专利名称：人肺癌细胞ngal基因启动子区转录调控元件的制作方法
技术领域：
本发明涉及基因表达调控，具体地说，涉及一种人肺癌细胞的NGAL基因启动子区的转录调控元件。
背景技术：
肺癌，又称原发性支气管癌，是肺部常见的恶性肿瘤。在全球，肺癌的发病率和死亡率均居癌症之首。而且目前肺癌发病率和死亡率在全世界范围内都呈现持续上升的趋势。肺癌早期没有明显症状，因症状就诊者多属中晚期，这些是肺癌高死亡率的重要原因。目前，肺癌的发病机制尚不清楚。研究发现，NGAL基因在很多肿瘤细胞包括肺癌细胞中有高表达；我们最近的研究结果显示，NGAL基因与细胞分化和肿瘤侵袭转移高度相关。
NGAL(neutrophil gelatinase-associated lipocalin)，即中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白，是1993年K jeldsen等在研究人中性粒细胞的明胶酶(gelatinase B，即MMP-9)时首先被发现的一个25KD的糖蛋白，是lipocalin家族的新成员。NGAL基因是单拷贝，定位于染色体9q34区域。NGAL基因的全长5869bp，其中包括1695bp的5′端非转录区，178bp的3′端非转录区及由七个外显子和六个内含子构成的3696bp的原初转录区(primary transcribedregion)。其cDNA全序列由63bp的5′端非翻译区和591bp的编码区组成，编码含197个氨基酸残基的肽链，此肽链包括178个氨基酸残基的成熟肽段(mature peptide)和19个氨基酸的前导序列(leadersequence)。
NGAL在不同组织和细胞的病理或生理条件下表现出不同的功能形式在发生炎症反应的上皮细胞中可见NGAL的表达；作为小分子铁化合物结合蛋白参与机体铁代谢和天然免疫反应；也可参与细胞分化以及作为一种存活因子参与细胞凋亡；有研究报道NGAL与肾缺血，肾毒性损伤以及动脉粥样硬化等相关。在人类肿瘤中如肺腺癌、食管癌、胰腺癌、结肠癌和乳腺癌中可见NGAL高表达，表明NGAL参与了肿瘤的发生发展过程。NGAL蛋白还具有保护MMP-9的活性而促进肿瘤侵袭。然而目前人们主要集中在对NGAL蛋白功能的研究，关于NGA基因的上游转录表达调控的机制尚不清楚。Cowland在肺癌细胞系A549细胞中研究IL-1β对NGAL的诱导表达时，曾提出在NGAL基因5′端上游-153～-90区间可能存在对基因表达调控起关键作用的顺式作用元件，然而具体的调控元件并未报道。我们在肺癌细胞系95D和A549细胞中获得了NGAL基因启动子区转录调控元件，由此完成了本发明。
发明内容
本发明的目的在于提供一种人肺癌细胞NGAL基因5′上游转录调控区域，确定人NGAL基因的启动子区转录调控元件。
本发明的另一个目的在于提供含有上述基因启动子区转录调控元件的载体。
本发明的进一步目的在于提供含有上述载体的宿主细胞。
本发明提供的人肺癌细胞NGAL基因启动子转录调控区域，核苷酸序列如SEQ ID NO1所示，位于NGAL基因5′上游-152～-141和-106～-79的片段，其中NGAL基因的启动子所包含的TATA Box在该元件下游-37的位置。
为了获得本发明的NGAL基因的表达调控元件，正如在下述实施所详细描述的，对人NGAL基因的启动子区进行不同方法的缺失，插入到pGL3-Basic载体，得到一系列序列长度不同的表达质粒，利用萤火虫荧光素酶报告基因，检测这些质粒在肺癌细胞系95D和A549细胞中的转录活性。为减少细胞培养微环境所造成的误差，以表达海肾荧光素酶的质粒pRL-TK作为内参照，与上述缺失质粒共同转染95D和A549细胞，测定萤火虫荧光素酶与海肾荧光素酶的酶活性，用二者的比值，即相对荧光素酶活性表示启动子转录活性。经过多次实验结果验证-152～-141和-106～-79之间为主要转录活性调控区段。
