脆茎2基因家族和相关方法及用途的制作方法

专利名称：：脆茎2基因家族和相关方法及用途的制作方法
技术领域：
：发明领域涉及植物分子生物学，尤其是脆茎2-样(BRITTLESTALK.2-Like)基因，脆茎2-样多肽，和其用途。
背景技术：
：植物初生生长主要由细胞的增大驱动，后者通过初生细胞壁对细胞内膨压的不可逆产生来实现。尽管需要细胞分裂来产生新细胞，由这些细胞的扩充导致的生长不仅仅源自它们的分裂。包埋入半纤维素基质中的纤维素微纤维和细胞壁中的木质素，是抗张强度的主要决定因素(Appenzeller等人,Ce〃w/騰11:287-299(2004))。细胞通常沿着垂直于微纤维方向的轴扩充。例如，微纤维的辐射状沉积有助于细胞沿着纵轴的扩充。次生壁与初生壁的不同之处在于，它富含纤维素和木质素，且它的沉积开始于细胞扩充的结束。初生细胞壁合成的调控已经应用于改变植物的生长速率和大小(高度)，而次生壁的调控可以用于提高生物质积累和组织强度(Appenzeller等人，Ce〃w/^e11:287-299(2004))。纤维素通常是成熟植物细胞的主要壁成分，形成营养组织。通过形成链间和链内氩键而使能量最小化导致的纤维素类结晶结构使它成为以密度为基础已知的机械上最强的有机分子之一。然后自然地，纤维素是结构组织强度的主要决定因素。植物机械强度是最重要的农学特性之一。已经分离和表征了茎强度缺陷型植物突变体。首先基于秆的物理性质，描述了大麦脆秆(bc)突变体，与野生型植物相比，它具有纤维素量的80%减少和断裂强度的2倍减少(Kokubo等人，尸/"W尸/^wo/.97:509-514(1991))。稻脆秆/(6c/)突变体表现出细胞壁厚度和纤维素含量的减少(Qian等人，C/Uw〃.46:2082-2085(2001))。Li等人描述了稻應差/(BC/)的鉴别，其是编码COBRA-样蛋白的基因(77^尸/"^Ce〃15(9):2020-2031(2003))。它们的发现表明，BC/在调节次生细l包壁的生物合成中起作用，以提供稻植物的主要机械强度。玉米應差2fM2)突变体的茎表现出比它们的野生型副本显著降低的机械强度(Langham,A^、仏14:21-22(1940))。玉米突变体具有非常脆的且容易断裂的茎和叶子。突变体茎缺少的主要化学成分是纤维素。因此，茎机械强度似乎主要依赖于穗下单位长度的茎中纤维素的量。此外，编码纤维素合酶催化亚基(CeM)的基因已经认为涉及细胞壁合成，且由植物中的一个大家族代表。完全基因组测序后在薦孚齐中鉴别出了IO种基因，通过EST测序已经从玉米分离出12种基因(美国专利号6,803,498和6,930,225)。已经才艮道，来自各鼠耳芥和玉米的3种CesA基因会产生次生壁，而剩余的显然产生初生壁(Taylor等人，尸rac.Ato/.爿c^/.U.S.A.100:1450-1455(2003))。来自鼠耳芥的3种CesA基因中的突变，导致茎-样梗萎陷的木质部和降低的机械强度。当来自稻的相关CeM基因突变时，秆变脆，这指示着这些基因在次生壁形成中的作用。在每种情况下，降低的机械强度与减少的纤维素含量相关。一般而言，参与初生壁形成的Ce"基因的突变会造成严重的表型改变，而次生壁-形成基因的突变不会象它们影响机械强度那样大地改变外观表型(Appenzeller等人，Ce〃w/o"11:287-299(2004))。由于不足的茎强度是玉米育种的主要问题，希望提供操控细胞壁中的纤维素浓度、从而改变植物茎强度和/或提高的站立性的植物品质或青贮饲料品质的组合物和方法
发明内容本发明包括在一个实施方案中，包括分离的多核普酸，其包含(a)编码与茎机械强度有关的多肽的核苷酸序列，其中基于ClustalV比对方法，与SEQIDNO:16或18比较，所述多肽的氨基酸序列具有至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性，或80%和100%之间的任意整数，或(b)该核苷酸序列的互补序列，其中所述互补序列和核苷酸序列由相同数目的核苷酸组成，且是100%互补。在另一个实施方案中，包括改变(优选增加)植物茎机械强度的方法，其包含(a)向可再生的才直物细月包中导入重组DNA构建体，以生成转化的植物细胞，所述重组DNA构建体包含在植物中有功能的启动子，该启动子可搡作地连接到(i)多核苷酸，其编码基于ClustalV比对方法，与SEQIDNO:4,6,8，10,12,14,16,和18比较，氨基酸序列具有至少80。/。序列同一性的多肽，或(b)上述(a)(i)所述多核苷酸的全长互补序列；和(b)从所述转化的植物细胞再生转基因植物，其中所述转基因植物在它的基因组中包含所述重组DNA构建体，且其中与不包含所述重组DNA构建体的对照植物相比，所述转基因植物表现出茎机械强度的改变(优选增加)。该方法还可以包含，(c)获取源自所述转基因植物的后代植物，其中所述后代植物在它的基因组中包含该重组DNA构建体。在另一个实施方案中，包括评价植物茎机械强度的方法，其包含(a)向可再生的植物细胞中导入重组DNA构建体，以生成转化的植物细胞，所述重组DNA构建体包含在植物中有功能的启动子，该启动子可操作地连接到(i)多核苷酸，其编码基于ClustalV比对方法，与SEQIDNO:4,6,8,10，12,14，16,和18比4支，氨基酸序列具有至少80%序列同一性的多肽，或(b)上述(a)(i)所述多核苷酸的全长互补序列；(b)从所述转化的植物细胞再生转基因植物；和(c)评价所述转基因植物的茎机械强度。该方法还可以包含，(d)获取源自所述转基因植物的后代植物；和(e)评价所述后代植物的茎机械强度。在另一个实施方案中，包括评价植物茎机械强度的方法，其包含(a)向可再生的植物细胞中导入重组DNA构建体，以生成转化的植物细胞，所述重组DNA构建体包含在植物中有功能的启动子，该启动子可操作地连接到(i)多核苦酸，其编码基于ClustalV比对方法，与SEQIDNO:4,6，8,10,12,14,16,和18比4交，氨基酸序列具有至少80%序列同一性的多肽，或(b)上述(a)(i)所述多核普酸的全长互补序列；(b)从所述转化的植物细胞再生转基因植物；(c)获取源自所述转基因植物的后代植物；和(d)评价所述后代植物的茎机械强度。本发明也包括在一个实施方案中，包括一种植物，在它的基因组中包含(a)第一种重组DNA构建体，其包含至少一个在植物中有功能的启动子，该启动子可操作地连接到至少一个选自下组的第一种分离的多核苷酸(i)多核普酸，其编码基于ClustalV比对方法，与SEQIDNO:2,4，6,8,10,12，14,16,和18比4支，氨基酸序列、具有至少80%序列同一性的多肽；(ii)多核苷酸，其核酸序列基于ClustalV比对方法，与SEQIDNO:1,3,5,7,9,11,13,15，和17比较，具有至少60%序列同一性；和(iii)上述(a)(i)或(a)(ii)的多核苷酸的全长互补序列；和(b)第二种重组DNA构建体，其包含至少一个在植物中有功能的启动子，该启动子可操作地连接到至少一个选自下组的第二种分离的多核苷酸(iv)多核苦酸，其编码基于ClustalV比对方法，与SEQIDNO:20，22,24,26,28，30，32，34,36,38,40，和42比较，氨基酸序列具有至少80%序列同一性的多肽；(v)多核苷酸，其核酸序列基于ClustalV比对方法，与SEQIDNO:21,23，25,27,29,31，33，35,37,39，和41比4支，具有至少60%序列同一性；和(vi)上述(b)(iv)或(b)(v)的多核苷酸的全长互补序列。在另一个实施方案中，包括一种植物，在它的基因组中包含至少一个调节序列，该调节序列可操作地连接到(a)至少一个选自下组的分离的多核苷酸(i)多核苷酸，其编码基于ClustalV比对方法，与SEQIDNO:2，4,6,8，10,12,14,16,和18比4交，氨基酸序列具有至少80%序列同一性的多肽；(ii)多核苷酸，其核酸序列基于ClustalV比对方法，与SEQIDNO:1，3,5,7,9,11,13,15,和17比4支，具有至少60%序列同一性；和(iii)上述(a)(i)或(a)(ii)的多核苷酸的全长互补序列；和(b)至少一个选自下组的分离的多核苷酸(i)多核苷酸，其编码基于ClustalV比对方法，与SEQIDNO:20,22，24,26，28,30,32,34,36,38,40，和42比较，氨基酸序列具有至少80%序列同一性的多肽；(ii)多核苷酸，其核酸序列基于ClustalV比对方法，与SEQIDNO:21,23,25,27,29，31,33,35,37,39,和41比较，具有至少60%序列同一性；和(iii)上述(b)(i)或(b)(ii)的多核苷酸的全长互补序列，其中与不包含所述至少一个可操作地连接到所述(a)和(b)上的调节序列的对照植物相比，所述植物表现出增加的细胞壁纤维素含量或增加的生长速率。在另一个实施方案中，包括一种植物，在它的基因组中包含抑制DNA构建体，该构建体包含在植物中有功能的启动子，该启动子可操作地连接到(a)以下核酸序列的全部或部分(i)核酸序列，其编码基于ClustalV比对方法，与SEQIDNO:2,4,6,8,10，12,14，16,和18比较，氨基酸序列具有至少50%序列同一性、或从51%至最高达(且包括)100%的任意整数序列同一性的多肽，或(ii)上述(a)(i)的核酸序列的全长互补序列；或(b)源自目标靶基因的全部或部分有义链或反义链的区域，所述区域的核酸序列基于ClustalV比对方法，与得到所述区域的全部或部分有义链或反义链比较，具有至少50%序列同一性、或从51%至最高达(且包括)100%的任意整数序列同一性，且其中所述目标草巴基因编码选自Bk2、Bk2Ll、Bk2L3、Bk2L4、Bk2L5、Bk2L6、Bk2L7、Bk2L8和Bk2L9的多肽，其中与不包含所述抑制DNA构建体的对照植物相比，所述植物表现出降低的茎机械强度。