专利名称：对于赤鹿、梅花鹿、马鹿以及驯鹿的基因特异的引物以及利用该引物识别鹿茸品种的方法
技术领域：
本发明涉及对于赤鹿(Cervus elaphus)、梅花鹿(C.nippon)、马鹿(C.canadensis)以及驯鹿(Rangifer tarandus)特异的引物以及利用该引物识别鹿茸品种的方法，尤其涉及，对于梅花鹿、赤鹿、马鹿以及驯鹿的基因具有特异序列的引物以及通过利用该引物的多重PCR来识别鹿茸品种的方法。
背景技术：
鹿茸(Cervi Parvum Cornu)是将梅花鹿(Cervus nippon)、赤鹿的亚种(C.elaphus L.)或者马鹿(C.elaphus canadensis)的未骨化的幼角切割而使之干燥的物质，其中包括多种氨基酸、无机物、糖类等(Kim et al.，1973)。
梅花鹿(Cervus nippon)，广泛分布在东北部(Ohtaishi 1986，Ohtaishiet.Al.1990，Whitehead 1972，White head 1993)，大小比其他鹿稍微小并且体重为80kg、体长为95～180cm、肩高为65～109cm，具有明显的臀部斑点(Geist 1982)。赤鹿与马鹿(C.canadensis)虽然外貌相似但可以明显区分。北美赤鹿的亚种与欧洲马鹿大小相似而被称为北美马鹿(Alces alces或者moose)，因对赤鹿起了作为不同品种的名字的‘马鹿’而导致了品种名的混淆。从而，北美马鹿被称为糜鹿(wapiti)，但糜鹿与欧洲马鹿在外观上不能明显区分。
麋鹿与欧洲马鹿在外观上不易区分，并且由此得到的鹿茸也不易区分。由于鹿茸按照产地和部位其价格之差相当大，因此为了区分这两个而试图进行各种研究，公开了染色体核型分析(karyotyping，Fontana andRubini，1990)、重复性的DNA分析(Lima-de Faria et al.，1984；Bogenbergeret al.，1987；Scherthan，1991)、线粒体DNA的RFLP分析(Cronin，1992)、线粒体DNA的RNA基因碱基序列分析(Miyamoto et al.，1990)等研究。
由于鹿茸按照产地和部位其价格之差相当大并且在形态上被同定，因此在完整状态下能鉴别，但在切片状态下由于其形态极其相似而即使是专家也难以正确地进行鉴别。从而，构思了不仅识别从麋鹿和欧洲马鹿切割出来的鹿茸的种类之外还要识别从糜鹿、赤鹿、梅花鹿、狍(roe deer，Capreolus capreolus)等切割出来的鹿茸的种类的各种方法，其中公知利用碱基序列晶体的分类法(Polziehn and Strobeck，1998)、利用12种鹿茸药材的外部形态的性质形状鉴别(Daixian et al，1999)、使用微卫星多态性(microsatellite polymorphism)的变异的方法等(Poetsch et al.，2001)。
在各种方法中利用PCR识别物种的方法是由于过程简单且正确而最近较常用的方法之一。其中多重(multiplex)PCR以制作对于物种特异的引物而同时分析各个试样的方法来能够快速分析并且能够保证特异性和正确性(Dean et al.，2005)。
线粒体DNA(mt DNA)是实施PCR时适合用作模板的DNA，这是因为，mt DNA的碱基置换率比核DNA(nuclear DNA)高很多而呈现较高多态性(Upholt and Dawid，1997，Brown et.al.1979)，并且在物种之间以及物种内保留很多变异的事实从包括人类的各种哺乳动物已被公开(Potter et.al.1975，Brown et.al.1982，Lansman et.al.1983)，在mtDNA中存在的D-loop因hypervariable region而碱基置换率比其他的mtDNA高于五倍(Aquadro et.al.1983)而在多样的物种的个体内容易观察遗传多样性(Bernatchez et.al.1992，Giuffra et.al.1994，Randi et.al.1994，Richardet.al.1996，Wilkinson et.al.199l，Yang et.al.1994)。
