啮齿动物细胞中的蛋白质表达的制作方法

专利名称：啮齿动物细胞中的蛋白质表达的制作方法
啮齿动物细胞中的蛋白质表达 本发明涉及异源蛋白质在啮齿动物细胞中的表达。编码蛋白质的核酸
被提供于附加体上，其处于EB病毒的oriP/EBNA-l-系统的控制和保持下， 其中，oriP和EBNA-l的结构基因位于细胞中不同的元件上。
背景技术：
过去数年间生物技术生产工艺的作用和影响越发重要。随着生物技术 工艺重要性日益增加，生产的产品的复杂性也稳步增长。
可能用来表达异源蛋白质的宿主细胞是HEK(人胚肾)、 HeLa(Henrietta Lacks)、 COS(经SV40转化的非洲绿猴肾细胞)和CHO(中 国仓鼠卵巢)细胞，因为在这些宿主中表达的异源蛋白质可按照人细胞中的 情形被折叠、加工、由蛋白酶使其成熟、糖基化和硫酸化(见，例如Watson， E.,等人，Glycobiol. 4 (1994) 227-37)。
EB病毒(EBV)是人B淋巴细胞的病原体。其属于人类疱渗病毒类(疱 瘆病毒科(herpesviridae))。经EBV转化的B淋巴细胞可能不受调控地增殖 (propagate)(Miller， G"由Fields, B.在Virology中编著，B" Raven Press, N.Y. (1985) 563-5卯)。经EBV转化的细胞的特征性特点是所谓的EB病毒 核抗原(EBNA)蛋白质的表达。其中，目前已鉴定出了六种不同的变体。
EBNA-1蛋白质在EBV核酸在经转化细胞中的复制循环中发挥重要作 用。与第二 EBV元件(顺式作用的复制起点(oriP))组合，附加体得以在细 胞中复制和保持(Lupton， S.，和Levine， A.J.， Mol. Cell. Biol. 5 (1985) 2533-2542; Yates, J.L.，等人，Nature (London) 313 (1985) 812-815)。
oriP片断由两个区域构成二重对称元件和重复家族。第一种是65bp 的序列片断。其在病毒的核酸中被大约1000 bp与重复家族分离开。这一 第二种片断由重复了 20次的30 bp的序列组成(Hudson， G.S.，等人，
Virology 147 (1985) 81-98; Rdsman， D.,等人，Mol. Cell, Biol. 5 (1985) 1822-1832)。 30bp重复家族具有增强转录的能力，而二重对称元件则在复 制中发挥作用。完整的oriP-片断协助对质粒的染色体外保持。
EBNA-1蛋白质(即，反式作用起始蛋白质)和oriP的组合允许质粒的 构建，该质粒一旦被引入细胞，它们可作为附加体稳定保持，并且在细胞 增殖期间稳定复制(见，例如，Yates， J丄.，等人，Nature (London) 313 (1985) 812-815; Rdsman， D.，等人，Mol. Cell. Biol. 5 (1985) 1822-1832)。这两种 元件利用宿主细胞的复制机制来复制附加体(Bode， J.，等人，Gene Ther. Mol. Biol. 6 (2001) 33-46)。
Krysan， P.J.，等人(Mol. Cell. Biol. 9 (1989) 1026腸1033)表明，包含 EBV复制起点重复家族的质粒可被永久保留于人类细胞的细胞核中。因 此，EBNA-1蛋白质的存在M够的，不需要EBV的其它元件(还见Aiyar， A.，等人，EMBO J. 17 (1998) 6394-6403; Hung， S.C.,等人，PNAS 98 (2001) 1865-1870 ; Yates， J.L" in DNA Replication in Eukaryotic Cells, DePhamphilis编著，M丄.，Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y. (1996)第 751-774页；Yates， J丄.，等人，J. Vir. 74 (2000) 4512-4522)。
EBNA-1蛋白质在游离型复制期间将附加体与宿主细胞染色体相连， 由此确保了细胞分裂期间附加体的增殖。
此种相互关系对于其它一些病毒来说也是已知的，例如，来自猿猴病 毒40(SV 40)的大T-抗原和来自牛乳头瘤病毒(BPV)的El/E2蛋白质(见， 例如Gilbert, D.M.，等人，Cell 50 (1987) 59-68; DuBridge， R.B.，等人， Mutagen. 3 (1988) 1-9; Lebkowski, J.S"等人，Mol. Cell. Biol. 4 (1984) 1951-1960)。
EBV的元件EBNA-1和oriP的组合已用于制备非整合的、染色体外 的、自主复制的附加体。例如Horlick等人使用稳定表达EBNA-1蛋白质 的HEK(人胚肾)细胞来从含有EBV oriP的质粒表达CRHR(促肾上腺皮质 激素释放激素受体)(Horlick， R.A"等人，Prot. Exp. Purif. 9 (1997) 301-308)。
在美国专利4,686,186中，已报道了重组载体以及由此转化的真核宿 主。EBV元件oriP和EBNA-1在重组载体上组合。
在WO 2002/0卯533中，才艮道了一种生产重组蛋白质的方法，该方法 通过对悬浮培养的人胚肾细胞(293细胞系及其遗传变体)进行瞬时转染来 进行。提供EBV复制起点的质粒以染色体外方式保持。
在WO 2004/053137中，才艮道了一种在宿主细胞中生产重组多肽和/或 未翻译的RNA分子的方法。WO 2004/018506报道了可用于被瞬时转染进 哺乳动物宿主细胞的可调控表达系统的组合物和方法。
美国专利申请2002/0086419报道了用于在真核宿主细胞中稳定维持外 源DNA的重组载体以及该重组载体用于在宿主细胞中长期稳定生产基因 产物的用途。
在美国专利5,707,830中报道了可用于转染选用的哺乳动物宿主细胞 的表达载体。所ii^达载体含有EB病毒(Epstein-Barr-Virus)重复家族、 可在宿主细胞中功能性表达的EBNA-1基因的拷贝、真核DNA片段(其提 供载体在宿主细胞中复制的能力)和表达盒。
WO 2002/027005报道了增强的转染系统，其包含附加体保持系统、强 启动子/增强子、蛋白质反式激活系统和编码异源蛋白质的DNA。优选的 细胞系应当是非啮齿动物的，因为含oriP的质粒不能高效复制，并且CHO 细胞，例如，缺乏用于反式激活系统的细胞因子。
Wysokenski， D.A"和Yates， J丄.，(J. Vir. 63 (1989) 2657-2666)提到， EBV质粒复制不能将物种系从灵长类动物细胞交叉到啮齿动物细胞。这基 于缺乏与DNA复制所涉及的宿主蛋白质(其在啮齿动物中缺乏)的相互作 用。
Tomiyasu, K-i.，等人，Biochem. Biophys. Res. Commun. 253 (1998) 733-738、 Mizuguchi， H.，等人，FEBS Letters 472 (2000) 173-178和WO 2005/024030才艮道了含有oriP和EBNA-1结构基因以及其它元件的质粒。
美国专利5,976,807报道了生产表达多种感兴趣的蛋白质的重组真核 细胞系的方法。获得表达EBNA-1蛋白质的经转染的细胞，其含有至少两
种经转染的附加体。

发明内容
本发明提供了表达系统，用于在啮齿动物细胞系中表达异源蛋白质。
该系统包含EB病毒的oriP/EBNA-l游离型复制和保持系统。
具体地，本发明提供了啮齿动物细胞，其中，所述啮齿动物细胞表达 EB病毒的核抗原l(EBNA-l)，并且含有附加体，其中，所述附加体包含
a) 原核复制起点；
b) 选择标记；
c) EB病毒(EBV)复制起点(oriP);
d) 适于在所述啮齿动物细胞中表达异源多肽的表达盒，其中，所述表 达盒包含启动子序列、5'非翻译区域、编码所述异源蛋白质的核i^列以 及包含聚腺苷酸化信号的3啡翻译区域。
本发明还提供了一种方法，用于获得根据本发明的啮齿动物细胞，其 中，所述方法包括如下步骤
a) 提供啮齿动物细胞；
b) 提供下述质粒，其包含原核复制起点、选择标记和针对EB病毒核 抗原l(EBNA-l)的功能性表达盒，其中，所a达盒包含启动子序列、5' 非翻译区域、编码EBNA-1蛋白质的核酸序列以及包含聚腺苷酸化信号的 3'非翻译区域；
