助性成分制备而成的制剂。进一步的，上述的药物制剂的剂型为注射制剂或口服制剂。本发明方法中所使用的层析柱均为在市场上销售的常规层析柱，使用的各种层析柱填料也是蛋白质纯化制备领域中常用的填料，均按常规方法装柱或购买预装柱。在本发明方法的纯化过程中，自首次上SP-SepharoseF.F.柱后所使用的其装柱。在本发明方法的纯化过程中，自首次上SP-SepharoseF.F.柱后所使用的其它溶液均为无热原溶液，所使用的仪器设备也要经过无热原处理和检验，以确保不会在制备过程中产生新的热原物质。洗脱液的流速是常规流速，可以做适当调整，优选为5～14ml/min。本方法各步骤持续的时间可以根据层析柱体积，缓冲液流速，上样量等具体情况按本领域常识进行适当调整。本发明中超滤步骤优选使用截留分子量为5000道尔顿的超滤膜。本发明重组人白细胞介素1受体拮抗剂(rhIL-1ra)与药学上可以接受的相应药用辅料或载体等辅助添加成分组合，并按相应的相应制药方法加工，可制成为相应的剂型的药物制剂。例如，与注射药物中允许使用的适当溶剂和/或附加剂配合并按相应的工艺操作处理后，即可以制备成相应的水针、粉针或冻干制剂等肌肉或静脉形式的注射制剂药物。与药学上可以被接受的崩解剂、赋形剂、润滑剂、粘合剂、填充剂等常用的辅助添加成份混合后，按相应的常规工艺方法处理，即可制成为片剂、丸剂、胶囊剂或适当形式的缓释剂、控释剂等固体制剂形式的口服制剂；与常用的增溶剂、乳化剂、润湿剂、起泡或消泡剂等表面活性剂、稀释剂、防腐剂、稳定剂、矫味剂、增稠剂等混合，按相应的常规工艺方法处理，即可制成为水剂、糖浆等液体制剂形式的口服药物或口含制剂。本发明重组人白细胞介素1受体拮抗剂(rhIL-1ra)可按下述步骤制备成冻干制剂。将重组人白细胞介素1受体拮抗剂(rhIL-1ra)用无热原BufferG缓冲液稀释至80mg/ml的rhIL-1ra蛋白溶液，用无热原0.22μm膜过滤后即得半成品，质量检测符合要求后，在洁净环境下，1ml/瓶分装，冷冻干燥，包装即得成品。本发明的有益效果在于本发明重组人白细胞介素1受体拮抗剂(rhIL-1ra)热原低、纯度高、活性强，整体品质优于目前公开的重组人白细胞介素1受体拮抗剂，并且完全符合《中国药典》2005版第三部对该类产品的相关要求。本发明方法步骤简便，其表达率高，成本低廉，效果可靠，大大提高了产量，降低了生产成本和病人的使用成本，是一种优秀高效的重组人白细胞介素1受体拮抗剂(rhIL-1ra)制备方法，适于大规模推广应用；本发明方法还明确了生产过程中纯化重组人白细胞介素1受体拮抗剂(rhIL-1ra)的合适的凝胶柱种类和这些凝胶柱的最佳使用顺序，同时对使用方法进行了优化，既能高效去除热原，又能同时纯化产品。本发明重组人白细胞介素1受体拮抗剂(rhIL-1ra)添加药学上可以接受的辅助性成分所制备的治疗类风湿性关节炎的药物制剂，经研究证实具有良好的效果，并且没有任何与热原相关的不良反应出现，是一种安全有效的治疗的药物制剂，具有很好的市场前景。图1重组质粒构建示意图具体实施方式下面通过实施例对本发明作进一步说明，但并非对本发明的限制，本领域技术人员根据本发明的基本思想，可以作出各种变型或改进，只要不脱离本发明的基本思想，均在本发明的范围之内。实施例一分离扩增目的基因hIL-1racDNA1.培养人U937骨髓单核细胞(myelomonocyticcell，购自美国ATCC)。用总RNA试剂盒提取培养好的人U937骨髓单核细胞的总RNA，电泳检查合格后，用于RT-PCR反应。2根据CaterD.B.等发表的人IL-1racDNA序列，设计并合成用于扩增编码人IL-1racDNA(84-539)的上游引物P1和下游引物P2上游引物P15′-TTTCATATGCGACCCTCTAGAGGGAAAAAATCC-3’(SEQNO.1)在5′端附加翻译起始密码子(ATG)，NdeI酶切位点。下游引物P25′-AAAGGATCCTTATTAGTCCTCCTCCTGGAAGTAGAA-3′(SEQNO.2)。在3′端附加BamHI酶切位点和终止密码子TAA。3、扩增hIL-1racDNA取4～5μg总RNA为模板，以40pmol/L引物P2为引导，在RNasin保护及dNTP参与下，加AMV逆转录酶于42℃反应1hr，合成人IL-1racDNA的第一条链，取RT反应物5μL为模板，加上游引物P1和下游引物P2，用PCR试剂盒进行扩增，引物浓度50pmol/L。反应条件94℃30s、50℃30s、72℃60s，共30个循环，1.2％琼脂糖电泳显示获得0.5kb左右大小的基因片段。以此条件大规模进行RT-PCR反应后，用琼脂糖凝胶电泳分离上述大规模RT-PCR反应液中的0.5kb左右大小的cDNA片段，纯化后获得高质量的IL-1racDNA(见图1)用于后继步骤。