PCR-RFLP(Murray et.al.1995)等作为识别鹿茸的物种的传统的方法广泛公知，但是由于需要较长的实验过程和时间，因此公知利用对于物种特异的探针(probe)的方法(Li et al，2005)、碱基序列范围分类方法(Polziehan and Strobeck，1998)、microsatellite polymorphism(Poetsch et.al.2001)、RAPD分析法(Hidetoshi et al.，1995，Perez et al.，1998)，但还是认为PCR方法是能够快速且正确地识别鹿茸的具有一致性和可靠性的合适方法。尤其，通过一次PCR能够确认多种物种的多重(multiplex)PCR方法能够节省时间和金钱并且能够提高正确性和特异性，因此作为非常有效的方法备受瞩目(Dean et al.，2005)。
在韩国专利1998-0014747中记载了利用多重PCR方法的病原性大肠杆菌检测方法。
在韩国专利1997-002483中记载了通过利用特定寡核苷酸(oligonucleotide)引物的PCR方法来诊断弧菌感染的方法。
在韩国专利1996-0057885中记载了利用引物扩增判别高丽人参的产地的方法。
如上所述，虽然有很多利用基因特异引物而检测疾病或者个体的方法，但从来没有在鹿茸的品种选别上引入的例。
鉴于此，本发明者们确认了通过利用对于赤鹿、梅花鹿、马鹿以及驯鹿特异的引物的多重PCR方法能够从鹿茸的混合试样简单且正确地区别鹿茸品种，从而完成了本发明。
发明内容
本发明的目的在于提供一种与赤鹿、梅花鹿、马鹿以及驯鹿的基因特异结合的引物。
另外，本发明的目的在于提供一种利用上述引物识别鹿茸品种的方法。
为了达到上述目的，本发明提供与赤鹿、梅花鹿、马鹿以及驯鹿的基因的D-loop特异结合的引物。
另外，本发明提供利用上述引物识别鹿茸品种的方法。
以下详细说明本发明。
本发明提供与赤鹿、梅花鹿、马鹿以及驯鹿的基因特异结合的引物。
如本发明，在混合对于多种类型(赤鹿、梅花鹿、马鹿、驯鹿)基因的引物并同时执行一次PCR而选别鹿的物种以及驯鹿的多重PCR反应中，设计引物时与单个PCR的情况相比要求更严格的条件，并且为了结束反应后在凝胶体(gel)上区别被扩增的基因产物而基因产物的大小需要不同。在反应条件的设定上需设定对于所有的多对引物的相同的反应条件因此条件设定与单个PCR相比难度高。
本发明者们为了制作满足上述条件的引物而进行如下过程。
首先，为了在从赤鹿、梅花鹿、马鹿以及驯鹿中分离的所有DNA中扩增线粒体DNA的D-loop区进行碱基序列分析，利用了Polziehn et al.(1998)中公开的CST2引物(序列号1)，CST39引物(序列号2)。
利用上述引物对D-loop整体进行扩增的结果取得与赤鹿(1134bp)、梅花鹿(1228bp)、马鹿(1209bp)以及驯鹿(1142bp)的每一个的D-loop对应的PCR产物。对现有的已登记的鹿种类的D-loop碱基序列(htt//www.ncbi.nlm.nih.gov)与在本研究中分离的上述D-loop区的鹿茸碱基序列进行比较而确认被使用的碱基序列的正确性的结果，呈现95％以上的相似性，从而确认了在本发明中用PCR扩增的D-loop为各物种的D-loop碱基序列(参照图1和图2)。
由于确定了各物种的标准D-loop碱基序列，因此基于该碱基序列制作了在将要用于选别物种的PCR上使用的引物。正向引物是作为赤鹿、梅花鹿、马鹿以及驯鹿的D-loop的共同碱基序列在以序列号15记载了碱基序列内被选择的18至32mer的引物，优选正向引物是以序列号4记载的引物。反向引物由物种特异碱基序列部分制作，对于赤鹿、梅花鹿、马鹿以及驯鹿特异的反向引物，分别是以序列号16记载的碱基序列的互补序列内被选择的18至32mer的反向引物、以序列号17记载的碱基序列的互补序列内被选择的18至32mer的反向引物、以序列号18记载的碱基序列的互补序列内被选择的18至20mer的反向引物以及以序列号19记载的碱基序列的互补序列内被选择的18至23mer的反向引物，作为优选，分别是以序列号5、6、7以及8记载的引物。赤鹿、梅花鹿、马鹿以及驯鹿的反向引物分别称为RED、NIP、ELK以及REIN。驯鹿作为白尾巴鹿亚科(Odocoilinae)的哺乳类，与梅花鹿、赤鹿以及驯鹿完全不同的物种(Geist 1982)，但驯鹿(Rangiger tarnadus)的角有时非法流通，因此为了识别鹿茸的物种与驯鹿而制作了对驯鹿特异的引物。作为内对照制作了从线粒体DNA的细胞色素b(Cytochrome b)基因得到一定的489bp扩增产物的L14724引物和H14149引物。
