专利名称：人胃癌细胞ngal基因启动子区tpa核心反应元件的制作方法
技术领域：
本发明涉及基因表达调控，具体地说，涉及一种人胃癌细胞的 iVGAL基因启动子区TPA核心反应元件。
背景技术：
胃癌的发病率位于各类恶性肿瘤的前茅，死亡率也位于恶性肿瘤 之首，总体来说有色人种比白色人种发病率高，日本、智利、俄罗斯 和冰岛为高发区，中国也是比较高发的国家；中国的发病率北方比南 方高，沿海比内地高，以西北的甘肃，青海，宁夏等省自治区最高。 目前，胃癌的发病机制尚不清楚。研究发现iVGAL基因在很多肿瘤细 胞包括胃癌细胞中发现有高表达；而12-0-十四烷酰佛波醋酸酯-13 (TPA)，这种促癌物在细胞恶性转化过程中发挥非常重要的作用。有 人曾研究报道永生化食管上皮细胞系SHEE经TPA诱导后可恶性转 化为食管癌细胞系SHEEC。最近我们研究发现在TPA的剌激下， BGC823胃癌细胞中iVCML基因启动子区能激活荧光素酶报告基因， 且其活性上升约为基础表达时的3~9倍，表明WGAL基因启动子区存 在着TPA反应元件。
WG4L ( neutrophil gelatinase~associated lipocalin )，艮卩中'性丰立细 胞明胶酶相关脂质运载蛋白，是1993年K jeldsen等在研究人中性粒 细胞的明胶酶(gelatinase B，即MMP-9)时首先被发现的，
基因是单拷贝，定位于染色体9q34上。A^G4丄基因的全长5869bp， 其中包括1695bp的5'端非转录区，178bp的3'端非转录区及由七个 外显子和六个内含子构成的3696bp的原初转录区(primary transcribed region)。其cDNA全序列由63bp的5'端非翻译区和591bp的编码区 组成，编码含197个氨基酸残基的肽链，此肽链包括178个氨基酸残 基的成熟肽段(mature peptide)和19个氨基酸的前导序列(leader sequence)o
越来越多的证据表明WGA丄与炎症、免疫反应、细胞分化、细胞 凋亡、组织重构以及多种肿瘤的发生与发展等过程相关，并在很多肿 瘤中如食管癌、胰腺癌、结肠癌、乳腺癌等高表达。也有研究报道 7V04L与肾缺血，肾毒性损伤以及动脉粥样硬化等相关。目前的研究 主要集中在ATGAL蛋白的功能、细胞中与iVG4L蛋白相互作用的分子 及其作用机制，而关于WG4L高表达的原因以及该基因的转录表达调 控机制的研究，报道尚不多见。Cowland曾报道在A549肺癌细胞系 中IL-ip能上调WG4i:的表达，并在MM丄5'侧翼区鉴定出了 IL-ip 核心反应元件。为了弄清胃癌细胞中TPA上调iVG4L表达的机制， 我们在BGC823胃癌细胞系中获得了 WG4L基因启动子区TPA核心 反应元件，由此完成了本发明。在本文所述的TPA核心反应元件称 之为hNTRE。
发明内容
本发明的目的在于提供一种人胃癌细胞WGAiL基因启动子区TPA核心作用元件，确定人基因5'上游转录调控区域的TPA 核心作用区间。
本发明的另一个目的在于提供含有上述基因TPA核心反应元件 的载体。
本发明的进一步目的在于提供含有上述载体的宿主细胞。 本发明提供的人胃癌细胞iVG4L基因启动子区TPA核心反应元 件，命名为hNTRE。其长度为31 bp，核苷酸序列如SEQ ID No: 1 所示，位于iVG4L基因5，上游-109 -79的片段，其中iVG4L基因的 启动子所包含的TATA Box在该元件下游，在-37的位置。