对-152～-79之间的序列分析表明这段序列中有一个C/EBPβ结合位点(-150～-137，GTCTTGCCCAATCC)，一个AP-2结合位点(-106～-97，TCCGCAGGAG)，一个SP1结合位点(-101～-96，AGGAGT)，一个MRF4结合位点(-103～-94，GCAGGAGTTG)一个MyoD结合位点(-91～-82，GGCAATTGCC)，其中AP-2与SP1和MyoD结合位点有部分重叠，本发明针对C/EBPβ、AP-2、SP1、MRF4和MyoD分别作进一步修饰，即删除或突变C/EBPβ位点、对另外四个位点分别进行碱基突变，检测修饰调控元件的重组质粒的表达能力，分析上述五个调控元件对NGAL启动子转录活性的影响。结果显示，-152～-141和-106～-79是NGAL基因启动子关键调控序列，C/EBPβ和MRF4、MyoD结合位点是启动子转录活性的关键调控元件。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果本发明首次鉴定了人肺癌细胞NGAL基因启动子关键调控元件，并将5′端序列逐渐缺失和部分调控元件被修饰的启动子序列插入报告基因上游构建了一系列真核表达质粒，转染哺乳动物细胞瞬时表达，确定了人NGAL基因启动子在肺癌细胞中转录活性的关键调控序列。本发明将有助于从分子水平上探索肺癌的发病机制，为肺癌的防治提供新的理论依据。本发明对研究NGAL在肿瘤细胞中的表达调控机制以及以NGAL为靶点的临床治疗具有重要意义。
图1为pB1431质粒构建流程图；图2为启动子5′端嵌套缺失质粒构建流程图；图3为pB110、pB106质粒构建流程图；图4为启动子调控元件定点修饰质粒的构建流程图；图5为启动子调控元件定点修饰质粒的构建流程图；图6为NGAL启动子区缺失质粒在95D和A549细胞中的相对荧光素酶活性分析；图7为NGAL启动子调控元件修饰质粒的转录活性比较；图8为NGAL启动子调控元件与核转录因子的结合实验分析；其中，图6中，(a)为NGAL 5′侧翼区(-1431～-59)系列缺失重组质粒(在pGL3-Basic载体上)的模式图；(b)为对应缺失子的相对荧光素酶活性。
图7中，(a)为NGAL启动子上C/EBPβ结合位点修饰质粒在pGL3-Basic载体上的模式图和对应质粒的相对荧光素酶活性；(b)为NGAL启动子上AP-2、SP1、MRF4和MyoD修饰质粒在pGL3-Basic载体上的模式图和对应质粒的相对荧光素酶活性。实验至少被重复3次，在此显示来自3次实验中有代表性的数据，误差线代表标准差。
图8中，1泳道为阳性对照，2、3、4泳道为超滞留实验分析，5-9泳道为竞争性实验分析。(a)和(b)分别为在95D和A549细胞中分析C/EBPβ调控元件的DNA-蛋白结合结合实验；(c)和(d)为95D和A549细胞中NGAL启动子调控元件与MRF4和MyoD转录因子的结合分析实验。
具体实施例方式
实施例1 含有NGAL基因启动子区调控元件的真核表达质粒的构建1、人NGAL基因5’上游片段(-1695～+84)的克隆和序列分析根据NCBI数据库上的NGAL基因序列(X99133)，设计并合成了扩增NGAL转录起始密码子下游+84到上游不同位点(分别为-1431，-1137，-945，-657，-416，-152)的六对引物P1～P6和R，所述引物序列如下R5′ATAGATCT+84GAGACCTAGGGGCATGATTT+653′(下划线为BglII位点，此引物为以下6条引物的公用3’端引物)
