专利名称：通过XRCC1和ERCC2上的三个SNPs检测肺癌易感性的试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种疾病易感性检测用的试剂盒，尤其是一种检测肺癌易感性的试剂盒，通过同时检测X 射线交错互补修复基因1 (X-ray repair cross- -complementing gene 1, XliCCl)的单核苷酸多态性位点(SNP) 和切除修复复合物2(Excision Repair Cross-complementing Rodent Repair Deficiency, Complementation Group 2, ERCC2)的两个不同单核苷酸多态性位点(SNPs)来预测个体对肺癌的易感性。
背景技术：
原发性支气管肺癌，简称肺癌，为当前世界各地最常见的恶性肿瘤之一，是一种严重威胁人类健康和 生命的疾病。肿瘤细胞源于支气管粘膜或腺体，常有区域性淋巴结和血行转移，早期常有刺激性咳嗽、痰 中带血等呼吸道症状，病情进展速度与细胞的生物特性有关。
半个世纪以来,世界各国肺癌的发病率和病死率都有明显增高趋势。世界卫生组织(WHO)2000年报告 1997年全世界死于恶性肿瘤的共706.5万人，占死亡人数的12.6%，其中肺癌占恶性肿瘤死亡的19%,居 恶性肿瘤死因的第一位。我国19卯 1992年的抽样调査显示，在城市人口的肿瘤死亡中，肺癌由原来的 第4位上升为第1位，农村上升最快的也是肺癌。云南锡矿的肺癌发病率在954 1959年间为28.02/10 万，1960 1969年间为197.87/10万,1970 1979年间上升到219.10/10万，这在全世界也是罕见的。英国 著名肿瘤学家R.Peto预言如果我国不及时控制吸烟和空气污染，到2025年我国每年肺癌将超过100万， 成为世界第一肺癌大国。
病因和发病机制迄今尚未明确。 一致认为肺癌的发病与下列因素有关①吸烟(包括主动吸烟和被动 吸烟)②职业致癌因子，己被确认的致人类肺癌的职业因素包括石棉、无机砷化合物、二氯甲醚、铬及 其化合物、镍、氡、芥子气、氯乙烯、煤烟、焦油和石油中的多环芳烃、烟草的加热产物等；③空气污染 (包括室内小环境和室外大环境污染)； 电离辐射；⑤饮食与营养，美国纽约和芝加哥开展的前瞻性人 群观察的结果说明，食物中天然维生素A类、e胡萝卜素的摄入量与十几年后癌症的发生呈负相关，其中 最突出的是肺癌； 其他，美国癌症学会将结核列为肺癌的发病因素之一。有结核病者患肺癌的危险性是 正常人群的10倍。其主要组织学类型是腺癌。此外，病毒感染、真菌毒素(黄曲霉)、机体免疫功能低下、 内分泌失调以及家族遗传等因素，对肺癌的发生可能也起一定的综合作用。
近年研究表明，肺癌的发生与某些癌基因的活化及抑癌基因的失活密切相关。已经证明的几个癌基因 家族包括引起突变的ras族、放大基因的myc族、C-erB2、机制不明的bcl-2、 Kit及由野生型变异的抗癌 基因p53、 pl6和RB等。大量研究表明C-myc、 L-myc、 N-myc和RAF在小细胞肺癌中均有过度表达。 非小细胞肺癌中则常可见ras族基因的过度表达。这些深入的研究将为基因预防和治疗肺癌提供理论基础。
SNP (single nucleotide polymorphism),即单核苷酸多态性标记，是一类基于单碱基变异引起的DNA 多态性，被遗传学界称为第三代遗传标记。主要是指由基因组核苷酸水平上的变异引起的DNA序列多态性， 包括单碱基转换、颠换，以及单碱基的插入/缺失等。它是基因组中最为广泛存在的一类多态性标记，占 大约90%。这些基因组序列变异可以导致个体间表型的差异以及不同个体对疾病，特别是复杂疾病的易感 性和对环境因素、药物反应的差异。