对于各鹿的物种的DNA利用通过上述方式制作的引物执行PCR的结果，与预料的一样，对于赤鹿、梅花鹿、马鹿以及驯鹿分别能够确认199bp、300bp、245bp以及375bp的PCR产物。相反，对于小白鼠、老鼠、猫、牛、狗以及人只能确认489bp(细胞色素b)扩增产物，由此确认了只有在鹿茸上预料到的带(band)(参照图3)。从而，确认了本发明的引物是对于赤鹿、梅花鹿、马鹿以及驯鹿的线粒体基因的D-loop特异的引物。
另外，本发明提供由如下步骤构成的鹿茸品种识别方法，该识别方法的步骤包括1)从对象体提取DNA的步骤；2)执行多重PCR的步骤，将上述DNA为模板使用对于赤鹿、梅花鹿、马鹿以及驯鹿的基因的D-loop的共同引物和每一个物种的特异引物扩增对各物种特异的基因；3)实施电泳的步骤；和4)确认PCR产物的步骤。
本发明者们试图确认在混合试样中利用本发明的引物是否也能识别鹿的物种。首先将各个品种的整体DNA以1∶1混合后，在其中混合了对于D-loop具有共同性的正向引物、对于赤鹿、梅花鹿、马鹿以及驯鹿的每一个特异的反向引物以及用于扩增作为内对照的细胞色素的引物对而实施多重PCR。其结果，即使同时使用多个引物，也依然可以互不相干地可同时识别在混合两种到四种的鹿茸试样的状态下的扩增产物(参照图5)。
为了在实际流通的干燥鹿茸中确认物种识别的可能性，将市场上的鹿茸为对象提取DNA后用本发明地引物实施多重PCR。其结果，确认了在混合多种鹿茸的试样中也可以互不相干地正确地检测出鹿茸品种的特异产物(参照图6)。从而，确认了以利用本发明的多重PCR在混合试样中也可以正确地识别鹿茸的品种。
另外，本发明提供包括与赤鹿、梅花鹿、马鹿以及驯鹿的基因特异结合的引物以及线粒体基因的D-loop共同结合的引物的鹿茸品种识别用多重工具(Kit)。
上述工具可以附加包括转录(transcription)、扩增以及生成物检测用的试剂和对该试剂的指示事项。例如，上述工具能够包含转录酶、脱氧核苷酸(Deoxynucleotide)、适用于DNA扩增反应的热稳定性聚合酶和核酸的标签化(tagging)以及检测用试剂。
上述工具从鹿茸试样中能够同时检测出四种鹿茸品种，因此以少量试样在短时间内能够知道鹿茸的品种以及真伪。
图1是表示将赤鹿、梅花鹿、马鹿以及驯鹿的线粒体基因的D-loop为模板(template)实施PCR的结果的图，其中1-Cervus elaphus(RED)；2-C.nippon(NIP)；3-C.elaphus canadensis(ELK)；4-Rangifer tarandus(REIN)；L-100bp梯形带。
图2是表示对按照各物种扩增的D-loop区进行多重排列(multiplealignment)以及物种的特异设计的引物的图，其中A是正向引物(FOR)、B是RED引物、C是ELK引物、D是SIKA引物、E是REIN引物。
图3是利用物种的特异引物将各物种的线粒体基因的D-loop为模板实施PCR的结果的图，其中1-Cervus elaphus；2-Cervus Nippon；3-Cervus elaphus Canadensis；4-Rangifer tarandus；5-小白鼠；6-老鼠；7-猫；8-牛；9-狗；10-人；11-阴性对照(Negative control)；L-100bp梯形带(ladder)。
图4是在利用物种的特异引物将各物种的线粒体D-loop为模板实施PCR的情况下表示PCR扩增灵敏度的图，其中A-RED；B-NIP；C-ELK；D-REIN；1-1ng；2-500pg；3-100pg；4-50pg；5-10pg；6-5pg；7-1pg；8-0.5pg；L-100bp梯形带。
