专利名称：：人细胞系中重组人蛋白质的无血清稳定转染和生产的制作方法人细胞系中重组人蛋白质的无血清稳定转染和生产本发明涉及无血清生产永生化人细胞系的改进方法，所述细胞系在无血清M下稳定转染了带有编码目的蛋白的基因的特定栽体。另外，本发明涉及通过所述方法获得的生产细胞系，使用所述生产细胞系生产所述目的蛋白的方法以及自身携带目的基因的特定载体。
背景技术：
：人蛋白质的重组生产一般是通过培养稳定转染的真核(优选哺乳动物)细胞系并从培养液中分离所述蛋白质来进行。当所述重组蛋白旨在用于药物应用时，长期以来的一般实践是使用非人细胞系，以避免共纯化可能被人细胞接纳并表达的传染原的风险。在一些人蛋白质如人凝血因子VHI的生产中，发现使用非人细胞系具有某些缺点，例如所表达蛋白质、,培养基的分泌水平不够理想。相，的微小差别，这也可能影响所表达多肽的生物活性。除此之外，还存在这种担心从非A^达系统中纯化的治疗性蛋白质被可在患者中《1起抗原反应的细胞成分污染。另一个担心是在非人表达系统中重组生产的人蛋白质上发现的非A^t基化模式。人们认为这增加了患者中发生抗原反应的可能性。另外，血液蛋白质(例如凝血因子)的生物稳定性和效力受其N-糖基化模式的显著影响。尤其是外周及末端单糖是4艮重要的，因为它们被负责降解它们的细胞的特定受体所检测。例如，凝血因子带有唾液酸残基作为末端单糖。对糖蛋白触角(antennae)中唾液酸组成的修饰可导致异源糖基化模式。因此，修饰的发生与生物稳定性和效力高度相关。因此，在重组凝血因子的生产中，评估非人生产细胞系与人细胞系相比糖基化的影响是重要的考虑因素。另一方面，用于所需基因高水平蛋白质表达的一般方法是可用的，其包括表达病毒转录激活子蛋白的永生化稳定转染哺乳动物细胞系(例如，美国专利5,712,119)。这些细胞系可使用载体构建体转化，其中合适的病毒转录启动子与定义目的基因的DNA序列有效连接，由细胞系提供的转录激活子蛋白激活病毒转录启动子，由此起始目的基因的表达。与细胞系同样重要的是用于将重组基因引入固定的生产细胞系中的栽体。许多种栽体用于翻译哺乳动物蛋白质，(例如，Witsch-Baumgartner，M等Am.J.Genet(2000).66，402-412将DHCR7cDNA克隆进pCI-neo哺乳动物表达载体，并在HEK293细胞中表达；McGarvey，T.W.等Oncogene(2001)20,1041-1051将TERE1基因克隆进pTARGET哺乳动物表达载体，并在人膀胱移行细胞癌中表达；LinLin等JBiolChem(2002)277(44)41872-8将AchR基因克隆进哺乳动物表达载体pEF6/myc-His载体，并在293细胞中表达)。最近开发的极具潜力的载体是Invitrogen的名为pcDNATM3.1的栽体，它已证明能够it^达重组蛋白。LiJ.等，LifeSci.2004Apr16;74(22):2693-705已经成功地使用pcDNA3.1在HEK293细胞中过表达了组蛋白脱乙酰基酶。稳定转染了所述细胞并在血清存在下进行培养。Yuan-GenFu.等，WorldJGastroenterol2003已经在胃癌细胞系SGC7卯1中使用基于pcDNA3.1(+)的真核载体生产了重组胱天蛋白酶-3(Caspase-3)，所述细胞系瞬时转染了所述载体并且在血清存在下进行培养。MaH.等，InvestOphthalmolVisSci.2000Dec;41(13):4232國9使用COS-7作为细胞系检查了亚克隆进pcDNA3.1载体的Lp82及Lp82相关蛋白中稳定蛋白质的缺乏以及酶活性的丧失。所述细胞经瞬时转染并在培养基中存在血清的情况下培养。硫氧还蛋白it^达阻止了在肺内皮细胞中NO诱导的NO合酶活性的下降。ZhangJ.等，AmJPhysiol.1998Aug;275(2Pt1):L288-93公开了通过使用pcDNA3.1载体瞬时转染培养的猪肺动脉内皮细胞来子这些细胞中it^ii^L氧还蛋白。所述转染细胞在补充了血清的培养基中培养。ShinkiT.等，ProcNatl.Acad.Sci.USA1997Nov25;94(24):12920-5将大鼠肾线粒体细胞色素P450混合功能氧化酶、25-羟基维生素D3-la-羟化酶的全长cDNA与维生素D缺乏大鼠的cDNA进行了比较，将其亚克隆进哺乳动物表达载体pcDNA3.1(+)，并将所述载体瞬时转染进COS-7转化猴肾细胞。所述转染细胞在补充了血清的培养基中培养。Zhang等,ActaBiochimicaetBiophysicaSinica2004,36(10):707-712公开了使用pcDNA转染人胚肾293细胞，所迷pcDNA含有编码人源化520C9单链Fv抗体/人白介素-2融合蛋白的基因。在无血清SFMII培养基中培养所述细胞三天后，收取上清液。所得融合蛋白具有针对pl85(用于乳腺癌抗体治疗的有希望的靶标)的结合特异性，并且保留了重要的IL-2免疫激活活性。Chen,J.Z.等，IntJBiochemCellBiol.2004Aug;36(8):J554-614吏用转染了pcDNA-Bima3的HEK293细胞it^达凋亡的必要因子Bim蛋白。提高重组蛋白药物应用安全性的另一个措施是在培养过程中使用无血清培养基，因为血清的使用代表了安全性风险以及不想要的污染的来源。这样的无血清培养的缺点是生产过程的产量通常显著降低。另一个安全性担心是转染宿主细胞时使用血清作为常规方法，因为在转染过程中应用血清可造成不想要的生物材料整合进细胞，这些材料随后污染生产过程中细胞表达的产物。尽管一些可用的生产重组蛋白的方法(包含上文提到的那些)允许无血清培养，但是人细胞的无血清稳定转染仍然未知。在第19届ESACT^i义，Harrogate,2005年6月5日-8日上，Kuchenbecker等提出了CHO细胞的无血清转染。因此，期望开发一种有效且安全的生产人重组蛋白的方法。
发明内容意想不到的是，我们发现可以从在无血清条件下稳定转染了编码目质(即不含不想要的蛋白质副产物的蛋白质制备物)。更详细地，本发明提供(1)制备稳定转染了核酸序列的永生化人细胞系的方法，所述核酸序列包含编码人耙蛋白质或其衍生物或其突变体的基因、启动子和牛生长激素多聚腺苷酸化(多聚A)信号，所述启动子和多聚A信号分别与所述编码人耙蛋白质的基因的5，和3，末端连接，所述方法包括使用包含所述核酸序列和复制起点的转染载体在无血清条件下转染永生化人宿主细胞系；(2)上述(1)的方法，其中转染载体来源于含有序列SEQIDNO:4或5的pcDNA3.1载体；(3)上述(1)或(2)的方法，其中所i^A细胞系是选自293细胞(ATCCCRL-1573;DSMACC305)、FreeStyle293细胞(下文的"293F"细胞；InvitrogenR7卯07)、和293T细胞(ATCCCRL11268;DSMACC2494)的A^、肾细胞；(4)上述(1)-(3)的方法，其中所i^A蛋白质是凝血因子IX，(例如，如SEQIDNO:l的939位至2324位4^对所编码的)、a-l-抗胰蛋白酶(下文的"A1AT";例如，如SEQIDNO:2的913位至2259位碱基对所编码的)、凝血因子VIII(包括如SEQIDNO:8中所示的野生型因子VIII，或者如SEQIDNO:3的783位至5162位>5^对所编码的B结构域缺失的因子VIII突变体，)、因子VlI/VIIa(包括其a型和b型，由SEQIDNO:13和14所编码)、G-CSF(包括G-CSFa、b和c型，分别示于SEQIDNO:15、16和17)或者血友病因子(vonWillebrandfactor,vWF);(5)转染载体，其包含复制起点和编码如上述(1)和(2)中所定义的人蛋白质的基因，优选所述转染载体为包含编码如上文(4)中所定义的人蛋白质的基因的pcDNA3.1载体；(6)可通过上文(1)-(5)中所定义的方法获得的永生化人细胞系，优选所述人细胞系如上文(3)或(4)中所定义；和(7)重组生产人耙蛋白质或其衍生物或突变体的方法，其包括培养如上文(6)中所定义的永生化人细胞系，优选在无血清条件下进行培养。图1:野生型人凝血因子IX(FIX)蛋白。带有其5'非翻译(5'UTR)区和3，UTR区的FIX基因的示意图。