专利名称：雪莲体胚一步成苗的方法
技术领域：
本发明属于生物工程技术领域，涉及植物组织培养技术，具体为新疆雪莲体胚一步转化成苗。
背景技术：
新疆雪莲(Saussurea involucrata Kar.et Kir.)，又名雪荷花，英文名Snow Saussure，为菊科(Compositae)菜蓟族(Trib.Cynareae Less.)凤毛菊属(Saussurea DC.)一次开花结实的高山草本植物，在国内仅大面积分布于新疆。新疆雪莲具有清热解毒、强阳补血、抗炎镇痛等众多疗效，近年来又发掘出延缓衰老、抗肿瘤、抗辐射等效用，是维吾尔、哈萨克等少数民族传统的民族药，在国内的民族药行业具有很高的知名度。由于生态环境很严酷，种子自然萌发率在3％以下。加上长期以来无计划的掠夺式采挖，又无人工栽培，目前野生天山雪莲花在大部分地区已难觅其踪，同时造成了生态环境和水源的严重破坏，在《中国珍稀濒危保护植物名录》中被列为国家二级渐危物种而受到保护。
目前新疆地区有雪莲产品60多种，生产厂家30多家，每年雪莲的需要量近百吨，可见天山雪莲花在新疆中药民族药中的重要地位。为了满足对雪莲的需求，同时又保护生态环境，近几年新疆地区和国家对新疆雪莲的人工种植研究开发均给予了高度重视和积极扶持。这已成为西部开发和生态环境保护的重要组成部份。显然，采用植物细胞工程技术和方法进行新疆雪莲的大规模组培快繁、规范化种植对于促进新疆民族制药业的发展，造福新疆人民有着重要作用，具有显著的经济效益、社会效益。
前人对于雪莲人工繁殖所作的大量工作中，主要通过器官再生途径，消耗了大量的人力和物力。相比于器官发生途径，体细胞胚胎发生具有数量多，速度快，结构完整，再生率高等优点，为研究植物细胞的分化、发育、全能性表达和遗传转化、突变体筛选提供了良好的基础。而且本实验通过愈伤组织途径诱导产生的体胚成本低，也能保持亲本的优良性状，这些优点将大大推进人工种子的生产和应用进程。目前，新疆雪莲体胚同时生根生芽，一步成苗尚无文献报道。
发明内容
本发明的目的是使雪莲的体胚一步成苗，为雪莲大面积人工种植奠定基础。根据体胚发生原理，通过间接体胚发生方式(即经愈伤阶段形成体胚)得到体胚，实现了雪莲体胚同时生根生芽，一步转化成苗。该方法操作简单，为雪莲大面积人工种植提供了一条新的途径。
本发明所述的雪莲体胚一步成苗的方法，按下列步骤进行a、选用雪莲种子，流水冲洗1小时，75％的乙醇消毒50-60s，0.1％的HgCl2溶液消毒15-20min后，接种到MS培养基上，10天后有70％种子萌发，培养基添加蔗糖3％，琼脂0.5％，调节pH 5.85±0.5，灭菌条件为121℃，20min，培养条件室内散射光下光照为8-10h/d，25±1℃，湿度为65±5％；b、将生长20天的无菌苗切成0.5cm2的小段，接种到琼脂固化MS+0.5mg/l 2，4-D+0.05-1mg/l BA的培养基上，培养基添加蔗糖3％，琼脂0.5％，调节pH 5.85±0.05，灭菌条件为121℃，20min，固体培养接种量为250ml三角瓶含50ml琼脂固化培养基，接7-8个外植体，培养条件日光灯2500-5000lx，光照时间12h/d，25±1℃，湿度为65±5％；c、30±5天后，90-95％的外植体诱导出愈伤，培养一个月后，对诱导出的愈伤进行第一次继代，继代培养基MS+0.05-0.1mg/l2，4-D，固体培养接种量为250ml三角瓶含50ml琼脂固化培养基，接7-8个外植体，培养条件日光灯2500-5000lx，光照时间12h/d，25±1℃，湿度为65±5％；d、第一次继代20天后，挑选黄绿色，颗粒状，质地紧实的胚性愈伤，转接到250ml，内含50ml液态体胚分化培养基MS+0.05-0.1mg/l 