实施例二构建表达载体以及转化1.表达载体的来源表达载体pBV220购自北京原平生物技术公司。2.宿主菌的来源及生物学特性宿主菌DH5α，购自美国Promega公司。基因型SupE44，ΔLacV169(φ80LacZΔM15)，hsdR17，recA1，endA1，gyrA96，thi-1，relA1。3表达质粒构建、转化、酶切鉴定3.1.感受态细胞E.coliDH5α的制备(《分子克隆实验指南》作者J.萨姆布鲁克D.W.拉塞尔科学出版社2002年8月)挑取冻干菌DH5α，接入20mLLB培养基，30℃、250rpm培养过夜，取4mL培养液转入另一20mLLB培养液中，在30℃、250rpm培养至OD600为0.4左右时停止培养，转入另一新的、无菌的50mL离心管，冰浴10分钟。3.2.表达质粒的构建将上述PCR扩增的0.5kb左右大小的DNA片段纯化后，取一部分用NcoI和KpnI分别酶切上述PCR产物，凝胶电泳结果表明NcoI和KpnI分别能把上述PCR扩增的0.5kb左右大小的DNA线性片段酶切成2个片段，根据文献可知NcoI和KpnI是人IL-1racDNA片段上的单酶切位点。取另一部分纯化后的PCR产物经NdeI酶切后，用大片段酶(Klenowfragment)补齐成平端，再用BamHI酶切，纯化后待用。取质粒pBV220用EcoRI酶切后，用大片段酶(Klenowfragment)补齐成平端，再用BamHI酶切后用试剂盒回收，用DNA连接酶连接两个片段。连接反应产物转化大肠杆菌DH5a，筛选阳性克隆后，获得重组表达质粒pBV220-IL-1ra。质粒构建示意图见图1。3.3.阳性克隆pBV220-IL-1ra酶切鉴定及核苷酸顺序分析NcoI和KpnI是人IL-1racDNA片段上的单酶切位点，且pBV220上无此酶切位点，用上述各限制性内切酶NcoI和KpnI及BamHI，SalI，PstI分别酶切阳性克隆pBV220-IL-1raDNA，1.2％琼脂糖凝胶电泳显示，可将阳性克隆pBV220-IL-1ra线性化(图3)。说明上述人IL-1racDNA片段以重组到pBV220。用双脱氧末端终止法测序证实，该cDNA序列与文献报道一致，表达相位一致。筛选获得的阳性克隆表达质粒pBV220-IL-1ra可以用于表达重组人IL-1ra，该重组人IL-1ra基因的核苷酸序列(SEQNO.3)及所编码的氨基酸序列见表1表1重组人IL-1ra基因核苷酸序列(SEQNO.3)及所编码的氨基酸序列1ATGCGACCCTCTGGGAGAAAATCCAGCAAGATGCAAGCCTTCAGA45MetArgProSerGlyArgLysSerSerLysMetGlnAlaPheArg46ATCTGGGATGTTAACCAGAAGACCTTCTATCTGAGGAACAACCAA90IleTrpAspValAsnGlnLysThrPheTyrLeuArgAsnAsnGln91CTAGTTGCTGGATACTTGCAAGGACCAAATGTCAATTTAGAAGAA135LeuValAlaGlyTyrLeuGlnGlyProAsnValAsnLeuGluGlu136AAGATAGATGTGGTACCCATTGAGCCTCATGCTCTGTTCTTGGGA180LysIleAspValValProIleGluProHisAlaLeuPheLeuGly181ATCCATGGAGGGAAGATGTGCCTGTCCTGTGTCAAGTCTGGTGAT225IleHisGlyGlyLysMetCysLeuSerCysValLysSerGlyAsp226GAGACCAGACTCCAGCTGGAGGCAGTTAACATCACTGACCTGAGC270GluThrArgLeuGlnLeuGluAlaValAsnIleThrAspLeuSer271GAGAACAGAAAGCAGGACAAGCGCTTCGCCTTCATCCGCTCAGAC315GluAsnArgLysGlnAspLysArgPheAlaPheIleArgSerAsp316AGTGGCCCCACCACCAGTTTTGAGTCTGCCGCCTGCCCCGGTTGG360SerGlyProThrThrSerPheGluSerAlaAlaCysProGlyTrp361TTCCTCTGCACAGCGATGGAAGCTGACCAGCCCCTCAGCCTCACC405PheLeuCysThrAlaMetGluAlaAspGlnProLeuSerLeuThr406AATATGCCTGACGAAGGCGTCATGGTCACCAAATTCTACTTCCAG450AsnMetProAspGluGlyValMetValThrLysPheTyrPheGln451GAGGACGAGTAA462GluAspGluStop实施例三pBV220-IL-1ra高效表达工程菌株的筛选及大规模表达1、主要仪器设备PCR仪MastercyclerPersonal，购自Eppendof；激光扫描光密度计GS-700，购自Bio-Rad；SCF-24摇床(购自上海离心机械研究所)发酵罐KSB6231MFRK3T，购自KoBioTechCo.LTD，工作罐工作体积300L、种子罐30L。