图5是表示在对混合了各鹿种的DNA的试样以特异引物实施多重PCR(Multiplex-PCR)的情况下，比较扩增产物的图案的结果的图，其中1-Cervus elaphus∶Cervus nippon＝1∶1；2-Cervus elaphus∶Cervus canadensis.＝1∶1；3-Cervus elaphus∶Rangifer tarnadus＝1∶1；4-Cervus nippon∶Cervus canadensis＝1∶1；5-Cervus nippon∶Rangifer tarnadus＝1∶1；6-Cervus canadensis∶Rangifer tarnadus＝1∶1；7-Cervus elaphus∶Cervus nippon∶Cervus canadensis＝1∶1∶1；8-Cervus elaphus∶Cervus nippon∶Rangifer tarnadus＝1∶1∶1；9-Cervus elaphus∶Cervus canadensis∶Rangifer tarnadus＝1∶1∶1；10-Cervus nippon∶Cervus canadensis∶Rangifer tarnadus＝1∶1∶1；
11-Cervus elaphus∶Cervus nippon∶Cervus canadensis∶Rangifertarnadus＝1∶1∶1∶1；L-100bp梯形带。
图6是在对混合了各鹿种和驯鹿的DNA的试样以特异引物实施多重PCR的情况下，比较扩增产物的图案的结果的图，其中A-Cervus elaphus(a)∶Rangifer tarnadus(b)；B-Cervus nippon(a)∶Rangifer tarnadus(b)；C-Cervus elaphus canadensis(a)∶Rangifer tarnadus(b)；1-a∶b＝1∶14；2-a∶b＝1∶9；3-a∶b＝3∶7；4-a∶b＝5∶5；5-a∶b＝7∶3；6-a∶b＝9∶1；7-a∶b＝14∶1；L-100bp梯形带。
图7是表示对在市场中流通的鹿茸试样以特异引物实施多重PCR的结果的图，其中1-韩国(ELK)；2-新西兰；3-俄罗斯；4-韩国(进口1)；5-韩国(进口2)；6-中国；7-新西兰；8-俄罗斯；9-加拿大；10-中国；11-中国；12-驯鹿(Rangifer tarandus)；13-阴性对照(D.W)；L-100bp梯形带。
具体实施例方式
以下通过实施例详细说明本发明。
但是，下述实施例仅仅例示本发明，而本发明并不限定于下述实施例。
(实施例1)准备鹿茸试样作为鹿茸的标准试样采用了在首尔大公园饲养的赤鹿、梅花鹿、马鹿、驯鹿的血液以及组织，作为其他血液购买了在国内个人农场中饲养的赤鹿、梅花鹿、马鹿的血液和在国内流通的干燥鹿茸而使用于实验上。利用QIAamp DNA microkit(QIAGEN Germany)按照使用者指示提取出从鹿茸的血液或者组织中分离的全部DNA。
(实施例2)确认鹿茸的D-loop部分碱基序列以及确定标准D-loop碱基序列为了扩增赤鹿(Cervus elaphus)、梅花鹿(Cervus nippon)、马鹿(Cervuselaphus canadensis)以及驯鹿(Rangiger tarandus)的线粒体DNA(mtDNA)的D-loop区进行碱基序列分析，使用了三种引物。以序列号1、2记载的CST2引物和CST39引物是采用了在Polziehn et al.(1998)中公布的引物，由于以序列号3记载的SeqR引物不能通过一次实验对整个D-loop进行碱基序列分析，因此基于以CST39引物进行碱基序列分析的结果进行重新合成，并且以此来完成剩余的碱基序列分析从而取得全部碱基序列。
D-loop区的碱基序列分析用Perkin-Elmer DNA terminator CycleSequencing Ready Reaction Kit，DNA扩增器(GeneAmp PCR System 9700，Applied biosystems)以及BI 310 genetic analyser(Applied biosystems)来执行。
用赤鹿、梅花鹿、马鹿以及驯鹿的血液以及组织、CST2和CST39引物来扩增所有D-loop(图1)。PCR反应条件为，用DNA聚合酶(TaqGold Polymerase，Applied biosystems)在95℃下使上述的一对引物和模板变性12分钟，在94℃下1分钟内反应30次、在52℃下1分钟内反应30次以及在72℃下一分钟内反应30次，在72℃下延长(extension)7分钟后结束反应。
排列与各个种类对应的扩增产物的1134bp、1288bp、1209bp以及1142bp大小的扩增产物而确定D-loop标准碱基序列(图2)。