P15′TACTCGAG-1431AAAGACAGTAGCAGAGGTGG-14123′(下划线为XhoI位点)P25′TACTCGAG-1137CAAGCAGCACGTAGGCAGAG-11183′(下划线为XhoI位点)P35′TACTCGAG-945GTTGAGATAACTGCTTCCCT-9263′(下划线为XhoI位点)P45′TACTCGAG-657GTCTCTTCCCACTGCACTCA-6383′(下划线为XhoI位点)P55′TACTCGAG-416CAGGAAACAGCACATGATCT-3973′(下划线为XhoI位点)P65′TACTCGAG-152CTGTCTTGCCCAATCCTGAC-1333′(下划线为XhoI位点)应用此六对引物，从人食管癌细胞SHEEC基因组DNA中经PCR扩增出与预期一致的DNA片段。回收所扩增的目的片段，XhoI/BglII双酶切后，与经XhoI/BglII双酶切的载体pGL3-Basic(Promega公司)连接。pGL3-Basic为萤火虫荧光素酶报告基因上游不含启动子的表达载体。经过转化入大肠杆菌感受态细胞JM109，挑取阳性克隆，经过酶切鉴定以及最后的测序结果证明人NGAL基因不同长度片段已定向克隆至萤火虫荧光素酶基因上游，该重组质粒分别命名为pB1431，pB1137，pB945，pB657，pB416，pB152。以pB1431为例的整个质粒构建流程如图1所示。
2、以pB152为基础的启动子5’端缺失载体的构建在缺失分析中，有种经典的技术叫嵌套缺失，控制外切核酸酶III(ExoIII)的消化时间，使NGAL基因5′调控区从5′上游-152处开始逐渐缩短。pB152质粒中的SacI酶切位点，其相应的内切酶作用后可使DNA形成5′突出端，进一步被ExoIII外切核酸酶降解；而位于SacI下游的XhoI位点，该内切酶位点酶切后形成DNA3′末端突出端，不被ExoIII降解。将pB152用SacI和XhoI依次酶切，用QuickPCR purification kit(QIAGEN)方法回收酶切产物，通过测量A260对回收的酶切产物进行定量，将一定量的线状酶切产物用ExoIII特异性切割，取不同反应时间的酶切后产物，用S1核酸酶切除单链DNA，Klenow补平末端后，T4 DNA连接酶使片段自连，连接产物转化大肠杆菌JM109，进行抗性筛选及测序，得到一系列5′端缩短的NGAL启动子真核表达质粒，构建流程参见图2。另外一种方式就是直接针对目的片段设计引物进行PCR扩增实现缺失。由于嵌套缺失所得的重组子报告基因显示启动子调控元件存在于-152～-79之间，为了进一步确定范围，设计了引物利用PCR方法在-140的基础上进一步缺失，因而构建了pB110和pB106真核表达质粒。引物序列如下P75′TACTCGAG-110TGTTTCCGCAGGAGTTGCTG-913′(下划线为XhoI位点)P85′TACTCGAG-106TCCGCAGGAGTTGCTGGC-893′(下划线为XhoI位点)R5′ATAGATCT+84GAGACCTAGGGGCATGATTT+653′(下划线为BglII位点)应用此两对引物以pB140为模板扩增出与预期长度一致的DNA片断，并成功构建到pGL3-Basic载体上。质粒构建流程图见图3。
3、启动子调控元件定点修饰质粒的构建双荧光素酶报告基因检测结果显示NGAL基因5′调控区从-152缩短到-140处以及从-106到-78处时，启动子转录活性显著降低，提示-152～-141和-106～-79之间为调控转录活性的关键区域。针对C/EBPβ结合位点(-150～-137，GTCTTGCCCAATCC)设计一系列突变引物，置换或突变修饰C/EBPβ结合位点，以进一步确定影响NGAL基因启动子转录活性的关键调控元件。所述突变引物如下pB147m5′TACTCGAGCT-150GTCAACCCGTTTCC-137TGAC3′pB144m5′TACTCGAGCT-150GTCTTGGATGGTCC-137TGAC3′pB141m5′TACTCGAGCT-150GTCTTGCCCGATCC-137TGAC3′pBC/EBP5′TACTCGAGCT-150GTCTTGCGCAATCC-137TGAC3′R5′ATAGATCTGAGACCTAGGGGCATGATTT3′以上寡核苷酸序列分别与R组成四对引物，以pB152为模板进行PCR扩增。经XhoI/BglII双酶切后，与pGL3-Basic的XhoI/BglII双酶切回收片段连接，连接产物转化大肠杆菌JM109，进行抗性筛选及测序，即得到一系列NGAL基因启动子上定点修饰C/EBPβ结合位点的真核表达质粒，质粒构建流程参见图4。