XRCC1位于第19号染色体19ql3.2-13.3位置，全长32.3kb, mRNA全长2087bp,共有17个外显子， 编码634个氨基酸的蛋白。XRCC1编码的蛋白对因电离辐射和烷基化物引起的DNA单链断裂能起到有效 的修复作用。XRCC1编码的蛋白与DNA连接酶川、聚合酶e 、多聚ADP核糖转移酶交互作用，参与DM 的碱基切除修复(Base Excision R印air, BER)通路。众多研究显示，XRCC1基因上部分位点的多态性，与 癌症发生有密切的关系。与XRCC1相关的癌症主要有乳腺癌、头颈部鳞状细胞癌、食管癌、胃癌、结 肠癌、胰腺癌、肺癌等。
rs25487是位于第19号染色体XRCC1基因上的一个G/A多态，引起XRCC1基因编码的蛋白第399 个氨基酸由Arg变为Gln。 Arg399Gln位于第10号外显子，XRCC1蛋白BCRTI区域。在世界人群中的该 多态的频率分布，G占0.72， A占0,28左右。中国人群中的分布G为0.68， A为0.32。分子生物学研究表
明，XRCC1基因上第399号氨基酸Ai -Gln的替代加强XRCC1蛋白与DNA-致癌物加合物的结合能力， 从而影响个体的肿瘤易感性。通过大量对于大规模人群的肺癌病例对照研究，XRCC1的399贫基酸突变 位点在做单因素分析时与肺癌发生相关。ERCC2,位于第19号染色体19ql3.3位置，共有23个外显子，基因全长19.0kb, mRNA全长2355bp， 编码含761个氨基酸的蛋白。由ERCC2编码的蛋白参与转录偶联的核苷酸切除修复，它可识别与修复结 构无关的大范围的损伤，如大的加合物和胸腺嘧啶二聚体，并且是基本转录因子复合物BTF2/TFIIH的一 个组成成分。该蛋白具有ATP依赖性的DNA解旋活性，并且属于RAD3/XPD解旋酶亚家族。ERCC2的 功能缺失导致基本转录因子复合物不能正确识别DNA损伤位点，从而使碱基切除修复无法正确进行，导 致DNA上的致癌损伤积累。ERCC2基因的突变或者失活可能导致的疾病包括癌症、着色性干皮病、毛 发硫营养不良、柯凯因氏综合症。rsl3181是位于第19号染色体ERCC2基因第23号外显子段Lys751Gln的T/G多态。世界人群中的频 率约为T:G =0.798: 0.202,杂合度0.322,中国人群中的频率约为T:G =0.91: 0.09。目前的多项研究表明， Lys751Gln的氣基酸替代位于ERCC2蛋白C-末端部，这个位点的多态性与肺癌、膀胱癌、乳腺癌、皮肤 癌等疾病有关。ERCC2 Lys751Gln位点的多态现象与肺癌特别是肺鳞癌的发生存在显著关联。rsl799793是位于第19号染色体ERCC2基因第10号外显子段Asp312Asn的G/A多态。世界人群中 的频率约为G:A=0.778:0.222,中国人群中的频率约为G:A=0.94:0.06。目前的多项研究表明，该位点的多 态会导致ERCC2参与构成的转录因子复合物的性能发生弱化，从而使得对DNA损伤修复的能力下降，转 录因子的能力也同时发生下降，导致一系列诸如肺癌，前列腺癌等疾病的发生。ERCC2Asp312Asn多态性 与肺癌特别是肺鳞癌发生有显著关联，该位点的多态现象被认为是中国人群中肺癌遗传易感因素之一。国内外的大量的关联分析表明，XRCC1基因上的rs25487号SNP位点基因型为A时肺癌的发生几率增 加；ERCC2基因上rsl3181号SNP位点基因型为G时肺癌的发生几率增加；ERCC2基因上rsl799793号SNP 位点基因型为A时肺癌的发生几率增加。这三个SNPs位点的多态性可用于评估个体对肺癌的易感性。发明内容基于XRCC1基因上的rs25487号SNP位点、ERCC2基因上的rsl3181号SNP位点和ERCC2基因上的 rsl799793号SNP位点的多态性可用于评估个体对肺癌的易感性的基础上，本发明提供一种检测肺癌易感 性的试剂盒。