c) 将所M粒b)引入所述啮齿动物细胞a);
d) 选择经稳定转化的啮齿动物细胞；
e) 提供一个或多个下述另一质粒，其包含原核复制起点、选择标记、 EB病毒(EBV)复制起点(oriP)、适于在经转化的啮齿动物细胞中表达异源 蛋白质的表达盒，其中，所i^达盒包含启动子序列、5'非翻译区域、编 码异源多肽的核酸序列和包含聚腺苷酸化信号的3'非翻译区域，
f) 将所述另 一质粒e)引入啮齿动物细胞d);
g) 重复步骤e)至f)多至五次。
本发明还提供了用于生产异源多肽的方法，其中，所述方法包含
a) 提供根据本发明的啮齿动物细胞；
b) 在适合表达所述异源多肽的条件下培养所述啮齿动物细胞；
c) 从培养物中回收所述异源多肽。
本发明还提供了生产根据本发明的啮齿动物细胞的试剂盒，其中，所 述试剂盒包含
a) 啮齿动物细胞；
b) 第一质粒，其包含原核复制起点、选择标记和针对EB病毒核抗原 l(EBNA-l)的功能性表达盒，其中，所^达盒包含启动子序列、5'非翻译 区域、编码EBNA-1蛋白质的核酸序列以及包含聚腺苷酸化信号的3'非翻 译区域；
c) 第二质粒，其包含原核复制起点、选择标记、EB病毒(EBV)复制起 点(oriP)、适于在啮齿动物细胞中表达异源多肽的表达盒，其中，所述表达 盒包含启动子序列、用于引入核酸序列的克隆位点和包含聚腺苷酸化信号 的3'非翻译区域。
在本发明的一种实施方案中，啮齿动物细胞是CHO细胞。 在本发明的另一实施方案中，CHO细胞选自CHO-K1细胞、
CHO-DXB11细胞、CHO-DG44细胞和表达EBNA-1蛋白质的CHO细胞。 在本发明的另一实施方案中，待表达的异源多肽选自前药、酶、酶片
段、酶抑制剂、酶激活剂、生物活性多肽、刺猬(hedgedog)蛋白质、骨形
态发生蛋白、生长因子、促红细胞生成素、血小板生成素、G-CSF、白细
胞介素、干扰素、免疫球蛋白或免疫球蛋白片段的组。
在一种实施方案中，所述异源多肽是免疫球蛋白或免疫球蛋白片段。 在另一实施方案中，根据本发明的对异源蛋白质的生产在瞬时转染下进行。
在另一实施方案中，所述异源多肽分泌进培养基。 在本发明的又一实施方案中，引入啮齿动物细胞的质粒含有至少两种 选择标记，优选至少 一种原核选择标记以及至少 一种真核选择标记。
在本发明的又一实施方案中，引入一个啮齿动物细胞的质粒的数量为
1至5个质粒之间。
在本发明的另 一实施方案中，在同 一步骤中引入啮齿动物细胞的质粒 的数量在1至3之间，优选，l至2个质粒之间。
发明详述
本发明提供了啮齿动物细胞，其中，所述啮齿动物细胞表达EB病毒 核抗原l(EBNA-l)，并且含有附加体，其中，所述附加体包含
a) 原核复制起点；
b) 选捧才示^己；
c) EB病毒(EBV)复制起点(oriP);
d) 适于在所述啮齿动物细胞中表达异源多肽的表达盒，其中，所述表 达盒包含启动子序列、5'非翻译区域、编码所述异源多肽的核酸序列以及 包含聚腺苷酸化信号的3'非翻译区域。
可用于开展本发明的方法和4支术4皮描述于，例如，Ausubel, F.M.，编 著，Current Protocols in Molecular Biology,巻I至III (1997); Glover， N.D" 和Hames, B.D.，编著,DNA Cloning: A Practical Approach,巻I和II (1995)， Oxford University Press; Freshney, R.I.(编著)，Animal Cell Culture — a practical approach, IRL Press (1986); Watson, J.D.，等人, Recombinant DNA，第二版，CHSL Press (1992); Winnacker， E丄.，From Genes to Clones; N.Y" VCH Publishers (1987); Cdis， J.，编著，Cell Biology, 第二版,Academic Press (1998); Freshney, R.I.， Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Techniques,第二版，Alan R. Liss， Inc., N.Y. (1987)中。
用于本文中的"核酸"指编码可重组生产的多肽的、至少部分非天然存 在的核酸。"非天然存在，，可指各核苷酸的序列或所用的功能性元件的组合， 所述功能性元件不限于启动子、3'非翻译区域、增强子或复制起点。核酸 可由核酸片段来构成，所述核酸片段优选是DNA片段，其是经分离的或 通过化学手段合成的。核酸可被整合进另外的核酸，例如，整合进质粒或
真核宿主细胞的基因组/染色体。质粒包括穿梭载体和表达载体等。通常，
质粒还将包含原核增殖单元，其包含复制起点(例如ColEl复制起点)和选 择标记(例如，氨节青霉素或四环素抗性基因)，分别用于在细菌中复制和 选择载体。
同样地，核酸可通过由各核苷酸构成的其核酸序列来表征。
用于本申请中的术语"核酸序列"指核酸分子和其变体的核苷酸序列，
所述核酸分子和其变体编码肽、多肽或蛋白质或其功能性变体，即，例如， 具有不同M酸序列但具有相同生物学功能/活性的蛋白质。这些改变是由 于，例如，遗传密码子的简并、突变(例如点突变)、缺失、插入等导致的。 蛋白质变体的M^列与亲本蛋白质的M^列有所不同，这是由于 亲本蛋白质序列中 一个或多个氨基酸残基的添加、缺失和/或取代导致的。 普遍地，变体将具有与亲本蛋白质序列有至少卯％氨基#列同一性的氨 基酸序列，更优选地，至少95%，最优选地，至少99%。
"表达盒"指这样的核酸序列，其包含对于在细胞中表达和分泌至少其 所含有的结构基因来说必要的元件。
"基因"指这样的片断，例如，位于染色体或质粒上，其对于表达肽、 多肽或蛋白质来说是必要的。除了编码区域之外，基因还包含其它功能性 元件，包括启动子、内含子和终止子。
"结构基因"指基因的编码区域，而没有信号序列。 在本申请中使用的术语"启动子"指用于推动下游核酸序列转录的调控
性核酸序列。启动子序列可选自以下的启动子序列巨细胞病毒(CMV)、 早期和晚期猿猴病毒40(SV40)(Bernoist， C.，和Chambon， P" Nature 290 (1981) 304-10)、劳斯肉瘤病毒(RSV)3'长末端重复中含有的启动子 (Yamamoto等人，Cell 22:787-97 (1980))、甘油糾酸脱氢酶(GADPH)、 逆转录病毒LTRs、延伸因子la(EF-la)、泛素、单纯疱疹病毒的胸苷激酶 (HSVTK)(还见，例如，Lee，A.，等人,Mol. Cell. 7 (1997) 495-501， Wagner 等人，Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 78:1441-45 (1981))以及金属硫蛋白基因 的调节序列(Brinster等人，Nature 296 (1982) 39-42)。优选的是强启动子，
例如，腺病毒启动子(例如，腺病毒主要晚期启动子)，清蛋白启动子，ApoAl 启动子，P-肌动蛋白启动子，热激启动子，异源启动子(例如CMV)，人珠 蛋白和生长激素启动子，可诱导启动子(例如MMT)，逆转录病毒LTR启 动子、RSV以及胸苷激酶启动子(例如单纯疱瘆病毒的胸苷激酶启动子)。 尤其优选的是强病毒启动子，例如，腺病毒启动子，即时早期和晚期巨细 胞病毒启动子(CMV; Boshart等人，Cell 41 (1985) 521-30)，小鼠乳胂瘤病 毒启动子(MMTV)和来自长末端重复的劳斯肉瘤病毒启动子(LTR-RSV; Gorman等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79 (1982) 6777-81)。
用于本申请中的术语"聚腺苷酸化信号"指用于诱导特定核酸序列片断 的初级转录本的切割和聚腺苷酸化的核酸序列。包含聚腺苷酸化信号的3， 非翻译区域可选自包含源自SV40、牛生长素(BGH)的基因、免疫球蛋白基 因和胸苷激酶基因(tk，例如，单纯疱渗的胸苷激酶聚腺苷酸化信号)的聚腺 苷酸化信号的3'非翻译区域构成。
