专利名称：基于巯基含量检测技术的acat抑制剂高通量筛选模型的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种完善的基于巯基含量检测技术的ACAT抑制剂高通量筛选技术平台，该技术平台可用于筛选出一批ACAT抑制剂创新药物候选化合物和先导化合物，此类药物对于预防和\或治疗高脂血症、动脉粥样硬化及相关的脂代谢紊乱疾病。
背景技术：
脂酰辅酶A胆固醇酰基转移酶(Acyl-CoAcholesterolacyltransferase，ACAT)发现于二十世纪五十年代，位于细胞内质网上，催化长链脂肪酰辅酶A和胆固醇共价结合形成胆固醇酯(CE)。ACAT和DGAT(脂酰辅酶A二酰基甘油酰基转移酶，Acyl-CoAdiacylglycerol acyltransferase，DGAT)在合成中性脂质、装配和分泌脂蛋白中有重要作用，而ACAT在巨噬细胞合成胆固醇酯形成泡沫细胞中起重要作用。生物体内的胆固醇主要有两个来源1、外源性胆固醇食物中胆固醇(主要以CE形式存在)经水解后形成游离型胆固醇，在肠道被吸收进入小肠上皮细胞；2、内源性胆固醇肝脏通过受体获取的脂蛋白经水解后形成的游离胆固醇以及肝脏自身合成的胆固醇。此两个来源的胆固醇均在ACAT的作用下酰化形成CE。ACAT与血胆固醇水平及动脉粥样硬化有很密切的关系(1)促进食物中胆固醇吸收；(2)参与肝中脂蛋白装配；(3)维持细胞内胆固醇代谢平衡。
ACAT抑制剂的药理作用1、降血脂抑制小肠和肝脏的ACAT，阻止食物中胆固醇的吸收和肝中脂蛋白装配，增加肝中游离型胆固醇的分解利用以及胆汁的排泄。
2、抗动脉粥样硬化动脉粥样硬化形成的主要机制是内皮损伤导致单核细胞在内皮细胞受损处粘附，血小板凝集。而内皮功能障碍导致LDL和其他类型脂蛋白介导的胆固醇的渗透，单核细胞进入动脉内膜变为巨噬细胞，在不经调节的情况下，通过“清道夫受体”吞噬氧化型低密度脂蛋白，导致细胞内胆固醇酯微滴的蓄积，随后变为泡沫细胞在内膜中死亡，并在内膜上积累胆固醇酯使内膜增厚。同时，平滑肌细胞也迁入内膜，发生类似上述的过程。这些过程不断重复，产生粥样硬化斑块将覆盖整个血管腔，产生动脉粥样硬化。因此，在动脉内膜巨噬细胞和平滑肌细胞中过量积累的胆固醇酯是导致动脉粥样硬化的一个重要因素。由于细胞可主动摄入胆固醇酯而造成细胞内过量蓄积，而过量的游离型胆固醇将被细胞排出，所以抑制动脉内膜细胞的ACAT，使酯化过程受阻，防止胆固醇酯过量蓄积，可直接起到抗动脉粥样硬化的作用。另一方面，由于抑制小肠和肝脏的ACAT，降低血脂含量，将间接起到抗动脉粥样硬化的作用。
因此，ACAT抑制剂可有效阻断ACAT的酯化作用，降低血脂，直接和间接的对抗动脉粥样硬化，具有强大的发展潜力，必将成为一种新型的降血脂、抗动脉粥样硬化及治疗相关的脂代谢紊乱疾病等的药物。
现已建立的ACAT抑制剂药物筛选技术平台采用放射免疫测定法，反应原理。用14C标记ACAT的底物长链脂肪酰辅酶A，反应后萃取提纯反应产物14C长链脂肪酰胆固醇酯，用液闪计数仪测出含量，计算出酶活性。其特点是灵敏度高，但试剂费用昂贵，步骤复杂，仪器设备要求高，放射性对实验操作者有损害，放射性废物有污染，不宜于高通量筛选。故本研究拟建立方法简便易行，费用较低，无放射性，仪器设备要求低，适用于高通量筛选的筛选平台。
综上所述，ACAT抑制剂在降血脂、抗动脉粥样硬化及治疗相关的脂代谢紊乱疾病等方面有重要的作用，但目前尚未有良好的ACAT抑制剂用于临床，因此ACAT抑制剂药物筛选技术的研究与开发有很大的施展空间。
发明内容
本发明的目的之一在于建立以测定巯基含量作为检测指标的ACAT抑制剂高通量药物筛选方法。
本发明的目的之二在于建立ACAT抑制剂高通量药物筛选方法，筛选大量的化合物和天然产物，发现一批ACAT抑制剂创新药物候选化合物和先导化合物。
因此，为了完成本发明的上述目的，本发明主要涉及建立ACAT抑制剂高通量药物筛选方法，该研究结果可用于研发预防和治疗高脂血症和动脉粥样硬化及相关的脂代谢紊乱疾病的ACAT抑制剂。
