专利名称：一种检测生物巯基的荧光探针及其制备方法与使用方法
技术领域：
本发明属于生物工程技术领域，尤其涉及一种检测生物巯基的荧光探针及其制备方法与使用方法。
背景技术：
巯基是细胞中化学活性最高的基团，是生物体中许多蛋白质和小分子的重要组成部分，在细胞的抗氧化系统中具有重要的作用。巯基分子的含量直接与多种疾病相关，如癌症，帕金森症，心血管疾病等。因而发展快速，灵敏，简便的检测巯基的方法在生物化学和临床化学中具有重要意义。传统的检测方法有质谱法，高效液相色谱法，电化学法，荧光法等， 而荧光法由于其高灵敏度、宽动态响应范围等特点，更重要的是能够实现对活体甚至单个细胞的实时可视化示踪，成为目前广泛采用的检测细胞内硫醇类物质的一种重要手段。鉴于此，近年来巯基荧光探针得到了充分的发展并取得了较大的进步。如发展的芳基卤化物、丹磺酰氮丙啶类、芘类等，它们具有好的选择性和灵敏度，对巯基的检测限一般在纳摩尔(nmol)左右，但这些探针自身都有较强的荧光，用于活体细胞成像时会造成较低的信噪比；苯并呋喃磺酰卤类探针，虽然自身荧光较弱但是需要在碱性及高温条件下与巯基反应，也无法应用于活体细胞的荧光成像；而乙酰卤衍生物类巯基衍生试剂，能够在室温和生理PH下与巯基迅速反应，但是光稳定性较差，容易失去荧光团，因而也难以满足生物检测和荧光成像的要求。到目前为止，能够真正用于活体细胞内巯基定位成像的高灵敏， 高响应的探针还比较少见。
发明内容
本发明针对现有技术的不足，提供一种基于2，4- 二硝基苯磺酰基修饰的二氟化硼-二吡咯甲烷类(BODIPY)化合物的可用于活细胞检测的高性能活性巯基荧光探针及其制备与使用方法。检测生物巯基的荧光探针有两部分组成2，4- 二硝基苯磺酰基为识别基团，二氟化硼-二吡咯甲烷衍生物为信息报告功能团，其结构如式I。
权利要求
1. 一种检测生物巯基的荧光探针的制备方法，其特征在于该检测生物巯基的荧光探针有两部分组成2，4- 二硝基苯磺酰基为识别基团，二氟化硼-二吡咯甲烷衍生物为信息报告功能团，其结构如下；
2. 一种检测生物巯基的荧光探针的使用方法，其特征在于该方法包括以下步骤 步骤一，测量探针分子的核磁共振波谱及高分辨质谱数据步骤二，测定探针分子对巯基的选择性将探针分子以少量DMSO溶解，再用PBS缓冲液配置成溶液；分别加入以PBS缓冲液溶解的待测样品，使最终探针分子的浓度为0.1 μ M，而待测样品的浓度为2 mM;反应0.5小时后在荧光光谱仪上进行测定，进而确定探针分子对巯基的选择性； 步骤三，测定探针分子对L-半胱氨酸的荧光-浓度曲线将探针分子以少量DMSO溶解，再用PBS缓冲液配置成溶液；分别加入不同浓度的L-半胱氨酸，使最终探针分子的浓度为0. 1 μΜ ；反应0. 5小时后在荧光光谱仪上进行测定，进而得到荧光强度对浓度变化的曲线；步骤四，测定探针分子对L-半胱氨酸的荧光-时间曲线将探针分子以少量DMSO溶解，再用PBS缓冲液配置成溶液；分别加入不同浓度的L-半胱氨酸，使最终探针分子的浓度为0.1 μ Μ，而L-半胱氨酸的浓度为2 mM;反应一定时间， 检测荧光强度，进而得到荧光强度对时间变化的曲线；步骤五，探针分子对Mel细胞中活性巯基的荧光成像检测待测Mel细胞用PBS缓冲液洗涤三次后，加入20 μ M的荧光探针分子，在37°C下孵育 10分钟后，再用PBS缓冲液洗涤细胞三次，然后进行荧光成像检测。
全文摘要
本发明公布了一种检测生物巯基的荧光探针及其制备方法与使用方法，检测生物巯基的荧光探针有两部分组成2,4-二硝基苯磺酰基为识别基团，二氟化硼-二吡咯甲烷(BODIPY)衍生物为信息报告功能团。该探针分子可简单迅速地进入活细胞，与细胞内巯基发生特异性反应，导致荧光强度显著增强，进而可用于活体细胞中活性巯基的荧光检测和成像。本发明稳定性好，能够长期保存使用，适用于活细胞生长的多种环境，具有较高的巯基检测灵敏度，抗干扰能力强，具有优秀的选择性，与其它常见生物干扰分子无作用。可简单进入活细胞和活组织，能有效实现对生物体系内巯基的单一识别,因而能够用于活体细胞的荧光成像。
文档编号C09K11/06GK102532178SQ201110439870
公开日2012年7月4日 申请日期2011年12月23日 优先权日2011年12月23日
发明者刘静, 韩益丰 申请人:浙江理工大学