碱基序列比较分析使用了ClustalW(ver.1.75，Thompson et.al.，1994)，并且利用以序列号9和10记载的L14724引物和H15149引物。为了制作对鹿茸品种特异的引物，比较现有登记的鹿种类的D-loop碱基序列(http//www.ncbi.nlm.nih.gov)与在本研究中分离的D-loop区的鹿茸碱基序列而确认被使用的碱基序列的正确性。赤鹿的D-loop碱基序列与genbank(AF016973)呈现98％相似性，梅花鹿的D-loop碱基序列与genbank(AF016965)呈现95％相似性，驯鹿亚种(Rangifer tarandusgroenlandicus，AF096413)与在本实验中分离出的碱基序列呈现99％相似性而被认定为驯鹿。还有，由于马鹿的碱基序列未登记在genbank，因此与从饲养在首尔大公园中的马鹿的血液和饲养在国内农场中的马鹿的血液中分离出的D-loop区的碱基序列进行比较时呈现99％的相似性，从而将该碱基序列确定为马鹿的碱基序列。
(实施例3)制作以及确认特异的引物确定赤鹿、梅花鹿、马鹿以及驯鹿的标准D-loop碱基序列之后，作为正向引物使用了FOR引物(sense；Tm value 58℃)(序列号4)，作为反向引物制作了与赤鹿、梅花鹿、马鹿以及驯鹿特异地反应的引物(序列号5至8)，各引物称为RED(Tmvalue 53℃)、NIP(Tm value 53℃)、ELK(Tm value 53℃)、REIN(Tm value 54℃)。为了制作引物而利用http//www.bioneer.co.kr/tools网站。
为了得到鹿茸的物种的特异D-loop mtDNA切片，将2pmole的FOR、RED、NIP、ELK、REIN引物和作为内对照的40pmole的L14724(Masudaet.al.，1996)引物、10X reaction buffer(Applied biosystems，U.S.A.)、1.5mMMgCl2、0.2mM dNTP Mixture、1.25unit的AmpliTaq Gold polymerase(Applied biosystems，U.S.A.)还有1ng的DNA添加到25μl反应液中。
DNA扩增利用GeneAmp PCR System 9700(Applied biosystems)在95℃下进行12分钟的前期处理之后，将在94℃下进行的30秒的denaturation、在55℃下进行的30秒的annealing、在72℃下进行的30秒的extension的温度变异过程重复进行30次，最终在72℃下进行7分钟的extension。在包含0.5μg/Ml EtBr的2％agarose gel(Amresco)中利用0.5XTBE buffer(45mM Tris-borate and 1mM EDTA，pH8.0)对5μl的扩增产物进行电泳而在UV transilluminator上确认扩增结果。
用上述引物实施PCR的结果，与预料中的结果一样对于赤鹿能够确认489bp和199bp的扩增产物、对于梅花鹿能够确认489bp和300bp的扩增产物、对于马鹿能够确认489bp和245bp的扩增产物、以及对于驯鹿能够确认489bp和375bp的扩增产物，对于小白鼠、老鼠、猫、牛以及人只能构确认由细胞色素b生成的489bp的扩增产物，由此确认了只有对于鹿茸可预料到的带(图3)。从而能够确认本发明的引物对鹿茸的特异性。
从上述结果与现有的仅识别一个种类的其他实验不同能够同时识别四个品种的这一点出发，认为若利用RED、NIP、ELK、REIN的引物则在时间上、经济上比以往的结果((Gao et.al.2004，Dean et.al.2005，Wan &Fang 2003)更有用。
(实施例4)确认利用物种的特异引物的多重(multiplex)PCR的灵敏度利用作为物种识别引物的RED、NIP、ELK以及REIN通过多重PCR进行有效检测浓度实验。标准鹿品种的DNA浓度调整为1ng、500pg、100pg、50pg、10pg、5pg、1pg、0.5pg后执行PCR的结果，能够确认对于四个品种可确认的最小浓度(图4)。在赤鹿的情况下(A.RED)，由物种特异引物可扩增的浓度为5pg，但内对照可确认到50pg为止，从而可进行物种识别的所有DNA的最小浓度为50pg。在梅花鹿的情况下(B.NIP)，物种特异引物和内对照可进行物种识别的所有DNA的最小浓度均为5pg。在马鹿的情况下(C.ELK)，由物种特异引物可扩增的浓度为10pg，但内对照可确认到50pg为止，从而可进行物种识别的所有DNA的最小浓度为50pg。在驯鹿的情况下(D.REIN)的情况下，所有的物种特异引物和内对照可进行物种识别的所有DNA的最小浓度均为5pg。综合以上结果，可知在鹿茸的物种识别上只要存在至少50pg以上的所有DNA就可以识别物种。