标出了含461个M酸的未加工蛋白质的8个结构域[信号肽；P:前肽;Gla结构域:Y-^J^氨酰结构域；H结构域:疏7jc序列；EGF结构域表皮生长因子样结构域;L:连接序列；AP:激活肽;催化结构域。FIX成熟蛋白质长度为415个絲酸，近似分子量为55kDa。图2:pcDNA3.1-FIX载体。该环状DNA栽体包含6，960个4^对，其确切序列;SEQIDNO:l中给出。在示意图中标出了CMV启动子(CMV)、人FIX基因(hFIX)、fl起点(fl)、SV40启动子(SV40)控制下的潮霉素(Hyg)基因、多聚A区(SV40多聚A)、pUC起点和氨爷青霉素(Amp)抗性基因以及大量限制性位点。此载体来源于SEQIDNO:5的经重测序的pcDNA3.1载体pcDNA3.1Hygro(+)-zz。图3:pcDNA3.1-AlAT载体。该环状DNA载体包含6,914>5^对，其确切序列;SEQIDNO:2中给出。在示意图中标出了CMV增强子启动子、AlATcDNA、包含转录终止序列以增强mRNA稳定性的牛生长激素多聚腺苷酸化(多聚A)信号、fl起点(fl)、SV40启动子(SV40)控制下的潮霉素(Hyg)基因、SV40多聚A区(SV40多聚A)、pUC起点和氨苄青霉素(Amp)抗性基因以及大量限制性位点。此栽体来源于SEQIDNO:5的pcDNA3.1Hygro(+)國zz栽体。图4:4吏用编码a-l-抗胰蛋白酶的载体瞬时转染不同的人胚肾细胞。显示在瞬时转染研究中的细胞系比较。显示了每106个293、293T和293F细胞中a-l-抗胰蛋白酶(A1AT)的表达量(％)。将瞬时转染了pcDNA3.1-AlAT的293F细胞中A1AT的表达量设置为100%。图5:使用编码a-l-抗胰蛋白酶的不同栽体瞬时转染293F细胞。显示了使用瞬时转染的freestyle293F细胞由不同载体表达的AIAT浓度的比较。pcDNA3.1-AlAT的AIAT表达水平设置为100%。还测试了带有AIAT基因的多种其它载体将自制载体(in-housevector)pTGl-AlAT(用于生产图10所示人重组AIAT的自制载体，)、pCMVScriptAIAT(Stratagene)和pelneo-AlAT(Promega)与pcDNA3.1-AlAT(pcDNA3.1)进行了比较。这些其它载体均未接近使用pcDNA3.1-AlAT时观察到的高表达水平。图6:细胞培养上清液的SDS-PAGE和Western印迹。通过SDS-PAGE和western印迹分析瞬时转染pcDNA3.1-AlAT(1-3道和6-8道)或GFP表达对照质粒(4和8道)的freestyle293F细胞上清液的等分试样。l道含有大小标记，5道为空白。A1AT的条带使用箭头标出。还可见4和8道中对应于GFP的27kDa条带。图7显示DcDNA3.1-F.Vm。所述载体包含9,975个>5^对，其确切序列在SEQIDNO:3中显示。783-5162位>^^"编码的因子VIII蛋白是WO01/70968中公开的B结构域缺失的因子VIII突变体。此载体也来源于SEQIDNO:5的pcDNA3.1Hygro(+)-zz载体。图8:对使用pcDNA3.1-FVI11和自制栽体pTGF8-2hyg-s(其确切序列在SEQIDNO:7中显示)转染的293和293F细胞中，i好的三个稳定转染克隆中因子VIII平均生产量的比较。图9显示dTG1-A1AT载体。所述载体包含5,610个>5^对，其确切序列在SEQIDNO:6中显示。图10显示pCR2.1d2-GCSFb载体。所述载体包含4,542个>5^对，其确切序列在SEQIDNO:21中显示。图11显示pDNA3.1-GCSFb载体。所述载体包含6,237个4^对，其确切序列在SEQIDNO:22中显示。图12显示pCINeo-GCSFb载体。所述载体包含6,101个4^对，其确切序列在SEQIDNO:23中显示。图13显示pCMVScript-GCSFb载体。所述栽体包含4,920个4^对，其确切序列在SEQIDNO:24中显示。图14显示pTG2-GCSFb-hyg-as载体。所述载体包含6,917个4^对，其确切序列在SEQIDNO:25中显示。图15比较根据实施例9通过不同表#建体产生的rhG-CSF的量。图16显示根据实施例9产生的rhG^CSF的western印迹。发明详述本发明提供在完全无血清和无蛋白质条件下在人永生化细胞系中转染和生产人重组蛋白的改进方法。它允许无血清地转染和生产人蛋白质。所述方法可包括一种或多种纯化步骤，包括病毒灭活操作，其降低了人类病原体污染重组蛋白的风险。由于人细胞系中产生的人重组蛋白带有AJt基化模式，因此它们与缺乏其天然糖基化模式的人蛋白质相比也较为不易降解。总之，本发明的方法提供M现有技术的多种优点。具体地，本发明实施方案(7)的方法提供了生产安全、高活性的人重组凝血因子(例如，用于人血友病B和A的治疗用途的因子IX和FVIII)的有效系统。所述方法适于表达野生型蛋白质，但是也可用于这些蛋白质如因子VIII的突变体，其对于蛋白水解失活异常稳定，从而允许接受激烈的病毒灭活方案。本发明实施方案(7)方法的优选模式包括无血清培养带有载体的永生化细胞系，所述载体含有与编码所^AA液蛋白的DNA序列5'末端连接的启动子。编码所i^/ok液蛋白的DNA序列的3'末端与牛生长激素多聚A信号有效连接。根据本发明，使用所述载体稳定转染永生化人细胞系。为检测稳定转染，除了^jk液蛋白基因以外，所述载体还可包含至少一种与启动子有效连接的用于选择标记系统的基因。合适的启动子包含病毒启动子、看家基因启动子、组织特异性启动子等。对于启动子为病毒启动子的情况，所述细胞系不包含与所述启动子相匹配的病毒转录激活子蛋白。然而，所述细胞可包含与另一病毒启动子互补的病毒转录激活子蛋白(例如T抗原)，所述另一个病毒启动子没有与编码Ajk液蛋白的基因有效连接。优选的，所述启动子是SV40启动子、CMV启动子、EF-la启动子、HSVTK启动子等，最优选地，启动子是CMV启动子，即巨细胞病毒的组成型主要中间早期启动子。表述"转染，，或"转染的，，指在允许所述蛋白质表达的条件下将核酸引入到细胞中。通常，所述核酸是DNA序列，特别的是携带合适启动子控制下的目的基因的载体或质粒，所述基因的表达受到所述启动子的控制。但是，术语转染也包括RNA转染。技术人员熟悉多种转染方法，例如使用栽体分子，例如阳离子脂类如DOTAP(Roche)、DOSPER(Roche)、Fugene(Roche)、Transfectam(Promega)、TransFast(Promega)和TfxTM(Promega)、脂转染胺(Lipofectamine)(Invitrogene)和293fectinTM(Invitrogene)的方法，或者使用磷酸钾和DEAE葡聚糖的方法。技术人员也熟悉强力转染技术。它们包括电穿孔、使用核酸包被的栽体颗粒进行轰击(基因枪)和显微注射。最后，技术人员也熟悉使用病毒载体的核酸转染。"瞬时转染的"或"瞬时转染"指由于所引入核酸的附加体性质而瞬时(即非永久性)表达目的基因。根据其这种性质，RNA转染或细胞溶解性病毒只可用于瞬时表达。附加体核酸，包括DNA(质粒或载体)，在2到4天后被细胞降解，因此目的基因的表达此时终止。"稳定转染的"或"稳定转染"指由于转染的DNA整合进细胞基因组而永久性表达目的基因。多数(如果不是所有)细胞具有将附加体DNA整合进其基因组的潜力，虽然整合率非常低。但是，4吏用复杂的选择策略以扩增那些已整合了转染DNA的细胞。为此，所述载体必需含有至少一个选择标记(例如潮霉素)基因。术语"稳定转染"或"稳定转染的"在本文中也用于指携带可自主复制的质粒并因而可用于长期表达外源基因的细胞。可用于"稳定转染"细胞的一个具体的基因转移系统是基于重组逆转录病毒。由于前病毒DNA的整合是在逆转录病毒复制周期中必需的步骤，因此使用重组逆转录病毒感染细胞使很高比例的细胞带有整合的目的基因并因而稳定转染。术语"培养"指体外在容器中维持细胞/细胞系，所述容器中含有支持其增殖和基因表达的培养基。因此所述培养造成所表达的可分泌蛋白在培养基中积累。培养基通常含有稳定pH值的补充剂以及氨基酸、脂类、微量元素、维生素和其它生长促进成分。