该试剂盒包括:检测XRCC1基因上的rs25487号SNP位点的特异性引物对及特异性炎光探针、检测ERCC2 基冈上的rsl3181号SNP位点的特异性引物对及特异性荧光探针、检测ERCC2基因上的rsl799793号SNP 位点的特异性引物对及特异性荧光探针、Taq酶、dNTP混合液、MgCl2溶液、荧光定量PCR反应缓冲液、 去离子水。本试剂盒中所述的特异性引物对是指针对XRCC1基因上的rs25487号SNP位点、ERCC2基因上的 rsl3181号SNP位点和ERCC2基因上的rsl799793号SNP位点而设计，能特异性扩增出耙位点的DNA片段。 设计这类引物对是本领域技术人员能够轻易完成的。优选地，试剂盒中包含具有SEQ ID NO: l和2所示 序列的引物对、具有SEQ ID NO: 3和4所示序列的引物对以及具有SEQ ID NO: 5和6所示序列的引物对。 特异性引物对可用常规的合成技术进行合成。本领域的技术人员能够理解，本发明的引物不限于这三对引 物。本试剂盒中所述的特异性荧光探针是指针对XRCC1基因上的rs25487号SNP位点、ERCC2基因上的 rsl3181号SNP位点和ERCC2基因上的rsl799793号SNP位点而设计，能通过荧光定量PCR技术特异性检 测出这三个SNPs位点肺癌易感基因型的探针。设计这类探针是本领域技术人员能够轻易完成的。优选地， 试剂盒中包含具有SEQ ID NO: 7、 8和9所示序列的Taqman探针。特异性荧光探针可用常规的合成技术 进行合成。本领域的技术人员能够理解，本发明的特异性荧光探针不限于这H条探针，所有可用于荧光定 PCR检测XRCC1基因上的rs25487号SNP位点、ERCC2基因上的rsl3181号SNP位点和ERCC2基因上的 rsl799793号SNP位点的探针均在本发明范围内。本发明试剂盒的组分和含量包括1M1 10 X荧光定霣PCR反应缓冲液，0. 1^1 25raM dNTP混合液，0. 5nl 25mM MgCl2溶液，0.02nl (5units/nl) Taq DNA聚合酶，20nM特异性引物对(六条)各0.225^1,IO一特异性荧光探针(三条)各0.25^1，去离子水4.28nl。本试剂盒供一人份检测应用，试剂盒的保存温度为-20'C。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规 条件，或按照厂商所建议的条件。实施例l.检测试剂盒的使用 步骤l: DNA模板的抽取 用硅胶吸附法抽提口腔上皮细胞的基因组DNA。 步骤2:荧光定量PCR反应使用可检测肺癌易感性的荧光定量PCR检测试剂盒，其中，含有下列引物对和荧光探针:有义引物l:5'-TMCTGGCATCnCACTTCT -3'卿IDNO:1)Tm值为反义引物l:5，- TCCAGATTCCTGGCATTGC -3'(SEQIDNO:2)Tm值为58'C有义引物2:5,- ACTCAGGAGTCACCAGGAA -3'(SEQIDNO:3)Tm值为58'C反义引物2:5'-TCTGTTCTCTGCAGGAGGA -3'(SEQIDNO:4)Tm值为58*C有义引物3:5'- ATCAAAGAGACAGACGAGCA -3，(SEQIDNO:5)Tm值为58'C反义引物3:5'-TCAGGAAGCCCAGGAAAT -3'(SEQIDNO:6)Tm值为5化炎光探针1:5'-CGGCTGCCCTCCCAGAGG -3'(SEQIDNO:7)Tm值为64,C炎光探针2:5'- AATCTGCTCTATCCTCTGCAGC -3'(SEQIDNO:8)Tm值为66'C炎光探针3:5，- TGCCCMCGAAGTGCTGCAG -3'(SEQIDNO:9)Tm值为64'C有义引物1，反义引物1和荧光探针1特异地针对检测XRCC1基因上的rs25487号SNP位点多态性； 有义引物2,反义引物2和荧光探针2特异地针对检测ERCC2基因上的rsl3181号SNP位点多态性；有义 引物3,反义引物3和荧光探针3特异地针对检测ERCC2基因上rsl799793号SNP位点多态性。