"抗性基因"或"选择标记"可在本申请中互换使用，其是这样的基因， 在存在相应选择剂时，其使得携带该基因的细胞被特异性选出或选掉。有 用的阳性抗性基因是抗生素抗性基因。该选择标记使得经该基因转化的宿 主细胞在存在相应抗生素时^i日性选出，而未经转化的宿主细胞则不能在 选择性培养条件下生长或存活。选择标记可以是阳性的、阴性的或双功能
的。阳性选择标记使得携带所述标记的细胞被选出，而阴性选择标记则使 得携带所述标记的细胞被选择性清除。通常，选择标记将赋予对药物的抗 性或对宿主细胞中代谢或异化缺陷的补偿。在原核细胞中，通常使用赋予
抗氨苄青霉素、四环素、卡纳霉素或氯霉素抗性的基因等。对于真核细胞 有用的抗性基因包括，例如，针对M糖苷磷酸转移酶(APH)(例如潮霉素 磷酸转移酶(hyg)、新霉素和G418 APH)、 二氢叶酸还原酶(DHFR)、胸苷 激酶(tk)、谷氨酰胺合成酶(GS)、天冬酰胺合成酶、色氨酸合成酶(p引咪)、 组氨醇脱氢酶(组氨醇D)的基因和编码对嘌呤霉素、博来霉素、腐草霉素、 氯霉素、Zeocin和霉酚酸的抗性的基因。其它标记基因被描述于WO 92/08796和WO 94/28143中。
除了在存在相应选择物质时进行选择之外，选择标记还可提供编码正
常情况下不存在于细胞中的分子(例如，绿色荧光蛋白(GFP))的基因。带有 这种编码GFP的基因的细胞可容易地与不带该基因的细胞区分开，这仅通 过探测GFP发出的荧光即可实现。
真核表达载体/质粒可在原核细胞中增殖。因此，真核表达载体/质粒可 以并且通常将携带不止一种抗性基因，即，可用于原核选择的一种抗性基 因以及可用于真核选择的一种抗性基因。
本文中使用的"调控元件"指编码感兴趣的肽、多肽或蛋白质的结构基 因的转录和/或翻译必需的、以顺式存在的核苷酸序列。转录调控元件通常 包含处于待表达的结构基因上游的启动子、转录起始和终止位点以及聚腺 苷酸化信号序列。术语"转录起始位点，，指对应于基因中将掺入初级转录本 (即，mRNA前体)的第一个核酸的核酸威基；转录起始位点可与启动子序 列重叠。术语"转录终止位点"指通常呈现于待转录的感兴趣基因3'末端的 核苷酸序列，其导致RNA聚合酶终止转录。聚腺苷酸化信号序列，或多 聚A添加信号，提供了在真核mRNA的3'末端的特定位点进行切割以及 在核中向经切割的3'末端翻译后添加大约100-200个腺普酸序列(多聚A尾 巴)的信号。聚腺苷酸化信号序列可包括位于切割位点上游大约10-30个核 苷酸处的共有序列——AATAAA。
为生产分泌的多肽，感兴趣的结构基因额外包含编码信号序列/前导肽 的DNA片断。信号序列将新合成的肽、多肽或蛋白质指导到ER膜上以及 穿过ER膜，在ER膜处，所述多肽可进入分泌途径。在蛋白质穿过ER 膜期间，信号序列可净皮信号肽酶切下。对于信号序列的功能而言，宿主细 胞分泌机制的识别是必要的。因此，所用的信号序列必须被宿主细胞分泌 机制的蛋白质和酶识别。
翻译调控元件包括翻译起始(AUG)和停止密码子(TAA、 TAG或 TGA)。内部核糖体ii^位点(IRES)可包括在一些构建体中。
"启动子"指控制基因/结构基因或与其有效相连的核酸序列转录的多 核苦酸序列。启动子包括针对RNA聚合酶结合和转录起始的信号。所使
功能。来自多种不同来源的大量的启动子，包括组成型、诱导型和阻遏型
启动子是本领域公知的(并被鉴定于数据库，例如GenBank中)，并可(从， 例如，保藏机构，例如ATCC以及其它商业或个体来源)作为克隆的多核 苷酸获得，或在克隆的多核苷酸中获得。"启动子"包含指导结构基因转录 的核苷酸序列。通常，启动子位于基因的上游区域(5')，邻近结构基因的转 录开始位点。启动子中作用于起始转录的序列元件通常通过共有的核苷酸 序列来表征。这些启动子元件包括RNA聚合酶结合位点，TATA序列， CAAT序列，分化特异性元件(DSE; McGehee， R.E.，等人，Mol. Endocrinol. 7 (1993) 551-60),环化AMP应答元件(CRE)，血清应答元件(SRE;Treisman， R.， Seminars in Cancer Biol. 1 (19卯)47-58)，糖皮质激素应答元件(GRE) 和针对其它转录因子的结合位点，例如，CRE/ATF(0，Reilly， M.A.,等人，J. Biol. Chem. 267 (1992) 19938-43)、 AP2(Ye， J"等人，J. Biol. Chem. 269 (1994) 25728)、 SP1、 cAMP应答元件结合蛋白质(CREB; Loeken， M.R.， GeneExpr. 3 (1993) 253-64)和八聚体因子(一般而言，见，Watson等人，编 著，Molecular Biology of the Gene,第4版,The Benjamin/Cummings Publishing Company, Inc. 1987和Lemaigre， F.P.和Rousseau, G.G.， Biochem. J. 303 (1994) 1-14)。如果启动子是诱导型启动子，那么转录速率 应答于诱导剂增加。相反，如果启动子是组成型启动子，转录速率则不受 诱导剂调控。阻遏型启动子也是已知的。例如，当生长因素与其细胞表面 上的受体结合时，c-fos启动子^皮特异性激活。可通过由，例如，CMV启 动子以及接着的两个Tet-操纵子位点构成的人工杂合启动子来实现由四环 素(tet)调控的表达。Tet-阻遏子与两个Tet-操纵子位点结合，阻止转录。加 入诱导剂四环素之后，Tet-阻遏子从Tet-操纵子位点释放，转录得以进行 (Gossen， M.和Bujard， H. PNAS 89 (1992) 5547-5551)。关于其它i秀导型启 动子，包括金属硫蛋白和热激启动子，见，例如，Sambrook等人(见前文) 和Gossen，M.，等人，Curr. Opin. Biotech. 5 (1994) 516-520。已被鉴定为用 于高水平表达的强启动子的真核启动子包括SV40早期启动子、腺病毒主
要晚期启动子、小鼠金属硫蛋白-I启动子、劳斯肉瘤病毒长末端重复、中
国仓鼠延伸因子la(CHEF-l，见，例如US 5,888,809)、人EF-la、泛素和 人巨细胞病毒即刻早期启动子(CMV IE)。
"启动子，，可以是组成型或诱导型的。增强子(即，作用于启动子上以增 加转录的顺式作用DNA元件)可能是必要的，以与启动子一^L挥功能以 增加表达水平(相对于单独用启动子获得的)，其可作为转录调控元件被包 括进去。通常，含有启动子的多核苷酸片断将还包括增强子(例如，CMV 或SV40)。
本文中使用的"增强子"指增强与其有效相连的编码序列或基因的转录 的多核苷酸序列。与启动子不同，增强子的定向和位置相对独立，其,皮发 现对于转录单元来说是5，或3'的(Lusky， M"等人，Mol. Cell Bio.， 3 (1983) 1108-22)，位于内含子中(Banerji， J.，等人，Cell, 33 (1983) 729-40)以及位于 编码序列本身中(Osborne, T.F"等人，Mol. Cell Bio" 4 (1984) 1293-305)。 因此，增强子可被放置于转录起始位点的上游或下游，或者与启动子有相 当大的距离，虽然实践中，增强子可能与启动子物理和功能重叠。来自多 种不同来源的大量增强子是本领域公知的(并被鉴定于数据库，例如 GenBank中)，并可(从，例如，保藏机构，例如ATCC以及其它商业或个 体来源)作为克隆的多核苷酸序列获得，或在克隆的多核苷酸序列中获得。 多种包含启动子序列的多核苷酸(例如，商业使用的CMV启动子)也包含增 强子序列。例如，上文列出的所有强启动子也可含有强增强子(见，例如， Bendig， M.M.， Genetic Engineering, 7 (1988) 91-127)。
"有效相连"指两种或多种组分的并列，其中，所描述的组分处于允许 它们以其期望的方式发挥功能的关系中。例如，如果启动子和/或增强子顺 式作用，以控制或调节相连序列的转录的话，那么启动子和/或增强子则是 与编码序列有效相连的。通常但并非必须，"有效相连"的DNA序列是邻 接的(contiguous),根据需要将两个蛋白质编码区域(例如分泌前导区和多 肽)连接成邻接并且符合读码框的。但是，虽然有效相连的启动子通常位于 编码序列的上游，但其并不一定要与编码序列邻接。增强子不必要邻接。