术语"无血清"、"无血清转染"或"无血清培养"指细胞的转染和培养在含有除任何种类血清之外的合适补充剂的培养基中进行。补充剂选自氨基酸、脂类、微量元素、维生素和其它生长促进成分。所述"无血清"培养条件经常更加严格，并且如果不加入外源蛋白质，培养基中也不含有外源蛋白质，则所述培养基被称作"无蛋白质"。术语"永生化人细胞系"指不是直接取自生物体的原代细胞的人细胞。特别地，它指永久建立的细胞培养物，其在给予合适的新鲜培养基和空间时将无限增殖，因而已脱离了海弗利克极限。术语"浓缩"指从培养基中浓缩所生产的重组蛋白。它必然也导致了蛋白质的浓缩。本领域技术人员熟悉浓缩技术，例如过滤，其包括超滤、离心、沉淀等。浓缩不一定得到纯的蛋白质，所分离的蛋白质可仍然包含非蛋白质及蛋白质的污染物。经常需要其他纯化步骤。术语"纯化"指应用于所分离的蛋白质的步骤，用于获得基本上纯(至少60%纯、优选至少75%纯、更优选超过卯％纯、最优选超过99.9%纯)的人重组蛋白。纯度可通过合适的方法测量。本领域技术人员熟悉可用于纯化重组蛋白的技术，例如免疫亲和层析、亲和层析、蛋白质沉淀、緩冲液交换、离子交换层析、疏7jc相互作用层析、尺寸排阻层析、电泳。另外，所述纯化可包含病毒灭活步骤，例如在干燥或液体状态下、在存在或不存在化学物质(包括蛋白酶抑制剂)的情况下进行热处理和/或溶剂去污剂(SD)处理。另外，所述纯化可包括一个或多个除去朊病毒的步骤，例如蛋白沉淀、过滤、层析步骤，特别是亲和层析步骤(参阅如"PartitioningofTSEinfectivityduringethanolfractionationofhumanplasma",Gregori,L等，Biologicals321-10;2(2004);以及"RemovalofTSEagentsfrombloodproducts",Foster,P.R.,VaxSanguinis87(Suppl.2)，S7-S10(2004))。在病毒灭活之后，选自上述任何一种的额外纯化步骤可能是除去用于病毒失活的化学物质所必需的。术语"载体，，指与适当的控制元件连接时能够复制的任何基因构建体，例如质粒、噬菌体、粘粒等，DNA片段可插入或克隆到其中。栽体包含独特的限制性位点，并且可能能够在宿主细胞中自主复制。该术语包括克隆和表达载体。"载体"还可带有一个或多个其他调节元件，所述调节元件优选选自剪切位点、重组位点、多聚A位点、增强子、多克隆位点和原核质粒序列。术语"有效连接"指载体的构型，其中启动子以能够激活编码目的蛋白质(特別是Aj6l液蛋白)的dna序列转录的形式位于所述载体中。术语"成熟"指给定蛋白质的经加工蛋白质的分子结构，即缺少了N端输出信号的蛋白质。术语"启动子"指在转录的起始中结合RNA聚合酶和转录因子的调节性DNA序列区。术语"增强子"指提高真核启动子利用、并能在相对于启动子的任何取向和任何位置上(上游或下游)发挥功能的顺式作用序列。术语"多聚腺苷酸化(多聚A)信号"指专门的终止序列。它给出在mRNA末端添加使mRNA输出到胞质的腺苷酸"尾"的信号。到达胞质以后，mRNA的多聚A尾在蛋白质翻译过程中一直存在，并在蛋白质表达过程中稳定所述mRNA。术语"编码"或"编码的"指置于适当调控序列的控制下时，核酸序列在体外或体内可转录(DNA的情况)或翻译(mRNA的情况)成多肽(蛋白质)的特性。就本申请目的而言，术语"表达"指编码蛋白质的基因的转录和翻译o本发明的"人蛋白质"包括但不仅限于人的蛋白质、多肽、其突变和修饰。具体的，人蛋白质包括重组血浆蛋白质例如凝血因子(例如因子VIII、因子VII/VIIa、因子V、因子IX、因子XI、血友病因子等)、生长因子(例如红细胞生成素等)、集落刺激因子(CSF)(例如粒细胞刺激因子(G-CSF)、巨噬细胞CSF(M-CSF)、粒细胞-巨噬细胞CSF(GM-CSF))、细胞因子(例如白介素包括白介素3等)、蛋白酶抑制剂(如a-l-抗胰蛋白酶(A1AT)、胰凝乳蛋白酶等)、转运蛋白(例如激素等)、抑制或调节作用蛋白等等。另外，包括这些蛋白质或多肽的突变和修饰，特别是提供了所述重组蛋白更好的稳定性、延长的半衰期、或更好回收率的突变或修饰，分别包括缺失、替换或插入突变和功能性基团的化学突变。可通过本发明型的)、人因子IX、人OCSF、人A1AT、人因子VlI/VIIa和血友病因子。因子VIII和IX的重组生产是本领域已知的(EP-A-160457;WO-A-86/01961，美国专利4,770,999，5,521,070和5,521,070)。对于因子VIII,重组表达亚基以生产显示促凝剂活性的复合物是本领域公知的(例如EP國A画150735，EP-A-232112,EP-A國0500734，WO-91/074卯，WO画95/13300U.S.专利5，045，455和5,789,203)。此外，已描述了部分或全部缺失编码高度糖基化B結构域之序列的截短cDNA形式的表达(例如WO-86/06101,WO-87/04187,WO-87/07144，WO-88/00381，EP-A-251843,EP誦A誦253455,EP-A-254076,U.S.专利4,868,112和4,980,456，EP-A-294910,EP-A-265778，EP-A-303540和WO-91/09122中)。WO01/70968中公开了一种具体的因子VIII突变体，其中Arg740和Glul649位置之间的B结构域被至少含有3个Arg残基且包含10-25个M酸残基的富舍Arg接头肽取代(其中所述因子VIII编号是相对于SEQIDNO:9所示的成熟野生型因子VIII序列而言)，所述文献以其整体并入本文。特别地，所述富含Arg接头肽含有14-20个氨基酸残基，特别优选包含以下序列的接头^J^財列SFSQNSRH(SEQIDNO:IO)，和/或^J^絲列QAYRYRRG(SEQIDNO:ll)，和/或^J^財列SFSQNSRHQAYRYRRG(SEQIDNO:12)。这样的B结构域因子VIII突变体蛋白由SEQIDNO:3的783-5162位4^所编码。G-CSF是人血液中的镨系特异性小分子，其刺激从骨髓中产生一类白细胞，称为嗜中性粒细胞。嗜中性粒细胞在身体免疫系统和抵御感染中起中心作用。G-CSF(其a、b和c形式的具体cDNA序列在SEQIDNO:15、16和17中分别给出；G-CSFb形式蛋白(下文的"G-CSFb"蛋白)示于SEQIDNO:27)由单核细胞、成纤维细胞、和内皮细胞天然产生。正常情况下，健^体血液中的浓度是约40pg/ml。在患者血浆中，G-CSF的水平可降低10倍以上。G-CSF也在癌细胞系(如5637细胞)中产生，其分泌约70ng/ml。对于治疗，Amgenlnc.在大肠杆菌中以N端甲基化的非糖基化形式生产重组人OCSF(Filgrastim/Neupogen),其也以PEG化产物提供(Pegfilgrastim/Neulasta)。另一种药物由ChugaiPharmaceuticalsCo.在CHO细胞中生产，其产生糖基化产物(Lenograstim/Granocyte)。G-CSF作为药物用于治疗遗传的或者由化疗(癌症)、AIDS或骨髓移^iit成的嗜中性粒细胞减少症。为此，典型剂量是5ng/(kg'天)。适于本发明的特定A1ATcDNA序列在SEQIDNO:2的973-2259位^JJt中给出。特定的因子VII/VIIacDNA序列在SEQIDNO:13和14中给出，对应于其a和b形式。特定的vWFcDNA在SEQIDNO:18中给出。选择标记系统包括潮霉素抗性、嘌呤霉素抗性、新霉素抗性、腺苷脱氨酶(ADA)抗性、^ij^糖苷磷酸转移酶(neo、G418、APH)抗性、博来霉素(phleo、bleo、zeocin)抗性、胞嗜*5^^氛酵(CDA、CD)抗性、胞嘧咬脱氨酶(CDA、CD)抗性、二氢叶酸还原酶(DHFR)抗性、组氨醇脱氢酶(hisD)抗性、潮霉素-B-磷酸转移酶(HPH)抗性、嘌呤霉素-N-乙酰转移酶(PAC、puro)抗性、胸苷激酶(TK)抗性和黄噤呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(XGPRT、gpt)抗性。特别优选的是潮霉素抗性基因。