2，4-D的摇瓶中，进行悬浮培养，接种量为3％W/V，10±2天后对摇瓶进行继代，继代培养基为含或不含0.05mg/l 2，4-D的MS培养基，交替继代，灭菌条件121℃，20min，培养条件室内散射光下光照为8-10h/d，25±1℃，120r/min；e、继代3-4次后，胚性愈伤表面产生颗粒状的白色突起，继代培养基中除去2，4-D，加入5-25mg/l PEG6000，相同培养基继代两次后，逐渐降低PEG浓度，培养条件室内散射光下光照为8-10h/d，25±1℃，120r/min；f、待体细胞胚发育到鱼雷形胚阶段，加入0.05-2mg/lGA3，相同培养基继代两次后，逐渐降低GA3浓度，培养条件室内散射光下光照为8-10h/d，25±1℃，120r/min；g、待体胚发育到子叶形胚，将其转接到琼脂固化培养基MS+5mg/LGA3上，培养基添加蔗糖3％，琼脂0.7％，调节pH5.85±0.05，灭菌时间为121℃，20min，培养条件日光灯2500-5000lx，光照时间12h/d，25±1℃，湿度为65±5％；h、培养20天，体胚顶端萌发芽，底部生根，再将其转接到壮苗培养基MS+0.05～2mg/l NAA+0.01～0.5mg/l BA上，培养基添加蔗糖3％，琼脂0.5％，调节pH 5.85±0.5，灭菌条件为121℃，20min，培养条件日光灯2500-5000lx，光照时间12h/d，25±1℃，湿度为65±5％，壮苗2-3代后，将再生苗移栽到盛有无菌蛭石的小瓶中炼苗，成活后置于温室生长。
选用雪莲种子，流水冲洗1小时，75％的乙醇消毒50-60s，0.1％的HgCl2溶液消毒15-20min后，接种到MS培养基上(室内散射光下光照为8-10h/d)。10d后约有70％种子萌发。将生长20d左右的无菌苗切成0.5cm2的小段，接种到琼脂固化MS+0.5mg/l 2，4-D+0.05～1mg/l BA的培养基上。30±5d后，90％以上的外植体可诱导出愈伤。继代一次后，挑选黄绿色，颗粒状，质地紧实的胚性愈伤(图1)，转接到250ml，内含50ml液态体胚分化培养基(MS+0.05-0.1mg/l 2，4-D)的摇瓶中，进行悬浮培养。接种量为3％(W/V)。10±2d后对摇瓶进行继代，继代培养基为含或不含0.05mg/l 2，4-D的MS培养基。继代3～4次后，胚性愈伤表面产生颗粒状的白色突起，此为体细胞胚发育的球形胚阶段(图2)。此时继代培养基中除去2，4-D，加入5～25mg/l PEG6000。待体细胞胚发育到鱼雷形胚(图3)阶段，加入0.05～2mg/LGA3。待体胚发育到子叶形胚(图4)，将其转接到琼脂固化培养基MS+5mg/LGA3(琼脂0.7％)上。培养20d左右，体胚顶端萌发芽，底部生根，(图5、图6)。再将其转接到壮苗培养基(MS+0.05～2mg/l NAA+0.01～0.5mg/l BA)上。壮苗2-3代后，将再生苗移栽到盛有无菌蛭石的小瓶中炼苗，成活后置于温室生长。
固体培养条件为日光灯2500-5000lx，光照时间12h/d，(25±1)℃，湿度为(65±5)％。
固体培养接种量为250ml三角瓶含50ml琼脂固化培养基，接7-8个外植体。
固体培养基添加蔗糖3％，琼脂0.5％，调节pH(5.85±0.05)，灭菌时间为121℃，25min。