如果增强子增强了编码序列的转录，那么增强子即是与编码序列有效相连 的。有效相连的增强子可位于编码序列上游、之中或下游，以及与启动子 有相当大的距离。如果聚腺苷酸化位点位于编码序列的下游末端，使得转 录通过编码序列进行至聚腺苷酸化序列，那么聚腺苷酸化位点即是与编码 序歹'J/结构基因有效相连的。相连通过本领域已知的重组方法来完成，例如，
使用PCR方法和/或通过在方便的限制性位点进行连接。如果不存在方便 的限制性位点，那么可根据常规实践使用合成的寡核苷酸衔接子或接头。
本文中使用的术语"表达"指在宿主细胞内发生的转录和/或翻译。宿主 细胞中想要的产物的转录水平可基于细胞中存在的相应mRNA的量来测 定。例如，可通过PCR或Northern杂交(见，Sambrook等人，Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York (1989))来对从选定的序列转录的mRNA加以定量。可通过多种 方法来对选定的序列编码的蛋白质加以定量，例如，通过ELISA，通过针 对蛋白质生物学活性加以检测，或者通过使用独立于此类活性的检测，例 如，Western印迹或放射性免疫测定(其中j吏用识别并结合蛋白质的抗 体)(见，前文的Sambrook等人，1989)。
"宿主细胞"指将向其中引入编码本发明多肽的基因的细胞。宿主细胞 包括用于质粒/载体的增殖的原核细胞，以及用于表达结构基因的真核细 胞。通常，真核细胞是哺乳动物细胞。
"多肽"是通过肽键连接的氨基酸残基的聚合物，无论其是天然生产或 合成生产的。少于大约20个氨基酸残基的多肽可被称为"肽"。
"蛋白质"是包含一条或多条多肽链的大分子，其中，至少一条链具有 长度为100个氮基酸或更大的氨基酸长度。蛋白质还可包含非肽性组分， 例如，糖类基团。糖类和其它非肽性取代基可通过在其中生产蛋白质的细 胞加入到蛋白质中，其可随着细胞类型变动。本文中将根据其氨基酸主链 结构来限定蛋白质；添加(例如，糖类基团)通常并不特别指出，但也可以 存在。
"异源DNA"或"异源多肽"指天然不存在于给定的宿主细胞中的DNA
分子或多肽或DNA分子的群或多肽的群。对于特定宿主细胞来说异源的 DNA分子可含有源自宿主细胞物种的DNA(即，内源DNA),只要该宿主 DNA与非宿主DNA(即，外源DNA)组合即可。例如，含有与包含启动子 的宿主DNA片断有效相连的、编码多肽的非宿主DNA片断的DNA分子 被认为是异源DNA分子。反过来，异源DNA分子可包含与外源启动子有 效相连的内源结构基因。
非宿主DNA分子编码的肽或多肽是"异源"肽或多肽。 用于本申请中的术语"质粒"和"载体"指用于将遗传物质转入细胞的栽 体。该物质通常(但并不排它)是环状核酸分子。根据质粒的意欲用途，其 可额外含有复制起点以及必要的复制控制片断，例如，以使得质粒可在宿 主中复制或转录。
"克隆栽体"是具有在宿主细胞中自主复制的能力的核酸分子，例如质 粒、教粒、噬菌粒(phageimid)或细菌人工染色体(BAC)。通常，克隆栽体 含有一处或少量限制性内切酶识别位点(这使得核酸分子可以以可决定的 方式插入，而不会损失载体的必要生物学功能)以及编码抗性基因的核苷酸 序列，其适用于对经克隆载体转化的细胞进行鉴定和选择。通常，抗性基 因包括提供四环素抗性或氨千青霉素抗性的基因。
"表达质粒"是编码将在宿主细胞中表达的蛋白质的核酸分子。通常， 表达质粒包含原核质粒增殖单元(例如，对于大肠杆菌(E. coli)而言，包含 复制起点和选择标记)、真核选择标记以及用于表达感兴趣的结构基因的一 个或多个表达盒。通常，"表达盒"包含启动子、5'非翻译区域、结构基因 以及包括聚腺苷酸化信号的3'非翻译区域。基因表达通常处于启动子控制 下，此类结构基因被说成是与启动子"有效相连"的。类似地，如果调控元 件调节核心启动子的活性，那么调控元件和核心启动子;l有效相连的。
"经分离的多肽"是这样的多肽，其基本不含被细胞组分所污染，例如 糖类、脂类或与多肽天然相关联的其它蛋白质性杂质。通常，经分离的多 肽的制品含有高度纯化形式的多肽，即，至少大约80%纯，至少大约90％ 纯，至少大约95%纯，超过95%纯或超过99%纯。显示出特定蛋白质制
品含有经分离的多肽的一种途径是通过对蛋白质制品进行十二烷基石危酸钠
(SDS)-聚丙烯酰胺凝胶电泳以及对凝胶进行Coomassie亮蓝染色之后的单 一条带的出现来判断的。但是，术语"经分离得"并不排除以另外的物理形 式(例如二体、突变形式(例如点突变)或者可选地糖基化或衍生化的形式) 存在的同样的多肽的存在。
术语"免疫球蛋白"指由基本由免疫球蛋白基因编码的一种或多种多肽 构成的蛋白质。已知的免疫球蛋白基因包括不同的恒定区基因以及无数的 免疫球蛋白可变区基因。免疫球蛋白可以以多种形式存在，包括，例如， Fv、 Fab和F(ab)2以及单链(scFv)(例如，Huston, J.S.,等人，PNAS USA 85 (1988)5879-5883; Bird等人，Science 242 (1988) 423-426以及， 一般性地， Hood, L E.， Weissman， I.， Wood, W. B.，和Wilson, J. H.， Immunology, Benjamin/Cummings， Menlo Park, California. (1983)和Hunkapiller和 Hood, Nature 323 (1986) 15-16)。
免疫球蛋白通常包含至少两条轻链多肽和两条重链多肽。每条重链和 轻链多肽链可含有可变区(通常是多肽链的氨基末端部分)，其含有能与抗 原相互作用的结合结构域。每条重链和轻链多肽链包含恒定区(通常是M 末端部分)。重链的恒定区介导抗体与i)带有Fcy受体(FcYR)的细胞，例 如，吞噬细胞，的结合，ii)带有新生儿Fc受体(FcRn)(也被称为Brambell 受体)的细胞的结合。其还介导与一些因子的结合，所述因子包括经典补体 系统的因子，例如，补体成分(component)(Clq)。
免疫球蛋白轻链或重链的可变区进而包含不同片断，即，四个构架区 (FR)和三个高变区(CDR)。
"免疫球蛋白片段"指包含选自下述的一种或多种片断的多肽CH1 结构域、铰链区、Ch2結枸域、Ch3結枸域、Ch4結枸域、Cl結枸域、Vh 结构域、Vl結枸域、构架区l、构架区2、构架区3、构架区4、高变区l、 高变区2和高变区3(有或没有插入、缺失和/或突变)。
在本申请中指出的"包含聚腺苷酸化信号的3'非翻译区域"是长度为 50-750个^^iJ t的DNA序列，其提供了用于在真核mRNA的3'末端的特
异性位点进行切割以及在细胞核中向经切割的3'末端翻译后添加大约 100-200个腺普酸序列(多聚A尾巴)的信号。建议采用非常高效的聚腺苷酸 化信号，因为效率低的切割和聚腺苷酸化可以导致类似操纵子的mRNA形 成，这可能是不想要的，例如，质粒编码的基因表达的原因。
本申请中使用的术语"宿主"和"细胞"指适于接收根据本发明的质粒的 细胞。优选地，该细胞选自CHO(中国仓鼠卵巢)细胞、BHK(仓鼠婴肾)细 胞和其它啮齿动物细胞。优选的是CHO或源自CHO的细胞，其包含 CHO-K1细胞、CHO-DXB11细胞、CHO-DG44细胞和表达EBNA-1蛋白 质的CHO细胞。根据本发明提供的细胞的后代也包括在内。还包括在连 续世代具有修饰的、根据本发明提供的细胞的后代，所述修饰可能是由于 突变、环境影响或遗传密码的简并性导致的。术语"细胞系"尤其指可体外 增殖一段特定时间段的细胞群。在该时间段内，细胞生长并通过细胞分裂 增殖。
在本申请中使用的术语"瞬时转染"指这样的过程，其中，引入细胞的 核酸没有整合进细胞的基因组或染色体DNA。其实际上作为染色体外元 件，例如作为附加体保持于细胞中。附加体的核酸的转录过程不受影响， 例如，产生附加体的核酸编码的蛋白质。
本申请中使用的术语"稳定转化"指外源核酸可遗传地稳定整合进宿主 细胞基因组/染色体。