2、将表达质粒pBV220-IL-1ra用常规方法转化大肠杆菌DH5α后获得工程菌。3、用灭菌牙签从LB平板上随机挑取6个大小均一、形态一致的单菌落转化子(编号为1、2、3、4、5、6)，接种于装有5mLLB培养基(Amp+100μg/mL)的试管中，30℃，220rpm，摇瓶过夜。6个单菌落的种子液放置4℃冰箱保存。4、从上述单菌落培养液中各吸取1mL种子液分别接种于6个装有50mLLB培养基(Amp+100μg/mL)的三角瓶中，30℃，250rpm摇瓶培养。培养至OD600值为0.6左右时，升温到42℃，诱导培养5小时后收集菌体。5、取样离心收集菌体，经SDS-PAGE检测，用激光扫描光密度计进行扫描分析，选出rhIL-1ra蛋白表达量最高为35.1％的6号菌株为出发菌株，命名为HXI01。实验结果见表2。表2工程菌HXI01表达目的蛋白的SDS-PAGE分析结果6、大规模发酵发酵培养基为TB，接种量为10％，发酵体积为300升，D.O控制在30％以上，pH控制在7.0，30℃培养。当OD600达到5左右时，将温度升至42℃诱导。5小时后停止发酵培养，收获细菌，重复六次，结果见表3(其中rhIL-1ra蛋白表达量(％)是指表达的rhIL-1ra蛋白占菌体总蛋白量的比例)。表3HXI01连续六批中试发酵结果连续6次发酵结果表明该发酵工艺稳定可靠，重现性好，且菌体菌体密度稳定在30g/L左右，rhIL-1ra蛋白表达量可达35％，生产效果明显优于现有发酵技术。实施例4三批中试产品的分离纯化1、主要设备匀浆破碎机购自(APV1000)离心机J2-HS，购自BeckmanAKTA蛋白多肽纯化系统Purifier100购自PharmaciaBiotech电泳装置EPS-301购自PharmaciaBiotech超纯水装置MilliQBiocel，购自Millipore紫外-可见分光光度计Ultrospec4000，购自PharmaciaBiotech超低温冰柜Bio-Freezer购自FormaScientic中空纤维超滤器MIF-910购自天津膜天膜工程技术有限公司超滤器Sartocon2Plus，HYDRO-5K购自Sartorius。2、所用缓冲液BufferA为5mM磷酸盐缓冲液、pH6.0，BufferB为20mMTris.Cl溶液、pH8.0，BufferC为BufferB添加0.05MNaCl，BufferE为BufferA添加0.5MNaCl，BufferF为BufferB添加0.10MNaCl，BufferG为按重量百分比含0.8％NaCl、0.018％Na2EDTA、0.2％Na3C6H5O7的溶液，pH6.5。3、除热源及纯化工艺的初步确立(1)SP-SepharoseF.F.柱层析初步分离纯化使用凝胶为Pharmacia的SP-SepharoseF.F.，层析柱为上海精科的中压特制玻璃层析柱(3.5×20cm)，凝胶体积100ml，流速均为8ml/min(2-20ml/min)。层析步骤1.BufferA平衡至少4个柱床体积；2.上样，样品为发酵的菌体以10％(g湿重/ml)比例悬浮于含bufferA缓冲液中，用高压匀浆仪破菌，并经9000rpm长时间离心后的上清液；3.BufferA平衡至基线；4.BufferE(BufferA+0.5MNaCl)，收集洗脱目标峰。结果显示目的蛋白能很好的与凝胶结合，且用BufferE能将其完全洗脱下来。(2)SP-SepharoseF.F.柱和DEAE-SepharoseF.F.柱串联分离纯化rhIL-1ra使用凝胶为Pharmacia的SP-SepharoseF.F.和DEAE-SepharoseF.F.，层析柱为上海精科的中压特制玻璃层析柱(3.5×20cm)，凝胶体积均为100ml，将两个层析柱串联，DEAE在前，SP在后，流速为8ml/min(2-20ml/min)。2.1步收集的样品含有0.5M的NaCl，为了保证内毒素与DEAE很好的结合以及目的蛋白与SP很好的结合，必需减少收集液中的NaCl浓度。通过超滤用BufferA稀释收集液，将收集液的电导减少到2ms/cm以下。层析步骤1.用BufferA充分平衡层析柱；2.