选择标记基因也可与多聚A信号有效连接，例如来源于牛生长激素(BGH)的多聚A信号或SV40多聚腺苷酸化信号。在选择期中，转染细胞在其培养基中持续接触选择标记系统的蛋白质，例如潮霉素，导致只有携带载体的细胞生存下来。本领域技术人员熟悉适于建立稳定转染细胞的其他选择性标记以及需要应用的所选选择剂浓度。本发明特别优选的载体带有CMV启动子、潮霉素基因、多聚A序列和目的基因，优选是具有SEQIDNO:4序列的Invitrogen的pcDNA3.1载体，其中重测序所述载体发现实际具有SEQIDNO:5中所示序列。适于本发明方法的永生化细胞系选自肾、膀胱、肝、肺、心肌、平滑肌、卵巢或胃肠细胞。这些细胞可在其基因组中携带腺病毒DNA序列，特别是Ad5序列的前4344个核苷酸。优选的是人胚肾细胞(HEK),其选自293细胞(ATCCCRL画1573;DSMACC305;ECACCref.:85120602)、293T细胞(DSMACC2494;ECACC:tsa21，ref.96121229)、和freestyle293细胞(293F细胞；InvitrogenR7卯07)。最优选的是293F细胞。携*所述载体的永生化细胞系在允许重组基因表达的条件下培养。它们基本上是本领域技术人员已知的标准培养条件，但是在细胞携带人因子IX基因的情况下，培养基中应该包含维生素K。本发明的特定实施方案是在稳定的永生化细胞(其也在无血清条件下进行转染)的无血清培养物中无血清生产重组蛋白。为此，在无血清条件下转染和培养上述任一永生化人细胞系，优选293F细胞系。所述细胞在无血清的悬浮培养中稳定转染，接着适应于贴壁细胞生长以选择单细胞克隆。一旦获得个体克隆，将其贴壁扩增。在选择了最佳生产克隆之后，将细胞转移到悬浮培养。在整个稳定细胞系操作以及在为了生产进行的规模扩大中，细胞在无血清培养基培养，从不接触血清或者人类或动物蛋白质。从培养液中分离重组血液蛋白质(例如任一凝血因子)或蛋白酶抑制剂(例如A1AT)或生长因子(例如G-CSF和GM-CSF)，其后进行标准纯化步骤。更详细地，无血清生产重组Ajk液蛋白质(特别是人因子VIII或因子IX或A1AT或G-CSFb)的特定实施方案包括如下步骤(1)在无血清悬浮培养中转染人永生化细胞，优选293F细胞。细胞在一次性无菌聚碳酸酯锥形瓶中培养。细胞^f吏用转染试剂(优选阳离子转染试剂，更优选脂转染胺2000CD试剂(Invitrogen)或者鳞酸钓转染法的试剂以例如每亳升1x106个活细胞的密度进行转染；转染编码人血液蛋白质的载体，优选所述载体为pcDNA3.1-FIX、pcDNA3.1-FVin、pcDNA3.1-AlAT或pcDNA3.1-GCSFb;(2)转染后24-120小时，优选36-96小时，更优选48小时，将合适数量的细胞(103-101()个；优选105-108个，最优选106个细胞)转移到平板培养脏中，使之沉降以建立贴壁生长。优选地，所述培^J^是10cm培养jnL,并且细胞在无血清、无蛋白培养基中培养，优选FreeStyle293表达培养基(12338-018，Invitrogen)或者无血清自制培养基(OctapharmaStockholm)。(3)选择压力开始于转移进平板培^Jnz^后2-50小时，优选48小时。在培养基中补充合适的选择剂，其选自选择标记例如潮霉素、新霉素、G418和Zeocin。优选的选择剂是潮霉素，浓度为10-300jig/ml，优选50-200fig/ml，最优选50ng/ml。所述压力保持至少10-20天，优选14天，其中每隔一天更换一次补充了潮霉素的培养基。只有稳定转染的细胞在这些选择性条件下存活，并且形成可单独由沐的贴壁细胞克隆。另外可使用粘附因子以将细胞粘附在培养亚上，避免细胞从一个克隆漂浮到另一个细胞克隆。例如，此粘附因子可以是例如聚-D-赖氨酸、不含人或动物蛋白质的合成培养基补充剂或者其它物质。或者，可以使用克隆环(cloningring)糸沐克隆。(4)湘沐各个细胞克隆并转移到独立的培养容器中，以在没有选择压力的情况下无血清扩增细胞(，扩大)。任何培养容器都是合适的，但是优选首先将各个克隆转移到含有足量培养基的96孔板中，接着转移到48孔板、24孔板、12孔板以及6孔板中，然后转移到离心管中。在离心管阶段，所述细胞在轻微摇动的无血清培养基中培养，以将细胞带回悬浮培养。一旦所述细胞到达6孔板或离心管阶段，任选地根据一些选择标准(即细胞生长速率(优选生长较快的细胞)以及其生产重组蛋白的量)来选择最佳细胞克隆。但是，所述选择也可在任何以后的阶段进行。(5)将得自离心管培养的细胞接种到含有足够量无血清培养基的锥形培养瓶中。在悬浮生长的无血清、无蛋白质细胞克隆中用于目扩大的其它选择标准如下生存力、细胞形态、无聚集、与离心有关的健壮性以及无细胞碎片。如果载体是pcDNA3.1-hygro(+)-zz，则本发明方法特别有效。优选将编码人蛋白质(^别是人FIX、FVin、AlAT或G-CSFb)的基因以在CMV启动子控制之下的方式插入，分别如图2、3、7和11所示。优选插入所述基因的野生型序列，使得重组表达蛋白质不带有任何突变，并且结构上与^jfe浆中分离出的蛋白质相同。野生型人因子IX的示意图在图1中显示。SEQIDNO:1、2、3和22分别提供pcDNA3.1-FIX、pcDNA3.1-AlAT、pcDNA3.1-FVIH和pcDNA3.1-GCSFb的核酸序列。各个蛋白质分别由939至2224位、913至2259位、679至5055位和970至1584位核苷酸编码。本发明因此提供重组生产人因子IX、A1AT、因子Vin和G-CSFb的方法，它们被克隆到pcDNA3.1TM中，分别产生pcDNA3.1-FIX、pcDNA3.1-AlAT、pcDNA3.1-FVIH、和pcDNA3.1-GCSFb,其整合i^永生化人细胞的基因组，所述细胞优选人胚肾细胞，例如293细胞(ATCCCRL画1573;DSMACC305;ECACCref.:85120602)、Freestyle293细胞(293F细胞；InvitrogenR79007)或293T细胞(DSMACC2494;ECACC:tsa21，ref.96121229)。这些携带pcDNA3.1-FIX、pcDNA3.1-AlAT、pcDNA3.1-FVIH、或pcDNA3.1-GCSFb的细胞在使得基因表达的标准条件下在培养基中培养，或者它们在无血清条件下培养以使得人类病原体污染的风险最小化。可包括一个或多个除去朊病毒的步骤，例如蛋白沉淀、过滤、层析步骤，特别是亲和层析步骤。作为替代/补充，可使用敲除朊病毒的细胞系作为表达细胞。这可通过完全的基因组敲除或反义技术来获得。对于生产人因子IX的情况，所述细胞优选在维生素K存在下进行培养。从培养上清液中分离人血液蛋白质，并接受本领域已知的后续纯化步骤，以使得纯净、稳定并且高活性的产物的产量最大化，所述纯化步骤选自免疫亲和层析、阴离子交换层析、尺寸排阻层析等及其组合。容易使其适应分离重组因子IX、G-CSFb或A1AT的特定需要。在纯化过程之中及之后，所纯化蛋白质的量和活性可通过ELISA和/或一期凝血时间测定(aPTT)来监控。为克服纯化的蛋白质样品或直接得自含有分泌的所选重组蛋白的细胞培养上清液的产物中可能存在的感染性污染的问题，可使用病毒灭活步骤处理培养上清液，所述步骤包括热处理和/或SD-处理(干燥或液态下，加入或不加入包含蛋白酶抑制剂的化学物质)。本领域技术人员熟悉纯化操作。例如，通过阴离子交换层析从血浆中分离、纯化和回收高纯度病毒灭活的因子VIII描述于W093/15105。另外，若干从血浆或其它生物学来源中产生高纯度、无感染性凝血因子的方法已经有过报道。通过使用形成两相系统的疏7jC相处理潜在的感染性物质并接着由此除去不溶于水的部分，脂类包被的病毒被有效灭活。已证实同时或依次使用非离子型生物相容性洗涤剂和二烷基或三烷基磷酸酯(WO96/36369，EP0131740,US6,007,979)补充疏7jC相处理可提供其他优点。非脂质包被的病毒需要由非离子型洗涤剂及其后加热数小时(60-65"C)的步骤组成的失活方案(WO94/17834)。在病毒灭活之后，用于除去所述化学物质的其他纯化步骤可能是必需的。总之，本发明提供有效的蛋白质生产方法，其基于人细胞系与已经认可的蛋白质纯化方法以及失活潜在危险性传染原的方法的结合。