荧光定量PCR反应体系为总体积10^1，包含浓度为20ngAxl的DNA模板2pl、 1^1 10 X荧光定量PCR 反应缓冲液、0. 1^1 25mM dNTP混合液、0. 5pl 25mM MgCl2溶液、0.02^1 (5units/nl) Taq DNA聚合酶、 20一的有义引物1、 2和3各0.225nl、 20nM的反义引物l、 2和l 3各0. 225^1、 10nM的荧光探针l、 2和 3各0.25nl，去离子水4.28nl。在ABI9700型PCR扩增仪上进行反应，反应条件为50'C、 2分钟，95'C、 IO分钟，进行60个循环的 95'C、 30秒，6(TC、 l分钟。反应结束后在ABI7900型荧光定量PCR仪上读取样品荧光量。步骤3: SNP基因型分析将荧光定量PCR仪上显示的最终样品荧光量和正常对照相对比,炎光探针1最终的炎光信号明显高于 正常对照，说明被检测DNA的XRCCl基因上的rs25487号SNP位点基因型携带有A型，为肺癌易感型炎
光探针2最终的荧光信号明显高于正常对照，说明被检测DNA的ERCC2基因上rsl3181号SNP位点基因型 携带有G型，为肺癌易感型荧光探针3最终的荧光信号明显高于正常对照，说明被检测DNA的ERCC2基 因上rsl799793号SNP位点基因型携带有A型，为肺癌易感型。实施例2.指导人们主动预防肺癌的服务目前在上海主健生物工程有限公司已经开展了这项服务。 步骤l: DNA提取对被检测者进行服务前咨询，由被检测者签署知情同意书，填写生活饮食习惯问巻调査表。依照取样 盒中的指示使用口腔采样拭进行口腔上皮细胞取样，采用硅胶吸附法进行口腔上皮细胞的DNA抽提。 步骤2:基因分型检测使用本发明提供的试剂盒，对被检测者DNA的XRCC1基因上的rs25487号SNP位点、ERCC2基因上 rsl3181号SNP位点和ERCC2基因上rsl799793号SNP位点同时进行荧光定量PCR检测，确定这三个SNPs 位点的基因型。步骤3:指导人们主动预防肺癌通过对被检测者SNPs基因型的分析，出具基因分型检测报告和被检测者个体化健康指导报告。基因 检测报告详细说明了被检测者肺癌易感程度的髙低以及患病的概率大小。个体化健康指导报告以被检测者 的基闪分型检测结果为基础，结合其生活饮食习惯问巻调査结果，评估被检测者肺痛遗传易感的相对风险。 同时制定出针对于被检测者的个:性化健康行动方案，方案包括在饮食习惯、生活方式上的改进建议等，并 为被检测者普及预防肺癌的健康知识。
序列表<110>上海主健生物工程有限公司<120〉通过XRCC1和ERCC2上的三个SNPs检测肺癌易感性的试剂盒 <歸9〈210> <211> 〈212〉 〈213>120 DNA人工序列<220><223>引物 ■〉 1taactggcat cttcacttct<210> 2 <211> 19 <212> DNA <213〉人工序列<220><223>引物 <■ 2tccagattcc tggcattgc<210> 3 <211> 19 〈212> DNA <213>人工序列〈220〉〈223〉引物 <400〉 3aCtC3gg8gt C3CC3gga3201919200610116663. 5〈210〉 4 <211> 19 <212〉 DNA <213〉人工序列<220><223>引物 <400> 4tctgttctct gcagg鄉a<210> 5 <211> 20 <212〉 DNA <213〉人工序列<220〉<223>引物 〈德5atC犯3g柳C8g3Cg3gC3<210> 6 <211> 18 <212> DNA <213>人工序列<220><223〉引物 < 6tcetgg卿cc C3ggaast<210> 7 <211> 18 <212> DNA <213>人工序列<220〉<223>探针