本筛选方法的原理，R-SH+5，5’-二硫双-C2-硝基苯甲酸(DTNB)→2-硝基-5-巯基苯甲酸(呈亮黄色)，测定2-硝基-5-巯基苯甲酸在412nm处的吸光度(OD值)确定ACAT催化反应的产物之一HSCoA的量，计算出ACAT酶的催化活性。ACAT抑制剂将抑制ACAT酶的催化活性，减少产物HSCoA的量，使显色反应变浅，从而筛选出ACAT抑制剂。
图1Forlin法定蛋白标准曲线。
图2肝微粒体不同稀释梯度蛋白含量曲线。
图3GSH巯基含量标准曲线。
图4L-Cys巯基含量标准曲线。
图5不同蛋白含量的肝微粒体中巯基浓度曲线。
图6不同蛋白浓度肝微粒体液的催化反应速度曲线。
具体实施例方式
下述实施例具体显示本发明的应用。但本实施例不限定本发明的使用范围。
实施例1肝微粒体的提取及蛋白含量的确定材料[主要试剂]生理盐水、牛血清蛋白(BSA)、Tris、蔗糖、氯化镁、氢氧化钠、无水碳酸钠、硫酸铜、酒石酸钾、弗林酚，弗林酚为Sigma试剂，生理盐水为医用注射液，其余试剂均为国产分析纯试剂。
●TMS缓冲液Tris 6.05g，氯化镁609mg，蔗糖68.4g，加水至1L，浓盐酸调PH至7.4。
定蛋白试剂●400μg/ml BSA溶液4mg牛血清蛋白，定容至10ml●A液0.2mol/L氢氧化钠，4％无水碳酸钠1∶1混合●B液1％硫酸铜，2％酒石酸钾1∶1混合●C液A液/B液＝50∶1(当天用当天配)弗林酚试剂弗林酚/生理盐水(v/v)1∶1混合[主要仪器]天平、PH计、匀浆机、低温离心机、低温冰柜、酶标仪[实验材料]Wister大鼠5只，雄性，体重250g左右。
方法[匀浆制备]大鼠断头处死，迅速取出肝脏，称重剪碎后按W/V＝1/5加入TMS缓冲液，内切式匀浆器制成匀浆(冰浴中进行)，12,000g离心15分钟，取上清液在100,000g离心1小时，弃去上清液，沉淀板加TMS缓冲液制成均匀混合体系，即得到肝微粒体液，于-70℃冰箱保存备用。
按表1操作表1Forlin法定蛋白标准曲线的制备
肝微粒体液原液中加入TMS缓冲液，稀释为下列浓度梯度10、20、30、40、50、60、70、80倍取不同梯度的肝微粒体稀释液，C液200μl，混匀，反应10min，加入酚试剂20μl，迅速混匀，室温反应30min后，酶标仪λ＝492nm测OD值结果及分析蛋白含量标准曲线见图1不同肝微粒稀释体液蛋白含量曲线见图2实施例2巯基浓度标准曲线的制备材料[主要试剂]BSA、5，5’-二硫双-C2-硝基苯甲酸(DTNB)、GSH、L-Cys、EDTA[主要试剂配制]●GSH储备液的配置30.7mg GSH，0.68g BSA，0.3722g EDTA溶于100ml水中●L-Cys储备液的配置12.1mgL-Cys，0.68g BSA，0.3722gEDTA溶于100ml水中
●10(-3)mol/l DTNB溶液39.6mg DTNB溶于10ml甲醇中方法[巯基浓度标准曲线的制备]将GSH储备液及L-Cys储备液分别加入生理盐水，等比稀释为10(-4)、3.33*10(-5)、1.11*10(-5)、3.7*10(-6)、1.23*10(-6)、4.1*10(-7)、1.4*10(-7)mol/l，上述浓度梯度的稀释液各取45μl，加入1mmol/LDTNB15ul，混匀反应15分后，412nm测OD值[不同蛋白浓度肝微粒体液的巯基浓度曲线]肝微粒体液原液中加入TMS缓冲液，稀释为下列浓度梯度10、20、30、40、50、60、70、80倍取上述不同梯度的肝微粒体稀释液各45μl，加入1mmol/LDTNB15ul，混匀反应15分后，412nm测OD值[巯基显色反应OD值在两小时内的稳定性]取上述不同梯度的肝微粒体稀释液各45μl，加入1mmol/LDTNB15ul，混匀室温反应15min、30min、60min、120min后，于412nm测OD值[统计方法]以SPSS统计软件进行数据分析结果及分析巯基浓度标准曲线见图3和图4由GSH和L-Cys巯基含量标准曲线可知，DTNB与巯基的显色反应线性较佳，重复性好。
不同蛋白浓度肝微粒体液的巯基浓度曲线见图5由图5可知采用提取肝脏微粒体代替ACAT，而肝脏微粒体提取纯度较低，肝脏组织中有巯基存在，对实验结果有一定干扰。但同一次提取的肝脏微粒体中巯基含量基本固定，故可于实验结果中减去。