已经建立了安全易用的生产重组蛋白(例如凝血因子IX或VIII、A1AT和G-CSFb)的应用系统。重组生产的蛋白质的活性可使用标准测试进行检测。例如，对于人因子IX的情况，使用活化部分促凝血酶原激酶时间测定，其中使用采取手动凝血设备的DapptinTC(Kaolin/Sulfatid-Phospholipid目录号5035090，TechnocloneGmbH)活化。最后，这样获得的重组蛋白(例如上文所述的血液蛋白质，特别是人因子IX)可用于药用组合物。在下述实施例中进一步描述本发明。但是，所述实施例不应解释为对本发明的限制。实施例材料和方法用于蛋白质表达的人细胞系:优选的细胞系是HEK293(ECACCRef:85120602)、FreeStyle293(293F;InvitrogenR79007)和293T细胞(tsA201，ECACCref.96121229),它是稳定表达SV40温度敏感性T抗原的转化人胚肾细胞系。这些上皮样细胞系已经用于许多功能性表达测定，并且已有报道产生高水平的重组蛋白。在以下实施例中优选使用来自293细胞系的293F细胞系(Invitrogen)。母细胞系293是从转化了经剪切人腺病毒5型DNA(Graham等，1977;Harrison等，1977)的原代人胚肾细胞建立的永久细胞系。293F细胞系是293细胞系的变体，其适于在Freestyle293(293F)表达培养基(12338-018，Invitrogen)中悬浮生长。293F细胞系从Pharmacopeia的RobertHorlick处获得。293F细胞系最初从低代数母细胞库(MasterCellBank)培养物中制得，所述培养物来源于通过限制性稀释再次克隆的母293F细胞。在本发明开发期间，细胞在无血清Freestyle293表达培养基或无血清培养基(OctapharmaStockholm)中以良好的生存力和良好的形态持续生长一年以上。为了高效生产人因子IX，可通过添加维生素K来改造所述培养基。这些细胞系能够在含有合适补充物的无血清和/或无蛋白质培养基中培养。靶蛋白质的测定和测量通过ELISA测定人因子IX的浓度根据标准操作,l吏用山羊抗人FIX(GAFIX-AP，AffinityBiologicals)作为捕获抗体通过ELISA测定上清液中人重组因子IX水平。所有孵育在室温下的潮湿容器中进行。Octanyne(血浆来源的FIX,Octapharma)和BeneFIX(重组FIX,GeneticsInstitute)均作为标准品使用。检测抗体是过氧化物酶缀合的山羊抗人FIX(GAFIX-AP，AffinityBiologicals)。ABTS(目录号1682008，RocheDiagnostics)作为底物加入每个孔中，在15分钟内在405nm处检测显色反应。通过标准浓度与标准吸光度的线性回归计算浓度。检测人凝血因子IX活性上清液中人重组因子IX的凝血活性按照如下进行测定基于活化部分促凝血酶原激酶时间测定来测定凝血活性，其中使用采取手动凝血设备(AmelungKC4Amicro,AmelungGmbH)的DapptinTC活化(Kaolin/Sulfatid-Phospholipid目录号5035090,TechnocloneGmbH)。就该研究而言，将来自转^细胞的50上清液、50jil缺乏FIX的血浆(Progen)和50piDapptinTC在37C孵育2分钟。通it^入50nlCaCl2(目录号84687-22F,InstumentationLaboratory)起始凝血。将样品凝血时间与Octanyne或/和BeneFIX进行比较。4吏用COAMATIC:FVIII测定(Chromogenix)来测定BDDrhFVIII:商品生色测定试剂盒COAMATIC:FVIII(Chromogenix,目录号822585)含有FIX、FX以及可通过FXa切割转化成黄色水溶性染料的生色团。含有样品的FVIII完成了此系统FVIII通过络合激活FIX,此#物通过蛋白水解切割激活FX,使之变成FXa。FXa将生色团转化为染料，其接着在405nm处进行光度测定。此测试设计用于测定来自患者血浆的FVIII。建立以下操作以使此测试可用于稀释培养基中因子VIII的测定。使用全长重组人凝血因子VIII(NIBSC，订货号57814F)和正常对照血浆(InstrumentationLaboratoryCompany)作为对照标准品。样品制备使用与COAMATIC试剂一起递送的稀释緩冲液稀释样品至预计FVIII最终活性在2到20mlU/ml之间，并且与WHONo.6标准曲线进行比较。方法在置于thermobloc上的96孔阵列上，标准品和样品各测量三次。操作方案(每孔)试剂体积孵育(37X:)稀释的标准和样品50jil4分钟因子试剂(37C)50nl置于96孔光度计设备中，在37X:孵箱中孵育2分钟S-2765+1-2581(37^)50nl置于96孔光度计设备中，在37X:孵箱中孵育2分钟20%乙酸50jil置于96孔光度计设备中，在96孔光度计上摇动15s立刻在405nm处测定吸光度^:用弹性蛋白酶活性测试测定A1AT活性:在转染A1AT的cDNA之后，A1AT表达并分泌进入细胞培养基。通过离心(5分钟，1000rpm)除去细胞之后，在培养上清液中测定A1AT活性。在此活性测试中，通过A1AT对弹性蛋白酶的抑制效应测定其活性。弹性蛋白酶从底物N-琥珀酰-(Ala)3-pNA上切割pNA。在405nm处用光度法测定pNA释放。通过与具有确定A1AT活性的标准样品进行比较来测定各个样品的活性。如其它实验中所证实的，该测试在无血清Freestyle培养基中有效。为确认Freestyle培养基不影响所述测试，制备了两条标准曲线在T+緩冲液或Freestyle培养基中稀释的标准人血浆。稀释样品以未稀释、1:10稀释和1:50稀释在Freestyle培养基中测试所有样品，并与人血浆标准品稀释液进行比较。方法分别将50nl每种标准品稀释液和样品稀释液移入96孑L微孔板的孔中。在每个孔中加入150nl弹性蛋白酶工作溶液之后，在ELISA读数器上摇动96孔板1分钟，然后在37"C孵育30分钟。用多道移液器在每个孔中加入100jil底物工作溶液。在加入底物溶液后以及在黑暗处37匸孵育7分钟后，在405nm处测定吸光度。第一个值代表未发生弹性蛋白,化反应的基本吸光度，从代表弹性蛋白酶从底物上切割pNA之后的吸光度的第二个值中减去第一个值。使用相减之后的结果，才艮据标准曲线计算所述样品的A1AT活性。通过ELISA确定G-CSF活性:根据标准方法，使用小鼠抗人G-CSF抗体(MAB-214，R&DSystem)作为捕获抗体通过ELISA测定细胞培养上清液中的人重组G-CSF水平。所有孵育均在室温下的潮湿容器中进行。使用G-CSF标准品(重组hG"CSF，大肠杆菌，214-CS-025，R&DSystems)。检测抗体为生物素化的山羊抗人G-CSF(BAF-214,R&DSystems)。链霉抗生物素蛋白缀合到与检测抗体连接的辣根过氧化物酶(DY998,R&DSystems)上。在每个孔中加入QuantaBlu荧光过氧化物酶底物(15169，Piece)作为底物，在60分钟内，在消光320nm/发射光420nm处检测焚光>^应。通过标准品浓度与标准品相对荧光单位(RFU)的线性回归来计算结果。实施例l:克隆靼蛋白质。A.克隆人因子IX:通过HindIII和Notl的双消化从如WO01/70968中公开的pTG36载体中切下含有人凝血因子IX开放读码框的1.4kb片段。将此片段连接进栽体pcDNA3.1Hygro(+)-zz(来自V870-20,Invitrogen)经HindIII和Notl双消化的的5.6kb片段,得到图2所示的pcDNA3.1-FIX。pcDNA3.1-FIX的DNA序列在SEQIDNO.l中显示。相比于Invitrogen公开的序列(如SEQIDNO:4中所示)，在pcDNA3.1Hygro(+)-zz(见SEQIDNO:5)中发现了载体骨架中的三个其他核苷酸插入。载体pcDNA3.1-FIX含有潮霉素抗性基因盒，以允许进行用于稳定转染细胞克隆的选择方法(见图2、3和7)。