正如在下述实施所详细描述的，为了获得本发明的TPA核心反 应元件hNTRE，对人iVGAL基因的启动子区进行不同方法的缺失， 插入到pGL3-Basic载体，得到一系列序列长度不同的表达质粒，利 用萤火虫荧光素酶报告基因，检测这些质粒在胃癌细胞BGC823中的 转录活性。为减少细胞培养微环境所造成的误差，以表达海肾荧光素 酶的质粒pRI^TK作为内参照，与上述缺失质粒同时转染BGC823细 胞，测定萤火虫荧光素酶与海肾荧光素酶的酶活性，用二者的比值， 即相对荧光素酶活性表示基础转录活性。在转染24小时后，再加入 TPA剌激24小时，检测出各个载体的相对荧光素酶活性，再算出与 各自基础活性比较的上升倍数，经过多次重复实验结果确定了 -109~-79这段区间为TPA核心反应元件。
对-109 -79之间的序列分析表明这段序列中有一个AP-2结 合位点(-106 -97， TCCGCAGGAG)， 一个MRF4结合位点(-103
-94， GCAGGAGTTG), —个类似API的结合位点(-85 79， TGCCTCA)(以下该位点直接称API位点)， 一个C/EBPa结合位点
(-87 -78， ATTGCCTCAC)，其中AP-2与MRF4结合位点有部分 重叠，APl和C/EBPa结合位点之间也有部分序列重叠。本发明选择 AP-2， MRF4和API三个位点作进一步修饰，即分别删除两个位点
(其中AP-2和MRF4作为一个位点)、对两个位点分别或同时进行 碱基突变，测定修饰后调控元件重组质粒的表达能力以及加入TPA 剌激之后的表达能力，通过比较上升倍数，分析上述三个调控元件对 基础和TPA处理后对iVG4L调控区转录活性的影响。结果显示， -106~-94和-85~-79是MML基因启动子区TPA核心反应元件的关键 调控序列。
与现有技术相比，本发明有如下有益效果本发明首次鉴定了人 胃癌细胞iVG4L基因启动子区TPA核心反应元件，并将启动子序列 逐渐缺失和部分调控元件被修饰的调控序列插入报告基因上游构建 了一系列真核表达质粒，转染哺乳动物细胞瞬时表达，确定了人 A^AL基因启动子在胃癌细胞中的TPA关键调控序列。本发明将有助 于从分子水平上探索包括胃癌在内的肿瘤的发病机制，并为TPA的 恶性转化作用机制提供线索，也有助于进一步认识TPA信号细胞内 传递途径网络在肿瘤发展机制中的作用。本发明对研究WGAL在肿瘤 细胞中的表达调控机制以及以^G4L为靶点的临床治疗具有重要意义。
图1为质粒pB1431构建流程图2为启动子5'端嵌套缺失质粒构建流程图； 图3为p B110质粒构建流程图； 图4为hNTRE定点修饰质粒的构建流程图； 图5为pB1431质粒经过不同浓度TPA诱导后的相对荧光素酶 活性分析；
图6为ATG4L启动子区缺失质粒在BGC823细胞中基础与TPA 诱导后的相对荧光素酶活性分析；
图7为/OT72E调控元件修饰质粒在BGC823细胞中基础与TPA 诱导后的相对荧光素酶活性分析。
图6中，(a)为iVGAL5'侧翼区(-1431 -10)系列缺失重组质粒 (在pGL3-Basic载体上)的模式图；(b)为对应缺失子的相对荧光素 酶活性。
图7中，(a)为ZiiV77 E J: AP-2， MRF4和API修饰质粒(在 pGL3-Basic载体上)的模式图；(b)为对应质粒的相对荧光素酶活性。
具体实施例方式
实施例l含有WCML基因启动子区TPA核心反应元件的真核表 达质粒的构建
1、人iVCML基因5，上游片段(-1695 +84)的克隆和序列分析 根据NCBI数据库上的WG4L基因序列(X99133)，设计并合
成了扩增iV(M￡转录起始密码子下游+84到上游不同位点(分别为 -1431， -1137， -945， -657， -416， -152)的六对引物P1~P6和R，所 述引物序列如下
R: 5'ATAGATCT^GAGACCTAGGGGCATGATTT^5 3'(下划线
为5g/n位点，此引物为以下6条引物的公用3'端引物)