表2巯基显色反应OD值在两小时内的稳定性
由表2可知，巯基显色反应OD值在两小时内无明显变化，经SPSS统计软件进行数据分析，p值均大于80％，无显著性差异。故巯基显色反应选定反应时间为15min。
实施例3ACAT酶活性测定条件的选择材料[主要试剂]磷酸钾、BSA、丙酮、甲醇、胆固醇、油酰CoA、5，5’-二硫双-C2-硝基苯甲酸(DTNB)[主要试剂配制]●400μg/ml BSA溶液4mg牛血清蛋白，定容至10ml●磷酸钾缓冲液(1M磷酸钾，pH7.4)21.2g磷酸钾溶于100ml水中，加浓盐酸调pH至7.4●0.5mg/ml胆固醇溶液5mg胆固醇溶于10ml丙酮●1mg/ml油酰基辅酶A10mg油酰基辅酶A溶于10ml水中●10(-3)mol/l DTNB溶液39.6mg DTNB溶于10ml甲醇中方法[ACAT酶活性测定条件的选择]将60、30、20、10倍的肝微粒体稀释液各取5μl，加入磷酸钾缓冲液5μl，BSA 5μl，胆固醇5μl，油酰CoA 5μl，混匀，37℃孵育45min后，加入15μl DTNB，混匀，室温反应15min后，酶标仪λ＝412nm测OD值。根据反应结果选定合适的肝微粒体稀释液作为药物筛选的肝微粒体浓度。
结果及分析[ACAT酶活性测定条件的选择]不同蛋白浓度肝微粒体液的催化反应速度曲线见图6由图6可知，不同蛋白浓度的肝微粒体液在反应时间均为45min时，底物(5μl 0.5mg/ml胆固醇溶液，5μl 1mg/ml油酰基辅酶A)足量，显色剂(15μl 10(-3)mol/l DTNB溶液)足量；低蛋白浓度的肝微粒体液显色反应明显，同时，蛋白浓度越高，其本身所含巯基显色反应越明显，对ACAT催化反应的干扰越大，故选定低蛋白浓度的肝微粒体液(肝微粒体原液稀释60倍，蛋白浓度0.22mg/ml)进行ACAT催化反应。
总结ACAT催化反应的条件为5μl磷酸钾缓冲液(1M磷酸钾，pH7.4)，5μl 400μg/mlBSA，肝微粒体液蛋白浓度0.22mg/ml，5μl 0.5mg/ml胆固醇溶液，5μl 1mg/ml油酰基辅酶A，37℃孵育45min，加入1mmol/LDTNB 15ul室温反应15分后，412nm测OD值实施例4ACAT抑制剂的筛选材料[主要试剂]磷酸钾、BSA、丙酮、甲醇、胆固醇、油酰CoA、5，5’-二硫双-C2-硝基苯甲酸(DTNB)[主要试剂配制]●400μg/ml BSA溶液4mg牛血清蛋白，定容至10ml●磷酸钾缓冲液(1M磷酸钾，pH7.4)21.2g磷酸钾溶于100ml水中，加浓盐酸调pH至7.4●0.5mg/ml胆固醇溶液5mg胆固醇溶于10ml丙酮●1mg/ml油酰基辅酶A10mg油酰基辅酶A溶于10ml水中●10(-3)mol/l DTNB溶液39.6mg DTNB溶于10ml甲醇中方法[ACAT抑制剂的筛选]按Tab3操作Tab3ACAT抑制剂的筛选方法
权利要求
1.一种脂酰辅酶A胆固醇酰基转移酶抑制剂的高通量筛选方法，其特征在于，用动物肝脏微粒体代替ACAT酶用于ACAT酶活性的测定。
2.根据权利要求1的方法，其特征在于，该方法包括巯基浓度-OD值标准曲线的制备。
3.根据权利要求2的方法，其特征在于，所述的巯基浓度-OD值标准曲线的制备是将含巯基的化合物作为标准品。
4.根据权利要求1的方法，其特征在于，该方法包括显色反应。
5.将权利要求1所述的筛选方法用于筛选脂酰辅酶A胆固醇酰基转移酶抑制剂。
6.一种以显色方法测定ACAT酶活性的方法。
全文摘要
本发明公开了一种完善的基于巯基含量检测技术的ACAT抑制剂高通量筛选技术平台，该技术平台可用于筛选出一批ACAT抑制剂创新药物候选化合物和先导化合物，此类药物对于预防和\或治疗高脂血症、动脉粥样硬化及相关的脂代谢紊乱疾病等有重要作用。
文档编号C12Q1/48GK1967219SQ20061009203
公开日2007年5月23日 申请日期2006年6月7日 优先权日2005年6月7日
发明者杜冠华, 朱海波, 张岭, 严君, 臧艳桥 申请人:中国医学科学院药物研究所