所述载体允许通过磷酸锌转染或其它方法建立稳定表达细胞系，接着选择潮霉素抗性。B.克隆人因子VIII:使用Notl+Xhol消化从载体pTGF8-2hyg-s(SEQIDNO:7;其生产在WO01/70968中公开)上分离含有缺失B结构域的人凝血因子VIII开放读码框的4380bpFVIIIcDNA，并与使用XhoI+PspOMI线性化的pcDNA3.1Hygro(+)-zz连接，得到如图7所示的pcDNA3.1-FVHI栽体。C.克隆人A1AT:使用mRNAMiniprep试剂盒(Sigma,目录号MRN-10)直接从HepG-2细胞(DSMZ#ACC180)中分离A1ATmRNA。在后面的步骤中，将mRNA捕获在寡聚(dT)珠子上。之后，使用禽成髓细胞性白血病病毒逆转录酶(AMVRT,Promega,目录号M5101)将mRNA转录成双链cDNA，接着进行RT-PCR(逆转录-聚合酶链式反应)。使用PCR反应扩增A1ATcDNA。将PCR产物上样到琼脂糖凝胶上。分离合适的DNA条带，然后使用Qiaquik凝胶提取试剂盒(Qiagen,目录号28704)进行纯化。接着将A1AT片段亚克隆到商品栽体上(TOPOInvitrogen,目录号K4650-01)。为了克隆pCMV-Script:使用EcoRI消化PCRIITOPO-AIAT，将A1AT的1370bp片段连接进用EcoRI线性化的pCMV-Script上。为克隆pCI-neo-AlAT，使用EcoRI消化PCRIITOPO-AIAT，将A1AT的1370bp片段连接到用EcoRI线性化的pCI-neo上为克隆pcDNA3.1-FVIH，使用Xhol+Hindlll消化PCRIITOPO-AIAT,分离出1370bp的A1AT，并与Xhol+Hindlll线性化的pcDNA3.1连接。所得载体在图3中显示。为克隆pTGl-AlAT,使用HindIII和Notl消化PCRIITOPO-AlAT。将1370bp的A1AT与使用HindIII和Notl线性化的pTGl(无PRE)连接。所得栽体在图9中显示。D,克隆G-CSFcDNA:使用RNeasymini试剂盒(QIAGEN，目录号74104)直接从天然5637人膀胱癌细胞中分离总RNA。之后，将分离的总RNA与DNaseI—起赙育，以消化可能混入的5637细胞基因组DNA。为得到无DNase的总RNA，使用RNeasyclean-up试剂盒(QIAGEN，目录号74204)处理反应混合物。使用寡聚(dT)12-18引物(Invitrogen，目录号18418-012)和SuperscriptIIRNaseH-逆转录酶(Invitrogen,目录号18064-022)，在RNase抑制剂(Roche,目录号799-017)存在下以总RNA作为模板进行RT-PCR，以合成来自5637细胞的dscDNA库。接着使用PCR反应扩增G-CSFcDNA。使用QIAquick凝胶提取试剂盒(QIAGEN，目录号28704)从琼脂糖:^中分离G-CSFcDNA，然后使用下述G-CSFPCR引物进行测序-G-CSF正向5'-ATGGCTGGACCTGCCACCCAGAGC-3'(SEQIDNO:19)-G-CSF反向5'-TCAGGGCTGGGCAAGGTGGCGTAG-3'(SEQIDNO:20)通过测序分析确认从5637细胞合成的DNA序列为GCSF-b型(含有SEQIDNO:26所示序列)。接着，直接将如上所述分离的GCSF-b型cDNA连接进商品栽体pCR2.1(Invitrogen).所得质粒4^名为pCR2.1d2-GCSFb，在图10中显示。使用HindIII和Notl消化pCR2.1d2-GCSFb，分离出705bp的GCSFbcDNA片段并将其连接进使用HindIII和Notl线性化的pcDNA3.1Hygro(+)-zz载体。所得pDNA3.1-GCSFb载体在图11中显示。使用EcoRI消化pCR2.1d2-GCSFb,分离出629bp的GCSFbcDNA片段并将其连接进使用EcoRI线性化的pCINeo栽体。所得pCINeo-GCSFb载体在图12中显示。使用BamHI和Xhol消化pCR2.1d2-GCSFb，分离出693bp的GCSFbcDNA片段并将其连接进使用BamHI和Xhol线性化的pCMVScript载体。所得pCMVScript-GCSFb载体在图13中显示。使用HindIII和Notl消化pCR2.1d2-GCSFb，分离出705bp的GCSFbcDNA片段并将其连接进使用HindIII和Notl线性化的pTG2-hyg-as载体。所得pTG2-GCSFb-hyg-as载体在图14中显示。实施例2:在不同细胞系和不同载体中表达靶蛋白质:在优化用于生产重组蛋白的本发明方法时，测试了不同细胞系(均携带包含a-l-抗胰蛋白酶(A1AT)重组基因的载体)进行高水平表达的能力。发现与293T细胞系相比，CHO、BHK和其它细胞系在瞬时转染测定中生产的重组蛋白较少。因此，检查了其它人胚肾细胞系的衍生细胞系。结果在图4-6中显示。实施例3:将在含血清培养基中瞬时转染的293T和293细胞与在无血清条件下转染和培养的293F细胞进行比较:将0.1-0.2xi()6个293T或293细胞的活细胞置于6孔板中。第二天使用磷酸钓法(Biotechniques6:7632-638(1988))转染细胞在0.1xTE緩沖液(加入200^1转染混合物)中稀释4jig质粒DNA，轻轻混匀，将20nl2,5MCaCl2和100nl2xHBS加入转染样品。转染样品在室温孵育20分钟。6小时孵育后更换培养基，接着孵育细胞48小时。实施例4:在无血清培养基中的293F细胞中进行无血清转染并表达耙蛋白质:制备细胞密度为106个活293F细胞的28ml悬浮培养物(在转染实验的同一天)。通过在Opti-MEMI(Invitrogen)中稀释30jig质粒DNA至总体积为1ml,并在Opti-MEMI中稀释40^il293fectin至总体积为1ml制得脂质-DNA复合物。室温孵育5分钟后，将稀释DNA加入到293fectii^中，使得总体积为2ml。转染样品在黑暗中室温孵育20分钟。将2ml的转染混合物加入28ml293F悬浮培养物(终细胞密度为1x106细胞/ml)中。在37"C/8。/。C02加湿空气中，在以125rpm旋转的轨道摇动混合器上将转染的293F细胞孵育72小时。A:转染和表达A1AT:这些将293F与293和293T进行比较的实验结果在图4中显示。在所有实验中使用pcDNA3.1-AlAt转染确定量的细胞(106个细胞)。比较这些不同细胞系中表达的A1AT的量。293F细胞中表达的A1AT的量设置为100%。从图4中可见，293和293T细胞只生产293F细胞A1AT量的12-13%。另外，测试不同的载体骨架是否影响293F细胞中产生重组蛋白的量。将人a-l-抗胰蛋白酶(A1AT)的编码序列插入到pTG(自制载体)、pCMVScript(Stratagene)、pelneo(Promega)以及pcDNA3.:TM载体中。pcDNA3.1-AlAT中A1AT的表达水平设置为100%。其它栽体均未接近pcDNATM3.1-AIAT中观察到的高表达。如ELISA所检测的，发现pcDNA3.1-AIAT产生最大量的AIAT(见图5)。相比于pcDNA3.1表达的A1AT量，自制栽体只表达20%的量，其它商品载体在15-30%的范围内。因此，选择pcDNA3.1进行所有其它的实验。总之，用带有AlAT基因的pcDNATM3.1转染不同细胞系。显示无血清293F细胞系每106个细胞表达的A1AT是293T和293细胞的7倍。因此，选择freestyle293F细胞系进^il定转染实验。瞬时转染实验的结果在图6中显示。上图(A)显示使用不同转染载体的6个不同转染实验上清液的SDS-PAGE分析。从分析图中可得出结论，所分析的细胞培养上清液中存在的al-抗胰蛋白酶质量良好，这可从抗原活性比为1(数据未显示)中推出。测试结果的有效性可从阴性对照不显示(Xl-抗胰蛋白酶活性也不显示抗原活性中推出。通过SDS-PAGE分析分子质量分布显示与三个含al-抗胰蛋白酶的样品极其相似的图像。