在另一个实施方案中，包括一种植物，在它的基因组中包含抑制DNA构建体，该构建体包含在植物中有功能的启动子，该启动子可操作地连接到(a)以下核酸序列的全部或部分(i)核酸序列，其编码基于ClustalV比对方法，与SEQIDNO:6比4交，氨基酸序列具有至少50%序列同一性、或从51%至最高达(且包括)100%的任意整数序列同一性的多肽，或(ii)上述(a)(i)的核酸序列的全长互补序列；或(b)源自目标耙基因的全部或部分有义链或反义链的区域，所述区域的核酸序列基于ClustalV比对方法，与得到所述区域的全部或部分有义链或反义链比较，具有至少50%序列同一性、或从51%至最高达(且包括)100%的任意整数序列同一性，且其中所述目标輩巴基因编码Bk2L3多肽，其中与不包含所述抑制DNA构建体的对照植物相比，所述植物表现出降低的植物高度和/或减小的器官大小。在另一个实施方案中，包括一种植物，在它的基因组中包含抑制DNA构建体，该构建体包含在植物中有功能的启动子，该启动子可操作地连接到(a)以下核酸序列的全部或部分(i)核酸序列，其编码基于ClustalV比对方法，与SEQIDNO:10比4交，氨基酸序列具有至少50%序列同一性、或从51%至最高达(且包括)100%的任意整数序列同一性的多肽，或(ii)上述(a)(i)的核酸序列的全长互补序列；或(b)源自目标耙基因的全部或部分有义链或反义链的区域，所述区域的核酸序列基于ClustalV比对方法，与得到所述区域的全部或部分有义链或反义链比较，具有至少50%序列同一性、或从51%至最高达(且包括)100%的任意整数序列同一性，且其中所述目标耙基因编码Bk2L5多肽，其中与不包含所述抑制DNA构建体的对照植物相比，所述植物表现出雄性不育。附图和序列表简述从构成本申请的一部分的下述详述、附图和序列表，可以更充分地理解本发明。图1A-1F显示了SEQIDNO:2,4,6,8,10，12，14,16和18所述Bk2和Bk2-样蛋白的氨基酸序列的ClustalV比对，其中使用缺省参数。图2显示的图表对比了图1A-1F所示的9个氨基酸序列之间的同一性百分比(和下半三角中的趋异性百分比)，其中使用ClustalV比对方法。图3显示了基因5A:2的SolexaMPSS基因表达分析。图4显示了SW基因与CesA基因家族成员之间表达才莫式的关联。图5A-5B显示了从SolexaMPSStm研究得到的来自玉米的所有不同和基因的表达水平之间的关耳关。图6显示了来自玉米的Bk2L蛋白、来自稻的BC1L蛋白和来自鼠耳芥的COBL蛋白(NCBI登记号在括号中)的种系发生分析。沿着分支的数字是启发式检索5,000个重复得到的自引导值。仅显示了得到>50%时间支持的单系组的自引导值。分支长度与推断的氨基酸差异成比例。SEQIDNO:1是1784碱基对核芬酸序列，其含有来自玉米的應,2(^:2)基因的可读框(ORF)(核苦酸89-1438),后者在该ORF区的5'(核苦酸l-88)和3'(核苦酸1439-1784)侧接额外的不翻译区(UTR)。SEQIDNO:2是源自SEQIDNO:1所述核苷酸序列的ORF的玉米脆茎2(Bk2)多肽的推导的氨基酸序列。SEQIDNO:3是3152石咸基对核苦酸序列，其含有来自玉米的應差2-(ByU丄/)基因的ORF(核苷酸586-2586)，后者在该ORF区的5，(核苷酸l-585)和3，(核苷酸2587-3152)侧接额外的UTR区。SEQIDNO:4是源自SEQIDNO:3所述核苦酸序列的ORF的玉米脆茎2-样1(Bk2Ll)多肽的推导的氨基酸序列。SEQIDNO:5是2094碱基对核苷酸序列，其含有来自玉米的處基因的ORF(核苦酸281-1624),后者在该ORF区的5'(核苦酸l-280)和3'(核苦酸1625-2094)侧接额外的UTR区。SEQIDNO:6是源自SEQIDNO:5所述核苷酸序列的ORF的玉米脆茎2-样3(Bk2L3)多肽的推导的氨基酸序列。SEQIDNO:7是2102碱基对核苷酸序列，其含有来自玉米的應差2-yf4(^:2L力基因的ORF(核苦酸326-1672),后者在该ORF区的5'(核香酸l-325)和3'(核芬酸1673-2102)侧接额外的UTR区。SEQIDNO:8是源自SEQIDNO:7所述核苦酸序列的ORF的玉米脆茎2-样4(Bk2L4)多肽的推导的氨基酸序列。SEQIDNO:9是2422碱基对核苷酸序列，其含有来自玉米的應差2-举5CSWZJ)基因的ORF(核苷酸"6-r49),后者在该ORF区的5，(核苷酸l-215)和3，(核香酸2250-2422)侧接额外的UTR区。SEQIDNO:10是源自SEQIDNO:9所述核苷酸序列的ORF的玉米脆茎2-样5(Bk2L5)的推导的氨基酸序列。SEQIDNO:11是1845石咸基对核苦酸序列，其含有来自玉米的麂差2-(5(^t2L6)基因的ORF(核苷酸184-1563)，后者在该ORF区的5'(核普酸l-183)和3，(核苷酸1564-1845)侧接额外的UTR区。SEQIDNO:12是源自SEQIDNO:11所述核苦酸序列的ORF的玉米脆茎2-样6(Bk2L6)多肽的推导的氨基酸序列。SEQIDNO:13是1644碱基对核苷酸序列，其含有来自玉米的應差2-7(^:ZL7)基因的ORF(核苦酸85-1425),后者在该ORF区的5，(核苷酸l-84)和3，(核苦酸1426-1644)侧接额外的UTR区。SEQIDNO:14是源自SEQIDNO:13所述核苷酸序列的ORF的玉米脆茎2-样7(Bk2L7)多肽的推导的氨基酸序列。SEQIDNO:15是2108石咸基对核普酸序列，其含有来自玉米的應差2-^^S(^:2L8)基因的ORF(核苷酸144-2105),后者在该ORF区的5，(核苷酸l-143)和3'(核苦酸2106-2108)侧接额外的UTR区。SEQIDNO:16是源自SEQIDNO:15所述核苷酸序列的ORF的玉米脆茎2-样8(Bk2L8)多肽的推导的氨基酸序列。SEQIDNO:17是1335石咸基对核苷酸序列，其含有来自玉米的應差2-#9(BA2/^)基因的ORF(核苦酸1-1332)，后者在该ORF区的5，(核苦酸0)和3'(核苦酸1963-1965)侧4妻额外的UTR区。SEQIDNO:18是源自SEQIDNO:17所述核苷酸序列的ORF的玉米脆茎2-样9(Bk2L9)多肽的推导的氨基酸序列。SEQIDNO:19是3780碱基对核苷酸序列，其含有来自玉米的CeW/基因的ORF(核苷酸201-3428),后者在该ORF区的5，(核苷酸l-200)和3，(核苦酸3429-3780)侧接额外的UTR区。SEQIDNO:20是源自SEQIDNO:19所述核苷酸序列的ORF的玉米CesAl多肽的推导的氨基酸序列。SEQIDNO:21是3725碱基对核苦酸序列，其含有来自玉米的CeM2基因的ORF(核苷酸179-3403),后者在该ORF区的5，(核苷酸l-178)和3'(核苷酸3404-3725)侧接额外的UTR区。SEQIDNO:22是源自SEQIDNO:21所述核苷酸序列的ORF的玉米CesA2多肽的推导的氨基酸序列。SEQIDNO:23是2830石咸基对核苷酸序列，其含有来自玉米的CeW3基因的ORF(核苷酸3-2468)，后者在该ORF区的5，(核苷酸1-2)和3，(核苷酸2469-2830)侧接额外的UTR区。SEQIDNO:24是源自SEQIDNO:23所述核苷酸序列的ORF的玉米CesA3多肽的推导的氨基酸序列。SEQIDNO:25是3773碱基对核苷酸序列，其含有来自玉米的C^y^基因的ORF(核香酸338-3571),后者在该ORF区的5，(核苷酸l-337)和3'(核苦酸3572-3773)侧接额外的UTR区。SEQIDNO:26是源自SEQIDNO:25所述核苦酸序列的ORF的玉米CesA4多肽的推导的氨基酸序列。SEQIDNO:27是3704碱基对核苷酸序列，其含有来自玉米的基因的ORF(核苦酸272-3502),后者在该ORF区的5，(核苷酸l-271)和3，(核苦酸3503-3704)侧接额外的UTR区。SEQIDNO:28是源自SEQIDNO:27所述核苦酸序列的ORF的玉米CesA5多肽的推导的氨基酸序列。SEQIDNO:29是3568碱基对核苷酸序列，其含有来自玉米的CeW6基因的ORF(核苦酸63-3242),后者在该ORF区的5，(核苷酸l-62)和3，(核苷酸3243-3568)侧接额外的UTR区。SEQIDNO:30是源自SEQIDNO:29所述核普酸序列的ORF的玉米CesA6多肽的推导的氨基酸序列。SEQIDNO:31是3969碱基对核苷酸序列，其含有来自玉米的Ce"7基因的ORF(核苷酸144-3404),后者在该ORF区的5，(核苷酸l-143)和3'(核苷酸3405)侧接额外的UTR区。SEQIDNO:32是源自SEQIDNO:31所述核苷酸序列的ORF的玉米CesA7多肽的推导的氨基酸序列。