上样，样品为经透析处理的样品；3.用BufferA平衡150ml后小心的移去DEAE层析柱，再用BufferA平衡SP层析柱至基线；4.用BufferB洗脱SP层析柱并收集目标洗脱峰。检测结果显示目的蛋白在收集峰中。按《重组人白细胞介素1受体拮抗剂注射液制造及检定暂定规程》3.1.10细菌内毒素含量测收集峰中的内毒素含量，结果＜100EU/80mg蛋白。(3)Q-SepharoseF.F.柱层析分离纯化rhIL-1ra使用凝胶为Pharmacia的Q-SepharoseF.F.，层析柱为上海精科的中压特制玻璃层析柱(3.5×20cm)，凝胶体积80ml，流速均为8ml/min(2-20ml/min)。层析步骤1.BufferB平衡至少4个柱床体积；2.上样，样品为上一步层析收集的洗脱峰；3.BufferB平衡至基线；4.BufferF(BufferB+0.10MNaCl)洗脱，收集目标峰。结果显示目的蛋白能很好的与凝胶结合，且用BufferF能将其完全洗脱下来。按《重组人白细胞介素1受体拮抗剂注射液检定规程》3.1.10项下细菌内毒素含量测收集峰中的内毒素含量，结果＜40EU/80mg蛋白。此时rhIL-1ra纯度为100.0％(SEC-HPLC分析)。4、rhIL-1ra的大规模纯化(1).将连续六批大规模发酵培养所得的培养液分成三批A、B、C，分别用大超滤器超滤浓缩后再经5000rpm离心5min，收集菌体放于4℃备用。隔天将菌体以20％(W/V)浓度均匀的悬浮于BufferA中，高压匀浆破碎，镜检破菌效率95％以上。破菌液离心(9000rpm、30min)后弃沉淀留上清。(2).SP-SepharoseF.F.柱层析分离纯化三批上清液将三批破菌上清液分别上用BufferA平衡好的10LSP-SepharoseF.F.凝胶柱，收集BufferE目标洗脱峰。(3).DEAE-SepharoseF.F.柱和SP-SepharoseF.F.柱串联分离纯化rhIL-1ra将收集的BufferE洗脱峰超滤脱盐，至溶液电导小于2ms/cm。溶液过串联的DEAE-SepharoseF.F.柱和SP-SepharoseF.F.柱，平衡液为经干烤处理的BufferA。DEAE-SepharoseF.F.柱体积为5L，SP-SepharoseF.F.柱为10L，样品上完且平衡完成后将DEAE-SepharoseF.F.柱拆下，用BufferB洗脱SP-SepharoseF.F.层析柱并收集目标洗脱峰。(4).Q-SepharoseF.F.柱层析分离纯化rhIL-1ra将上一步的三批洗脱峰分别上BufferB平衡好的5LQ-SepharoseF.F.凝胶柱，用BufferB洗至基线后再用BufferC洗柱3-5个柱床体积，BufferF(BufferB+0.10MNaCl)洗脱，收集BufferF洗脱的目标峰。超滤浓缩洗脱峰至蛋白浓度100mg/ml以上，并将缓冲液交换成BufferG(0.8％NaCl、0.018％Na2EDTA、0.2％Na3C6H5O7)。此时蛋白纯度在99.5％以上，测热原小于40EU/80mg(0.5EU/mg)蛋白，回收率为65.7％。各步纯化效果比较见表4。表4各步纯化效果对比实施例四本发明重组人白细胞介素1受体拮抗剂(rhIL-1ra)的热原含量验证取上述实施例二第二步所得产物和最后一步所得产物参照《中国药典》三部相关内毒素测定方法鲎试剂法(0.25EU/ml)进行热原测定，结果见表5。表5热原验证实验结果在基因工程蛋白质药物的制备过程中，每一步都要注意热原。由表5可见，在经过本发明方法纯化过程的第一步处理之后，重组人白细胞介素1受体拮抗剂(rhIL-1ra)原液的热原物质含量非常高，远远大于药典中的内毒素控制要求。在此步骤的基础上，中间一步的DEAE-SepharoseF.F.柱和SP-SepharoseF.F.柱串联纯化可以将纯化溶液中的绝大部分内毒素去除，使产品热原降到很低的水平，接近药典对内毒素的控制要求，所以本步骤是本发明方法中对重组人白细胞介素1受体拮抗剂(rhIL-1ra)热原量有影响的关键步骤之一。而最后一步Q-SepharoseF.F柱纯化在彻底去除热原使之达到要求时，也使重组人白细胞介素1受体拮抗剂(rhIL-1ra)的纯度达到了99.5％(HPLC纯度)以上，满足了大规模纯化生产的需要。当然，这样的效果的取得是需要几个步骤进行配合才能达到的。实施例5所得产物的质量检测和验证通过原液质谱分子量分析、免疫印迹、N-末端序列测定、肽图分析、等电点测定以及紫外光谱扫描等方法对由三批中试产品分离纯化所得的rhIL-1ra产品A、B、C进行确证，结果如下(见表6)1.质谱分子量分析委托中国医学科学院基础医学研究所中心实验室测定。