另外，针对-106～-79区间的AP-2结合位点(-106～-97，TCCGCAGGAG)，SP1结合位点(-101～-96，AGGAGT)，MRF4结合位点(-103～-94，GCAGGAGTTG)，MyoD结合位点(-91～-82，GGCAATTGCC)设计一系列寡核苷酸序列，突变修饰AP-2、SP1、MRF4和MyoD结合位点，以进一步确定在此区间影响NGAL基因启动子转录活性的关键调控元件。所述寡核苷酸序列如下105m5′CAGCAA-97CTCCTGCAAA-106AACACTTGGCAAG3′100m5′CAATTGCCAGCA-96ACTAAT101GCGGAAACACTTG3′95m5′GTTTCC-103GCAGGAGTAC-94CTGGCAATTGCC3′85m5′CAGGAATGTGA-82GGTTATTGCC-91AGCAACTC3′应用上述寡核苷酸序列，采用Site-Directed MutagenesisSystem对以上结合位点进行突变修饰。合成的寡核苷酸序列磷酸化后，以碱变性的pB140为模板进行退火杂交，得到的重组子经T4 DNA多聚酶和T4 DNA连接酶连接环化，连接产物首先转化至修复缺陷菌株BMH71-18muts感受态细胞，得到突变的重组质粒，然后再转化大肠杆菌JM109，进行抗性筛选及测序，即得到一系列NGAL基因启动子上定点修饰AP-2、SP1、MRF4和MyoD结合位点的真核表达质粒，构建流程参见图5。
实施例2 人肺癌细胞NGAL基因启动子区调控元件活性分析A.方法1.细胞培养肺癌细胞系95D和A549细胞在5％CO2和37℃的条件下，在DMEM+HAM F12培养基中(Invitrogen公司)中贴壁生长，细胞用0.25％胰酶和0.02％EDTA的细胞消化液进行消化传代。
2.瞬时转染用Qiagen Plasmid Midi Kit(QIAGEN公司)提取需转染的实验质粒、对照质粒pGL3-Basic(Promega公司)及内参照质粒pRL-TK(Promega公司)，测定其含量和纯度。取上述表达萤火虫荧光素酶的实验质粒和对照质粒用Buffer EB(10mM Tris·Cl，pH8.5)稀释至100ng/μl，表达海肾荧光素酶的内参照质粒pRL-TK用Buffer EB稀释至20ng/μl。将实验质粒与内参照质粒按50∶1混合，即1μg∶20ng(10μl∶1μl)。
在转染前24小时，将95D和A549细胞分别接种到96孔板中，每孔100μl，细胞计数为1.5×105个/ml，在转染当天，细胞达50％～60％满度时即可用于转染。
转染方法如下在超净工作台中，取7ml玻璃离心管若干支，做好标记，加入74μl不含血清的DMEM基础培养液，再加入16.5μl上述混合好的相应的质粒混合液，空白管中加入16.5μlBuffer EB，涡旋5sec，再加入3μl的SuperFect转染试剂(QIAGEN公司)，涡旋10sec，室温下放置5～10min。将96孔板做好标记，每个样品设3个平行孔，将每孔的培养基弃去，滴加2滴1×PBS(PH值7.4)，吸尽培养基，备用。向静置5～10min后的玻璃管中加入450μl含血清的DMEM培养基，用加样器上下吹打混匀，迅速将混合液加入到96孔板中，每孔170μl，于37℃5％CO2培养箱中继续培养。3h后，弃去培养基，换上150μl新鲜的DMEM培养基，继续培养至48h。
3.双荧光素酶报告基因检测双荧光素酶报告基因的检测采用Promega公司的Dual-Luciferase Reporter Assay System进行分析，在TD20/20照度计上进行检测(Turner Designs公司)。将转染48h后的95D和A549细胞用1×PBS洗涤一次，去尽残液，加入20μl新鲜配制的1×PLB，室温下，摇床上剧烈振荡15min以裂解细胞。取15μl上述细胞裂解液加入含100μl LARII溶液的1.5ml离心管中，混匀，测定荧火虫荧光素酶活性，再向同一离心管中加入100μl新鲜配制的1×STOP液，混匀，测定海肾荧光素酶(内参照)活性，计算出两种荧光素酶活性比值，即相对荧光素酶活性。