SEQIDNO:33是3813碱基对核苷酸序列，其含有来自玉米的基因的ORF(核苷酸215-3499)，后者在该ORF区的5，(核苷酸1國214)和3，(核苦酸3500-3813)侧接额外的UTR区。SEQIDNO:34是源自SEQIDNO:33所述核苷酸序列的ORF的玉米CesA8多肽的推导的氨基酸序列。SEQIDNO:35是3799碱基对核苷酸序列，其含有来自玉米的CeM9基因的ORF(核苦酸238-3477),后者在该ORF区的5，(核苦酸l-237)和3，(核苦酸3478-3799)侧接额外的UTR区。SEQIDNO:36是源自SEQIDNO:35所述核苦酸序列的ORF的玉米CesA9多肽的推导的氨基酸序列。SEQIDNO:37是3470碱基对核苷酸序列，其含有来自玉米的ORF(核苦酸29_3265),后者在该ORF区的5，(核苦酸l-28)和3，(核苷酸3266-3470)侧接额外的UTR区。SEQIDNO:38是源自SEQIDNO:37所述核普酸序列的ORF的玉米CesA10多肽的推导的氨基酸序列。SEQIDNO:39是3231碱基对核苷酸序列，其含有来自玉米的CeWW基因的ORF(核苷酸21-3044),后者在该ORF区的5'(核香酸l-20)和3，(核苦酸3045-3231)側接额外的UTR区。SEQIDNO:40是源自SEQIDNO:39所述核苦酸序列的ORF的玉米CesAll多肽的推导的氨基酸序列。SEQIDNO:41是3028碱基对核苷酸序列，其含有来自玉米的CeW"基因的ORF(核苷酸52-2835)，后者在该ORF区的5，(核苷酸l-51)和3，(核苷酸2836-3028)侧接额外的UTR区。SEQIDNO:42是源自SEQIDNO:41所述核苷酸序列的ORF的玉米CesA12多肽的推导的氨基酸序列。序列表含有核苷酸序列字符的单字母代码和氨基酸的3字母代码，它们的定义与在本文中引作参考的Wwc/"c13:3021-3030(1985)和B,oc/ze肪c"/J.219(2):345-373(1984)所述的IUPAC-IUBMB标准相一致。为核苷酸和氨基酸序列数据使用的标识和格式符合在37C.F.R.§1.822中所述的规则。序列描述和所附序列表符合37C.F.R.§1.821-1.825所述关于专利申请的核苷酸和/或氨基酸序列7>开的规则。发明详述在本申请中引用的所有专利、专利申请和出版物，都特此整体引作参考。如在本说明书和所附权利要求书中所使用的，单数形式"一种"、"一个，，和"该"包括复数对象，除非上下文清楚地作出相反说明。因而，例如，"一种植物"包括多种这样的植物，"一个细胞"包括1个或多个细胞和本领域技术人员已知的其等同方案，依此类推。在本说明书的上下文中，将使用许多术语。"转基因的"包括其基因组已经因为存在异源核酸而改变的任意细胞、细胞系、愈伤组织、组织、植物部分或植物，所述异源核酸例如重组DNA构建体，包括最初这样改变的那些转基因植物以及从最初的转基因植物有性杂交或无性繁殖建立的那些。本文使用的术语"转基因的，，不包括通过常规植物育种方法或通过天然存在的事件对基因组(染色体的或染色体外)的改变，所述天然存在的事件例如随机的异体受精，非重组病毒感染，非重组细菌转化，非重组转座，或自发突变。当应用于植物细胞时，"基因组"不仅包括在核内发现的染色体DNA，而且包括在细胞的亚细胞组分(例如，线粒体，质体)内发现的细胞器DNA。"植物"包括完整植物、植物器官、植物组织、种子和植物细胞和它们的后代。植物细胞包括、但不限于，来自种子，悬浮培养物，胚，分生组织区域，愈伤组织，叶，根，芽，配子体，孢子体，花粉，和小孢子的细胞。"后代"包含植物的任意后续世代。"转基因植物"包括在基因组内包含异源多核苷酸的植物。优选地，所述异源多核苷酸稳定整合入基因组中，使得该多核苷酸传递连续世代。所述异源多核苷酸可以单独地或作为重组DNA构建体的一部分整合入基因组中。"异源"序列是指源自外来物种的序列，或者，如果来自相同物种，通过故意的人工干预组成和/或基因组基因座从它的天然形式显著修饰。"多核苷酸"，"核酸序列"，"核苷酸序列"，或"核酸片段"可互换使用，是单链或双链RNA或DNA的聚合物，其任选地含有合成的、非天然的或改变的核苦酸碱基。核苷酸(通常以它们的5'-单磷酸形式存在)用如下的单字母命名来表示"A"表示腺苷酸或脱氧腺苷酸(分别对于RNA或DNA)，"C"表示胞苦酸或脱氧胞苷酸，"G"表示鸟苷酸或脱氧鸟苷酸，"U"表示尿苷酸，"T"表示脱氧胸苷酸，"R"表示噤呤(A或G),"Y，，表示嘧啶(C或T)，"K，，表示G或T，"H"表示A或C或T,'T，表示肌苦，且"N"表示任意核苷酸。"多肽"，"肽"，"氨基酸序列，，和"蛋白"在本文中可互换使用，是指氨基酸残基的聚合物。该术语应用于氨基酸聚合物，其中的一个或多个氨基酸残基是对应的天然存在的氨基酸的人工化学类似物，也应用于天然存在的氨基酸聚合物。术语"多肽"，"肽"，"氨基酸序列"，和"蛋白"也包括修饰，包括、但不限于，糖基化，脂质结合，硫酸化，谷氨酸残基的y-羧基化，羟基化和ADP-核糖基化。"信使RNA(mRNA)，，指没有内含子、且可以被细胞翻译成蛋白的RNA。"cDNA"是指与mRNA模板互补且使用反转录酶从mRNA模板合成的DNA。cDNA可以是单链的，或可以使用DNA聚合酶I的克列诺片段转化成双链形式。"成熟的，，蛋白指翻译后加工的多肽；即厂&舌狄其中去除最初翻译产物中存在的任意前肽或肽原的多肽。"前体"蛋白指mRNA翻译的最初产物；即，前肽和肽原仍然存在。前肽和肽原可以是，^旦不限于，细胞内定位信号。"分离的，，指以下材料，例如核酸分子和/或蛋白，其基本上不含有或去除了在天然存在的环境中通常伴随该材料或与该材料相互作用的组分。分离的多核苷酸可以从它们天然存在的宿主细胞纯化而来。可以使用技术人员已知的常规核酸纯化方法，来获得分离的多核苷酸。该术语也包括重组多核苦酸和化学合成的多核普酸。"重组"指2个原本是分开的序列区段的人工组合，例如，通过化学合成或通过遗传工程技术操纵分离的核酸区段。"重组"也包括已经通过导入异源核酸而修饰的细胞或载体，或源自这样修饰的细胞的细胞，但是不包括通过天然存在的事件(例如，自发突变，天然转化/转导/转座)对细胞或载体的改变，例如不经故意的人工干预而产生的那些。"重组DNA构建体"是指天然通常不会一起发现的核酸片段的组合。因此，重组DNA构建体可以包含源自不同来源的调节序列和编码序列，或源自相同来源的调节序列和编码序列，但是以不同于天然通常发现的方式排列。"调节序列"是指位于编码序列的上游(5'非编码序列)、内部或下游(3'非编码序列)的核苦酸序列，其会影响相关的编码序列的转录、RNA加工或稳定性或翻译。调节序列可以包括、但不限于，启动子，翻译先导序列，内含子，和聚腺苷酸化识别序列。"启动子"是指能控制另一个核酸片段的转录的核酸片段。"在植物中有功能的启动子"是能控制植物细胞中的转录的启动子，无论它的起源是否来自植物细胞。"可操作地连接的"指单个片段中核酸片段的締合，使得一个片段的功能受到其它片段的调节。例如，当能调节核酸片段的转录时，启动子与该核酸片段可操作地连接。"表达，，指功能产物的生成。例如，核酸片段的表达可以指核酸片段的转录(例如，产生mRNA或功能性RNA的转录)和/或mRNA翻译为前体或成熟蛋白。"表型"是指细胞或生物体的可检测的特征。在将核酸片l殳(例如，重组DNA构建体)插入细胞中的上下文中，"导入"指"转染"或"转化"或"转导"，包括核酸片段向真核或原核细胞中的掺入，其中所述核酸片段可以掺入细胞的基因组(例如，染色体，质粒，质体或线粒体的DNA)中，转化成自主复制子，或瞬时表达(例如，转染的mRNA)。"转化的细胞"是其中已经导入了核酸片段(例如，重组DNA构建体)的任意细胞。本文使用的"转化"指稳定转化和瞬时转化。"稳定转化"指核酸片段向宿主生物体基因组中的导入，导致遗传上稳定的遗传。一旦稳定转化，将核酸片段稳定整合入宿主生物体和任意后代的基因组中。"瞬时转化"是指核酸片段向宿主生物体的细胞核、或含有DNA的细胞器中的导入，导致没有遗传上稳定的遗传的基因表达。"等位基因，，是占据染色体上的特定基因座的基因的几种替代形式之一。基因的不同等位基因的DNA序列不同。当在二倍体植物的一对同源染色体上的特定基因座处存在的等位基因相同时，该植物在该基因座处是纯合的。如果在二倍体植物的一对同源染色体上的特定基因座处存在的等位基因不同，该植物在该基因座处是杂合的。如果转基因存在于二倍体植物的一对同源染色体之一上，该植物在该基因座处是半合的。"重叠群"是指从2个或多个组分核香酸序列组装而成的核苷酸序列，所述组分核苦酸序列具有序列同源性的共同或重叠区。例如，可以对比和比对2个或多个核酸片段的核苷酸序列，以便鉴别共同的或重叠的序列。当共同的或重叠的序列存在于2个或多个核酸片革殳之间列。。、、、、、-、、，、、-、"密码子简并"指遗传密码的趋异，其允许核苷酸序列的变化，而不影响编码的多肽的氨基酸序列。因此，本发明涉及包含核苷酸序列的任意核酸片段，所述核苷酸序列编码本文所述氨基酸序列的所有或主要部分。技术人员熟知特定宿主细胞在使用核苷酸密码子以指定特定氨基酸中表现出的"密码子偏爱"。因此，当合成核酸片段来提高宿主细胞中的表达时，希望设计核酸片段，使得它的密码子选择的频率接近宿主细胞的优选密码子选择的频率。"合成的核酸片段"可以使用本领域技术人员已知的方法，从化学合成的寡核苷酸基本单位组装而来。连接并退火这些基本单位，以形成更大的核酸片段，它们然后可以酶法组装，以构建整个目标核酸片段。