本文中使用的术语"生物活性多肽，，指当被给予人工生物学系统(例如 使用细胞系和病毒进行的生物检测)或体内给予动物(包括但不限于鸟和哺 乳动物，包括人)时导致生物学效果的有机分子，例如生物大分子，例如， 肽、蛋白质、核蛋白、黏蛋白、脂蛋白、合成多肽或蛋白质。生物学效果 可以是(但不限于)酶抑制、激活或变构修饰，与受体的结合(在结合位点或 周围)，阻碍或激活受体，信号触发或抗原结合。
EBV的oriP复制起点、EBV 二重对称元件和EBV重复家族的核^ 列表示SEQ ID NO: 01至SEQ ID NO: 03，其已从GenBank条目V01555 获得。编码EBNA-1蛋白质的序列表示在SEQ ID NO: 04(核酸序列)和SEQID NO: 05(氨基酸序列)。这些序列已分别从V01555(GenBank)和 P03211(SwissProt)获得。
已经4艮好地建立了不同的方法，它们被广泛用于蛋白质纯化，例如用 微生物蛋白质进行的亲和色i脊(例如，A蛋白或G蛋白亲和色语)、离子交 换色i普(例如，阳离子交换(羧甲基树脂)、阴离子交换(氨基乙基树脂)和混 合模式交换)、亲硫吸附(例如，用卩巯基乙醇和其它SH配体)、疏7jc相互 作用或芳香族吸附色语(例如，用苯基-琼脂糖凝胶、氮杂-arenophilic树脂 或间氨基苯硼酸)、金属螯合亲和色语(例如，用Ni(II)-和Cu(II)-亲和材料)、 大小排除色i普和电泳方法(例如凝胶电泳、毛细管电泳)(Vijayalakshmi， M.A.， Appl. Biochem. Biotech. 75 (1998) 93-102)。
本发明提供了方法，用于在啮齿动物细胞中表达目标肽、多肽和蛋白 质。本发明还提供了啮齿动物细胞，用于生产异源肽、多肽或蛋白质，其 中，编码所述异源肽、多肽或蛋白质的结构基因是啮齿动物细胞内的附加 体提供的。由两个或多个亚基组成的多肽或蛋白质，即，例如免疫球蛋白 也可按照本发明的方法来生产。例如，在免疫球蛋白(由两对轻链和重链构 成)的情况下，可以使用含有编码免疫球蛋白两种链的两个结构基因的一个 附加体。或者，可以使用两个附加体，例如，其中一个含有编码轻链的结 构基因， 一个含有编码重链的结构基因。
在本发明中使用指导EBNA-1蛋白质表达的启动子。优选地，使用强 启动子，优选地，使用异源强启动子，例如，CMV。 EBNA-1蛋白质的表 达盒稳定整合进染色体DNA导致产生经修饰的啮齿动物细胞，其表达 EBNA-1蛋白质，即，编码EBNA-1蛋白质的结构基因，并且将和启动子 有效连接地整合进染色体DNA。
为阐述本发明的主题，将在下文中对本发明加以描述。作为第一个步 骤，构建表达EBNA-1蛋白质的基础啮齿动物细胞系。优选地，构建这样 的基础啮齿动物细胞系，其在培养物中稳定表达EBNA-1蛋白质。之后， 设计含有针对一种或多种异源多肽的表达盒的质粒，将其引入基础啮齿动 物细胞系。在适于表达异源多肽的a下，培养获得的表达EBNA-1蛋白
质并且携带有用于表达异源多肽的质粒的细胞系(见实施例1-4)。
提供下述描述和实施例是为了阐述本发明的目的，而非限制本发明范 围的目的。
构建宿主细胞系
本发明的宿主细胞提供编码EBNA-1蛋白质的核酸。
在实施例2a)中描述了对含有下W达盒的质粒的构建，所"达盒具 有编码EBNA-1蛋白质的结构基因。质粒的带注释图谱示于图1。
用该质粒转染啮齿动物细胞。在选择性培养制中(用G418作为选择剂) 下对经转染的细胞进行选择后，挑出转化体，扩展，并针对EBNA-1蛋白 质的生产加以测试。
构建的用于形成基础啮齿动物细胞系的质粒不含EBV oriP序列的功 能性拷贝。这包括oriP的两个元件——二重对称元件和重复家族。
构建表达质粒
为表达异源肽、多肽或蛋白质，必须构建含有针对相应结构基因的表 达盒的表达质粒。
对蛋白质举例而言，选用单克隆人抗IGF-1R抗体(见US 2005/0008642)。为生产HuMab抗IGF-1R，使用本发明的基础啮齿动物细 胞系，构建出表达质粒(见实施例3和图3-5)。构建的用于表达异源多肽的 质粒不含EBNA-1结构基因的功能性拷贝。
一般而言，通过亚克隆和重叠PCR，将编码HuMab抗IGF-1R轻链 可变区(VO和人K-轻链恒定区(QJ的结构基因连接起来，针对HuMab抗 IGF-1R重链可变区(VH)和人yl重链恒定区(CHl-铰链-CH2-CH3)也一样。随 后将这些构建体插入缺乏或携带EBV oriP的哺乳动物细胞表达载体。
在J^I啮齿动物细胞系中表达多肽
用一种或多种构建的表达质粒来转染根据本发明的基础啮齿动物细胞
系。在适于表达异源多肽的条件下，例如，在瞬时转染下，进行对经转染 细胞的培养。
一般而言，在瞬时转染下的培养允许经转染的表达质粒不整合进宿 主细胞的染色体，这是由于不存在选择剂施加的选择压力。由于这些非选 择性的培养条件，表达质粒不能在所有培养细胞中以100%的频率复制。 这导致总的蛋白质表达率緩慢降低。培养通常进行至直到培养物中表达的 蛋白质浓度达到最大值时。优选地，培养进行多至20天，优选地，多至 10天，更优选地，5至10天。
在该时间^，分出上清液，按照本领域技术人员已知的标准技术， 对产生的分泌的免疫球蛋白进行分离和纯化。
除了上文所述的分批培养之外，还可使用分流分批(split-batch)工艺来 培养细胞。在分流分批培养工艺期间，在培养期一半之后更换营养培养基。
因此，本发明的目的是提供表达异源多肽的方法，该方法允许在短时 间内生产出具有与哺乳动物细胞(优选地，人细胞)相似的糖基化模式的所 述异源多肽。现在已经吃惊地发现，根据本发明的方法满足此需求。
该方法基于的细胞系是啮齿动物细胞，优选地，CHO细胞，其遵从针 对生产治疗性多肽和蛋白质的细胞系建立的规则，即，不含原癌基因，例 如多瘤病毒的大T抗原。
已经吃惊地发现，在用编码EBNA-1蛋白质的结构基因(优选地，与启 动子有效相连)稳定转染的细胞中，染色体外元件，例如，表达质粒(具有 EB病毒(EBV)复制起点并且没有，即，不含编码EBNA-1蛋白质的结构基 因)在对异源多肽的表达中发挥功能。 一般而言，在根据本发明的方法中， 源自EB病毒的两个元件是采用复制起点(oriP)和编码EBNA-l蛋白质的结
构基因。
本发明的一个方面是在啮齿动物细胞中表达异源多肽的方法，其特征 在于，所述方法包括
a) 提供经编码EBNA-1蛋白质的结构基因稳定转染的啮齿动物细胞，
b) 用包含EB病毒(EBV)复制起点(oriP)的表达质粒来转染所述啮齿动
物细胞，
C)在适于表达所述异源多肽的条件下培养所述经转染的细胞， d)从培养物中回收所述异源多肽。
在一种实施方案中，所述异源多肽是免疫球蛋白或免疫球蛋白片段，
优选地，所述免疫球蛋白是免疫球G蛋白或免疫球蛋白E。
在一种实施方案中，所述异源多肽是分泌的异源多肽，并且从培养基
中回收所述异源多肽。
在一种实施方案中，所述啮齿动物细胞是CHO细胞。
在一种实施方案中，所述编码EBNA-1蛋白质的结构基因与启动子，
优选地，强启动子，尤其优选地，源自CMV的启动子有效相连。
在一种实施方案中，所述表达质粒包含单个源自EBV的元件——EB
病毒(EB V)复制起点(oriP)。
在一种实施方案中，所ii^达质粒不包含编码EBNA-1蛋白质的结构基因。
在一种实施方案中，所述表达质粒额外包含 -原核复制起点 -选择标记
-适于在所述啮齿动物细胞中表达异源多肽的表达盒，其中，所a 达盒包含启动子序列、5'非翻译区域、编码所述异源蛋白质的核酸序列(结 构基因)和包含聚腺苷酸化信号的3'非翻译区域。
在一种实施方案中，如果异源多肽是分泌的异源多肽，那么所述表达 盒额外饱含与编码所述异源多肽的结构基因有效相连的信号序列。
在一种实施方案中，表达异源多肽的方法作为分批工艺、分流分批工 艺或作为连续工艺进行。在优选的实施方案中，所述方法作为分批或分流 分批工艺进行。
在一种实施方案中，表达异源多肽的方法额外含有步骤e)纯化所述异 源多肽。
一般性的色谱方法及其用途是本领域技术人员已知的。见，例如，