B.结果1.NGAL基因启动子转录活性关键调控区域的确定由缺失质粒荧光素酶报告基因实验结果(图6)表明在人肺癌细胞中，NGAL基因转录起始密码子上游的1431bp序列具有明显的转录活性，当启动子从5′端-1431处缩短到-152时，转录活性没有明显的降低，但当片段缩短到-140时，其荧光素酶活力下降了约70％，然后一直从-106缺失到-78时，相对荧光素酶活力降低到pGLB的水平，以上结果表明在-152～-141和-106～-79之间存在有调控NGAL基因转录活性的顺式作用元件，而且在这两种肺癌细胞系中其表达调控机制是一致的。
2.NGAL基因启动子转录调控元件的初步鉴定针对NGAL基因启动子转录活性调控区域进行的定点修饰质粒实验结果(图7)表明在人肺癌细胞中，-152～-141区间的C/EBPβ结合位点发生不同碱基的突变或经典元件置换时，pB147m、pB144m和pB141m的启动子转录活性下降至pB140的水平，而pBC/EBP的荧光素酶活力表现升高，表明C/EBPβ这个位点是转录活性的关键调控元件；分别突变-106～-79区间的AP-2(105m)、SP1(100m)、MRF4(95m)和MyoD(85m)结合位点，发现在MRF4和MyoD结合位点突变时转录活性下降到pB78的水平。可见NGAL基因启动子区-152～-141处的C/EBPβ结合位点和-106～-79处的MRF4和MyoD结合位点是NGAL基因转录活性的关键调控元件。
实施例3 人肺癌细胞NGAL基因启动子区关键调控元件的证明A.方法1.提取核蛋白①肺癌细胞系95D和A549细胞进行常规传代培养，待长成单层后，先用1×PBS洗2次，再用含0.25％胰蛋白酶，0.02％EDTA的细胞消化液消化细胞并分别收获到15ml离心管中。然后1×PBS洗3次，每次均在室温下250g离心10min，弃上清。②加入5倍体积预冷的细胞匀浆缓冲液重悬细胞沉淀，冰浴10min后，4℃下250g离心10min。③弃上清，加入3倍体积预冷的含0.05％NP-40的细胞匀浆缓冲液重悬细胞沉淀，用Dounce匀浆器的紧型槌上下匀浆20次(冰上操作)，4℃下250g离心10min，收集细胞核。④弃上清，加入1ml细胞重悬缓冲液重悬细胞核，并加入70μl预冷的5mol/LNaCl，使NaCl终浓度为0.3mol/L。⑤4℃下20000g超速离心20min，取上清分装于0.5ml离心管中，用Bradford法测其蛋白含量后，-70℃保存。
2.探针标记应用Roche公司的Dig Gel Shift Kit标记下列两对寡核苷酸探针。一对是-152/-1145′CTGTCTTGCCCAATCCTGACCAGGTGCAGAAATCTTGCC3′5′GGCAAGATTTCTGCACCTGGTCAGGATTGGGCAAGACAG3′其序列位于NGAL基因5′侧翼区-152到-114，包含有C/EBPβ转录因子结合位点。另外一对是-112/-745′AGTGTTTCCGCAGGAGTTGCTGGCAATTGCCTCACATTC3′5′GAATGTGAGGCAATTGCCAGCAACTCCTGCGGAAACACT3′这段序列位于NGAL基因5′侧翼区-112到-74，含有MRFs家族的两个成员MRF4(-103～-94)和MyoD(-91～-82)结合位点。