与核酸片段有关的"化学合成的"是指，体外组装组分核苷酸。使用充分确立的方法，可以实现核酸片段的手工化学合成，或使用众多商业上可得到的机器之一，可以进行自动化的化学合成。因此，基于核苷酸序列的优化，可以为最佳基因表达定制核酸片段，以反映宿主细胞的密码子偏爱。如果密码子选择偏向宿主偏好的那些密码子，技术人员知道成功的基因表达的可能性。优选密码子的确定可以基于基因的调查，所述基因源自可得到序列信息的宿主细胞。术语"扩增"是指，使用至少一个核酸序列作为^t板，构建核酸序列的多个拷贝或与核酸序列互补的多个拷贝。扩增系统包括聚合酶链式反应(PCR)系统，连接酶链式反应(LCR)系统，基于核酸序列的扩增(NASBA,Cangene,Mississauga,Ontario),Q-p复制酶系统，基于转录的扩增系统(TAS),和链置换扩增(SDA)。参见，例如，DiagnosticMolecularMicrobiology:PrinciplesandApplications,D.H.Persing等人，Ed.，AmericanSocietyforMicrobiology,Washington,D.C.(1993)。扩增的产物称作扩增子。术语"染色体定位"包括，参照染色体包含的DNA线性区革爻可以测量的染色体的长度。参照2个独特的DNA序列，即标记，可以定义染色体定位。术语"标记"包括染色体上的用于鉴别染色体上的独特位置的基因座。"多态性标记"包括以多种形式(等位基因)出现的标记，使得不同形式的标记当存在于一个同源对中时，允许传递该对中的每个染色体。使用一个或多个标记，可以定义基因型。使用许多用于检测同源序列的对比方法，包括、但不限于，LASARGENE生物信息计算包的Megalign程序(DNASTARInc.,Madison,WI),可以测定序列比对和同一性百分比计算。除非另有i兌明，使用ClustalV比对方法(Higgins和Sharp(1989)5:151-153),利用缺省参数(GAPPENALTY=10,GAPLENGTHPENALTY=10),进行本文提供的序列的多个比对。使用ClustalV方法逐对比对和计算蛋白序列的同一性百分比的缺省参数是KTUPLE=1,GAPPENALTY=3,WINDOW=5和DIAGONALSSAVED=5。对于核酸，这些参数是KTUPLE=2,GAPPENALTY=5,WINDOW=4和DIAGONALSSAVED=4。比对序列后，通过在相同程序上观察"序列距离，，表，使用ClustalV程序，可以得到"同一性百分比"和"趋异性"值；除非另有说明，以该方式计算在本文中提供和要求保护的同一性百分比和趋异性。除非另有说明，本文提供的"BLAST"序列同一性/相似性值是指使用BLAST2.0程序包，使用缺省参数(Altschul等人，M/c/"c爿"^25:3389-3402(1997))得到的值。进行BLAST分析的软件是可7>开得到的，例如，通过国家生物才支术信息中心(NationalCenterforBiotechnologyInformation)。该算法包含，首先通过筌别查询序列中长度W的短字，其在与数据库序列中的相同长度的字比对时，匹配或满足一些正值的阈值评分T,从而鉴别高评分序列对(HSPs)。T称作邻域字得分阈值(Altschul等人，^J:)。这些最初的邻域字命中作为启动发现含有它们的更长HSP的检索的种子。然后沿着每个序列的两个方向延伸所述字命中，直到累积的比对计分可以提高。对于核苷酸序列，使用参数M(匹配的残基对的奖励分；总是〉0)和N(错配残基的罚分；总是O)来计算累积的计分。对于氨基酸序列，使用计分矩阵来计算累积的分数。在下述情况时停止在每个方向上字命中的延伸累积的比对分数从其达到的最大值下降了数值X;由于一个或多个负得分残基比对的积累，累积的计分达到零或低于零；或到达任何一个序列的结尾。BLAST算法的参数W、T和X决定了比对的敏感性和速度。BLASTN程序(对于核苷酸序列)默认使用的是字长(W)ll,预期值(E)IO,截止值100,M=5,N=-4,比较两个链。对于氨基酸序列，BLASTP程序默认使用的是，字长(W)3,预期值(E)10,和BLOSUM62计分矩阵(參JBHenikoff&Henikoff,尸rac.M^/.爿cm/.t7&489:10915(1989))。如本文所使用的，"从51%至最高达(且包括)100%的任意整数"是指51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%,或100%"。如本文所使用的，"从61%至最高达(且包括)100%的任意整数"是指61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%,或100%"。如本文所使用的，"从81%至最高达(且包括)100%的任意整数是指81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%,或100%"。如本文所^f吏用的，"80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性，或80%至100%之间的任意其它整数"是指80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%,或100%。本文使用的标准的重组DNA和分子克隆技术是本领域众所周知的，更完整地描述在Sambrook,J.,Fritsch,E.F.和Maniatis，T.A/o/ecw/"rC7om'wg..」Z^oraforyMwwa/;ColdSpringHarborLaboratoryPress:ColdSpringHarbor,1989(在下文中"Sambrook")。现在转至优选的实施方案优选实施方案包括分离的多核苦酸和多肽，重组DNA构建体，包含这些重组DNA构建体的组合物(例如才直物或种子)，和^f吏用这些重组DNA构建体的方法。优选的分离的多核苷酸和多肽本发明包括下述的优选的分离的多核苷酸和多肽在一个优选的实施方案中，分离的多核苷酸包含(a)编码与茎机械强度有关的多肽的核苷酸序列，其中基于ClustalV比对方法，与SEQIDNO:2,4,6,8,10,12,14,16或18比4支，所述多肽的氨基酸序列具有至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性，或80%至100%之间的任意其它整数；或(b)上述(a)的核苷酸序列的互补序列，其中所述互补序列和核苷酸序列由相同数目的核苷酸组成，且是100%互补(即，(a)的核苷酸序列的全长互补序列)。优选地，所述多肽与玉米茎机械强度有关，且所述多肽的氨基酸序列与SEQIDNO:16或18相比4支。在另一个优选的实施方案中，分离的多核苷酸包含(a)基于ClustalV比对方法，与SEQIDNO:1,3,5,7,9,11,13,15,和17比较，具有至少60%序列同一性、或从61%至最高达(且包括)100%的任意整数序列同一性的核酸序列，或(b)上述(a)的核酸序列的全长互补序列。在另一个优选的实施方案中，与茎机械强度有关的分离的多肽包括的氨基酸序列基于ClustalV比对方法，与SEQIDNO:2,4,6,8,10,12,14,16或18比较，具有至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性，或80%至100%之间的任意其它整数。几种方法可以用于测量植物的茎枳4成强度。优选地，可以用电才几械实验系统测量机械强度。在玉米茎机械强度的情况下，在一种优选方法中，如下对穗下的结间段进行3点弯曲实验使用Instron,4411型(InstronCorporation,100RoyallStreet,Canton,Massachusetts02021),锚定点之间的跨宽度是200mm，第三点以200mm/分钟的速度结合测力盒；使结间段断裂所需的载荷可以用作机械强度的度量(在下文中"3点弯曲实验，，)。已经证实，结间断裂强度与每单位长度的玉米茎中纤维素的量高度相关(参见美国专利申请号2004068767Al，在本文中引作参考)。与表达多肽的对照植物相比，当植物中该多肽的缺少会导致该植物茎机械强度的降低时，该多肽"与茎机械强度相关"。与表达多肽的对照玉米植物相比，当玉米植物中该多肽的缺少会导致该玉米植物茎机械强度的降低时，该多肽"与玉米茎机械强度相关'，应当理解，本领域技术人员会明白，本发明包括不止特定的示例性序列。导致在特定位点产生化学上等同的氨基酸、但是不影响编码的多肽的功能性质的核酸片段的变化，是本领域众所周知的。例如，可以将氨基酸丙氨酸(一种疏水氨基酸)的密码子取代为编码另一种疏水性较低的残基(例如甘氨酸)或疏水性较高的残基(例如缬氨酸，亮氨酸或异亮氨酸)的密码子。类似地，也可以预见到导致将一个带负电荷的残基取代为另一个残基的变化，例如将天冬氨酸取代为谷氨酸，或将一个带正电荷的残基取代为另一个的变化，例如将赖氨酸取代为精氨酸，以产生功能上等同的产物。也可以预见到导致多肽分子的N-末端和C-末端部分的改变的核苦酸变化，以改变多肽的活性。每个提出的4奮饰都在本领域的常识范围内，编码的产物的生物活性的保留的测定也在本领域常识范围内。优选重组DNA构建体和抑制DNA构建体本发明也包括重组DNA构建体，其包含至少一个可操作地连接到至少一个调节序列(例如，优选地，在所述植物中有功能的启动子)上的多核苷酸，其中所述多核苦酸包含本发明的任意分离的多核苷酸。