测定结果表明rhIL-1ra分子量与理论值一致。2.免疫印迹三批样品与氨基黑染色的对照品在同一位置出现特异显色条带且与KineretTM样品条带位置一致，结果见图2。3.N-末端序列测定取批次A的纯化产物液，委托国家生物医学分析中心测定。测定结果与预期结果一致。本例样品N-末端序列151015Met-Arg-Pro-Ser-Gly-Arg-Lys-Ser-Ser-Lys-Met-Gln-Ala-Phe-Arg-Ile文献报道N-末端序列151015Met-Arg-Pro-Ser-Gly-Arg-Lys-Ser-Ser-Lys-Met-Gln-Ala-Phe-Arg-Ile4.肽图分析参照《中国药典》2005年版三部附录VIIIE“肽图检查法”检测Kineret样品和三批原液，三批原液肽图一致且与KineretTM样品一致。5.等电点测定委托中国医学科学院基础医学研究所中心实验室，采用毛细管等电聚焦方法检测。三批原液结果基本一致，且与理论值基本一致。6.紫外光谱扫描参照《中国生物制品规程2000》附录紫外光谱测定方法进行测定。将待检样品和KineretTM样品用生理氯化钠稀释至100-500μg/ml，置1cm径长的吸收池中，在光路1cm、波长230-330nm下进行扫描，读最大吸收峰值。最大吸收波长都在278nm附近，结果符合《中国生物制品规程》相关规定。以上结构确证实验结果表明，本发明重组人白细胞介素-1受体拮抗剂在结构方面与天然的人白细胞介素-1受体拮抗剂一致，保证了了其具有与天然的人白细胞介素-1受体拮抗剂相近的生物学活性。检测结果也表明本实施例制得的重组人白细胞介素1受体拮抗剂(rhIL-1ra)均符合《中国药典》2005版三部对该类产品的相关要求。表6三批纯化产品的质量检验结果实施六本发明重组人白细胞介素1受体拮抗剂(rhIL-1ra)制剂的制备取实施例五中纯化得到的重组人白细胞介素1受体拮抗剂(rhIL-1ra)蛋白液500ml，按2.0倍的蛋白量加入20％注射用人白蛋白，并用无热原0.15MNaCLpH7.020mM磷酸缓冲液定容至配制成5mg/ml的rhIL-1ra蛋白液，迅速用无热原0.22μm膜过滤后即得半成品，检测内毒素含量符合药用要求后，100级洁净度下，1ml/瓶分装，冷冻干燥(-40℃预冻2～6小时后，抽真空，缓慢升温至-20℃，保持4～8小时，1小时内快速升温至0℃，在20～35℃保持2小时，结束冻干后，可真空或充氮封口)，即得成品。采用《中国药典》2005版三部附录所收录的该类产品的标准方法进行检定。检定结果(见表7)表明本发明重组人白细胞介素1受体拮抗剂(rhIL-1ra)均符合相关要求。表7制剂质量检定结果<tablesid="table7"num="007"><tablewidth="802">热原质试验符合《生物制品热原质试验规程》要求＜0.5EU/mg符合规定</table></tables>试验例1重组人白细胞介素1受体拮抗剂(rhIL-1ra)活性检测实验1、材料细胞株A375.S2(人黑色素瘤细胞系，ATCC)，经检测无支原体污染后，用含10％新生小牛血清(NBS)的DMEM培养液在37℃、5％CO2、饱和湿度的条件下传代培养于25-75cm2方瓶中；培养液A，为含10％NBS的DMEM培养液；0.25％胰蛋白酶溶液；IL-1β(比活性≥1×107U/mg，R&D生产)；IL-1ra标准品(活性为1U/mg，NIBSC)。2、实验步骤①将冻干的标准品(10μg)用1.25ml水溶解，分装冻存，使用前用培养液B稀10倍，使其浓度为800ng/ml。将待测品用培养液B稀释成800ng/ml②.在96孔培养板上每孔加入100μl培养液B③.将稀释的待测品及标准品加50μl于96孔培养板的第一孔，以1∶3稀释，共11个浓度，每一个浓度作3个复孔。设阴性对照(加入100μlB液)和阳性对照(加入100μlA液)各三个孔。④.取对数生长期的A375.S2细胞，胰蛋白酶消化记数后，用培养液A调细胞浓度为7×104个/ml，96孔培养板中每孔加100μl。⑤.将96孔板放入37℃、5％CO2的二氧化碳孵箱中培养96个小时(即阴性对照孔的细胞死亡90％以上)，每孔用Hank’s液洗细胞一次，加50μl无血清DMEM，每孔再加入20μlMTT(5mg/ml)，继续培养5小时。取出培养板吸出培养液，加入150μl裂解液，吹打以充分溶解还原物(formazan)。用酶联免疫检测仪(Model550，Bio-Rad)以实验波长570mm，参比波长630mm测定OD值。⑥.结果计算以OD值为Y轴，以标准品待测样品蛋白浓度为X轴，给出增殖抑制曲线，计算标准品ED50的蛋白稀释度及待检样品ED50的蛋白稀释度。