液体培养基添加蔗糖3％，调节pH(5.85±0.05)，灭菌时间为121℃，25min。
液体悬浮培养条件为室内散射光下光照为8-10h/d，25±1℃，120r/min。
参见附1为本发明在固体培养基上由外植体诱导形成的胚性愈伤；图2、3、4为本发明胚性愈伤经液体悬浮培养不同时期后，在其表面或内部形成的不同发育时期的胚状体；图5、6为本发明成熟体胚转接到固体培养基上培育不同时期后形成的再生植株；具体实施方式
下面用本发明的实施例来进一步说明本发明的实质内容，但不能解释为本发明被下面这些实施例所限制。
实施例1愈伤组织诱导新疆雪莲(Saussurea involucrata Kar.et Kir.)，种子来自新疆和静地区。称取雪莲种子1g(约250粒)，流水冲洗1小时，75％的乙醇消毒50s，0.1％的HgCl2溶液消毒20min后，接种到MS培养基上，10d后有70％种子萌发，培养基添加蔗糖3％，琼脂0.5％，调节pH5.85±0.05，灭菌条件为121℃，20min，培养条件室内散射光下光照为8-10h/d，25±1℃，湿度为(65±5)％；将生长20d左右的无菌苗切成0.5cm2的小段，接种到琼脂固化MS+0.5mg/l 2，4-D+1mg/l BA的培养基上，培养基添加蔗糖3％，琼脂0.5％，调节pH5.85±0.05，灭菌条件为121℃，20min，固体培养接种量为250ml三角瓶含50ml琼脂固化培养基，接7-8个外植体，培养条件日光灯2500lx，光照12h/d，25±1℃，湿度为65±5％；培养30±5d后，90％以上的外植体可诱导出愈伤。诱导出的愈伤有两种胚性愈伤(淡黄色，颗粒状，质地紧实，图1)和非胚性愈伤(透明，水渍状，质地松散或者黄绿色，块状，质地密实)。培养一个月后，对诱导出的愈伤进行第一次继代，继代培养基MS+0.1mg/l 2，4-D，固体培养接种量为250ml三角瓶含50ml琼脂固化培养基，接7-8个外植体，培养条件日光灯2500lx，光照12h/d，25±1℃，湿度为(65±5)％；体胚诱导第一次继代20d后，挑选黄绿色，颗粒状，质地紧实的胚性愈伤，转接到250ml，内含50ml液态体胚分化培养基MS+0.1mg/l 2，4-D的摇瓶中，进行悬浮培养，接种量为3％(W/V)，10d后对摇瓶进行继代，继代培养基为含0.05mg/l 2，4-D的MS培养基，交替继代，随着摇瓶内生物量的不断增大，继代周期相应缩短为7±2d，培养基添加蔗糖3％，调节pH5.85±0.5，灭菌条件为121℃，20min，培养条件室内散射光下光照为8-10h/d，25±1℃，120r/min；体胚成熟继代3次后，胚性愈伤表面产生颗粒状的白色突起，为体细胞胚发育的球形胚阶段(图2)，将继代培养基中除去2，4-D，加入25mg/lPEG6000，相同培养基继代两次后，逐渐降低PEG浓度，培养条件室内散射光下光照为8-10h/d，25±1℃，120r/min；待体细胞胚发育到鱼雷形胚(图3)阶段，加入2mg/LGA3，相同培养基继代两次，此后逐渐降低GA3浓度，培养条件室内散射光下光照为8-10h/d，25±1℃，120r/min；植株再生继代培养几次后，体细胞胚发育到子叶形胚(图4)，此时将其转接到琼脂固化培养基MS+5mg/LGA3上，培养基添加蔗糖3％，琼脂0.7％，调节pH5.85±0.5，灭菌时间为121℃，20min，培养条件日光灯2500lx，光照12h/d，25±1℃，湿度为(65±5)％；培养20d左右，体胚顶端萌发芽，底部生根，(图5、图6)。再将其转接到壮苗培养基MS+2mg/l NAA+0.5mg/l BA上，培养基添加蔗糖3％，琼脂0.5％，调节pH5.85±0.5，灭菌条件为121℃，20min。培养条件日光灯2500lx，光照12h/d，25±1℃，湿度为(65±5)％；将壮苗2-3代后的再生苗移栽到盛有无菌蛭石的小瓶中炼苗，成活后置于温室生长。