在一个优选的实施方案中，重组DNA构建体包含在才直物中有功能的启动子，该启动子可操作地连接到(a)多核苷酸，其编码基于ClustalV比对方法，与SEQIDNO:2,4,6,8，10,12,14,16,和18比较，氨基酸序列具有至少80%序列同一性、或从81%至最高达(且包括)100%的任意整数序列同一性的多肽，或(b)上述(a)的所述多核苷酸的全长互补序列。在另一个优选的实施方案中，重组DNA构建体包含在才直物中有功能的启动子，该启动子可操作地连接到(a)多核苷酸，基于ClustalV比对方法，与SEQIDNO:1，3,5，7,9,11,13,15,和17比4交，其核酸序列具有至少60%序列同一性、或/人61%至最高达(且包括)100%的任意整数序列同一性，或(b)上述(a)的所述多核苷酸的全长互补序列。本发明也包括抑制DNA构建体。在一个优选的实施方案中，抑制DNA构建体包含在植物中有功能的启动子，该启动子可操作地连接到(a)以下核酸序列的全部或部分(i)核酸序列，其编码基于ClustalV比对方法，与SEQIDNO:2,4,6,8,10,12,14,16,和18比较，氨基酸序列具有至少50%序列同一性、或从51%至最高达(且包括)100%的任意整数序列同一性的多肽，或(ii)上述(a)(i)的核酸序列的全长互补序列；或(b)源自目标靶基因的全部或部分有义链或反义链的区域，所述区域的核酸序列基于ClustalV比对方法，与得到所述区域的全部或部分有义链或反义链比较，具有至少50%序列同一性、或从51%至最高达(且包括)100%的任意整数序列同一性，且其中所述目标靶基因编码选自Bk2、Bk2Ll、Bk2L3、Bk2L4、Bk2L5、Bk2L6、Bk2L7、Bk2L8和Bk2L9的多肽。"抑制DNA构建体"是一种重组DNA构建体，当转化或稳定整合入植物的基因组中时，导致植物中靶基因的"沉默"。所述靶基因可以是该植物内源的或转基因的。本文关于耙基因使用的"沉默"，通常是指靶基因表达的mRNA或蛋白/酶的水平的抑制，和/或酶活性水平或蛋白功能性的抑制。术语"抑制"包括降低、减少、下降、减退、抑制、消除和阻止。"沉默"或"基因沉默"不特指机制，且是包含性的，不限于，反义、共抑制、病毒抑制、发夹抑制、茎-环抑制、基于RNAi的方案，和基于小RNA的方案。抑制DNA构建体可以包含一个源自目标靶基因的区域，且可以包含目标耙基因的有义链(或反义链)的全部或部分核酸序列。根据要使用的方案，所述区域可以与目标基因的全部或部分有义链(或反义链)100%—致或小于100%—致(例如，至少50%或51%至100%—致之间的任意整数)。抑制DNA构建体是本领域已知的，一旦选定目标靶基因后可以容易地构建，包括、但不限于，共抑制构建体，反义构建体，病毒抑制构建体，发夹抑制构建体，茎-环抑制构建体，双链RNA-生产构建体，和更一舶:地，RNAi(RNA干扰)构建体和小RNA构建体例如siRNA(短干扰RNA)构建体和miRNA(微RNA)构建体。"反义抑制"指能抑制靶蛋白的表达的反义RNA转录物的生产。"反义RNA"是指与全部或部分的乾初级转录物或mRNA互补、且阻断分离的輩巴核酸片段的表达的RNA转录物(美国专利号5,107,065)。反义RNA的互补性可以是与特定基因转录物的任意部分，即，在5'非编码序列，3'非编码序列，内含子，或编码序列。"共抑制"是指能抑制靶蛋白的表达的有义RNA转录物的生产。"有义"RNA是指一种RNA转录物，其包括mRNA,且可以在细月包内或体外翻译成蛋白。通过集中在与天然mRNA在有义方向具有同源性的核酸序列的过表达，以前已经设计了植物中的共抑制构建体，它会导致与过表达的序列具有同源性的所有RNA的减少(参见Vaucheret等人(1998)尸/"W丄651-659;和Gura(2000)A^"404:804-808)。另一个变化形式描述了植物病毒序列的指导邻近mRNA编码序列的抑制的应用(PCT公开WO98/36083,于1998年8月20日/>开)。最近的工作已经描述了"发夹"结构的应用，该结构掺入了互补方向的所有或部分的mRNA编码序列，其导致表达的RNA的潜在"茎-环"结构(PCT^^开WO99/53050,于1999年10月21日7>开)。在该情况下，茎由与目标基因相对应的多核苷酸形成，所述目标基因相对于启动子以有义或反义方向插入，且环由目标基因的有些多核苷酸形成，它们在构建体中不具有互补序列。这会增加回收的转基因植物中共抑制或沉默的频率。关于发夹抑制的综述，参见Wesley,S.V等人(2003)MethodsinMolecularBiology,PlantFunctionalGenomics:MethodsandProtocols23(5:273-286。其中茎由至少30个来自要抑制的基因的核苷酸形成、且环由随机的核苷酸序列形成的构建体，也已经有效地用于抑制(WO99/61632,于1999年12月2日公开)。也已经描述了聚-T和聚-A序列用于建立茎-环结构中的茎的用途(WO02/00894,于2002年1月3日7>开)。另一个变化形式包括，使用合成的重复序列来促进茎-环结构中的茎的形成。已经证实，用这样的重组DNA片段制备的转基因生物体具有降低水平的由形成环的核苷酸片段编码的蛋白，如2002年1月3日公开的PCT公开WO02/00904所述。RNA干扰是指由短干扰RNA(siRNA)介导的动物中序列-特异性的转录后基因沉默的过程(Fire等人，A^we391:8061998)。植物中的对应过程通常称作转录后基因沉默(PTGS)或RNA沉默，在真菌中也称作压抑(quelling)。认为转录后基因沉默的过程是用于阻止外来基因的表达的进化上保守的细胞防御机制，通常由不同的植物区系和门共有(Fire等人，7>em^15:3581999)。这样的来自外来基因表达的保护，可能已经反应于双链RNA(dsRNA)的生成而进化，所述双链RNA(dsRNA)源自病毒感染，或源自通过特异性破坏病毒基因组RNA的同源单链RNA的细胞反应，转座子元件向宿主基因组中的随机整合。dsRNA在细胞中的存在，会通过没有充分表征的机理，触发RNAi反应。长dsRNA在细胞中的存在，会刺激称作切丁酶(dicer)的核糖核酸酶III酶的活性。切丁酶参与dsRNA向称作短干扰RNA(siRNA)的dsRNA短片段的加工(Berstein等人，A^we409:363(2001))。由切丁酶活性得到的短干扰RNA的长度通常是约21至约23个核苷酸，且包含约19碱基对的双链体(Elbashir等人，GeneDev.15:188(2001))。切丁酶也已经被认为涉及21-和22-核苷酸的小的暂时RNA(stRNA)从参与翻译控制的保守结构的前体RNA切除(Hutvagner等人，293:834(2001))。RNAi反应也表征了通常称作RNA-诱导的沉默复合物(RISC)的内切核酸酶复合物，它会介导与siRNA双链体的反义链具有序列互补性的单链RNA的切割。靶RNA的切割发生在与siRNA双链体的反义《连互补的区域的中间(Elbashir等人，GeneDev.15:188(2001))。另外，RNA干扰也可以包含小RNA(例如，miRNA)介导的基因沉默，推测是通过调节染色质结构的细胞机制，从而阻止乾基因序列的转录(参见，例如，Allshire,297:1818-1819(2002);Volpe等人，Sc固ce297:1833-1837(2002);Jenuwein,Sc&匿297:2215-2218(2002);和Hall等人，S"e"ce297:2232-2237(2002))。这样，本发明的miRNA分子可以用于介导基因沉默，这是通过与RNA转录物的相互作用，或通过与特定基因序列的相互作用，其中这样的相互作用导致在转录或转录后水平的基因沉默。已经在多种系统中研究了RNAi。Fire等人(A/mM391:806(1998))首先在秀丽新杆线虫中观察到RNAi。Wianny和Goetz(Atow^Ce〃5zW.2:70(1999))描述了小鼠胚胎中由dsRNA介导的RNAi。Hammond等人(Atow^404:293(2000))描述了用dsRNA转染的果蝇细胞中的RNAi。Elbashir等人(Atowe411:494(2001))描述了通过在培养的哺乳动物细月包中导入合成的21-核苷酸RNA的双链体诱导的RNAi,所述哺乳动物细胞包括人胚肾和HeLa细胞。小RNA在控制基因表达中起重要作用。许多发育过程(包括开花)的调节，由小RNA控制。现在可能通过使用在植物中产生小RNA的转基因构建体，加工植物基因的基因表达的变化。小RNA似乎通过与互补RNA或DNA粑序列的碱基配对发挥功能。当结合RNA时，小RNA会触发l巴序列的RNA切割或翻i奪抑制。当结合DNA靶序列时，认为小RNA可以介导耙序列的DNA曱基化。无论具体的机理如何，这些事件的结果是抑制基因表达。认为小RNA和它们的RNA把之间的序列互补性，有助于确定采用哪个机理，即RNA切割或翻译抑制。据信，与把完美互补的siRNA,通过RNA切割发挥作用。有些miRNA具有完美的或接近完美的与它们的革巴的互补性，已经为至少一些这样的miRNAi正实了RNA切割。其它miRNA与它们的耙具有几个错配，且在翻译水平显然地上抑制它们的靶。另外，不受作用机理的具体理论的约束，一般规律是出现完美或接近完美的互补性造成RNA切割，而当miRNA/耙双链体含有许多错配时，偏好翻译抑制。