专利名称：一种在体外大规模扩增子宫内膜细胞的方法
技术领域：
本发明属组织工程领域，涉及一种在体外大规模扩增子宫内膜上皮细胞与基质细胞的生 物技术方法。这种方法能有效地分离、纯化及扩增子宫内膜细胞。
背景技术：
组织工程是应用生命科学和工程学的原理与技术，在正确认识哺乳动物的正常及病理两 种状态下结构与功能关系的基础上，研究、开发用于修复、维护、促进人体各种组织或器官 损伤后的功能和形态生物替代物的科学。子宫作为雌性哺乳动物的重要生殖器官，在孕育胎 儿和各种病理与生殖机制研究中占有重要地位。子宫的生理功能主要由子宫内膜执行，子宫 内膜细胞包括有分泌功能的腺上皮细胞与基质细胞，子宫内膜是胚胎发育的"温床"，同时也 是许多子宫疾病易发的部位。体外构建出子宫组织具有重要的理论和现实意义，除子宫组织 修复外，还可作为子宫肌瘤和内膜异位症等病理机制的体外研究和胚胎植入机制研究提供理 想的体外研究模型。鉴于子宫在生殖生理研究中的重要性，2001年美国华裔科学家刘宏清教 授在体外构建子宫内膜并在其上进行人胚胎的培养引起了世界的关注[1。但是因为伦理问题 没有报道具体的实施方案，工作也未能进行下去。2003年Park进行了体外子宫内膜肿瘤侵袭 模型的研究，为体外进行相关疾病研究提供了 一个借鉴[2]。
组织工程化组织主要取决于以下三个关键性制约因素种子细胞、支架材料以及有助于 细胞生长、组织再生的外在环境。其中获得足够数量且具有再生活力的种子细胞是开展子宫 组织工程研究的前提和基础。
组织工程化子宫组织构建首先要获得高纯度的子宫内膜上皮细胞与基质细胞。子宫内膜 细胞的体外分离有多种方法，OsteeW与陈秀荔W等用滤网法得到较高纯度的子宫内膜上皮细 胞。Bongo问等和Dong问用离心法分离了人子宫内膜上皮细胞。Fernandez等[7将悬浮的子宫
内膜细胞吸附在用Thy-l抗体包被的免疫磁珠上，用免疫磁珠法也成功分离了子宫内膜上皮
细胞，分离的上皮细胞纯度82%，存活率76%。过滤法分离的子宫内膜上皮细胞纯度虽高， 但该方法步骤繁琐，易污染，细胞损失大，对细胞活力也有影响。而免疫磁珠法则存在成本 高等问题。
子宫内膜主要由腺上皮细胞和基质细胞组成，它们具有自分泌/旁分泌功能，且受多种因 素调节。现在己经发现子宫内膜细胞能分泌激素，细胞因子如表皮生长因子(EGF)、白介素 (IL)、干扰素(IFN)、肿瘤坏死因子(TNF-a)等，酶类如基质金属蛋白酶(MMPs)、内啡 肽酶等以及多种功能蛋白如胎盘糖蛋白、整合蛋白等，这些物质对于子宫本身的生理功能和病 理状态、胚胎着床、发育及生理平衡起着重要的作用。其中激素的调节是最为重要的方式。有 研究表明，子宫内膜上皮细胞在正常生理条件下受体内激素尤其是雌激素(E2)和孕激素(P4) 的影响呈周期性变化。Emilia Pierro (2001)的研究表明雌激素的促人子宫上皮细胞(EEC) 增殖作用可能至少部分是由于间质细胞(ESC)分泌的IGFI介导所致^。
在子宫内膜细胞体外培养与扩增方面，目前一般采用的原代培养。上皮细胞一般不能够传 代，所用的培养环境通常为含有一定比例(如10%等)血清的培养基(如DMEM/F12)进行 贴壁培养，也有研究发现胰岛素对子宫内膜细胞有较强的促增殖作用。
发明内容
为了有效的提高子宫内膜细胞的体外纯化率以及增殖能力，本发明的目的是提供一种子 宫内膜细胞分离纯化及扩增培养的方法。
本发明第 一个目的即子宫内膜细胞分离纯化通过以下方案实现
首先对实验动物进行促情激素(PMSG)和促排卵激素(hCG)处理从而调节其子宫生理 至内膜"增殖期"，然后用外科手术法分离其两侧子宫并刮取子宫内膜，胰蛋白酶或I型胶原酶 消化分离后，利用离心法纯化子宫内膜上皮细胞与基质细胞。
本发明的第二个目的是在随后的纯化细胞扩增培养中，建立一种体外培养体系，所用的体 外培养体系含有雌激素与孕激素，其组成为DMEM/F12、胎牛血清、雌二醇(E2)、孕激素(P4)，
其组成比例为DMEM/F12、 10。/。胎牛血清、10nmol/L-100nmol/LE2、 10nmol/L-100nmol/LP4。
本发明的有益效果是
(1) 本发明提供的方法中对家兔进行促情激素(PMSG)和促排卵激素(hCG)处理从 而调节家兔子宫生理至内膜"增殖期"，可以使子宫内膜变厚、细胞数量增加，不仅利于子宫内 膜细胞分离收集，而且利于子宫内膜细胞的贴壁生长。
(2) 本发明采用含有雌激素与孕激素的新的培养体系能有效地提高子宫内膜上皮细胞与 基质细胞的增殖能力，其中子宫内膜上皮细胞与基质细胞都能够扩增10代以上，此外，培养 传代后子宫内膜的细胞纯度达到较高水平，流式细胞分析仪检测结果说明上皮细胞纯度达到 96%;基质细胞纯度达到98%。
具体实施例方式
本发明结合具体实施例作进一步说明。应理解，这些实施例仅用于说明目的，而不用于 限制本发明范围。
本发明釆取的一个具体实例是家兔子宫内膜细胞的分离纯化
采用2-2.5Kg的新西兰大白兔为实验动物。肌肉注射100 IU PMSG， 24小时后耳缘静脉 注射75IUhCG， 18小时后耳缘静脉注射5ml空气处死，消毒腹部，打开腹腔取双侧子宫， 置D'Hanks平衡液中。在超净工作台内用手术刀轻轻刮取内膜，加0.01-0.25%胰酶37'C消 化2-5min，用含血清的DMEM/F12培养液终止消化，离心，用10ml含血清的DMEM/F12 培养液重悬细胞，再以低速离心5-10min,离心管内上层为富含基质细胞组分，余下的为上皮 细胞组分，分别培养在5%C02， 37。C孵箱内培养，12-36h后用无血清DMEM/F12培养液清 洗两遍去除血细胞，加入新的含10。/。血清以及10nmol/L-100nmol/L雌激素和 10nmol/L-100nmol/L孕激素的DMEM/F12培养液继续培养。