〈400〉 7cggctgccct cccag鄉 18<210〉 <211〉 <212〉 <213>822 DNA人工序列〈220〉〈223〉探针 ■〉 8aatctgctct atcctctgca gc 22<210〉 〈211〉 <212> <213>920 DNA人工序列<220><223>探针 <400> 9tgcccaacga agtgctgcag 20
权利要求
1.一种检测肺癌易感性的试剂盒，包括同时检测XRCC1基因上的rs25487号SNP位点、ERCC2基因上的rs13181号SNP位点和rs1799793号SNP位点的特异性引物对及特异性荧光探针、Taq酶、dNTP混合液、MgCl2溶液、荧光定量PCR反应缓冲液、去离子水。
2. 根据权利要求1所述的试剂盒,其特征在于:所述的特异性引物对是指针对XRCC1基因上的rs25487 号SNP位点、ERCC2基因上的rsl3181号SNP位点和rsl799793号SNP位点而设计，能特异性扩增出包含 XRCC1基因上的rs25487号SNP位点、ERCC2基因上的rsl3181号SNP位点和rsl799793号SNP位点的引 物对。
3. 根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于所述的特异性荧光探针是指针对XRCC1基因上的 rs25487号SNP位点、ERCC2基因上的rsl3181号SNP位点和rsl799793号SNP位点而设计，能通过荧光 定量PCR技术特异性检测出这三个SNPs位点肺癌易感基因型的探针。
4. 根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于所含的特异性引物对选自具有SEQ ID N0: l和2所 示序列的引物对、具有SEQ ID NO: 3和4所示序列的引物对以及具有SEQ ID NO: 5和6所示序列的引物 对。
5. 根据权利耍求1所述的试剂盒，其特征在于所含的特异性荧光探针选自具有SEQ ID NO: 7、 8 和9所示序列的Taqman探针。
6. 根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于试剂盒的组分和含量包括ljil IOX荧光定量PCR反 应缓冲液，0. lpl 25mM dNTP混合液，0.5^1 25mM MgCl2溶液，0, 02pl (5units/nl) Taq DM聚合酶， 20nM特异性引物对(六条)各0.225^1， 10nM特异性荧光探针(三条)各0.25nl，去离子水4.28nl。本 试剂盒供一人份检测应用，试剂盒的保存温度为-20'C 。
全文摘要
本发明公开了一种检测肺癌易感性的试剂盒。该试剂盒包括同时检测XRCC1基因上的rs25487号SNP位点、ERCC2基因上的rs13181号SNP位点和rs1799793号SNP位点的特异性引物对及特异性荧光探针、用于荧光定量PCR检测的常规组件等。本发明的试剂盒通过同时检测分析个体的XRCC1基因和ERCC2基因上的SNPs位点基因携带型来预测个体对肺癌的易感性。
文档编号C12R1/68GK101153345SQ20061011666
公开日2008年4月2日 申请日期2006年9月28日 优先权日2006年9月28日
发明者冯哲民, 邹祖烨 申请人:上海主健生物工程有限公司