专利名称：一种尼龙亲和膜的制备方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种尼龙亲和膜的制备方法和用途，特别是涉及一种以尼龙为基质、以染料Cibacron Blue F3GA为亲和基的亲和膜的制备方法及其在分离纯化木瓜蛋白酶方面的应用。
背景技术：
木瓜蛋白酶(EC3.4.22.2)是一类巯基蛋白酶，广泛存在于番木瓜(Caricapapaya)的根、茎、叶和果实内，其中在未成熟的乳汁中含量最丰富[1-2]。广泛地应用于食品行业，如啤酒的澄清和肉质的嫩化以及皮革、纺织、日化和制药工业[3-5]。木瓜蛋白酶的纯化大部分是采用沉淀法，但是这种方法仍然混有其他的蛋白酶[6]，不能达到制药工业的需求。
随着人们对纯度和安全性提出进一步的要求，色谱技术应用于木瓜蛋白酶的纯化，如离子交换色谱、亲和色谱[7-9]，该类填料特异性高，纯化倍数高，但分离速度受粒间扩散和低的轴向速率限制，压降大，分离时间长，处理量小，不能使用高的加料速度。而膜分离是一种根据分子的大小进行分离的技术，特点是表面积大、扩散路径短、操作压低、处理量大，但传统膜分离技术只有分离相对分子质量相差10倍以上的物系，不能满足生化分离的需要。
参考文献[1]M.Azarkan，A.E.Moussaoui，D.W.Wuytswinkel，G.Dehon，Y.Looze.J.Chromatogr.B，2003，790229-238. Deng Jing(邓静)，Wu Huachang(吴华昌)，Zhou Jian(周健).G.X.Light Ind.(广西轻工业)，2003，35-7. Q.H.Chen，GQ.He，Y.C.Jiao，H.Ni.Food Chem.，2006，98624-629.. S.S.Khaparde，R.S.Singhal.Bioresource Technol.，2001，781-4. F.S.Ian，M.Paul，S.Geisela.Bums，1999，25636-639. S.Nitsawang，H.K.Rajni，P.Kanasawud，Enzyme Microb.Tech.，2006，in press. D.Tombaccini，A.Mocali，E.Weber，F.Paoletti.Anal.Biochem.，2001，289231-238. E.Govrin，A.Levine.Protein Expres.Purif.，1999，15247-350. W.J.Syu，S.H.Wu，K.T.Wang.J.Chromatogr.，1983，262346-351. L.Yang，W.W.Hsiao，P.Chen，J.Membr.Sci.197(2002)185.
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种尼龙亲和膜的制备方法和应用，以弥补现有技术的不足或缺陷，满足生产和生活的需要。
为了解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案之一是一种尼龙亲和膜的制备方法，包括如下步骤(1)尼龙膜先在0.1-10M盐酸重水解10-72h，然后以10％-25％的戊二醛活化处理，活化后的尼龙膜置于0.5％-5％的壳聚糖溶液中进行化学键合，然后在70-120℃的烘箱中烘干，即得壳聚糖改性的尼龙膜；(2)把壳聚糖改性处理后的尼龙膜2-10g置于浓度为5.0-30mg/ml的50-350mlCibacron Blue F3GA染料溶液中，60℃反应0.5-3h，然后加入20-50ml浓度为20％NaCl溶液，继续反应1.0-3.0h，然后加入5.0-20ml浓度为20％的NaCO3溶液进行固色反应，反应2-10h后，取出，依次以热水，甲醇、2M NaCl，6M尿素，去离子水进行洗涤，得到所述的尼龙亲和膜，4℃保存，备用。