合成的各单链寡核苷酸用无菌水溶解至终浓度为40pmol/μl。①在2个作好标记的0.5ml离心管中，加入相应的一对寡核苷酸溶液各5μl，混匀，沸水浴中放置10min，缓慢冷却至室温，以使寡核苷酸退火成双链。补加TEN Buffer使其终浓度为4pmol/μl。②再取2个新的0.5ml离心管作好标记，依次加入下列试剂1μl 4pmol/μl的双链寡核苷酸、9μl无菌水、5×Labeling Buffer4μl、CoCl2溶液4μl、Dig-ddUTP溶液1μl和Terminal Transferase1μl。混匀，37℃温育15min，然后迅速置于冰上。③在其中加入2μl0.2mol/LEDTA(pH8.0)终止反应，再加入3μl无菌水至总体积为25μl。即获得了0.16pmol/μl的两种探针-152/-114probe和-112/-74probe。④检测探针标记效率取若干只0.5ml离心管，对上述标记好的探针用TEN Buffer进行10×稀释，探针浓度范围是16～0.016fmol/μl。同时设定相应浓度的阳性对照(试剂盒提供)。然后各取1μl点至尼龙膜上，120℃干燥30min。干燥后的膜用20ml洗涤缓冲液浸湿5min；10ml封闭液中封闭30min；10mlAnti-Dig抗体工作液中孵育30min；10ml洗涤缓冲液洗2次，每次15min；在测定缓冲液中平衡5min。最后膜与CSPD化学发光工作液充分接触5min后，保鲜膜包好，37℃温箱中放置10min，化学发光成像系统拍照。
3.凝胶滞留和超滞留试验首先制备6％的聚丙烯酰胺凝胶，在预冷的0.5×TBE电泳缓冲液中4℃，80V预电泳30min。根据Roche公司的Dig Gel Shift Kit说明书，①在20μl体积下，核蛋白与标记好的探针在含有20mmol Hepes液(pH7.9)、1mmol/L EDTA(pH8.0)、1mmol/L DTT、10mmol/L(NH4)2SO4溶液、0.2％Tween-20(w/v)、30mmol/L KCl溶液、1μg poly-[d(I-C)]和0.1μg多聚赖氨酸中室温下孵育30min。然后各与5μl的上样缓冲液混合上样，4℃，80V电泳100min。②电泳结束后，将凝胶上的DNA-蛋白复合物和游离的探针转至尼龙膜上，4℃，400mA转30min。然后，120℃干燥30min。③免疫检测干燥后的膜用40ml洗涤缓冲液浸湿5min；40ml封闭液中封闭30min；10mlAnti-Dig抗体工作液中孵育30min；40ml洗涤缓冲液洗2次，每次15min；在测定缓冲液中平衡5min。最后膜与CSPD化学发光工作液充分接触5min后，保鲜膜包好，37℃温箱中放置10min，化学发光成像系统拍照。超滞留试验分析时，首先将抗C/EBPα、β、γ抗体以及抗MRF4、MyoD和myogenin抗体(Santa公司)分别与95D和A549细胞的核蛋白在室温下孵育20min，最后加入标记好的探针再孵育20min，然后上样电泳。其中，为检测所产生滞留带的特异性，同时设定竞争性分析实验，即除了加入标记好的探针以外，再加入≥200倍探针浓度的未标记双链寡核苷酸。包括与探针完全相同的寡核苷酸和将所包含结合位点突变之后的寡核苷酸。所述寡核苷酸序列如下-152/-1145′CTGTCTTGCCCAATCCTGACCAGGTGCAGAAATCTTGCC3′5′GGCAAGATTTCTGCACCTGGTCAGGATTGGGCAAGACAG3′-147/-140m5′CTGTC-147GACTAGTC-140TCCTGACCAGGTGCAGAAATCTTGCC3′5′GGCAAGATTTCTGCACCTGGTCAGGA-140GACTAGTC-147GACAG3′-145/-143m5′CTGTCTT-145TAA-143CAATCCTGACCAGGTGCAGAAATCTTGCC3′5′GGCAAGATTTCTGCACCTGGTCAGGATTG-143TTA-145AAGACAG3′-112/-745′AGTGTTTCCGCAGGAGTTGCTGGCAATTGCCTCACATTC3′5′GAATGTGAGGCAATTGCCAGCAACTCCTGCGGAAACACT3′-95/-94m5′AGTGTTTCCGCAGGAGT-95AC-94CTGGCAATTGCCTCACATTC3′5′GAATGTGAGGCAATTGCCAG-94GT-95ACTCCTGCGGAAACACT3′-84m5′AGTGTTTCCGCAGGAGTTGCTGGCAATTT-84CCC-81CACATTC3′5′GAATGTGG-81GGA-84AATTGCCAGCAACTCCTGCGGAAACACT3′B.