Chromatography, 第五版,部分 A: Fundamentals and Techniques, Heftmann， E.(编著)，Elsevier Science Publishing Company, New York (1992); Advanced Chromatographic and Electromigration Methods in Biosciences, Deyl， Z.(编著)，Elsevier Science BV， Amsterdam, The Netherlands (1998); Chromatography Today, Poole， C. F.，和Poole， S. K.， Elsevier Science Publishing Company, New York (1991》 Scopes, Protein Purification: Principles and Practice (1982); Sambrook， J.，等人(编著)， Molecular Cloning: A Laboratory Manual,第二版,Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989)，或Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel， F. M.，等人(编著)"John Wiley & Sons, Inc., New York。
一般而言，对免疫球蛋白的纯化工艺包含多步骤的色傳部分。在第一 个步骤中，通过亲和色谦，例如用A蛋白将非免疫球蛋白多肽和蛋白质与 免疫球蛋白级分分开。之后，可进行离子交换色语来分离各免疫球蛋白的 类以及除去从第一柱上共洗脱下来的痕量A蛋白。最后，必须进行第三个 色谱步骤，来将同一类的免疫球蛋白单体与多体和片段分开。聚集物的量 有时较高(5%或更高)，在第三个纯化步骤中不可能对它们高效分离，因此 还需要后续纯化步骤。
随着对特定免疫球蛋白的重组生产，用于分离不同的免疫球蛋白类的 分离步骤不再是必需的。因此，对重组产生的免疫球蛋白的整个纯化工艺 可减至两个色i普步骤。
通常，在低于各免疫球蛋白等电点的pH值下，在阳离子交换材料上 对A蛋白洗脱物进行色镨加工。
在一种实施方案中，表达异源多肽的方法在瞬时转染下进行。
在所述用于表达异源多肽的方法的一种实施方案中，所述编码 EBNA-1蛋白质的结构基因是编码EBNA-1蛋白质的全长结构基因(SEQ ID NO: 4)，所i4^达质粒不包含编码EBNA-1蛋白质的全长结构基因(SEQ ID NO: 4)。
下述实施例、序列表和附图被提供来辅助理解本发明，本发明的实际 保护范围示于所附的权利要求中。应当理解，可在不偏离本发明宗旨的情 况下对示出的流程加以改变。


图1:质粒pcDNA3—EBNA-1的图i普，该质粒含有EBNA-1蛋白质的 表达盒。
图2:对EBNA-1表达的Western印迹分析。
图2a)的图例道l: 293 EBNA， 65pg蛋白质；道2: CHO-DG44, 100將蛋白质;道3: DG-700画IIH7， 100將蛋白质;道4: DG-700-IIID9， 100pg蛋白质；道5: DG-700画IIIE3， lOOpg蛋白质；道6: DG-700-IIIE8， lOOpg蛋白质；道7: DG画700國IIIF1 ， 100 ing蛋白质；道8: DG曙700-IIIG10, IOO照蛋白质；道9: DG-700-IIIH8, 100)Lig蛋白质。
图2b)的图例道l:蛋白标准；道2: 293 EBNA， 100pg蛋白质； 道3: DG-700-IIIE3subl，第4代，第6天，100 jug蛋白质；道4: DG-700國IIIE3subl ，第15代，第37天，100照蛋白质；道5: DG-700-IIIE3subl,第18代，第48天，100 pg蛋白质；道6: DG-700-IIIE3subl，第20代，第54天，IOO照蛋白质。 图3a:质粒p4816-pUC-L-IR18- k Bsml的图镨 图3b:质粒p4817-pUC-H-IR18- Y 1 Bsml的图镨 图4a:质粒p4818-pUC-Hyg-OriP-重-IR18-Bsml的图傳 图4b:质粒p4819-pUC-Hyg-OriP-轻-IR18-Bsml的图谞 图5:质粒p4821-pUC-Hyg-OriP-IR18-重-轻-Bsml的图语 图6:对抗体在不同细胞系中以及通过不同表达质粒的表达进行的比
序列描述
SEQIDNO:01: EBVoriP的核絲列；V01555 (GenBank); Yates
J丄.，等人，Proc Natl Acad Sci USA 81 (1984) 3806-3806。
SEQ ID NO: 02: EBV 二重对称元件的核酸序列；V01555 (GenBank);
Reisman， D,，等人，Mol. Cell Biol. 5 (1985) 1822-1832。
SEQ ID NO: 03: EBV重复家族的核酸序列；V01555 (GenBank);
Reisman等人，1985。
SEQ ID NO: 04:编码EBNA-l蛋白质的核酸序列；V01555
(GenBank)。
EBNA-l蛋白质的^J^紗列；P03211 (SwissProt)。 引物寡核苦酸l。 引物寡核苷酸2。 引物寡核苷酸3。 引物寡核苷酸4。
SEQ ID NO: 05 SEQ ID NO: 06 SEQ ID NO: 07 SEQ ID NO: 08 SEQ ID NO: 09
实施例描述
实施例l: 一般性技术。
实施例2:构建表达EBNA-l蛋白质的CHO细胞系。
实施例3:构建携带有EBV oriP和针对人单克隆抗IGF-1R抗体的轻
链及重链的表达盒的质粒。
实施例4:通过EBNA-l阳性的DG-700-IIIE3subl细胞从携带oriP
的质粒生产抗体。
实施例1 一般性技术 a)重组DNA技术
按照S腿brook, J" Fritsch, E.F.和Maniatis, T. (1989)， Molecular cloning: A laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York所述，用标准方法来操作DNA。按照厂商 说明书来使用分子生物学试剂。b) DNA序列测定
通过在麦蒂基因公司(MediGenomix GmbH)(Martinsried，德国)上进 行双链测序来测定DNA序列。
c) DNA和蛋白质序列分析和序列数据管理
用GCG(麦迪逊遗传计算机公司(Genetics Computer Group), Madison, Wisconsin)的软件包版本10.2和Infomax，s Vector NTI Advance套装版本 8.0来产生序列、进行图镨定位、分析、注释和阐述。
d) 细胞培养技术
按照Current Protocols in Cell Biology (2000)， Bonifacino， J.S.， Dasso， M.， Harford, J.B.， Lippincott-Schwartz， J.和Yamada， K.M.(编著)，John Wiley & Sons, Inc所述，使用标准的细胞培养技术。
e) 对EBNA-1表达进行Western印迹分析
通过在200 xg离心收获细胞，用PBS(磷酸盐緩冲盐水)洗，在裂解緩 冲液(50 mM Tris'HCl(三(羟甲基)氨基甲烷盐酸盐)，pH 8.0， 120 mM NaCl， 0.5%(v/v)Nonidet P40， 10。/q(v/v)甘油，5 mM DTT(二硫苏糖醇)，1 mM EGTA(亚乙基-双-(氧亚乙基次氨基)四乙酸)，l%(v/v)Trasylol ， 2 mM PMSF(苯甲基磺酰氟)、50照/ml亮抑酶肽(Leupeptin))中于冰上孵育30分 钟。在13,000 x g离心之后，收获可溶的上清液，按照厂商方案，使用 Bio-Rad蛋白质测定(Cat-Nr.: 5000-0001)针对蛋白质质浓度加以测试。
按照厂商推荐，使用]\1^八0￡@凝胶系统(英杰生命技术公司 (Invitrogen))，对蛋白质进行SDS/聚丙烯酰胺凝胶电泳(十二烷基硫酸钠， SDS-PAGE)和电印迹(electro-blotting)。简言之，将蛋白质裂解物(100 |ng 蛋白质)与4倍体积的还原LDS(十二烷基硫酸锂)样品緩冲液合并，在70°C 孵育10分钟，上样到10% NuPAGE Novex Bis/Tris凝胶(英杰生命技术 公司(Invitrogen)， Cat-Nr.: NP0301)上。对蛋白质的分离发生在还原 NuPAGE MES SDS(4-吗啉代乙磺^/十二烷l^克酸钠)运行緩冲液中。为 将蛋白质从SDS/聚丙烯酰胺凝胶电转移，使用标准尼龙膜。在电转移之后， 在50 mM TrisHCl, pH7.5， 150 mM NaCl(TBS, tris緩沖盐水)中洗膜，