其明显例外是植物中的微RNA172(miR172)。miR172的革巴之一是APETALA2(AP2),尽管miR172与AP2具有接近完美的互补性，似乎会造成AP2的翻译抑制，而不是RNA切割。微RNA(miRNA)是已经在动物和植物中鉴别出的长度为约19-约24个核苷酸(nt)的非编码RNA(Lagos-Quintana等人，Scze"ce294:853-858(2001),Lagos-Qmntana等人，Cwr.12:735-739(2002);Lau等人，S"e固294:858-862(2001);Lee和Ambros,Scze鮮294:862-864(2001);Llave等人，尸/a"fC"/14:1605-1619(2002);Mourelatos等人，Gene.Dev.16:720-728(2002);Park等人，Cwr12:1484-1495(2002);Reinhart等人，Gene.Dev.16:1616-1626(2002))。它们从大小范围是约70-200核苷酸的更长前体转录物加工而成，这些前体转录物具有形成稳定发夹结构的能力。在动物中，参与加工miRNA前体的酶称作切酶(Dicer),即一种RNA酶III-样蛋白(Grishok等人，CW/106:23-342001;Hutvagner等人，293:834-838(2001);Ketting等人，Gene.Dev.15:2654-2659(2001))。植物也具有切酶-样酶，即DCL1(以前命名为CARPELFACTORY/SHORTINTEGUMENTS1/SUSPENSOR1),最近的证据表明，象切酶一样，它参与加工发夹前体，以产生成熟的miRNA(Park等人，Cmr.Ao/.12:1484-1495(2002);Reinhart等人,Gene.Dev.16:1616-1626(2002))。此外，/人最近的工作可以明白，至少有些miRNA发夹前体作为更长的聚腺苷酸化的转录物产生，几种不同的miRNA和相关的发夹可以存在于单个转录物中(Lagos-Quintana等人，294:853-858(2001);Lee等人，￡71/5(9J21:4663-46702002)。最近的工作还已经检查了从切酶加工发夹产生的dsRNA产物选择miRNA链(Schwartz,等人Ce〃115:199-208(2003))。似乎加工的dsRNA的2个末端的稳定性(即G:C与A:U含量，和/或错配)会影响链选择，低稳定性末端更容易被螺旋酶活性展开。在低稳定性末端的5'末端链掺入RISC复合物中，同时降解其它链。微RNA似乎通过结合位于这些基因产生的转录物中的互补序列，调节靶基因。在lin-4和let-7的情况下，靶位点位于靶mRNA的3，UTR(Lee等人，Ce〃75:843-854(1993);Wightman等人，Ce〃75:855-862(1993);Reinhart等人，A^/we403:901-906(2000);Slack等人，A/o/.0〃5:659-669(2000)),在lm-4和let-7miRNA和它们的耙位点之间存在几个错配。lin-4或let-7miRNA的结合似乎会造成革巴mRNA编码的蛋白的稳态水平的下调，而不影响转录物本身(Olsen和Ambros，Z)ev.5zo/.216:671-680(1999))。另一方面，最近的证据表明，miRNA在有些情况下可以造成耙位点内耙转录物的特异性RNA切割，且该切割步骤似乎需要miRNA和輩巴转录物之间的100%互补性(Hutvagner和Zamore,5""wce297:2056-2060(2002);Llave等人，尸/a"/Ce〃14:1605-1619(2002))。似乎可能的是，miRNA可以进入革巴基因调节的至少2个途径当輩巴互补性<100%时，蛋白下调；当耙互补性是100%时，RNA切割。进入RNA切割途径的孩iRNA类似于动物中RNA千扰(RNAi)过程中产生的21-25核苷酸短干扰RNA(siRNA)和植物中的转录后基因沉默(PTGS)(Hamilton和Baulcombe(1999);Hammond等人，(2000);Zamore等人,(2000);Elbashir等人，(2001)),且可能掺入与在RNAi中观察到的类似或相同的RNA-诱导的沉默复合物(RISC)。用生物信息学识别miRNA的靶，尚未在动物中成功，这可能是由于下述事实，即动物miRNA与它们的草巴具有低度的互补性。另一方面，生物信息学方案已经成功地用于预测植物miRNA的輩巴(Llave等人，尸/a"fC"/14:1605-1619(2002);Park等人，Cw"12:1484-1495(2002);Rhoades等人，Ce〃110:513-520(2002))，因而植物miRNA似乎与它们的推定把具有比动物miRNA更高的总互补性。才直物miRNA的大多数这样的预测靶转录物编成夫^始^*言"刑录因子家族的成员重组DNA构建体和抑制DNA构建体的优选调节元件许多启动子可以用于本发明的重组DNA构建体和抑制DNA构建体中。可以基于希望的结果，选择启动子，可以包括组成型、组织-特异性的、诱导型、或用于在宿主生物体中表达的其它启动子。在35S启动子控制下的候选基因的高水平组成型表达，可以具有多效影响。但是，组织特异性的和/或应胁迫特异性的表达可以消除不希望的影响，但是保留增强干旱耐受性的能力。该影响已经在,it-f齐中观察到(Kasuga等人，NatureBiotechnol.17:287-91(1999))。这样，当由不同启动子驱动时，可以测试候选基因功效。适用于才直物宿主细胞中的组成型启动子包括，例如，Rsyn7启动子的核心启动子，和在WO99/43838和美国专利号6,072,050中7>开的其它组成型启动子；核心CaMV35S启动子(Odell等人，A^m^e313:810-812(1985));稻肌动蛋白(McElroy等人，尸/滅Ce〃2:163-171(1990));泛素(Christensen等人，尸/a^Mo/.说o/.12:619-632(1989)和Christensen等人，尸/"WA/o/.Ao/.18:675-689(1992》；pEMU(Last等人，772醒G匿r.81:581-588(1991));MAS(Velten等人，五雄(93:2723-2730(1984));ALS启动子(美国专利号5,659,026),等。其它组成型启动子包^",例如，在美国专利号5,608,149;5,608,144;5,604,121;5,569,597;5，466，785;5,399,680;5,268,463;5,608,142;和6,177,611中讨论的那些。在选择用于本发明的方法中的启动子时，可能希望使用组织-特异性的或发育调节的启动子。组织-特异性的或发育调节的启动子是DNA序列，其调节DNA序列在对于雄花穗发育、结实、或二者的发育至关重要的植物细胞/组织中的选择性表达，并将这样的DNA序列的表达限制在植物的雄花穗发育或种子成熟的阶段。任意可识别的启动子可以用于本发明的方法中，造成希望的时间和空间表达。一种优选的茎-特异性的启动子是苜蓿茎-特异性的S2A基因(Abrahams等人，尸/虚M/.Wo/.27:513-528(1995》。种子或胚特异性的、且可以用于本发明中的启动子包括大豆Kunitz胰蛋白酶抑制剂(Kti3,Jofuku和Goldberg,PlantCell1:1079-1093(1989)),马铃薯块茎蛋白(patatin)(马铃薯块茎)(Rocha-Sosa等人，EMBOJ.8:23-29(1989)),convidlin,5宛豆5求蛋白，禾口豆5求蛋白(^宛豆子叶)(Rerie,W.G.,等人A/o/.259:149-157(1991);Newbigin，E丄，等人，尸/"wto180:461-470(1990);Higgins,T.J.V,等人，尸/a"f.Afo/.Ao/.11:683-695(1988)),玉米醇溶蛋白(玉米胚乳)(Schemthaner，J.P.,等人，E^ffi(9丄7:1249-1255(1988)),菜豆球蛋白(菜豆子叶)(Segupta-Gopalan,C.，等人，淑/.爿cat/.U.S.A.82:3320-3324(1985)),植物凝集素(菜豆子叶)(Voelker,T.等人，五MBO丄6:3571-3577(1987)),B-conglycinin和大豆球蛋白(大豆子叶)(Chen,Z-L,等人，￡A/S(9J.7:297-302(1988))，谷蛋白(稻胚乳)，大麦醇溶蛋白(大麦胚乳)(Marns,C.，等人，尸/朋fMo/.Bzo/.10:359-366(1988))，麦谷蛋白和麦醇溶蛋白(小麦胚乳)(Colot,V,等人，￡71/5(9,6:3559-3564(1987)),和甘薯f&藏蛋白(sporamm)(甘薯块茎)(Hattori,T.,等人，PlantMol.Biol.14:595-604(1990))。可操作地连接到嵌合基因构建体中的异源编码区的种子-特异性的基因的启动子，在转基因植物中维持它们的时间和空间表达模式。这样的实例包括，拟南芥2S种子储藏蛋白基因启动子，以在拟南芥和欧洲油菜种子中表达脑啡肽肽，(Vanderkerckhove等人Bio/Technology7:L929-932(1989))，菜豆凝集素和黄豆P-菜豆球蛋白启动子，以表达安光素酶(Riggs等人，PlantSci.63:47-57(1989)),和小麦谷蛋白启动子，以表达氯霉素乙酰转移酶(Colot等人，EMBOJ.6:3559-3564(1987))。