结果1.C/EBPβ调控元件的确定由凝胶滞留的实验结果(图8a、b)表明在人肺癌细胞中，当含有C/EBPβ结合位点的NGAL基因DNA片断(-152～-114)与95D和A549细胞的核蛋白孵育时，能够形成明显的滞留带。通过竞争性实验分析，表明此滞留带为特异的。而当C/EBPβ结合位点的部分碱基突变之后，结合蛋白的能力降低。再由超滞留实验分析，抗C/EBPβ抗体的加入能够阻止滞留带的产生，与DNA、核蛋白形成三元复合物而出现超滞留带。因此表明C/EBPβ结合位点是NGAL基因的关键调控元件。
2.MRF4和MyoD调控元件的确定由凝胶滞留的实验结果(图8c、d)表明在人肺癌细胞中，当含有MRF4和MyoD结合位点的NGAL基因DNA片断(-112～-74)与95D和A549细胞的核蛋白孵育时，同样也能够形成明显的滞留带。通过竞争性实验分析，表明此滞留带为特异的。当MRF4和MyoD结合位点的部分碱基突变之后，其结合蛋白的能力降低。在超滞留实验分析时，当加入抗MRF4和MyoD抗体，滞留带消失，抗体与DNA、核蛋白形成三元复合物而出现超滞留带。可见MRF4和MyoD结合位点也是NGAL基因的关键调控元件。
人肺癌细胞NGAL基因启动子区转录调控元件序列表SEQUENCE LISTING<110>汕头大学医学院<120>人肺癌细胞NGAL基因启动子区转录调控元件<130>
<160>1<170>Patent In version 3.2<210>1<211>74<212>DNA<213>人肺癌细胞(HUMAN LUNG CANCER CELLS)<400>1-152 CTGTCTTGCC CAATCCTGAC CAGGTGCAGA AATCTTGCCA AGTGTTTCCG-102 CAGGAGTTGC TGGCAATTGC CTCA<210>2<211>
<212>DNA<213>引物<400>2P15’-TACTCGAGAAAGACAGTAGCAGAGGTGG-3’P25’-TACTCGAGCAAGCAGCACGTAGGCAGAG-3’P35’-TACTCGAGGTTGAGATAACTGCTTCCCT-3’P45’-TACTCGAGGTCTCTTCCCACTGCACTCA-3’P55’-TACTCGAGCAGGAAACAGCACATGATCT-3’P65’-TACTCGAGCTGTCTTGCCCAATCCTGAC-3’R 5’-ATAGATCTGAGACCTAGGGGCATGATTT-3’<210>3<211>
<212>DNA<213>引物<400>3P75’-TACTCGAGTGTTTCCGCAGGAGTTGCTG-3’p85’-TACTCGAGTCCGCAGGAGTTGCTGGC-3’R 5’-ATAGATCTGAGACCTAGGGGCATGATTT-3’<210>4<211>
<212>DNA<213>引物<400>4pB147m5’-TACTCGAGCTGTCAACCCGTTTCCTGAC-3’pB144m5’-TACTCGAGCTGTCTTGGATGGTCCTGAC-3’pB141m5’-TACTCGAGCTGTCTTGCCCGATCCTGAC-3’pBC/EBP5’-TACTCGAGCTGTCTTGCGCAATCCTGAC-3’R5’-ATAGATCTGAGACCTAGGGGCATGATTT-3’<210>5<211>