按以下计算公式计算待测样品的活性单位按如下公式计算比活性样品比活性(mU/mg)＝待检样品效价(mU/ml)/蛋白质含量浓度(mg/ml)3、实验结果用以上方法测定上述实施例制备的A、B、C三批样品的活性及比活性，以2mg/ml的KineretTM作为对照，结果如下样品A活性＝(10/1.25)*(3837.5/10)*(915.853/924.243)＝3042.13mU/ml比活性＝3042.13/3.07＝990.9mU/mg样品B活性＝(10/1.25)*(3600/10)*(985.700/844.621)＝3361.05mU/ml比活性＝3361.05/2.88＝1167.0mU/mg样品C活性＝(10/1.25)*(3737.5/10)*(778.501/792.954)＝2935.50mU/ml比活性＝2935.50/2.99＝981.8mU/mg对照品活性＝(10/1.25)*(2500/10)*(948.935/908.138)＝2089.9mU/ml比活性＝2089.9/2.0＝1044.95mU/mg本实验表明本发明重组人白细胞介素-1受体拮抗剂具有较强的的活性。实验例2本发明重组人白细胞介素1受体拮抗剂(rhIL-1ra)制剂药效学试验采用SD大鼠作为受试动物，分别用完全弗氏佐剂和鸡II型胶原(CII)乳剂造成佐剂性及胶原性关节炎损伤模型，应用已通过美国FDA批准的KineretTM与本发明制备的重组人白细胞介素-1受体拮抗剂(rhIL-1ra)制剂进行比较，评价本发明rhIL-1ra对关节炎的治疗作用。a、白细胞介素-1受体拮抗剂(IL-1ra)制剂对大鼠佐剂性关节炎的影响本实验研究参照国家卫生部药政局印发的《新药审批办法》中附件五“新药药理、毒性研究的技术要求”，结合国内外相关研究资料，采用SD大鼠作为受试动物，一侧足爪注射完全弗氏佐剂造成大鼠佐剂性关节炎(adjuvantarthritis，AA)模型，应用已通过美国FDA批准上市的KineretTM(anakinra)与白细胞介素-1受体拮抗剂(IL-1ra)进行比较，评价了IL-1ra对大鼠佐剂性关节炎的治疗作用。受试药物IL-1ra由我公司提供。临用药前用无菌磷酸缓冲液配制成所需浓度。实验动物为雄性SD大鼠，随机分为6组，即正常对照组、模型对照组、IL-1ra三个剂量组(2.5、10、40mg/kg/次，皮下注射，每日3次)和阳性药对照组(Kineret，40mg/kg/次，皮下注射，每日3次)。除正常对照组外，各实验组大鼠足爪皮内注射完全弗氏佐剂(CFA，10g/L)0.1ml，致炎后第12天关节炎症出现后即开始用药，连续7天。分别于致炎后第12天、16天、20天、24天测定大鼠足肿胀度及进行足爪评分；大鼠致炎后d28，检测T、B淋巴细胞增殖反应及腹腔巨噬细胞产生IL-1的活性，同时对踝关节进行病理组织学观察。试验结果表明，IL-1ra对大鼠佐剂性关节炎(AA)有明显的治疗作用。现在小结如下(1)IL-1ra能明显减轻AA大鼠足肿胀程度。(2)IL-1ra能明显减少AA大鼠足爪评分分值。(3)IL-1ra能明显降低AA大鼠B淋巴细胞增殖反应和腹腔巨噬细胞IL-1的产生、可恢复降低的T淋巴细胞增殖反应。(4)病理组织学观察结果表明，IL-1ra可明显减轻AA大鼠关节中炎性细胞浸润、滑膜增生、血管翳形成、软骨和骨的破坏。(5)在本试验中，对受试药IL-1ra与阳性药Kineret的疗效进行比较，结果表明，受试药物IL-1ra对AA大鼠的治疗作用与Kineret相近。b、白细胞介素-1受体拮抗剂(IL-1ra)制剂对大鼠胶原性关节炎的影响本实验研究参照国家卫生部药政局印发的《新药审批办法》中附件五“新药药理、毒性研究的技术要求”，结合国内外相关研究资料，采用SD大鼠作为受试动物，皮内注射鸡II型胶原(CII)乳剂造成大鼠胶原性关节炎(Collagen-inducedarthritis，CIA)模型，应用已通过美国FDA批准的KineretTM(anakinra)与白细胞介素-1受体拮抗剂(IL-1ra)进行比较，评价了IL-1ra对大鼠胶原性关节炎的治疗作用。受试药物IL-1ra由我公司提供。临用药前用无菌磷酸缓冲液配制成所需浓度。实验动物为雄性SD大鼠，随机分为6组，即正常对照组、模型对照组、IL-1ra三个剂量组(2.5、10、40mg/kg/次，皮下注射，每日3次)和阳性药对照组(Kineret，40mg/kg/次，皮下注射，每日3次)。除正常对照组外，各实验组大鼠皮内多点注射鸡CII乳剂1ml，第7天时，再皮内多点注射同等剂量的该乳剂激发CIA模型的产生。致炎后第10天关节炎症出现后即开始用药，连续7天。