实施例2愈伤组织诱导新疆雪莲(Saussurea involucrata Kar.et Kir.)，种子来自新疆和静地区。称取雪莲种子2g(约500粒)，流水冲洗1小时，75％的乙醇消毒60s，0.1％的HgCl2溶液消毒15min后，接种到MS培养基上，10d后约有70％种子萌发，培养基添加蔗糖3％，琼脂0.5％，调节pH5.85±0.05，灭菌时间为121℃，20min，培养条件室内散射光下光照为8-10h/d，25±1℃，湿度为(65±5)％；将生长20d左右的无菌苗切成0.5cm2的小段，接种到琼脂固化MS+0.5mg/l 2，4-D+0.05mg/l BA的培养基上，培养基添加蔗糖3％，琼脂0.5％，调节pH5.85±0.05，灭菌条件为121℃，20min，固体培养接种量为250ml三角瓶含50ml琼脂固化培养基，接7-8个外植体，培养条件日光灯5000lx，光照12h/d，25±1℃，湿度为(65±5)％；培养30±5d后，90％以上的外植体可诱导出愈伤。诱导出的愈伤有两种胚性愈伤(淡黄色，颗粒状，质地紧实，图1)和非胚性愈伤(透明，水渍状，质地松散或者黄绿色，块状，质地密实)，培养一个月后，对诱导出的愈伤进行第一次继代，继代培养基MS+0.08mg/l 2，4-D，固体培养接种量为250ml三角瓶含50ml琼脂固化培养基，接7～8个外植体，培养条件日光灯3500lx，光照12h/d，25±1℃，湿度为(65±5)％；体胚诱导第一次继代20d后，挑选黄绿色，颗粒状，质地紧实的胚性愈伤，转接到250ml，内含50ml液态体胚分化培养基(MS+0.05mg/l 2，4-D)的摇瓶中，进行悬浮培养，接种量为3％(W/V)，11d后对摇瓶进行继代，继代培养基为不含激素的MS培养基，交替继代，随着摇瓶内生物量的不断增大，继代周期相应缩短为7±2d，培养基添加蔗糖3％，调节pH5.85±0.5，灭菌时间为121℃，20min，培养条件室内散射光下光照为8-10h/d，25±1℃，120r/min；体胚成熟继代4次后，胚性愈伤表面产生颗粒状的白色突起，为体细胞胚发育的球形胚阶段(图2)，将继代培养基中除去2，4-D，加入5mg/lPEG6000，相同培养基继代两次后，逐渐降低PEG浓度，培养条件室内散射光下光照为8-10h/d，25±1℃，120r/min；待体细胞胚发育到鱼雷形胚(图3)阶段，加入0.05/1GA3，相同培养基继代两次，此后逐渐降低GA3浓度，培养条件室内散射光下光照为8-10h/d，25±1℃，120r/min。；植株再生继代培养几次后，体细胞胚发育到子叶形胚(图4)，此时将其转接到琼脂固化培养基MS+5mg/lGA3上，培养基添加蔗糖3％，琼脂0.7％，调节pH5.85±0.5，灭菌时间为121℃，20min，培养条件日光灯3500lx，光照12h/d，25±1℃，湿度为(65±5)％；培养20d左右，体胚顶端萌发芽，底部生根，(图5、图6)，再将其转接到壮苗培养基(MS+0.05mg/l NAA+0.01mg/l BA)上，培养基添加蔗糖3％，琼脂0.5％，调节pH(5.85±0.5)。灭菌条件为121℃，20min，培养条件日光灯3500lx，光照12h/d，25±1℃，湿度为(65±5)％；将壮苗2-3代后的再生苗移栽到盛有无菌蛭石的小瓶中炼苗，成活后置于温室生长。