Pl: 5' TACTCGAg簡AAAGACAGTAGCAGAGGTGG-1412 3' (下划线为X/wI位点)
P2: 5' TACTCGAg1137CAAGCAGCACGTAGGCAGAG11183' (下划线为X/roI位点)
P3: 5' TACTCGAa945GTTGAGATAACTGCTTCCCT9263' (下划线为XAoI位点)
P4: 5'TACTCGAG^GTCTCTTCCCACTGCACTCA,
(下划线为X/wI位点)
P5: 5'TACTCGAG416CAGGAAACAGCACATGATCT3973' (下划线为X/ioI位点)
P6: 5'TACTCGAa152CTGTCTTGCCCAATCCTGAC1333' (下划线为X/ioI位点)
应用此六对引物，从人食管癌细胞SHEEC基因组DNA中经PCR 扩增出与预期一致的DNA片段。回收所扩增的目的片段，Xho I/Bg/II 双酶切后，与经X/w 1/fig/n双酶切的载体pGL3-Basic (Promega公 司)连接。pGL3-Basic为萤火虫荧光素酶报告基因上游不含启动子的 表达载体。经过转化入大肠杆菌感受态细胞JM109，挑取阳性克隆，
经过酶切鉴定以及最后的测序结果证明人iVGAL基因不同长度片段 己定向克隆至萤火虫荧光素酶基因上游，该重组质粒分别命名为 pB1431, pB1137， pB945， pB657， pB416， pB152。以pB1431为例 的整个质粒构建流程如图1所示
2、以pB152为基础的启动子5'端缺失载体的构建
在缺失分析中，有种经典的技术叫嵌套缺失，控制外切核酸酶m
(五;rain)的消化时间，使iVG4L基因5，调控区从5，上游-152处开始 逐渐縮短。pB152质粒中的SocI酶切位点，其相应的内切酶作用后 可使DNA形成5'突出端，进一步被ExoHI外切核酸酶降解；而位于 Sac I下游的X/w I位点，该内切酶位点酶切后形成DNA3'末端突出 端，不被5jcoHI降解。将pB152用Sac I和X/io I依次酶切，用Quick PCR purification kit (QIAGEN)方法回收酶切产物，通过测量A260 对回收的酶切产物进行定量，将一定量的线状酶切产物用ficoIII特 异性切割，取不同反应时间的酶切后产物，用SI核酸酶切除单链 DNA， Klenow补平末端后，T4 DNA连接酶使片段自连，连接产物 转化大肠杆菌JM109,进行抗性筛选及测序，得到一系列5'端縮短的 iVGAL启动子真核表达质粒，构建流程参见图2。另外一种方式就是 直接针对目的片段设计引物进行PCR扩增实现缺失，由于嵌套缺失 所得的重组子报告基因显示TPA核心反应元件存在于-140~-78之 间，为了进一步确定范围，设计了引物利用PCR方法在-140的基础 上进一步缺失，因而构建了pB110，质粒构建流程图见图3，引物P7 和R序列如下
P7: 5' TACTCGAG-110TGTTTCCGCAGGAGTTGCTg91 3'(下划 线为XAoI位点)
R: 5' ATAGATCT^GAGACCTAGGGGCATGATTT"5 3'(下划线为Bgzn位点)
应用此对引物以pB140为模板扩增出与预期长度一致的序列约 200bp，并成功构建到pGL3-Basic载体上。
3、 hNTRE定点修饰质粒的构建