为了解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案之二是所述的尼龙亲和膜的用于分离纯化木瓜蛋白酶，包括如下步骤10-20张尼龙亲和膜上叠成膜堆，放入膜桥，以蠕动泵送入缓冲液和洗脱液，首先以0.05M、pH为7.0的磷酸缓冲液平衡10-20min，流速为0.1-1.0ml/min；随后以蠕动泵送入15-50ml的1.0-5.0mg/ml的木瓜蛋白酶溶液通过膜桥，然后以0.05M、pH7.0磷酸缓冲液洗去未吸附上的蛋白质；最后以0.05M、pH为8.0磷酸缓冲液配制的1.0M NaSCN进行洗脱，得到目标蛋白质木瓜蛋白酶。
本发明的有益效果是与传统的膜分离、亲和色谱相比，本发明制备的尼龙亲和膜不仅具有纯化倍数高、压降小，分析时间短、生物大分子在分离过程中变性几率小，允许较快的加料速度等特点，而且比柱亲和色谱更易实现规模化纯化分离。
具体实施例方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步详细阐述。
实施例1尼龙膜先在0.1M盐酸重水解72h，然后以10％的戊二醛活化处理，活化的尼龙膜然后置于0.5％的壳聚糖溶液中进行化学键合，然后在70℃的烘箱中烘干，即得壳聚糖改性的尼龙膜。尼龙膜上键合的壳聚糖含量按文献[10]公开的方法进行测试，测试结果壳聚糖的含量为89.6mg/g膜。
把壳聚糖改性处理后的尼龙膜2g置于浓度为5.0mg/ml的50mlCibacronBlue F3GA染料溶液中，60℃反应0.5h，然后加入20ml浓度为20％NaCl溶液，继续反应1.0h，然后加入5.0ml浓度为20％的NaCO3溶液进行固色反应，反应2h后，取出，依次以热水，甲醇、2M NaCl，6M尿素，去离子水进行洗涤，4℃保存，备用。
亲和膜组成膜堆对木瓜蛋白酶进行分离纯化包括如下步骤10张上述方法制备的亲和膜上叠成膜堆，放入膜桥，以蠕动泵送入缓冲液和洗脱液等。首先以0.05M磷酸缓冲液(pH7.0)平衡10min，流速0.1ml/min；接着送样，15ml的1.0mg/ml的木瓜蛋白酶溶液，然后以0.05M磷酸缓冲液(pH7.0)洗去未吸附上的蛋白质。最后以0.05M磷酸缓冲液(pH8.0)配制的1.0MNaSCN.进行洗脱，得到目标蛋白质木瓜蛋白酶。得到木瓜蛋白酶的活性保留率和洗脱率都在95％。
实施例2尼龙膜先在10M盐酸重水解10h，然后以25％的戊二醛活化处理，活化的尼龙膜然后置于5％的壳聚糖溶液中进行化学键合，然后在120℃的烘箱中烘干，即得壳聚糖改性的尼龙膜。尼龙膜上键合的壳聚糖含量按文献[10]公开的方法进行测试，测试结果壳聚糖的含量为90.6mg/g膜。
把壳聚糖改性处理后的尼龙膜10g置于浓度为30mg/ml的350mlCibacronBlue F3GA染料溶液中，60℃反应3h，然后加入50ml浓度为20％NaCl溶液，继续反应3.0h，然后加入20ml浓度为20％的NaCO3溶液进行固色反应，反应10h后，取出，依次以热水，甲醇、2M NaCl，6M尿素，去离子水进行洗涤，4℃保存，备用。
亲和膜组成膜堆对木瓜蛋白酶进行分离纯化包括如下步骤20张上述方法制备的亲和膜上叠成膜堆，放入膜桥，以蠕动泵送入缓冲液和洗脱液等。首先以0.05M磷酸缓冲液(pH7.0)平衡20min，流速0.1-1.0ml/min；接着送样，50ml的5.0mg/ml的木瓜蛋白酶溶液，然后以0.05M磷酸缓冲液(pH7.0)洗去未吸附上的蛋白质。最后以0.05M磷酸缓冲液(pH8.0)配制的1.0M NaSCN.进行洗脱，得到目标蛋白质木瓜蛋白酶。得到木瓜蛋白酶的活性保留率和洗脱率都在93％。
实施例3尼龙膜先在5M盐酸重水解50h，然后以15％的戊二醛活化处理，活化的尼龙膜然后置于3％的壳聚糖溶液中进行化学键合，然后在100℃的烘箱中烘干，即得壳聚糖改性的尼龙膜。尼龙膜上键合的壳聚糖含量按文献[10]公开的方法进行测试，测试结果壳聚糖的含量为89.2mg/g膜。