实施例3愈伤组织诱导新疆雪莲(Saussurea involucrata Kar.et Kir.)，种子来自新疆和静地区。称取雪莲种子3g(约700粒)，流水冲洗1小时，75％的乙醇消毒55s，0.1％的HgCl2溶液消毒18min后，接种到MS培养基上，10d后约有70％种子萌发，培养基添加蔗糖3％，琼脂0.5％，调节pH5.85±0.05，灭菌条件为121℃，20min，培养条件室内散射光下光照为8-10h/d，25±1℃，湿度为(65±5)％；将生长20d左右的无菌苗切成0.5cm2的小段，接种到琼脂固化MS+0.5mg/l 2，4-D+0.5mg/l BA的培养基上，培养基添加蔗糖3％，琼脂0.5％，调节pH5.85±0.05，灭菌条件为121℃，20min，固体培养接种量为250ml三角瓶含50ml琼脂固化培养基，接7-8个外植体，培养条件日光灯5000lx，光照12h/d，25±1℃，湿度为(65±5)％；培养30±5d后，90％以上的外植体可诱导出愈伤。诱导出的愈伤有两种胚性愈伤(淡黄色，颗粒状，质地紧实，图1)和非胚性愈伤(透明，水渍状，质地松散或者黄绿色，块状，质地密实)。培养一个月后，对诱导出的愈伤进行第一次继代，继代培养基MS+0.08mg/l 2，4-D，固体培养接种量为250ml三角瓶含50ml琼脂固化培养基，接7-8个外植体，培养条件日光灯5000lx，光照12h/d，25±1℃，湿度为(65±5)％；体胚诱导第一次继代20d后，挑选黄绿色，颗粒状，质地紧实的胚性愈伤，转接到250ml，内含50ml液态体胚分化培养基(MS+0.08mg/l 2，4-D)的摇瓶中，进行悬浮培养，接种量为3％(W/V)，10±2d后对摇瓶进行继代，继代培养基为MS培养基，交替继代，随着摇瓶内生物量的不断增大，继代周期相应缩短为7±2d，培养基添加蔗糖3％，调节pH5.85±0.5，灭菌条件为121℃，20min，培养条件室内散射光下光照为8-10h/d，25±1℃，120r/min；体胚成熟继代3次后，胚性愈伤表面产生颗粒状的白色突起，为体细胞胚发育的球形胚阶段(图2)，将继代培养基中除去2，4-D，加入15mg/lPEG6000。相同培养基继代两次后，逐渐降低PEG浓度，培养条件室内散射光下光照为8-10h/d，25±1℃，120r/min；待体细胞胚发育到鱼雷形胚(图3)阶段，加入1mg/LGA3，相同培养基继代两次，此后逐渐降低GA3浓度，培养条件室内散射光下光照为8-10h/d，25±1℃，120r/min；植株再生继代培养几次后，体细胞胚发育到子叶形胚(图4)。此时将其转接到琼脂固化培养基MS+5mg/LGA3上，培养基添加蔗糖3％，琼脂0.7％，调节pH5.85±0.5，灭菌条件为121℃，20min，培养条件日光灯5000lx，光照12h/d，25±1℃，湿度为(65±5)％；培养20d左右，体胚顶端萌发芽，底部生根，(图5、图6)。再将其转接到壮苗培养基(MS+1mg/l NAA+0.02mg/l BA)上，培养基添加蔗糖3％，琼脂0.5％，调节pH5.85±0.5，灭菌条件为121℃，20min，培养条件日光灯5000lx，光照12h/d，25±1℃，湿度为(65±5)％；将壮苗2-3代后的再生苗移栽到盛有无菌蛭石的小瓶中炼苗，成活后置于温室生长。
权利要求