双荧光素酶报告基因检测结果显示iVGAL基因5'调控区从-110 处縮短到-78处时，TPA反应性活性显著降低，提示-109 -79之间为 TPA核心反应元件。针对AP-2结合位点(-106 -97， TCCGCAGGAG)， MRF4结合位点(-103 -94， GCAGGAGTTG)， AP1结合位点(-85 79， TGCCTCA)设计一系列寡核苷酸序列，删 除或突变修饰AP2, MRF4和API结合位点，以进一步确定影响 hNTRE的关键调控序列。所述寡核苷酸序列如下 AP2M: 5TACTCGAGTGTT^GAATACTTCTGGTMCTGGCAATTG CCTCACATTCC 3'
AP2D: 5TACTCGAGTGTT107------------94 CTGGCAATTGCCTCACA
TTCC3' AP1D:
5'TACTCGAGTGTTTCCGCAGGAGTTGCTGGCAAT86-------"CATT
CCTGGCCTTGGCAAAG 3'
AP1M:
5TACTCGAGTGTTTCCGCAGGAGTTGCTGGCAAT86GTAAGAC79
CATTCCTGGCCTTGGCAAAG 3'
AP12D:
5TACTCGAGTGTT107-------------WCTGGCAAT86-------"CATTCCTG
GCCTTGGCAAAG 3' AP12M:
5TACTCGAGTGTT^GAATACTTCTGGr94CTGGCAAT抽GTAAGA C-79CATTCCTGGCCTTGGCAAAG 3'
上述6条引物分别与R组成六对引物，以质粒pB110为模板进 行PCR扩增。经XAoI/Bg/n双酶切后，与pGL3-Basic的X/wI/i5g/11 双酶切回收片段连接，连接产物转化大肠杆菌JM109，进行抗性筛选 及测序，即得到一系列//G4L基因启动子上hNTRE定点修饰AP-2， MRF4和Apl结合位点的真核表达质粒，构建流程参见图4。
实施例2人胃癌细胞WCML基因启动子区TPA核心反应元件活
性分析
A方法
1.细胞培养胃癌细胞系BGC823在5免C02和37'C的条件下， 在含10%小牛血清的常规199培养基中(Invitrogen公司)中贴壁生 长，细胞用0.25%胰酶和0.02%EDTA的消化液进行消化传代。
2.瞬时转染和TPA诱导用QIAGEN Plasmid Midi Kit (QIAGEN 公司)提取需转染的实验质粒、对照质粒pGL3-Basic (Promega公司) 及内参照质粒pRL-TK (Promega公司)，测定其含量和纯度。取上述 表达萤火虫荧光素酶的实验质粒和对照质粒用Buffer EB (10 mM Tris《1， pH8.5)稀释至100ng/nl，表达海肾荧光素酶的内参照质粒 pRL-TK用Buffer EB稀释至20 ng/jil。将实验质粒与内参照质粒按50: l混合，艮Pl昭20ng(10(il: lnl)。
在转染前24小时，将BGC823细胞接种到96孔板中，每？LlOOpl, 细胞计数为2xl05/1111，在转染当天，细胞达50% 60%满度时即可用 于转染。
转染方法如下在超净工作台中，取7 ml玻璃离心管若干支， 做好标记，加入147 W不含血清的199基础培养液，再加入33 nl上 述混合好的相应的质粒混合液，空白管中加入33 |il BufferEB，涡旋 5 sec，再加入6 W的SuperFect转染试剂(GIAGEN公司)，涡旋10 sec,室温下放置5 ~10min。将96孔板做好标记，每个样品设6个平 行孔，将每孔的培养基弃去，滴加2滴lxPBS (PH值7.4)，吸尽培 养基备用。往静置5-10min后的玻璃管中加入90(Ha含血清的常规 199培养基，用加样器上下吹打混匀，迅速将混合液加入到96孔板 中，每孔170fi1，于37。C5X C02培养箱中继续培养，2h后，弃去 培养基，换上200nl新鲜的常规199培养基，转染24h后，在每组实 验样品的其中3个平行孔中加入5ng/mlTPA (Sigma公司)，继续培 养24h。