本发明涉及的参考文献
1、刘宏清，2001年，会议报道
2、 Park DW, Choi DS， Ryu HS et al. A well-defined in vitro three- dimensional culture of human endometrium and its applicability to endometrial cancer invision[J]. Cancer Letters，2003，195:185 192
3、 Osteen KG， Hill GA， Hargrove JT， W o/. Development of a method to isolate and culture highly purified populations of stromal and epithelial cells from human endometrial biopsy specimens. Fertil. Steril, 1989, 52: 956
4、 Xiuli Chen " a/. Isolation,culture and morphological observation of early pregnant rabbit. Journal of northwest SCI-TECH university of agriculture and forestry, 2004， 32: 1
5、 Bongso A， Gojra B， Lian NP， " a/. Establishment of human endometrial cell culture. Hum Reprod， 1988， 3:705
6、 Dong WP， Dong SC， Ryu HS, " a/. A well-defined v/^*o three-dimertsional culture of human endometrium and its applicability to endometrial cancer invision. Cancer Letters, 2003, 195: 185
7、 Fernandez Shaw S， Shorter SC， Naish CE. Isolation and purification of human endometrial stromal and glandular cells using immunomagnetic microspheres. Hum Reprod, 1992, 7: 156
8、 Emilia Pierro， Francesca Minici， a/. Stromal-Epithelial interactions modulate estrogen responsiveness in normal human endometrium. Biology of reproduction, 2001, 64: 831-838
本发明提及的所有文献都在申请中引用作为参考，就如同每一篇文献都被单独引用作为 参考那样。此外应理解，本发明是结合最佳实施例进行描述的，然而在阅读了本发明的上述 内容后，本领域技术人员可以对本发明做各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所 附权利要求书所限定的范围。
权利要求
1、一种子宫内膜细胞分离纯化与体外扩增培养的方法，其特征是对实验动物进行促情激素(PMSG)和促排卵激素(hCG)处理从而调节其子宫生理至内膜“增殖期”，离心法分离纯化子宫内膜细胞，在体外培养体系中传代扩增培养，该技术能有效地纯化子宫内膜细胞和提高其体外纯化率与传代扩增能力。
2、 权利要求1所述的促情激素(PMSG)和促排卵激素(hCG)，其注射的剂量为10-20单位每千克体重。
3、 权利要求l所述的子宫内膜细胞体外扩增培养的方法，其特征是所用的体外培养体系含 有雌激素(E2)与孕激素(P4)，其组成为DMEM/F12、胎牛血清、雌二醇(E2)、孕激素(P4)， 其组成比例为DMEM/F12、 10%胎牛血清、10nm/L-100nm/LE2、 10nm/L-100nm/LP4。
全文摘要
本发明提供一种子宫内膜细胞分离纯化及在体外大规模扩增培养的方法。为了有效的提高子宫内膜细胞的体外纯化率以及增殖能力，对实验动物进行促情激素和促排卵激素处理调节其子宫生理至内膜“增殖期”，离心法纯化子宫内膜细胞。并在随后的纯化细胞扩增培养中，建立了含有雌激素与孕激素的体外培养体系，可提高子宫内膜细胞的增殖能力，达到大规模扩增的目的，从而为组织工程化子宫组织的构建提供充足的种子细胞。
文档编号C12N5/08GK101096653SQ20061008668
公开日2008年1月2日 申请日期2006年6月28日 优先权日2006年6月28日
发明者宋宇轩, 段翠密, 红 江, 王和平, 王常勇, 王海滨, 郭希民 申请人:中国人民解放军军事医学科学院基础医学研究所