反应于内源或外源刺激例如化学化合物(化学诱导物)的存在，或反应于环境的、激素的、化学的、和/或发育的信号，诱导型启动子选择性地表达可操作地连接的DNA序列。诱导型或调节的启动子包括，例如，由光、热、胁迫、水灾或干旱、植物激素、伤口或化学物质(例如乙醇，茉莉酮酸酯，水杨酸，或安全剂)调节的启动子。反应于胁迫的启动子包括下述的启动子1)RD29A启动子(Kasuga等人，NatureBiotechnol.17:287-291(1991));2)大麦启动子，B22E;在发育中的玉米仁中，B22E的表达是梗特异性的("PrimaryStructureofaNovelBarleyGeneDifferentiallyExpressedinImmatureAleuroneLayers".Klemsdae,S.S.等人，Mol.Gen.Genet.228(1/2):9-16(1991));和3)玉米启动子，Zag2("IdentificationandmolecularcharacterizationofZAGl，themaizehomologoftheArabidopsisfloralhomeoticgeneAGAMOUS"，Schmidt,R.J.等人，PlantCell5(7):729-737(1993))。Zag2转录物在授粉前5天至授粉后7-8天可以检测到，并指导在发育中的雌花序的心皮中的表达，和对发育中的玉米仁的核特异性的Ciml。Ciml转录物在授粉前4-5天至授粉后6-8天可以检测到。其它有用的启动子包括可以源自其表达在母系上与发育中的雌小花有关的基因的任意启动子。启动子可以完全不同于天然基因，或包含源自在自然界发现的不同启动子的不同元件，或甚至包含合成的DNA区段。本领域技术人员会理解，不同的启动子可以指导在不同的组织或细胞类型中、或在不同的发育阶段、或反应于不同的环境条件的基因表达。还认识到，由于在大多数情况下尚未完全确定调节序列的准确边界，有些变体的DNA片段可能具有相同的启动子活性。造成基因在大多数细胞类型中表达的启动子在大多数情况下经常称作"組成型启动子"。不断发现在植物细胞中有用的不同类型的新启动子；在Okamuro,J.K.,和Goldberg,R.B.,&oc/2e,^7q/"尸/""f15:1-82(1989)的编辑物中，可以发现许多实例。特别优选的启动子可以包括苜蓿茎-特异性的S2A基因启动子，RIP2,mLIP15，ZmCORl,Rabl7,CaMV35S,RD29A,SAM合成酶，泛素，CaMV19S,nos,Adh,蔗糖合酶，R-等位基因，或根细胞启动子。其它优选的启动子包括在本文整体引作参考的美国专利公开2005/0086712A1中公开的CesAlO,CesAll,和CesA12启动子中的任一种。本发明的重组DNA构建体和抑制DNA构建体也可以包括其它调节序列，包括但不限于，翻译先导序列，内含子，和聚腺苷酸化识别序列。在本发明的另一个优选实施方案中，本发明的重组DNA构建体另外包含增强子或沉默子。可以将内含子序列添加到部分编码序列的5'不翻i奪区或编码序列上，以增加在胞质溶胶中积累的成熟信号的量。已经证实，在植物和动物表达构建体的转录单元中包含可剪接的内含子，会在mRNA和蛋白7jc平增加基因表达最高达1000倍。Buchman和Berg,A/o/.Ce〃5zo/.8:4395-4405(1988);Callis等人，GeneDev.1:1183-1200(1987)。当置于转录单元的5'末端附近时，基因表达的这样的内含子增强通常最大。玉米内含子Adhl-S内含子l、2和6、Bronze-l内含子的使用是本领域已知的。通常参见，T7zeZ/aw必ooA:,Chapter116,Freeling和Walbot,Eds,,Springer,NewYork(1994)。如果希望多肽表达，通常希望在多核苷酸编码区的3'-末端包括聚腺普酸化区。聚腺苷酸化区可以源自天然基因、许多其它植物基因或T-DNA。要添加的3'末端序列可以源自，例如，胭脂石咸合酶或章鱼石咸合酶基因，或者源自另一种植物基因，或不太优选地来自任意其它真核基因。翻译先导序列是位于基因的启动子序列和编码序列之间的DNA序列。翻译先导序列存在于在翻译起始序列上游的完全加工的mRNA中。翻i奪先导序列可以影响初级转录物向mRNA的加工、mRNA稳定性或翻i奪效率。已经描述了翻i奪先导序列的实例(Turner，R.和Foster,G.D.,MolecularBiotechnology3:225(1995》。可以选择任意的植物，用于筌别将用于制备本发明的重组DNA构建体和抑制DNA构建体的调节序列和基因。适用于分离基因和调节序列的植物靶的实例包括、但不限于苜蓿，苹果，杏，拟南芥，朝鲜蓟，芝麻菜(arugula),,夢，酪梨，香蕉，大麦，菜豆，甜菜，黑莓，蓝莓，绿花椰菜，抱子甘蓝，巻心菜，芸苔，香瓜，胡萝卜，木薯，蓖麻子，花椰菜，芽菜，樱桃，菊苣，芫荽，柑桔，金钱橘，三叶草，椰子，咖啡，玉米，棉花，酸果蔓，黄瓜，花旗松(Douglasfir),茄子，菊苣，茅菜(escarole),桉树，茴香，无花果，大蒜，葫芦，葡萄，葡萄柚，蜜汁，豆薯，猕猴桃，莴苣，韭，柠檬，菜姆(lime)，火炬松，亚麻子，芒果，甜瓜，蘑菇，油桃，坚果，燕麦，油椰，油籽油菜，秋葵，橄榄，洋葱，桔子，观赏植物，棕榈，木瓜，荷兰芽，荷兰防风草，豌豆，桃子，花生，梨，胡椒，柿，松，凤梨，车前草，洋李，石榴，白杨，马铃薯，西葫声，柑橘，放射松，radiscchio，小红萝卜，油菜籽，覆盆子，稻，黑麦，高梁，南方松，大豆，菠菜，南瓜，草莓，甜菜，甘蔗，向日葵，甘薯，香枫，红橘，茶树，烟草，番茄，小黑麦(tnticale)，草皮，芜菁，藤，西瓜，小麦，薯芋，和胡瓜。用于鉴别调节序列的特别优选的植物是拟南芥，玉米，小麦，大豆，和棉花。在本发明的另一个优选实施方案中，本发明的重组DNA构建体另外包含增强子。4尤选的纟且合物本发明的一种优选的组合物是植物，在它的基因组中包含任意的本发明的重组DNA构建体(例如上面讨论的那些优选的构建体)。另一种优选的组合物是植物，在它的基因组中包含选自Bk2、Bk2Ll、Bk2L3、Bk2L4、Bk2L5、Bk2L6、Bk2L7、Bk2L8和Bk2L9的至少一个基因(它可以是基因组异源的或内源的)的破坏(例如，插入，例如转座因子，或序列突变)。另一种优选的组合物是植物，在它的基因组中包含下面讨论的其它重组DNA构建体(例如，包含与SEQIDNO:20-42有关的核酸序列和氨基酸序列的构建体)。优选的组合物也包括植物的任意后代、和从植物或其后代得到的任意种子。后代包括通过植物的自花传粉或异型杂交得到的后代。后代也包括杂种和近交系。优选地，在杂种种子繁殖的作物中，成熟的转基因植物可以自交，以生产纯合的近交植物。近交植物会生成含有新导入的重组DNA构建体的种子。可以培育这些种子，以生成在基因组中含有重组DNA构建体、且表现出本文所述的相关表型的植物，或用于育种程序，以生产杂种种子，后者可以生长，以生成含有该重组DNA构建体、且表现出本文所述的相关表型的植物。优选地，所述种子是玉米。优选地，所述植物是单子叶或双子叶植物，更优选地，玉米或大豆植物、更优选玉米植物，例如玉米杂种植物或玉米近交植物。所述植物也可以是向日葵，高粱，卡诺拉(canola),小麦，苜蓿，棉花，稻，大麦或粟。优选地，任意重组DNA构建体稳定地整合入植物基因组中。特别优选的实施方案包括1.一种植物(优选玉米)，在它的基因组中包含含有至少一个调节元件的重组DNA构建体，所述调节元件可操作地连接到(a)编码与茎机械强度有关的多肽的核苷酸序列，其中所述多肽的氨基酸序列基于ClustalV比对方法，与SEQIDNO:16或18比较，具有至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性，或80%至100%之间的任意其它整数；或(b)该核香酸序列的互补序列，其中所述互补序列和核苦酸序列由相同数目的核苷酸组成，且是100%互补(即，(a)的核苷酸序列的全长互补序列)。优选地，所述至少一个调节元件是在植物中有功能的启动子。2.—种植物(优选玉米)，在它的基因组中包含(a)第一种重组DNA构建体，其包含至少一个在植物中有功能的启动子，该启动子可操作地连接到至少一个选自下组的第一种分离的多核苷酸(i)多核苷酸，其编码基于ClustalV比对方法，与SEQIDNO:2,4,6,8,10,12,14,16,和18比较，氨基酸序列具有至少80%序列同一性、或从81%至最高达(且包括)100%的任意整数序列同一性的多肽；(ii)多核普酸，其核酸序列基于ClustalV比对方法，与SEQIDNO:1，3,5，7,9，11，13,15,和17比较，具有至少60%序列同一性、或乂人61%至最高达(且包括)100%序列同一性的任意整数；和(iii)上述(a)(i)或(a)(ii)的多核苷酸的全长互补序列；和(b)第二种重组DNA构建体，其包含至少一个在植物中有功能的启动子，该启动子可操作地连接到至少一个选自下组的第二种分离的多核苷酸(i)多核苷酸，其编码基于ClustalV比对方法，与SEQIDNO:20,22,24，26，28,30，32,34,36，38，40,和42比较，氨基酸序列具有至少80%序列同一性、或从81%至最高达(且包括)100%的任意整数序列同一性的多肽；(ii)多核苷酸，其核酸序列基于ClustalV比对方法，与SEQIDNO:21,23,25，27,29，31,33,35，37,39，和41比较，具有至少60%序列同一性、或从61%至最高达(且包括)100%的任意整数序列同一性；和(iii)上述(b)(i)或(b)(ii)的多核苷酸的全长互补序列。