3.双荧光素酶报告基因检测双荧光素酶报告基因的检测采用 Promega公司的Dual-Luciferase Reporter Assay System进《亍分丰斤，在 TD20/20照度计上进行检测(Turner Designs公司)。将转染48h后的 BGC823细胞用1XPBS洗涤一次，去尽残液，加入20nl新鲜配制的 1XPLB，室温下，摇床上剧烈振荡15min以裂解细胞。取15 pl上述 细胞裂解液加入含100plLARII溶液的1.5ml离心管中，混匀，测定 荧火虫荧光素酶活性，再向同一离心管中加入100 nl新鲜配制的 lxSTOP液，混匀，测定海肾荧光素酶(内参照)活性，计算出两种 荧光素酶活性比值，即相对荧光素酶活性。
B结果
1. hNTRE的确定
不同TPA浓度对荧光素酶活力影响的比较由图5可知，TPA在 终浓度为5ng/ml时其诱导荧光素酶表达的能力最强，并且用来溶解 TPA的溶剂DMSO (二硝基亚砜)本身没有诱导能力，过高浓度的TPA 会对细胞产生毒性，因而确定5ng/ml作为TPA的实验浓度比较理想。
由缺失质粒荧光素酶报告基因实验结果(图6)表明在人胃癌 细胞中，7V6^:基因转录起始密码子上游的1431bp序列具有明显的转 录活性，在加入TPA诱导以后，其荧光素酶活力约升高6 9倍，当 启动子从5'端-1431处縮短到-110时，pB110仍能被TPA诱导，约 升高为基础表达的3 5倍，但当片段縮短到-78时，PB78加入TPA 诱导后其荧光素酶活力与基础表达几乎无差异，表明截短到-78时其
TPA反应核心元件已经丢失，并且其转录活性显著下降甚至接近质粒 pGL3-Basic的水平，以上结果表明-110 -78为基因启动子区 TPA核心反应元件。
2. hNTRE中的关键调控序列的确定
针对hNTRE进行的定点修饰质粒实验结果(图7)表明在人胃 癌细胞中，-85~-79这一区间的API结合位点全部突变或全部缺失时 (AP1M，共突变7个碱基，AP1D，缺失7个碱基)，其被TPA诱导的 能力几乎完全丧失，表明API这个位点对于hNTRE是起最关键作用的； 同时突变和缺失API, MRF4和AP-2时(见AP12D和AP12M)，也得到 同样的结果；删除或者突变MZ^基因启动子区-106—94的AP-2和 MRF4结合位点(见AP2D和AP2M)，启动子区被TPA诱导后其转录活 性升高倍数也明显降低。可见AK^基因启动子区-85 -79处的序列 和-106 -94处的序列是hNTRE的关键调控元件，类似API的结合位 点-85 -79为hNTRE最核心元件。
人胃癌细胞NGAL基因启动子区TPA核心反应元件序列表 SEQUENCE LISTING
〈110〉汕头大学医学院
<120>人胃癌细胞NGAL基因启动子区TPA核心反应元件
<130>
<160〉 1
<170> Patentln version 3. 2
<210> 1
<211> 31
<212〉 DNA
<213> 人胃癌细胞〈HUMAN GASTRIC CANCER CELL>
<400> 1
—109 GTTTCCGCAG GAGTTGCTGG CAATTGCCTC A
<210〉 2 <211>
<212〉 醒
<213〉 引物
<210〉 3 <211>
<212> DNA
<213> 弓l物
<400〉 3
P7: 5' -TACTCGAGTGTTTCCGCAGGAGTTGCTG-3'
R: 5' —ATAGATCTGAGACCTAGGGGCATGATTT-3'
<210> 4 <211>
<212> DNA
<213〉
引物
AP2D: 5' -TACTCGAGTGTTGMTACTTCTGGTCTGGCMTTGCCTCACATTCC-3'