<212>DNA<213>引物<400>5105m5’-CAGCAACTCCTGCAAAAACACTTGGCAAG-3’100m5’-CAATTGCCAGCAACTAATGCGGAAACACTTG-3’95m 5’-GTTTCCGCAGGAGTACCTGGCAATTGCC-3’85m 5’-CAGGAATGTGAGGTTATTGCCAGCAACTC-3’<210>6<211>
<212>DNA
人肺癌细胞NGAL基因启动子区转录调控元件序列表<213>探针<400>6152/-114 5’-CTGTCTTGCCCAATCCTGACCAGGTGCAGAAATCTTGCC-3’5’-GGCAAGATTTCTGCACCTGGTCAGGATTGGGCAAGACAG-3’-147/-140m5’-CTGTCGACTAGTCTCCTGACCAGGTGCAGAAATCTTGCC-3’5’-GGCAAGATTTCTGCACCTGGTCAGGAGACTAGTCGACAG-3’-145/-143m5’-CTGTCTTTAACAATCCTGACCAGGTGCAGAAATCTTGCC-3’5’-GGCAAGATTTCTGCACCTGGTCAGGATTGTTAAAGACAG-3’-112/-74 5’-AGTGTTTCCGCAGGAGTTGCTGGCAATTGCCTCACATTC-3’5’-GAATGTGAGGCAATTGCCAGCAACTCCTGCGGAAACACT-3’-95/-94m 5’-AGTGTTTCCGCAGGAGTACCTGGCAATTGCCTCACATTC-3’5’-GAATGTGAGGCAATTGCCAGGTACTCCTGCGGAAACACT-3’-84m 5’-AGTGTTTCCGCAGGAGTTGCTGGCAATTTCCCCACATTC 3’5’-GAATGTGGGGAAATTGCCAGCAACTCCTGCGGAAACACT 3’
权利要求
1.一种人肺癌细胞NGAL基因启动子区转录调控元件，其核苷酸序列选自下组(1)SEQ ID NO1所示的核苷酸序列，(2)SEQ ID NO1所示的核苷酸序列的互补序列，或(3)SEQ ID NO1所示的核苷酸序列中发生一处或多处缺失突变或替换突变的功能等价物。
2.如权利要求1所述的人肺癌细胞NGAL基因启动子区转录调控元件，其特征在于含有至少一个控制NGAL基因表达的调控元件。
3.如权利要求2所述的人肺癌细胞NGAL基因启动子区转录调控元件，其特征在于所述调控元件含有SEQ ID NO1中的核苷酸-152～-141。
4.如权利要求2所述的人肺癌细胞NGAL基因启动子区转录调控元件，其特征在于所述调控元件含有SEQ ID NO1中的核苷酸-106～-79。
5.一种载体，其特征在于，它含有权利要求1所述的人肺癌细胞NGAL基因启动子区转录调控元件。
6.如权利要求5所述的载体，其特征在于，它还含有所述的启动子区转录调控元件可操作地连接的外源基因。
7.如权利要求6所述的载体，其特征在于，所述外源基因是报告基因。
8.一种宿主细胞，其特征在于，它含有权利要求5所述的载体。
9.如权利要求8所述的宿主细胞，其特征在于，所述的宿主细胞是哺乳动物细胞。
10.如权利要求9所述的宿主细胞，其特征在于，所述哺乳动物细胞是人的细胞。
全文摘要
本发明涉及基因表达调控，公开了一种人肺癌细胞的NGAL基因启动子区转录调控元件。本发明首次鉴定了人肺癌细胞NGAL基因启动子区，并将5′端序列逐渐缺失和部分调控元件被修饰的启动子序列插入报告基因上游构建了一系列真核表达质粒，转染哺乳动物细胞瞬时表达，确定了人NGAL基因启动子在肺癌细胞中转录活性的关键调控元件。本发明对研究NGAL在肿瘤细胞中的表达调控机制以及以NGAL为靶点的临床治疗具有重要意义。将有助于从分子水平上探索包括肺癌在内的肿瘤的发病机制，为肿瘤的防治提供新的理论依据。
文档编号C12N15/63GK1974768SQ20061012299
公开日2007年6月6日 申请日期2006年10月24日 优先权日2006年10月24日
发明者李恩民, 常静霞, 许丽艳, 袁华敏, 王子良 申请人:汕头大学医学院