在TBS ， l%(w/v)Western封闭试剂(罗氏7>司(Roche), Cat Nr.: U921673001)中于4°C对非特异性结合位点封闭过夜。针对EBNA-1的小 鼠单克隆抗体E8.26(昂科基因公司(Oncogene), Cat Nr.: DP15L)用作为一 抗，其是用TBS， l%(w/v)Western封闭溶液进行了 l:l，OOO稀释的。在 TBS中洗两次以及在补充有0.05%(v/v)Tween-20的TBS(TBST)中洗两次 之后，用偶联过氧化物酶的抗小鼠/抗兔IgG抗体(罗氏公司(Roche)， Cat. No. 1520709)作为二抗，其是用具有l%(w/v)Western封闭溶液的TBS进 行了 1:10,000稀释的。在用TBST洗两次以及用TBS洗三次之后，使用 LumiLightPlus底物溶液(罗氏公司(Roche), Cat. Nr. 12015196001)和 Lumi-Imager Fl分析仪(罗氏分子生物化学公司(Roche Molecular Biochemicals)),通过化学发光来检测结合的过氧化物酶缀合物。 f)对细胞培养物上清液中的重组抗体进行定量
使用人Fc检测试剂盒(CIS生物公司(Cis Bio)， Cat-Nr.: 62HFCPEB), 通过竟争性免疫测定来对细胞培养物上清液中的抗体加以定量。该测定基 于HTI^^技术(均相时间分辨荧光)。简言之，在稀释緩冲液中对样品进行 1:10至1:100的稀释。将50 经稀释的样品与25^1抗人IgG Fc-穴状化合 物(cryptate)和25 pi人IgG-XL665在96孔板OptiPlates(普金艾尔莫公司 (Perkin Elmer), Cat-Nr.: 6005279)中合并。在室温下对测定混合物孵育过 夜。在320 nm激发后，使用Victor 1420分析仪(普金艾尔莫公司 (Perkin-Elmer))，在620 nm和665 nm处测量荧光发射。通过与校准曲线 比较，从665nm/620nm之比推断出抗体浓度。
实施例2
构建表达EBNA-1蛋白质的CHO细胞系
a)构建用于在CHO细胞中表达EBNA-1蛋白质的质粒 pcDNA3—EBNA画l
用限制性核酶Sacl和DraIII切质粒pcDNA3.1(英杰生命技术公司 (Invitrogen)， Cat-Nr.: V790-20),将得到的4715 bp的片段连接到通过退火
寡核苷酸l(SEQ ID NO: 06)和寡核苷酸2(SEQ ID NO: 07)获得的DNA接 头上。用HindIII和DraIII切得到的质粒。将4748 bp的载体片段连接到 编码EBNA-1的HindlII/DralH cDNA片段上，该片段是用pCEP4(英杰生 命技术公司(Invitrogen)， Cat-Nr.: V044-50)作为模板，寡核苷酸3(SEQ ID NO: 08)和寡核苷酸4(SEQ ID NO: 09)作为引物，通过聚合Sl^式反应获得 的。将针对EBNA-1的真核表达质粒命名为pcDNA3—EBNA-l(图1)。 b)用pcDNA3_EBNA-l转染CHO细胞以及选择稳定的转染子 在湿润的温育箱中，于37。C和5% pC02下，在DHI培养基(Schlaeger， E.J.， J. Immunol. Methods 194 (1996) 191-199)中，在旋转瓶(spinner flask) 中，保持对不含血清的悬浮培养物预适应的CHO-DG44细胞。
在转染之前，将细胞以lxl(^个细胞/ml接种进24孔板。按照厂商方 案，使用LipofectAmine 2000(英杰生命才支术/^司(Invitrogen), Cat-Nr.: 11668-027)来进行转染。简言之，在OptiMEM I-培养基(英杰生命技术公 司(Invitrogen), Cat-Nr.: 31985-047)中稀释LipofectAmine 2000和DNA， 以1:3至1:6的照DNA对pi LipofectAmine 2000之比对它们进行合并。 在室温下孵育20分钟后，将混合物加入到细胞中。24小时后，在DHI培 养基中稀释细胞，以300个细胞/孔接种进96孔板。再24小时后，向培养 基中以700照/ml力口入G418。转染后10天，扩展G418抗性菌落，通过 Western印迹杂交(图2a)针对EBNA-1蛋白质的表ii^以分析。将稳定表 达EBNA-1蛋白质的HEK 293细胞(HEK 293 EBNA或HEK 293 E)和未 经转染的CHO-DG44细胞用作为参照。克隆DG-700-IIIE3对于EBNA-1 来说是强阳性的，通过有限稀释对其亚克隆。连续培养EBNA-1阳性亚克 隆DG-700-IIIE3subl ，通过Western印迹杂交检查EBNA-1表达(图2b)。 如图2b所示，EBNA-1蛋白质水平在54天的培养中保持不变。
实施例3
构建携带EBV oriP和针对人单克隆抗IGF-1R抗体的轻链和重链的表 达盒的质粒
通过亚克隆和重叠PCR，将编码抗IGF-1R抗体轻链可变(ViJ区和人 k-轻链恒定(Ct)区的基因片断精确连接，对针对抗IGF-1R抗体可变重链 (VH)区和人yl-重链恒定(CHl-CH2-CH3)区的基因也一样。通过DNA测序验 证编码抗IGF-1R抗体结构基因(k-轻链和yl-重链)的DNA序列，随后将其 插入缺乏或携带有EBV oriP的哺乳动物细胞表达载体中。
HuMab抗-IR18 k-轻链表达载体p4816-pUC-L-IR-18- k -Bsml(p4816) 由下述元件组成
-来自载体pUC18的复制起点，其使得该质粒能在大肠杆菌中复制 (pUC ori)
-B-内酰胺酶基因，其在大肠杆菌中赋予氨节青霉素抗性(Amp) -用于表达抗IGF-lR抗体k-轻链的转录单元，其由下述元件组成 -来自人巨细胞病毒的主要即时早期启动子和增强子(hCMV
IE1)
-合成的S'-UTR，其包括Kozak序列
-鼠免疫球蛋白重链信号序列，其包括信号序列内含子(L1一内含
子—L2)
-克隆的抗IGF-1R抗体可变轻链cDNA，其在5，末端安排有唯 一的Bsm I限制性位点，以及在3'末端安排有剪接供体位点和唯一的Notl 限制性位点(V。
-基因组性的人k-轻链基因恒定区，其包括内含子性的小鼠Ig-k 增强子[Notl一小鼠-Ig-k-增强子-内含子-2一人-内含子-2—C-k
-人k-免疫球蛋白3' UTR，其包括聚腺苷酸化信号序列(3' UTR
C-k)
-分别处于5'和3'末端的唯一限制性位点Sse83711和Fsel,以使
得能将表达盒转入备选的表达质粒。
p4816-pUC-L-IR-18-k-Bsml的质粒图语如图3a)所示。
抗IGF-1R抗体yl-重^^达载体p4817-pUC-H-IR-18-yl-Bsml(p4817)
由下述元件组成
-来自载体pUC18的复制起点，其使得该质粒能在大肠杆菌中复制 (pUC ori)
-B-内酰胺酶基因，其在大肠杆菌中赋予氨爷青霉素抗性(Amp) 誦用于表达抗IGF-lR抗体yl-重链的转录单元，其由下述元件组成 -来自人巨细胞病毒的主要即时早期启动子和增强子(hCMV
IE1)
-合成的5'-UTR，其包括Kozak序列
-鼠免疫球蛋白重链信号序列，其包括信号序列内含子(L^内含
子JL2)
-克隆的抗IGF-1R抗体可变重链cDNA,其在5'末端安排有唯 一的Bsm I限制性位点，以及在3'末端安排有剪接供体位点和唯一的Notl 限制性位点
-基因组性的人yl-重链基因恒定区，其包括小鼠Ig-mu0i)-增强 子[Notl—小鼠-Ig卞-增强子Jmman-内含子-2—CH1-CH2-CH3,其具有间插内 含子
-人yl-免疫球蛋白3'UTR，其包括聚腺苷酸化信号序列 國分别处于5'和3'末端的唯一限制性位点SgrAI和Ascl，以使得 能将表达盒转入备选的表达质粒。