AP2M: 5' -TACTCGAGTGTTCTGGCAATTGCCTCACATTCC-3'
AP1D: 5" -TACTCGAGTGTTTCCGCAGGAGTTGCTGGCMTCATTCCTGGCCTTGGCAAAG-3'
AP1M: 5' -TACTCGAGTGTTTCCGCAGGAGTTGCTGGCAATGTAAGACCATTCCTGGCCTTGGCAAAG-3，
AP12D: 5' -TACTCGAGTGTTCTGGCMTCATTCCTGGCCTTGGCAAAG-3'
AP12M: 5' -TACTCGAGTGTTGAATACTTCTGGTCTGGCMTGTAAGACCATTCCTGGCCTTGGCAAAG-3'
2
-TACTCGAGAAAGACAGTAGCAGAGGTGG-3 ， -TACTCGAGCMGCAGCACGTAGGCAGAG-3' -TACTCGAGGTTGAGATMCTGCTTCCCT-3 ， -TACTCGAGGTCTCTTCCCACTGCACTCA-3' -TACTCGAGCAGGAAACAGCACATGATCT-3' -TACTCGAGCTGTCTTGCCCAATCCTGAC-3' -ATAGATCTGAGACCTAGGGGCATGATTT-3 ，
4123456 :
<PPPPPPR
权利要求
1.一种人胃癌细胞NGAL基因启动子区TPA核心反应元件，其核苷酸序列选自下组(1)SEQ ID No1所示的核苷酸序列，(2)SEQ ID No1所示的核苷酸序列的互补序列，或(3)SEQ ID No1所示的核苷酸序列中发生一处或多处缺失突变或替换突变的功能等价物。
2、 如权利要求l所述的人胃癌细胞iVCML基因启动子区TPA核 心反应元件，其特征在于含有至少一个控制iVGAL基因TPA反应性 的调控元件。
3、 如权利要求2所述的人胃癌细胞iVCML基因启动子区TPA核 心反应元件，其特征在于所述调控元件含有SEQIDNo: l中的核苷 酸-85 -79 。
4、 如权利要求2所述的人胃癌细胞iVG4L基因启动子区TPA核 心反应元件，其特征在于所述调控元件含有SEQIDNo: l中的核苷 酸-106 -94。
5、 一种载体，其特征在于，它含有权利要求1所述的人胃癌细 胞WG4L基因启动子区TPA核心反应元件。
6、 如权利要求5所述的载体，其特征在于，它还含有所述的TPA 核心反应元件可操作地连接的外源基因。
7、 如权利要求6所述的载体，其特征在于，所述外源基因是报 告基因。
8、 一种宿主细胞，其特征在于，它含有权利要求5所述的载体。
9、 如权利要求8所述的宿主细胞，其特征在于，所述的宿主细 胞是哺乳动物细胞。
10、 如权利要求9所述的宿主细胞，其特征在于，所述哺乳动物 细胞是人的细胞。
全文摘要
本发明涉及基因表达调控，公开了人胃癌细胞NGAL基因启动子区TPA核心反应元件，并将启动子序列逐渐缺失和部分调控元件被修饰的调控序列插入报告基因上游构建了一系列真核表达质粒，转染哺乳动物细胞瞬时表达，确定了人NGAL基因启动子在胃癌细胞中的TPA关键调控序列。本发明将有助于从分子水平上探索包括胃癌在内的肿瘤的发病机制，并为TPA的恶性转化的作用机制提供线索，也有助于进一步认识TPA信号细胞内传递途径网络在肿瘤发展机制中的作用。本发明对研究NGAL在肿瘤细胞中的表达调控机制以及以NGAL为靶点的临床治疗具有重要意义。
文档编号C12N15/12GK101372690SQ20061012299
公开日2009年2月25日 申请日期2006年10月24日 优先权日2006年10月24日
发明者常静霞, 李恩民, 王子良, 袁华敏, 许丽艳 申请人:汕头大学医学院