(实施例5)利用多重PCR在混合试样中分类鹿茸品种确认了本实验在混合试样中是否能够识别物种。首先将各个品种的3ng的所有DNA以1∶1混合而将1ng的所有DNA使用于实验上，其结果内对照(489bp)的扩增不受影响，即使同时使用多个引物也可以互不相干同时识别在混合两种到四种鹿茸的状态下的扩增产物(图5)。
还有，驯鹿的角是与鹿茸完全不同的品种因此不能用于鹿茸的药材，但实际上像鹿茸一样流通的事例比较多，因此为了确认在切片鹿茸状态下是否能区分，确认了被混合的驯鹿的最小检测浓度。从而，确认了在赤鹿和驯鹿、梅花鹿和驯鹿以及马鹿和驯鹿等混合着驯鹿的情况下的检测可能性。将最终DNA浓度调整为1ng/ul之后以多种浓度来混合时，在混合赤鹿和驯鹿的情况下，大约混合30％为止的驯鹿时能够确认到驯鹿的混合，在混合梅花鹿和驯鹿的情况下，大约混合10％为止的驯鹿时能够确认到驯鹿的混合。还有，在混合马鹿和驯鹿的情况下，大约混合7％为止的驯鹿时能够确认到驯鹿的混合(图6)。从而，确认了至少被混合另一品种的30％以上时可进行被混合的物种识别。
(实施例6)对于流通鹿茸的多重PCR的实际应用为了对于实际流通的干燥鹿茸确认物种识别的可能性，将市场中的鹿茸为对象提取DNA后将1ng的DNA使用于物种识别(图6)。其结果，对于国产马鹿(图7、线1)、俄罗斯产(图7、线3)、作为援用在市场中销售的俄罗斯产(图7、线8)以及加拿大产(马鹿、图7、线9)的流通鹿茸，确认了489bp和245bp的扩增产物而被确认为马鹿的鹿茸，对于新西兰产的2种(图7、线2和线7)、国内进口鹿茸(中医协会、图7、线4)以及国内进口鹿茸(中医流通、图7、线5)的流通鹿茸，确认了489bp和199bp的PCR扩增产物而被确认为赤鹿的鹿茸。在进口驯鹿情况下，确认了489bp和375bp的PCR扩增产物，在中国产三品种(图7、线6、10、11)的情况下，只确认到作为489bp的PCR扩增产物的内对照的扩增产物，因此被确认为不是驯鹿。从而，确认了以利用本发明的引物的多重PCR方法能够选别在市场上流通的鹿茸的品种。
(发明效果)如上所述，本发明的对于梅花鹿、赤鹿、马鹿以及驯鹿特异的引物和利用上述引物识别鹿茸品种的方法为，通过利用对于各个物种特异的引物的多重PCR方法，以一次PCR能够同时得到对于鹿茸品种特异的扩增产物，并且能够快速且正确地特异反应的新方法，因此能够利用于与现有的使用一种引物对的PCR方法相比更有效地判别鹿茸的品种方面。
5P-05-05<110>Korea Institute of Oriental Medicine<120>The primers specific to Cervus elaphus，C.nippon，C.canadensisand Rangifer tarandus gene and the method to identify CerviParvum Cornu species<160>19<170>Kopatent In 1.71<210>1<211>22<212>DNA<213>CST2 primer<400>1taatatactg gtcttgtaaa cc 22<210>2<211>24<212>DNA<213>CST39 primer<400>2gggtcggaag gctgggacca aacc 24<210>3<211>20<212>DNA<213>SeqR primer<400>3atgtcctgtg accattgact20<210>4<211>21<212>DNA<213>FOR primer<400>4ccctaagact caaggaagaa g 21<210>5<211>20<212>DNA<213>RED<400>5gtggttggtg gatgtaaaat20<210>6<211>20<212>DNA<213>NIP<400>6tatcttacgc accggtttat20<210>7<211>20<212>DNA<213>ELK<400>7ttttatgtac tacgagcgca20<210>8<211>21