分别于致炎后第10天、14天、18天、22天、26天测定大鼠足肿胀度及进行足爪评分；检测大鼠迟发性变态反应；大鼠致炎后d28，检测T、B淋巴细胞增殖反应及腹腔巨噬细胞IL-1的产生、ELISA法测定血清抗CII抗体、同时对踝关节进行病理组织学观察。试验结果表明，IL-1ra对大鼠胶原性关节炎(CIA)有明显的治疗作用。(1)L-1ra能明显减轻CIA大鼠足肿胀程度。(2)IL-1ra能明显减少CIA大鼠足爪评分分值。(3)IL-1ra能抑制CIA大鼠体重的下降。(4)IL-1ra能明显降低CIA大鼠T、B淋巴细胞增殖反应和腹腔巨噬细胞IL-1的产生。(5)IL-1ra能明显降低CIA大鼠迟发性变态反应及血清中抗CII抗体水平。(6)病理组织学观察结果表明，IL-1ra可明显减轻CIA大鼠关节中炎性细胞浸润、滑膜增生、血管翳形成、软骨和骨的破坏。在本实验中，对受试药IL-1ra与Kineret的疗效进行比较，结果表明，受试药物IL-1ra对CIA大鼠的治疗作用与Kineret相近。同时，在上述动物实验中，并没有发现任何由热原所引起的不良发应。为了能低成本地生产大量的rhIL-1ra蛋白，本发明提供了表达载体、宿主菌、重组质粒，以及高效表达重组人IL-1ra的工程菌和重组人IL-1ra的制备方法。在上述实例中，设计引物，利用RT-PCR技术扩增出了人hIL-1racDNA。然后插入到pBV220表达载体中，转化E.coli(DH5α)后使人IL-1ra在E.coli(DH5α)中得到高效表达；本发明方法还明确了生产过程中纯化重组人白细胞介素1受体拮抗剂(rhIL-1ra)的合适的凝胶柱种类和这些凝胶柱的最佳使用顺序，同时对使用方法进行了优化，既能高效去除热原，又能同时纯化产品，具有极大的应用价值。通过以上实例表明，本发明重组人白细胞介素1受体拮抗剂(rhIL-1ra)热原低，各批次内毒素含量均＜0.5EU/mg，热原含量完全符合《中国药典》三部对同类产品的要求；纯度高，其HPLC纯度在99％以上；活性强，效价高。由本发明重组人白细胞介素1受体拮抗剂(rhIL-1ra)添加药学上可以接受的辅助性成分所制备的治疗的制剂，在动物实验中在表现出很好疗效的同时，也没有出现任何由内毒素等热原物质引起的不良反应，是一种安全有效的治疗类风湿性关节炎的药物，具有很好的开发前景。以上对本发明的详细描述并不限制本发明，本领域的技术人员可以根据本发明的思想作出各种改变及变形，比如对制备发酵工艺中的参数进行较小幅度的改变，选用与本发明所使用的凝胶柱内填料的商品名不同但种类相同且指标相同或接近的产品，调节层析步骤的流速等，只要不脱离本发明的精神，均属于本发明所附权利要求所定义的范围。一种低热原重组人白细胞介素1受体拮抗剂(rhIL-1ra)及其高效制备方法.ST25SEQUENCELISTING<110>四川恒星生物医药有限公司<120>一种低热原重组人白细胞介素1受体拮抗剂(rhIL-1ra)及其高效制备方法<130>A060022<160>3<170>PatentInversion3.2<210>1<211>33<212>DNA<213>Artificial<220><223>引物1<400>1tttcatatgcgaccctctagagggaaaaaatcc33<210>2<211>36<212>DNA<213>Artificial<220><223>引物2<400>2aaaggatccttattagtcctcctcctggaagtagaa36<210>3<211>462<212>DNA<213>Artificial<220><223>重组人IL-1ra基因序列<400>3atgcgaccctctgggagaaaatccagcaagatgcaagccttcagaatctgggatgttaac60cagaagaccttctatctgaggaacaaccaactagttgctggatacttgcaaggaccaaat120gtcaatttagaagaaaagatagatgtggtacccattgagcctcatgctctgttcttggga180atccatggagggaagatgtgcctgtcctgtgtcaagtctggtgatgagaccagactccag240ctggaggcagttaacatcactgacctgagcgagaacagaaagcaggacaagcgcttcgcc300ttcatccgctcagacagtggccccaccaccagttttgagtctgccgcctgccccggttgg360ttcctctgcacagcgatggaagctgaccagcccctcagcctcaccaatatgcctgacgaa420ggcgtcatggtcaccaaattctacttccaggaggacgagtaa46权利要求1.一种重组人白细胞介素1受体拮抗剂，其特征在于其内毒素含量小于1Eu/mgrhIL-1ra。