把壳聚糖改性处理后的尼龙膜5g置于浓度为20mg/ml的200mlCibacronBlue F3GA染料溶液中，60℃反应2h，然后加入30ml浓度为20％NaCl溶液，继续反应2h，然后加入10ml浓度为20％的NaCO3溶液进行固色反应，反应5h后，取出，依次以热水，甲醇、2M NaCl，6M尿素，去离子水进行洗涤，4℃保存，备用。
亲和膜组成膜堆对木瓜蛋白酶进行分离纯化包括如下步骤15张上述方法制备的亲和膜上叠成膜堆，放入膜桥，以蠕动泵送入缓冲液和洗脱液等。首先以0.05M磷酸缓冲液(pH7.0)平衡15min，流速0.5ml/min；接着送样，30ml的3.0mg/ml的木瓜蛋白酶溶液，然后以0.05M磷酸缓冲液(pH7.0)洗去未吸附上的蛋白质。最后以0.05M磷酸缓冲液(pH8.0)配制的1.0MNaSCN.进行洗脱，得到目标蛋白质木瓜蛋白酶。得到木瓜蛋白酶的活性保留率和洗脱率都在90％。
实施例4本发明的尼龙亲和膜对木瓜蛋白酶的吸附性能测试包括如下步骤精确称取一定量按上述方法制备的尼龙亲和膜，置于0.05M，不同pH值的缓冲液配制的木瓜蛋白酶溶液(2.0mg/ml)中，室温震荡不同时间后，测量吸附前后蛋白质溶液在280nm下的吸光度，按下式计算吸附量Q＝[(ci-ct)Vs]/m式中Q-吸附量；ci-吸附前浓度；ct-吸附后浓度； Vs-溶液体积；m-膜质量测试结果为在pH值8.0，25℃，吸附时间3h，木瓜蛋白酶原始浓度为4.0mg/ml，吸附量可达到235.3mg/g。
权利要求
1.一种尼龙亲和膜的制备方法，其特征在于，包括如下步骤(1)尼龙膜先在0.1-10M盐酸重水解10-72h，然后以10％-25％的戊二醛活化处理，活化后的尼龙膜置于0.5％-5％的壳聚糖溶液中进行化学键合，然后在70-120℃的烘箱中烘干，即得壳聚糖改性的尼龙膜；(2)把壳聚糖改性处理后的尼龙膜2-10g置于浓度为5.0-30mg/ml的50-350mlCibacron Blue F3GA染料溶液中，60℃反应0.5-3h，然后加入20-50ml浓度为20％NaCl溶液，继续反应1.0-3.0h，然后加入5.0-20ml浓度为20％的NaCO3溶液进行固色反应，反应2-10h后，取出，依次以热水，甲醇、2M NaCl，6M尿素，去离子水进行洗涤，得到所述的尼龙亲和膜，4℃保存，备用。
2.一种如权利要求1所述的尼龙亲和膜的应用，其特征在于，用于分离纯化木瓜蛋白酶。
3.根据权利要求2所述的尼龙亲和膜的应用，其特征在于，尼龙亲和膜分离纯化木瓜蛋白酶包括如下步骤10-20张尼龙亲和膜上叠成膜堆，放入膜桥，以蠕动泵送入缓冲液和洗脱液，首先以0.05M、pH为7.0的磷酸缓冲液平衡10-20min，流速为0.1-1.0ml/min，随后以蠕动泵送入15-50ml的1.0-5.0mg/ml的木瓜蛋白酶溶液通过膜桥，然后以0.05M、pH7.0磷酸缓冲液洗去未吸附上的蛋白质；最后以0.05M、pH为8.0磷酸缓冲液配制的1.0M NaSCN进行洗脱，得到目标蛋白质木瓜蛋白酶。
全文摘要
本发明公开了一种尼龙亲和膜的制备方法，包括如下步骤(1)在尼龙膜上化学键合壳聚糖，以降低尼龙膜对蛋白质的非特异性吸附，即得壳聚糖改性的尼龙膜；(2)把壳聚糖改性处理后的尼龙膜与亲和基染料Cibacron Blue F3GA的键合，得到所述尼龙亲和膜；尼龙亲和膜用于分离纯化木瓜蛋白酶。本发明的有益效果是与传统的膜分离、亲和色谱相比，本发明制备的尼龙亲和膜不仅具有纯化倍数高、压降小，分析时间短、生物大分子在分离过程中变性几率小，允许较快的加料速度等特点，而且比柱亲和色谱更易实现规模化纯化分离。
文档编号C12N9/50GK1935339SQ20061011607
公开日2007年3月28日 申请日期2006年9月15日 优先权日2006年9月15日
发明者朱利民, 聂华丽 申请人:东华大学