5P-05-05<212>DNA<213>REIN<400>8gtgccatgta cgatcaataa t 21<210>9<211>28<212>DNA<213>L14724<400>9cgaagcttga tatgaaaaac catcgttg 28<210>10<211>35<212>DNA<213>H15149<400>10aaactgcagc ccctcagaaa tgatatttgt cctca 35<210>11<211>199<212>DNA<213>C.elaphus<400>11ccctaagact caaggaagaa gccatagccc cactatcaac acccaaagct gaagttctat 60ttaaactatt ccctgatgct tattaatata gttccataaa aatcaagaac tttatcagta120ttaaatttcc aaaaagtttt aatatttcaa tacagctttc cactcaacac ccattttaca180ttttacatcc accaaccac 199<210>12<211>299<212>DNA<213>C.nippon<400>12ccctaagact caaggaagaa gccatagccc cactatcaac acccaaagct gaagttctat 60ttaaactatt ctctgacgct tattaatata gttccataaa aatcaagaac tttatcagta120ttaaatttcc aaaaaatttt aatattttaa tacagttttc tactcaacac ccaatttaca180tttatgtcct actaattaca caacaaaaca cgtgatataa ccttatgcac ttgtagcaca240taaaattaat gcgttaagac ataccatgta caacagcaca taaaccggtg cgtaagata 299<210>13<211>245<212>DNA<213>C.e.canadensis<400>13ccctaagact caaggaagaa gccatagccc cactatcaac acccaaagct gaagttctat 60ttaaactatt ccctgacgct tattaatata gttccataaa aatcaagaac tttatcagta120ttaaatttcc aaaaaattta atattttaat acagctttct actcaacatc caatttacat180tttatgtcct actaattaca cagcaaaaca cgtgatataa ccttatgcgc tcgtagtaca240taaaa245<210>14
5P-05-05<211>375<212>DNA<213>R.tarandus<400>14ccctaagact caaggaagaa gctatagccc cactatcaac acccaaagct gaegttctaa 60traaactatt ccctggcgta tattaatata gctccacaaa attcaagagc cttgtcagta120ttaaatttct aaaaaccttc aagaatttaa tacagttctg cactcaatag ccatattata180tattaaatat cattaactac ataaatattt tataaacgta catatatggt cctgtacggc240tatagtacat aaaattaatg tattaagaca tattatgtat aatagtacat taaattatat300gccccatgct tataagcaag tacttgacat tatttacagt acatagtaca taatattatt360gatcgtacat ggcac 375<210>15<211>80<212>DNA<213>conserved sequence<400>15acctccctaa gactcaagga agaagccata gccccactat caacacccaa agctgaagtt60ctatttaaac tattctctga80<210>16<211>49<212>DNA<213>C.elapnus primer region<400>16tacattttac atccaccaac