2.根据权利要求1所述的重组人白细胞介素1受体拮抗剂，其特征在于其内毒素含量小于0.5Eu/mgrhIL-1ra。3.根据权利要求1或2所述的重组人白细胞介素1受体拮抗剂，其特征在于其HPLC纯度等于或大于99％。4.一种制备权利要求1～3任一项所述的重组人白细胞介素1受体拮抗剂的方法，其特征在于它包括以下步骤a、以具有如SEQNO.1所示的核苷酸序列的引物1和具有如SEQNO.2所示的核苷酸序列的引物2，扩增重组人白细胞介素1受体拮抗剂的cDNA序列，再用平端连接的方式，构建含编码重组人白细胞介素1受体拮抗剂的cDNA序列的重组质粒pBV220-IL-1ra；b、将构建的重组质粒转化大肠杆菌，获得转化子；c、从转化子表达重组人白细胞介素1受体拮抗剂，纯化、除热原即得产物。5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤a中所述的重组质粒pBV220-IL-1ra为将IL-1racDNA序列连接于质粒pBV220中的PL启动子后制备得到的。6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤b中所述的大肠杆菌为大肠杆菌DH5α。7.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤c中所述的重组人白细胞介素1受体拮抗剂的表达条件为以TB培养基为发酵用培养基，接种量为7-13％，发酵时溶氧值控制在30-50％，pH控制在7.0，在30℃下培养至OD600达到5左右时，将温度升至42℃诱导，4.5-5.5小时后停止发酵培养，收获细菌。8.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤c中所述的重组人自细胞介素1受体拮抗剂的纯化、除热原过程为a、将细菌菌体均匀的悬浮于BufferA中，高压匀浆破菌，将破菌液离心后弃沉淀留上清液；b、将步骤a所得上清液上用BufferA平衡好的SP-SepharoseF.F.凝胶层析柱，用BufferE洗脱，收集目标洗脱峰溶液；c、将步骤b所得洗脱峰溶液超滤脱盐至溶液电导小于2ms/cm，上以BufferA平衡的，串联的DEAE-SepharoseF.F.层析柱和SP-SepharoseF.F.层析柱，样品上完后将DEAE-SepharoseF.F.柱拆下，用BufferB洗脱SP-SepharoseF.F.层析柱并收集目标洗脱峰溶液，其中，串联时DEAE-SepharoseF.F.层析柱在前、SP-SepharoseF.F.层析柱在后；d、将步骤c所得洗脱峰溶液上用BufferB平衡好的Q-SepharoseF.F.凝胶柱，用BufferB洗至基线后再用BufferC洗脱3-5个柱床体积，再用BufferF洗脱，收集BufferF的目标洗脱峰溶液，超滤浓缩，交换缓冲液成BufferG，即得；所述各步骤中的BufferA为5mM磷酸盐缓冲液、pH6.0，BufferB为20mMTris.Cl溶液、pH8.0，BufferC为BufferB添加0.05MNaCl，BufferE为BufferA添加0.5MNaCl，BufferF为BufferB添加0.10MNaCl，BufferG为按重量百分比含0.8％NaCl、0.018％Na2EDTA、0.2％Na3C6H5O7的溶液、pH6.5；上述各步骤中洗脱时的流速为2～20ml/min。9.一种治疗类风湿性关节炎的药物组合物，它是由权利要求1～3任一项所述的重组人白细胞介素1受体拮抗剂(rhIL-1ra)添加药学上可以接受的辅助性成分制备而成的制剂。10.根据权利要求9所述的药物组合物，其特征在于所述的制剂为注射制剂或口服制剂。全文摘要本发明提供了一种重组人白细胞介素1受体拮抗剂(rhIL－1ra)及其制备方法。本发明rhIL－1ra的内毒素含量小于1Eu/mgrhIL－1ra。本发明rhIL－1raa由以下方法制备a、扩增rhIL－1ra的cDNA序列，构建含编码rhIL－1ra的cDNA序列的重组质粒pBV220－IL－1ra；b、将构建的重组质粒转化大肠杆菌，获得转化子；c、从转化子表达rhIL－1ra，纯化、除热原即得产物。本发明rhIL－1ra热原低、纯度高、活性强，整体品质优于目前公开的rhIL－1ra。本发明方法步骤简便，成本低廉，热原去除效果可靠，大大提高了产量，是一种优秀的方法，适于大规模应用。文档编号C12N15/63GK1837237SQ20061005906公开日2006年9月27日申请日期2006年2月25日优先权日2005年2月25日发明者彭红卫,赵斌,杨伟,张宝华,周裕诚申请人:四川恒星生物医药有限公司