p4817-pUC-L-IR-18-yl-Bsml的质粒图i普如图3b)所示。 通过引入下述两个元件，分别^粒p4817-pUC-H-IR18-yl-Bsml和 p4816-pUC-L-IR18-K陽Bsml获得如图4所示的质津立p4818-pUC-Hyg-OriP-重-IR18画Bsml(p4818)和p4819-pUC國Hyg-OriP画轻誦IR18画Bsml(p4819): -潮霉素抗性基因，其适合用作为真核细胞中的选择标记 -EB病毒的复制起点oriP
p4818-pUC-Hyg-OriP-重誦IR18-Bsml和p4819-pUC-Hyg-OriP誦轻 -IR18-Bsml的质粒图i普如图4a)和图4b)所示。
通过将p站l8的SgrAI/AscI片段(包^yl-重链转录单元)引入p站l9的 SgrAI和Ascl限制性位点，来构建质粒p4821-pUC-Hyg-OriP-IR18-重-轻
-BsmI。得到的质粒含有与p4819相同的元件，包括EBVoriP和针对K-轻 链的转录单元，加上yl-重链转录单元。
p4821-pUC-Hyg-OriP-IR18-重-轻-Bsml的质粒图i普如图5所示。
实施例4
通过EBNA-1 P日性的DG-700-IIIE3subl细胞从携带oriP的质粒生产
抗体
在37。C和5 % C02下，在静置培养中，在ProCH04-CDM(康伯斯公 司(Cambrex)，Cat画Nr.:BE12-029Q)、 2mM谷氨酰胺、2%(v/v)50 x HT补 充物(英杰生命技术公司(Invitrogen)， Cat-Nr.: 41065-012)和300照/ml G418中，对DG-700-IIIE3subl和未经修饰的CHO-DG44型细胞加以保 持。在转染前1小时，通过离心收获细胞，将其以0.5 x 106个细胞/1111重 新悬浮于DHI培养基(Schlaeger， E.J.， J. Immunol. Methods 194 (1996) 191-199)中。
<吏用LipofectAmine 2000(英杰生命才支术7>司(Invitrogen)， Cat國Nr.: 11668-027)来进行转染。为转染1 ml体积的培养物，合并下述组分200 pl OptiMEM I(英杰生命技术公司(Invitrogen)， Cat画Nr.: 31985-047)、 2照 DNA和6plLipofectAmine。在室温下孵育5至30分钟后，将混合物加入 细胞。转染后5-10天，收集细胞培养物上清液，按照实施例lf)所述针对 抗体浓度对其加以测试。
已将三组不同的质粒转染进了 CHO-DG44细胞系或表达EBNA-1的 源自CHO-DG44的细胞系DG-700-IIIE3subl。将用于表达抗体轻链的质 粒p4816与用于表达抗体重链的p4817共转染。两种质粒都缺乏EBV oriP。 将用于表达抗体轻链的质粒p4819与用于表达抗体重链的p4818共转染。 两种质粒都携带有EBVoriP。最后，单独转染用于表达抗体轻链和重链的 质粒p4821。质粒p4821携带有EBVoriP。
如图6所示，在EBNA-1阳性的DG-700-IIIE3subl细胞中转染携带 有oriP的质粒p4818和p4819导致抗体表达较之向相同细胞系或向
EBNA-1阴性的CHO-DG44细胞中转染没有oriP的p4816和p4817而言 增加2至3倍。当针对抗体轻链和重链的表达盒組合于携带oriP的单个质 粒(例如p4821)中时，DG-700-IIIE3subl细胞中的抗体表达甚至更强。相 反，携带oriP的质粒p4817/p4818和p4821在EBNA-1阴性的CHO-DG44 细胞中不产生增加的抗体表达水平。结果，当携带oriP的质粒转染进 EBNA-1阳性的CHO细胞中时，获得了免疫球蛋白的最大表达。
权利要求
1.啮齿动物细胞，其特征在于所述啮齿动物细胞a)表达EB病毒核抗原1(EBNA-1)；b)含有附加体，其中，所述附加体包含i)原核复制起点；ii)选择标记；iii)EB病毒(EBV)复制起点(oriP)；iv)适于在所述啮齿动物细胞中表达异源多肽的表达盒，其中，所述表达盒包含启动子序列、5′非翻译区域、编码所述异源多肽的核酸序列以及包含聚腺苷酸化信号的3′非翻译区域。
2. 获得啮齿动物细胞的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤a) 提供啮齿动物细胞；b) 提供下述质粒，所述质粒包含(i) 原核复制起点；(ii) 选择标记；(iii) 针对EB病毒核抗原l(EBNA-l)的功能性表达盒，其中，所述表 达盒包含启动子序列、5'非翻译区域、编码EBNA-1的核酸序列以及包含 聚腺苷酸化信号的3啡翻译序列；c) 将所述质粒b)引入所述啮齿动物细胞a)，以及选择经稳定转化的啮 齿动物细胞；d) 提供一个至四个下述另一质粒，所述质粒包含(i) 原核复制起点；(ii) 选择标记；(iii) EB病毒(EBV)复制起点(oriP);(iv) 适于在所述经转化的啮齿动物细胞中表达异源多肽的表达盒，其 中，所a达盒包含启动子序列、5'非翻译区域、编码异源多肽的核^ 列和具有聚腺苷酸化信号的3'非翻译区域；e)将所述另一质粒d)引入所述经稳定转化的啮齿动物细胞。
3. 生产异源多肽的方法，其特征在于，所述方法包括a) 提供根据权利要求1的啮齿动物细胞；b) 在适于表达所述异源多肽的条件下培养所述啮齿动物细胞；c) 从培养物中回收所述多肽。
4. 用于生产根据权利要求l的啮齿动物细胞的试剂盒，其特征在于， 所述试剂盒包含a) 啮齿动物细胞；b) 第一质粒，其包含 ①原核复制起点；(ii) 选择标记；(iii) 针对EB病毒核抗原l(EBNA-l)的功能性表达盒，其中，所述表 达盒包含启动子序列、5'非翻译区域、编码EBNA-1的核酸序列以及包含 聚腺苷酸化信号的3'非翻译区域；c) 第二质粒，其包含(i) 原核复制起点；(ii) 选择标记；(iii) EB病毒(EBV)复制起点(oriP);(iv) 适于在所述啮齿动物细胞中表达异源多肽的表达盒，其中，所述 表达盒包含启动子序列、5，非翻译区域、用于引入核酸序列的克隆位点和 包含聚腺苷酸化信号的3'非翻译区域。
5. 根据权利要求2至3中任意一项的方法，其特征在于，所述异源多 肽选自前药、酶、酶片段、酶抑制剂、酶激活剂、生物活性多肽、刺猬蛋 白质、骨形态发生蛋白、生长因子、促红细胞生成素、血小板生成素、G-CSF、 白细胞介素、干扰素、免疫球蛋白或免疫球蛋白片段。
6. 在啮齿动物细胞中表达异源多肽的方法，其特征在于，所述方法包括a)提供经编码EBNA-1蛋白质的结构基因稳定转染的啮齿动物细胞，b) 用包含EB病毒(EBV)复制起点(oriP)的表达质粒转染所述啮齿动物 细胞，c) 在适于表达所述异源多肽的条件下培养所述经转染的细胞，d) 从培养物中回收所述异源多肽。
7. 根据权利要求2至3和5至6中任意一项的方法，其特征在于，所 述异源多肽是分泌的异源多肽。
8. 根据权利要求2至3和5至7中任意一项的方法，其特征在于，所 ii^达质粒不包含编码所述EBNA-l蛋白质的结构基因。
9. 根据权利要求2至3和5至8中任意一项的方法，其特征在于，所 述培养在瞬时转染下进行。
10. 根据权利要求2至3和5至9中任意一项的方法，其特征在于， 所述啮齿动物细胞是CHO细胞。
11. 根据权利要求10的方法，其特征在于，所述CHO细胞选自 CHO-DBX11细胞、CHO-K1细胞、CHO-DG44细胞和表达EBNA-1的 CHO细胞。
全文摘要
本发明描述了用于在啮齿动物细胞中表达异源多肽的方法。所述方法包括EB病毒(EBV)的oriP/EBNA-1游离型复制和保持系统。随着EBNA-1蛋白质表达盒在启动子控制下稳定整合进啮齿动物细胞的基因组，在细胞中获得EBNA-1蛋白质的表达。异源蛋白质从包含EBV复制起点和所述异源蛋白质的功能性表达盒的附加体表达。本发明还包含经转化的啮齿动物细胞系、在所述细胞系中生产异源蛋白质的方法以及用于构建所述细胞系的试剂盒。
文档编号C12N15/869GK101341252SQ200680040367
公开日2009年1月7日 申请日期2006年10月26日 优先权日2005年10月28日
发明者E·科佩特茨基, U·格普费特 申请人:弗·哈夫曼-拉罗切有限公司