cacacaacaa aatatgtaat aaaacctta49<210>17<211>77<212>DNA<213>C.nippon primer region<400>17atgtacaaca gcacataaac cggtgcgtaa gatacattat gcatgatagt acataaatta60atgtattagg acatact 77<210>18<211>20<212>DNA<213>C.e.canadensis primer region<400>18tgcgctcgta gtacataaaa20<210>19<211>23<212>DNA<213>R.tarandus primer region<400>19atattattga tcgtacatgg cac2权利要求
1.一种反向引物，与赤鹿(Cervus elaphus)的线粒体基因的D-loop特异结合。
2.根据权利要求1所述的反向引物，其特征在于，所述引物是在以序列号16记载的碱基序列的互补序列内选择的18至32mer的反向引物。
3.根据权利要求2所述的反向引物，其特征在于，所述引物具有以序列号5记载的碱基序列。
4.一种引物，与梅花鹿(C.nippon)的线粒体基因的D-loop特异结合。
5.根据权利要求4所述的引物，其特征在于，所述引物是在以序列号17记载的碱基序列的互补序列内选择的18至32mer的反向引物。
6.根据权利要求5所述的反向引物，其特征在于，所述引物具有以序列号6记载的碱基序列。
7.一种引物，与马鹿(C.canadensis)的线粒体基因的D-loop特异结合。
8.根据权利要求7所述的引物，其特征在于，所述引物是在以序列号18记载的碱基序列的互补序列内选择的18至20mer的反向引物。
9.根据权利要求8所述的反向引物，其特征在于，所述引物具有以序列号7记载的碱基序列。
10.一种引物，与驯鹿(Rangifer tarandus)的线粒体基因的D-loop特异结合。
11.根据权利要求10所述的引物，其特征在于，所述引物是在以序列号19记载的碱基序列的互补序列内被选择的18至23mer的反向引物。
12.根据权利要求11所述的反向引物，其特征在于，所述引物具有以序列号8记载的碱基序列。
13.一种正向引物，与梅花鹿、赤鹿、马鹿以及驯鹿的线粒体基因的D-loop共同结合。
14.根据权利要求13所述的正向引物，其特征在于，所述引物是在以序列号15记载的碱基序列内选择的18至32mer的正向引物。
15.根据权利要求14所述的正向引物，其特征在于，所述引物具有以序列号4记载的碱基序列。
16.一种鹿茸品种的识别方法，包括1)从对象体提取DNA的步骤；2)执行多重PCR的步骤，将在步骤1)提取的DNA为模板使用权利要求13所述的引物和权利要求1、4、7以及10所述的引物，扩增对赤鹿、梅花鹿、马鹿或者驯鹿特异的基因；3)实施电泳的步骤；和4)确认PCR产物的步骤。
17.根据权利要求16所述的鹿茸品种的识别方法，其特征在于，步骤2)的赤鹿特异的基因以序列号11记载。
18.根据权利要求16所述的鹿茸品种的识别方法，其特征在于，步骤2)的梅花鹿特异的基因以序列号12记载。
19.根据权利要求16所述的鹿茸品种的识别方法，其特征在于，步骤2)的马鹿特异的基因以序列号13记载。
20.根据权利要求16所述的鹿茸品种的识别方法，其特征在于，步骤2)的驯鹿特异的基因以序列号14记载。
21.一种鹿茸品种识别用多重工具，包含权利要求1、4、7、以及13所述的引物。
全文摘要
本发明涉及对于赤鹿(Cervus elaphus)、梅花鹿(C.nippon)、马鹿(C.canadensis)以及驯鹿(Rangifer tarandus)特异的引物以及使用该引物识别鹿茸品种的方法，尤其涉及，对于梅花鹿、赤鹿、马鹿以及驯鹿的基因具有特异序列的各个引物以及通过利用该引物的多重聚合酶连锁反应(multiplex－PCR)来识别鹿茸的品种的方法。本发明的引物以及利用该引物的鹿茸识别方法正确地鉴别在切片状态下不易鉴别的鹿茸而能够有效利用于防止非鹿茸的其他动物的角的非法流通。
文档编号C12N15/11GK1932041SQ200610141919
公开日2007年3月21日 申请日期2006年7月6日 优先权日2005年7月6日
发明者高柄燮, 吴承恩, 李美英, 金应秀, 金令和 申请人:韩国韩医学研究院