在阴性对照中，除了不存在代表al-抗胰蛋白酶的条带之外，可见分子质量为27kD的额外条带，与预期一致。通过使用western印迹(使用抗人al-抗胰蛋白酶一抗)的分析，在还原条件下可以在预计的分子量区中鉴定到所述蛋白质。断裂产物不可见。质后较长时间才发生的。本发明解决了现有电穿孔方法的这些和其它缺陷。也与本发明相关的是研究和控制跨细胞膜的传质的现有技术。了解在功能正常的细胞和疾病细胞中跨细胞膜传质的本质对于研究某些疾病很有价值。此外，改变和控制跨细胞膜的传质的能力是现代生物技术和医学中进行研究和治疗的有用工具。对细胞引入或去除化学物质如DNA或蛋白质以控制细胞的功能、生理学或行为能提供关于细胞的正常和异常生理过程的有价值信息。实现和研究跨细胞膜传质的最常用方法是使经过或未经电穿孔的细胞接触含有准备跨膜运输的化合物的溶液。这种批量转移法不能准确控制或测定跨膜传质。具体部位的溶液组成是未知且可变的。此外，存在电场时，每一点上的局部场强不同。而且，曝露于溶液的细胞表面不是轮廓分明的。在给定群体的细胞中细胞表面积不同，这导致细胞的传质量明显不同。出于这些原因，批量传递过程实现的传质量在细胞之间并不均一，无法测定对任何具体细胞传递的实际量。迄今为止尝试克服批量传递技术的限制的方法包括处理单个细胞的技术，这些技术包括通过细胞膜机械注射(显微注射)化合物或者用微电极进行电穿孔。在注射技术中，用针穿透膜以递送化学物质，将化学物质的应用局限于接近注射点的小区域。这需要用人手操作细胞，这种技术难以进行、消耗大量劳动并且不易再现。用微电极进行电穿孔也受这些问题以及缺少检测单个细胞的电穿孔开始发生的任何方式之苦。本发明也解决了这些问题。如上所述，在生物技术和医学领域，用电穿孔引入通常无法穿透细胞膜进入细胞的分子。通过跨细胞膜施加电脉冲实现此目的。对于一定范围的振幅和施加时间，电脉冲能够可逆地通透细胞膜，而低于该范围的脉冲对细胞膜无影响，高于该范围的脉冲会诱导不可逆的通透。通常，电穿孔是试错法的过程，通过评价该过程对细胞的生物影响选择电穿孔的最优电脉冲参数。在我们的早期专利如美国专利6,482,619中，我们证明，在细胞膜通透也引起通过细胞的离子流改变的假定下，可通过测定通过细胞的电流检测电穿孔引起的细胞通透。这进而可用于实时检测、控制和优化电穿孔方案。采用单细胞微型机电芯片，我们已提供了这种过程如何用于单个细胞的例子。也可通过采用汇合细胞层的细胞和组织细胞的实验应用完全相同的构思控制多个细胞的电穿孔，如下例示。发明概述本发明部分基于以下发现可将在生物细胞和组织细胞群体中电穿孔开始发生时。B.稳定转染:如上文A中所述瞬时转染后72小时，将合适数量的细胞(105和106个细胞)转移进平板培养皿中，沉降以建立贴壁生长。转移进平板培一2-50小时(优选48小时)之后开始选择压力。优选的选择剂是浓度75照/ml的潮霉素。保持压力至少10-20天，优选14天，其中每2-3天更换补充了潮霉素的培养基。C.使用分析及杏沐机器人ClonePixFL(Genetix)挑选最佳G-CSF生产克隆:将如上文B中所述稳定转染的Freestyle293F细胞接种到基于甲基纤维素的半固体培养基上，所述培养基含有合适的抗生素，以在约两天后选择克隆，还含有标记的抗体，以通过荧光检测最高的生产克隆。使用ClonePixFL(Genetix)分析大量(数千)克隆的细胞数和G-CSF分泌，以使得接下来只杏沐几百个G-CSF最佳生产克隆。与其它已知方法(其中，非生产克隆和混合克隆也被随机杏沐)相反，ClonePixFL的应用允许挑选来源于单个细胞的快速生长的克隆，其仅仅挑选高生产者。所杏沐的细胞在微滴定板以及随后在离心管、细胞培养瓶和发酵器中扩增，其所有操作都在无血清条件下。同样，所有稳定转染操作均在无血清条件下进行。另外，在其后的所有扩增和细胞培##作中，细胞不接触任何血清或动物来源的蛋白质。在扩增过程中，选^^壮性、高生长速率、生存力和生产活性G-SCF(如在ELISA形式中所测量的)方面的最佳克隆。在此选择过程结束后，所挑取的克隆在不添加抗生素的无血清条件下培养。293F细胞在整个过程中完全无血清培养，每隔一天更换一次培养基。在完全无血清条件下从库勒振荡器(ktihnershaker)里的锥形瓶改大到wave反应器(WaveBiotechEur叩e)中的较大体积。在这种选择中，数量再次减少到只有几个最佳生产克隆。正确的cDNA序列、mRNA含量和发酵行为是鉴定用于亚克隆的最佳克隆的标准。为此，使用ClonePixFL将所选择克隆的细胞置于板中、分析并杏沐，然后如前所述进行扩增和选择。为了再次选择最佳生产克隆，亚克隆是消除在所培养的克隆亚群中可能的遗传改变的必要步骤。亚克隆之后，选择的克隆在无血清条件下再次保存。更详细的鉴定所表达的重组人G-CSF蛋白的生化特征。D.通过ELISA测定人G-CSF浓度:通过ELISA测定这样获得的FeeStyle293F细胞系所表达的rhG-CSF量，并JL^t使用不同载体转染的细胞所获得的蛋白质量进行比较(见图15)。如从实施例2和3中使用FIX和A1AT的表达实验中所预期的，载体pcDNA3.1-GCSFb与293F细胞系的组合在这里再次显示最高的生产力，因此4皮用于生产重组人G-CSFb。E.还原SDSPAGE中的rhG-CSF的western印迹:从HEK293和HEK293F细胞的上清液中生产的10^1G-CSF在15%SDSPAGE和western印迹中进行分析。通过BAF214-bio/SA-HRP/DAB检测G-CSF(见图16)。箭头指示具有正确分子量的rhG-CSF的单条带。序列表，文本<table>tableseeoriginaldocumentpage27</column></row><table>SEOIDNO:6:栽体pTGl-AlAT1655CMV启动子7833082人FVffl结构域Al和A230833104B结构域剩余部分及其他碱基31055162人因子F孤结构域A3,C1，C251885402BGHpA54655878f1起点59436267SV40启动子62857308HygR73217693SV40pA86267953CPUC起点96318771CAmpR(互补链)SEOIDNO:4:Invitrogen公开的pcDNA3.1序列5597bpsDNA,环状起始终止名称/说明209863CMV启动子8951010MCS10211235BGHpA12981711f1起点17762100SV40启动子21183141HygR31543526SV40pA44563786CPUC起点54614601CAmpR(互补链)SEOIDNO:5:pcDNA3.1Hv。ro(+)-zz,与SEQIDNO:4相比，在4380位点具有3个另外的碱基"GGT"5600bpsDNA,环状起始终止名称/说明209863CMV启动子8951010MCS10211235BGHpA12981711f1起点17762100SV40启动子21183141HygR31543526SV40pA44593786CPUC起点54644604CAmpR(互补链)SEOIDNO:子型域因因因域因域因栽体pFGF8-hyg-s10705bpsDNA,circular起始终止名称/说明15866762975297629972998505550675916592879108346842386819469CMV启动子hFVIQ结构域Al和A2B结构域的铰链剩余部分及其他碱基hFV见结构域A3，Cl，C2来源于SV40的多聚A内含子和多聚A位点潮霉素抗性孕酮应答元件氨苄青霉素抗性域因因因域域域因域域因区基基基区区区基区区基予型域域域域域因域域因分类区区区区区基区区基4;型域域域域域因域域因分类区区区区区基区区基分类区基基基区基区基SEOIDNO:8:人野生型因子vincdnaSEOIDNO:9:人野生型因子v瓜SEOIDNOs:10-12:接头肽SEOIDNO:13:a型hFwi的cDtwSEOIDNO:14:b型hFvn的cDNASEOIDNO:15:人a型GCSF的c加A，CDS:41—661SEOIDNO:16:人b型GCSF的cMA,CDS:41—652SEOIDNO:17:人c型GCSF的cDM，CDS:229-828SEOIDNO:18:1wWF