1.一种雪莲体胚一步成苗的方法，其特征在于按下列步骤进行a、选用雪莲种子，流水冲洗1小时，75％的乙醇消毒50-60s，0.1％的HgCl2溶液消毒15-20min后，接种到MS培养基上，10天后有70％种子萌发，培养基添加蔗糖3％，琼脂0.5％，调节pH5.85±0.5，灭菌条件为121℃，20min，培养条件室内散射光下光照为8-10h/d，25±1℃，湿度为65±5％；b、将生长20天的无菌苗切成0.5cm2的小段，接种到琼脂固化MS+0.5mg/l 2，4-D+0.05-1mg/l BA的培养基上，培养基添加蔗糖3％，琼脂0.5％，调节pH5.85±0.05，灭菌条件为121℃，20min，固体培养接种量为250ml三角瓶含50ml琼脂固化培养基，接7-8个外植体，培养条件日光灯2500-5000lx，光照时间12h/d，25±1℃，湿度为65±5％；c、30±5天后，90-95％的外植体诱导出愈伤，培养一个月后，对诱导出的愈伤进行第一次继代，继代培养基MS+0.05-0.1mg/l2，4-D，固体培养接种量为250ml三角瓶含50ml琼脂固化培养基，接7-8个外植体，培养条件日光灯2500-5000lx，光照时间12h/d，25±1℃，湿度为65±5％；d、第一次继代20天后，挑选黄绿色，颗粒状，质地紧实的胚性愈伤，转接到250ml，内含50ml液态体胚分化培养基MS+0.05-0.1mg/l 2，4-D的摇瓶中，进行悬浮培养，接种量为3％W/V，10±2天后对摇瓶进行继代，继代培养基为含或不含0.05mg/l 2，4-D的MS培养基，交替继代，灭菌条件121℃，20min，培养条件室内散射光下光照为8-10h/d，25±1℃，120r/min；e、继代3-4次后，胚性愈伤表面产生颗粒状的白色突起，继代培养基中除去2，4-D，加入5-25mg/l PEG6000，相同培养基继代两次后，逐渐降低PEG浓度，培养条件室内散射光下光照为8-10h/d，25±1℃，120r/min；f、待体细胞胚发育到鱼雷形胚阶段，加入0.05-2mg/l GA3，相同培养基继代两次后，逐渐降低GA3浓度，培养条件室内散射光下光照为8-10h/d，25±1℃，120r/min；g、待体胚发育到子叶形胚，将其转接到琼脂固化培养基MS+5mg/LGA3上，培养基添加蔗糖3％，琼脂0.7％，调节pH5.85±0.05，灭菌时间为121℃，20min，培养条件日光灯2500-5000lx，光照时间12h/d，25±1℃，湿度为65±5％；h、培养20天，体胚顶端萌发芽，底部生根，再将其转接到壮苗培养基MS+0.05-2mg/l NAA+0.01-0.5mg/l BA上，培养基添加蔗糖3％，琼脂0.5％，调节pH5.85±0.5，灭菌条件为121℃，20min，培养条件日光灯2500-5000lx，光照时间12h/d，25±1℃，湿度为65±5％，壮苗2-3代后，将再生苗移栽到盛有无菌蛭石的小瓶中炼苗，成活后置于温室生长。
全文摘要
本发明涉及一种雪莲体胚一步成苗的方法，该方法是根据体胚发生原理，通过间接体胚发生方式(即经愈伤阶段形成体胚)得到体胚，实现了雪莲体胚同时生根生芽，一步转化成苗。该方法操作简单，为雪莲大面积人工种植提供了一条新的途径。为雪莲大面积人工种植奠定基础。
文档编号C12N5/04GK1899030SQ200610092920
公开日2007年1月24日 申请日期2006年6月7日 优先权日2006年6月7日
发明者贾莉芳, 王晓军, 赵民安, 林侃, 付晓春 申请人:中国科学院新疆理化技术研究所