的cDnaIDNOs:19和20:G-CSF上游和下游引物SEOIDNO:21:载体PCR2.1d2-GCSFb分子4542bpsDNA;环状起始终止特征/名称293907GCSFb11591596fl起点19302724KanR27423602AmpR37474420pUC起点SEOIDNO:22:栽体pcDNA3.1-hyg(+)-GCSFb予始)9卩016581935241327553791509661016237bpsDNA,环状终止特征/名称863CMV启动子1584GCSFb1872BGHpA2348f1起点2737SV40启动子3778HygR4163SV40pA4423CPUC起点5241CAmpRSEOIDNO:23:分子6101起始终止1102211061720179620172112256726293047309238863950399844095269栽体pCINeo-GCSFbbpsDNA,环状特征/名称CMV启动子/内含子GCSFbSV40多聚afi起点SV40增强子/启动子NeoR多聚AAmpR分起29SEOIDNO:24:栽体pCMVScript—GCSFb,分子4920bpsDNA,坏状起始终止特征/名称1602CMV启动子7281342GCSFb14531836SV40多聚a19742280f1起点24492787SV40启动子28223613NeoR36144063HSV-TK多聚aSEOIDNO:25:pTG2-GCSFb-hyg-as分子6917bpsDNA,环状起始终止特征/名称591CMV启动子7221336GCSFb13832228SV40内含子+pA27672255CHSVTK多聚a37822745CHygR40443796CHSVTK启动子49165704AmpRSEOIDNO:26:人b型GCSF的cDMSEOIDNO:27:人b型GCSF蛋白权利要求1.制备稳定转染了核酸序列的永生化人细胞系的方法，所述核酸序列包含编码人靶蛋白质或其衍生物或突变体的基因、启动子和牛生长激素多聚腺苷酸化(多聚A)信号，所述启动子和多聚A信号分别与所述人靶蛋白质编码基因的5’和3’末端连接，所述方法包括在无血清条件下使用包含所述核酸序列和复制起点的转染载体转染永生化人宿主细胞系。2.权利要求1的方法，其中所i^乾蛋白质是Ajfe浆蛋白质，其选自凝血因子例如因子IX、因子VIII(野生型和B结构域缺失的)、因子VlI/VIIa和血友病因子(vWF);生长因子例如红细胞生成素等；集落刺激因子(CSF)例如粒细胞刺激因子(G"CSF)、巨噬细胞CSF(M-CSF)和粒细胞-巨噬细胞CSF(GM-CSF);细胞因子例如白介素；蛋白酶抑制剂例如a-l-抗胰蛋白酶(A1AT)和糜蛋白酶；转运蛋白例如激素；抑制或调节作用蛋白；及其衍生物和突变体，优选地，所iiA蛋白质选自因子IX、因子Vin(包括野生型因子VIII和B结构域缺失的因子VIII)、因子VlI/VIIa、G画CSF、vWF和A1AT，最优选地，所述蛋白质是如SEQIDNO:l的939-2324位对所编码的凝血因子IX、如SEQIDNO:2的973-2259位4^对所编码的人A1AT、如SEQIDNO:9中所示的野生型因子VIII、如SEQIDNO:3的783-5162位所编码的B结构域缺失的人因子VIII、如SEQIDNO:13和14所编码的因子VlI/VIIa、如SEQIDNO:15、16和17中所编码的G-CSF或者如SEQIDNO:18所编码的vWF。3.权利要求1或2的方法，其中在所述转染载体中，(i)启动子选自病毒启动子、看家基因启动子和组织特异性启动子，优选地，所述启动子是带有或不带内含子A的CMV启动子、SV40启动子、EF-la启动子、HSVTK启动子等，最优选地，所述启动子是CMV启动子；和/或(ii)复制起点允许所述质粒在细菌中复制和扩增；(m)所述栽体还带有至少一个选择标记基因，优选所述选择标记选自潮霉素抗性、新霉素抗性、^J4t苷磷酸转移酶(neo、G418、APH)抗性、博来霉素(phleo、bleo、zeocin)抗性和黄嘌吟-鸟噤吟裤酸核糖转移酵(XGPRT、gpt)抗性，和/或所述基因处于如上文(i)中定义的启动子的(iv)所述栽体还带有一个或多个其他调节元件，所述调节元件优选选自剪接位点、重組位点、多聚A位点、增强子、多克隆位点和原核质津立序列。4.权利要求3的方法，其中所迷转染载体带有CMV启动子、潮霉素基因、多聚A序列和目的基因，并优选来源于具有SEQIDNO:4或5所示序列的pcDNA3.1栽体。5.根据权利要求l-4中任一项的方法，其中所述永生化人细胞系(0能够在无血清条件下转染和培养；和/或(ii)已在其基因组中整合了腺病毒序列；和/或(iii)选自肾、膀胱、肝、肺、心肌、平滑肌、卵巢和胃肠细胞，优选人肾细胞系；和/或(iv)不能表i^A朊病毒蛋白。6.根据权利要求5的方法，其中所述肾细胞是人胚肾细胞，优选地，所述人胚肾细胞选自293细胞(ATCCCRL-1573;DSMACC305)、293T细胞(DSMACC2494)、FreeStyle293细胞(293F细胞；InvitrogenR79007)，优选为293F细胞(InvitrogenR79007)。7.权利要求6的方法，其中所述细胞系是293F,所述转染载体来源于pcDNA3.1，所述载体优选编码如SEQIDNO:l的939-2324位4^对所示的人凝血因子IX、如SEQIDNO:2的973-2259位>5^^"所编码的人A1AT、如SEQIDNO:9中所示的野生型人因子VIII,或者如SEQIDNO:3所示的B结构域缺失的人因子VIII、FVII/FVIIa、G-CSF、包括SEQIDNO:27中所示的G-CSFb，或者血友病因子。8.根据权利要求l-7中任一项的方法，其中所述无血清转染在无血清的悬浮培养物中使用阳离子转染试剂或磷酸钙进行，优选使用脂转染胺2000CD试剂(Invitrogen)。9.根据权利要求l-8中任一项的方法，还包括选择稳定转染的细胞，优选通过所生产重组蛋白的生产力、活性和产物质量进行选择。10.可通过权利要求1-9中任一项的方法获得的稳定转染的永生化人细胞系。11.权利要求10的细胞系，其可通过权利要求4-9的方法获得，优选所述细胞系是293F，并且所述转染栽体来源于pcDNA3.1。12.重组生产人靶蛋白质或其衍生物或突变体的方法，其包括培养权利要求10或11中所定义的永生化人细胞系。13.权利要求12的方法，其中人靶蛋白质是SEQIDNO:l的939-2324位^^Jj寸所示的人凝血因子IX、如SEQIDNO:2的973-2259位>5^对所编码的人A1AT、如SEQIDNO:9中所示的野生型人因子VIII,或者如SEQ1DNO:3所示的B结构域缺失的人因子VIII、FVII/FVIIa、G-CSF包括SEQIDNO:27中所示的G-CSFb，或者血友病因子。14.权利要求12或13的方法，还包括从培养液中浓缩所述重组人蛋白质的步骤和/或纯化所述蛋白质的步骤和/或除去腕病毒的步骤。15.根据权利要求12-14中任一项的方法，其中所i^A蛋白质的生产在无血清M下进行。16.如权利要求1-4所定义的转染载体，其包含复制起点和核酸序列，所述核^列包含编码人耙蛋白质或其衍生物或突变体的基因。17.权利要求16的转染载体，其是包含编码乾蛋白质的基因的pcDNA3.1栽体，所述靶蛋白质选自人蛋白质凝血因子IX、人A1AT、人凝血因子VIII、包括其野生型和B结构域缺失突变体、G-CSF包括其a、b和c形式、FVll/Vlla、包括其a和b形式以及vWF，优选地，所述转染栽体含有SEQIDNO:l、2、3或22所示的核酸序列。全文摘要本发明涉及无血清生产永生化人细胞系的改进方法，所述细胞系在无血清条件下稳定转染了带有编码目的蛋白的基因的特定载体。另外，本发明涉及通过所述方法获得的生产细胞系，使用所述生产细胞系生产所述目的蛋白的方法以及自身携带目的基因的特定载体。文档编号C12N15/79GK101233238SQ200680023280公开日2008年7月30日申请日期2006年6月29日优先权日2005年6月30日发明者丁海燕,卡特伦·韦格曼,卡罗拉·施罗德申请人:奥克塔法马股份有限公司