优选地，与不包含所述第一种重组DNA构建体和所述第二种重组DNA构建体的对照植物相比，所述植物表现出增加的细胞壁纤维素含量和/或增加的生长速率。3.—种植物(优选玉米)，在它的基因组中包含至少一个调节序列，所述调节序列可操作地连接到(a)至少一个选自下组的分离的多核苷酸(i)多核苷酸，其编码基于ClustalV比对方法，与SEQIDNO:2,4,6,8，10,12,14,16，和18比4交，氨基酸序列具有至少80%序列同一性、或从81%至最高达(且包括)100%的任意整数序列同一性的多肽；(ii)多核苷酸，其核酸序列基于ClustalV比对方法，与SEQIDNO:1，3，5,7,9,11,13,15,和17比4交，具有至少60%序列同一性、或从61%至最高达(且包括)100%的任意整数序列同一性；和(iii)上述(a)(i)或(a)(ii)的多核苷酸的全长互补序列；和(b)至少一个选自下組的分离的多核苷酸(i)多核苷酸，其编码基于ClustalV比对方法，与SEQIDNO:20,22,24,26,28,30,32,34，36,38，40，和42比较，氨基酸序列具有至少80%序列同一性、或从81%至最高达(且包括)100%的任意整数序列同一性的多肽；(ii)多核苷酸，其核酸序列基于ClustalV比对方法，与SEQIDNO:21,23,25,27,29，31,33,35,37,39,和41比4交，具有至少60%序列同一性、或/人61%至最高达(且包括)100%的任意整数序列同一性；和(iii)上述(b)(i)或(b)(ii)的多核苷酸的全长互补序列。优选地，与不包含所述至少一个可操作地连接到所述(a)和(b)上的调节序列的对照植物相比，所述植物表现出增加的细胞壁纤维素含量和/或增加的生长速率。4.一种植物(优选玉米)，在它的基因组中包含至少一个调节序列，所述调节序列可操作地连接到(a)至少一个选自下组的分离的多核苷酸(i)多核苷酸，其编码基于ClustalV比对方法，与SEQIDNO:2比较，氨基酸序列具有至少80%序列同一性、或从81%至最高达(且包括)100%的任意整数序列同一性的多肽；(ii)多核苷酸，其核酸序列基于ClustalV比对方法，与SEQIDNO:1比较，具有至少60%序列同一性、或从61%至最高达(且包括)100%的任意整数序列同一性；和(iii)上述(a)(i)或(a)(ii)的多核苷酸的全长互补序列；和(b)至少一个选自下组的分离的多核苷酸(i)多核苷酸，其编码基于ClustalV比对方法，与SEQIDNO:38,40,和42比4交，氨基酸序列具有至少80%序列同一性、或从81%至最高达(且包括)100%的任意整数序列同一性的多肽；(ii)多核苦酸，其核酸序列基于ClustalV比对方法，与SEQIDNO:37,39,和41比较，具有至少60%序列同一性、或从61%至最高达(且包括)100%的任意整数序列同一性；和(iii)上述(b)(i)或(b)(ii)的多核苷酸的全长互补序列。优选地，与不包含所述至少一个可操作地连接到所述(a)和(b)上的调节序列的对照植物相比，所述植物表现出增加的细胞壁纤维素含量。5.—种植物(优选玉米)，在它的基因组中包含至少一个调节序列，所述调节序列可操作地连接到(a)至少一个选自下组的分离的多核苷酸(i)多核普酸，其编码基于ClustalV比对方法，与SEQIDNO:6比较，氨基酸序列具有至少80%序列同一性、或从81%至最高达(且包括)100%的任意整数序列同一性的多肽；(ii)多核苷酸，其核酸序列基于ClustalV比对方法，与SEQIDNO:5比较，具有至少60%序列同一性、或从61%至最高达(且包括)100%的任意整数序列同一性；和(iii)上述(a)(i)或(a)(ii)的多核苷酸的全长互补序列；和(b)至少一个选自下组的分离的多核普酸(i)多核苦酸，其编码基于ClustalV比对方法，与SEQIDNO:20,32,和34比4支，氨基酸序列具有至少80%序列同一性、或从81%至最高达(且包括)100%的任意整数序列同一性的多肽；(ii)多核苷酸，其核酸序列基于ClustalV比对方法，与SEQIDNO:19,31，和33比较，具有至少60%序列同一性、或从61%至最高达(且包括)100%的任意整数序列同一性;和(iii)上述(b)(i)或(b)(ii)的多核苷酸的全长互补序列。优选地，与不包含所述至少一个可操作地连接到所述(a)和(b)上的调节序列的对照植物相比，所述植物表现出增加的生长速率。6.—种植物(优选玉米)，在它的基因组中包含至少一个调节序列，所述调节序列可操作地连接到至少2个选自下组的分离的多核苷酸(a)多核苷酸，其编码基于ClustalV比对方法，与SEQIDNO:2，4,6，8，10，12，14,16,和18比较，氨基酸序列具有至少80%序列同一性、或从81%至最高达(且包括)100%的任意整数序列同一性的多肽；(b)多核苷酸，其核酸序列基于ClustalV比对方法，与SEQIDNO:1,3,5,7，9,11,13,15,和17比4交，具有至少60°/。序列同一性、或从61%至最高达(且包括)100%的任意整数序列同一性；和(c)上述(a)或(b)的多核苷酸的全长互补序列。7.—种植物(优选玉米)，在它的基因组中包含抑制DNA构建体，后者包含在植物中有功能的启动子，该启动子可操作地连接到(a)下述核酸序列的全部或部分(i)核酸序列，其编码基于ClustalV比对方法，与SEQIDNO:2,4,6，8,10,12,14，16,和18比较，氨基酸序列具有至少50%序列同一性、或从51%至最高达(且包括)100%的任意整数序列同一性的多肽，或(ii)上述(a)(i)的核酸序列的全长互补序列；或(b)源自目标粑基因的全部或部分有义链或反义链的区域，所述区域的核酸序列基于ClustalV比对方法，与得到所述区域的全部或部分有义链或反义链比较，具有至少50%序列同一性、或从51%至最高达(且包括)100%的任意整数序列同一性，且其中所述目标靶基因编码选自Bk2、Bk2Ll、Bk2L3、Bk2L4、Bk2L5、Bk2L6、Bk2L7、Bk2L8和Bk2L9的多肽。优选地，与不包含所述抑制DNA构建体的对照植物相比，所述植物表现出降低的茎机械强度。优选地，所述抑制DNA构建体包含共抑制构建体，反义构建体，病毒抑制构建体，发夹抑制构建体，茎-环抑制构建体，双纟连RNA-生产构建体，RNAi构建体，或小RNA构建体(例如，siRNA构建体或miRNA构建体).8.—种才直物(优选玉米)，其基因组包含编码选自BK2、Bk2Ll、Bk2L3、Bk2L4、Bk2L5、Bk2L6、Bk2L7、Bk2L8和Bk2L9多肽的至少一个基因的^皮坏。优选地，所述破坏导致与不包含所述;皮坏的对照植物相比，所述植物表现出降低的茎机械强度。优选地，所述破坏包含一个插入，例如转座因子或序列突变。9.一种植物(优选玉米)，在它的基因组中包含抑制DNA构建体，后者包含在植物中有功能的启动子，该启动子可操作地连接到(a)以下核酸序列的全部或部分(i)核酸序列，其编码基于ClustalV比对方法，与SEQIDNO:6比较，氨基酸序列具有至少50%序列同一性、或从51%至最高达(且包括)100%的任意整数序列同一性的多肽，或(ii)上述(a)(i)的核酸序列的全长互补序列；或(b)源自目标靶基因的全部或部分有义链或反义链的区域，所述区域的核酸序列基于ClustalV比对方法，与得到所述区域的全部或部分有义链或反义链比较，具有至少50%序列同一性、或从51%至最高达(且包括)100%的任意整数序列同一性，且其中所述目标耙基因编码Bk2L3多肽。优选地，与不包含所述抑制DNA构建体的对照植物相比，所述植物表现出降低的植物高度和/或减小的器官大小。优选地，所述抑制DNA构建体包含共抑制构建体，反义构建体，病毒抑制构建体，发夹抑制构建体，茎-环抑制构建体，双链RNA-生产构建体，RNAi构建体，或小RNA构建体(例如，siRNA构建体或miRNA构建体)。10.—种植物(优选玉米)，其基因组包含编码Bk2L3多肽的至少一个基因的破坏。优选地，所述破坏导致与不包含所述破坏的对照植物相比，所述植物表现出降低的植物高度和/或减小的器官大小。优选地，所述破坏包含一个插入，例如转座因子或序列突变。11.一种植物(优选玉米)，在它的基因组中包含抑制DNA构建体，后者包含在植物中有功能的启动子，该启动子可操作地连接到(a)以下核酸序列的全部或部分(i)核酸序列，其编码基于ClustalV比对方法，与SEQIDNO:10比较，氨基酸序列具有至少50%序列同一性、或从51%至最高达(且包括)100%的任意整数序列同一性的多肽，或(ii)上述(a)(i)的核酸序列的全长互补序列；或(b)源自目标靶基因的全部或部分有义链或反义链的区域，所述区域的核酸序列基于ClustalV比对方法，与得到所述区域的全部或部分有义链或反义链比较，具有至少50%序列同一性、或从51%至最高达(且包括)100%的任意整数序列同一性，且其中所述目标輩巴基因编码Bk2L5多肽。优选地，与不包含所述抑制DNA构建体的对照植物相比，所述植物表现出雄性不育。优选地，所述抑制DNA构建体包含共抑制构建体，反义构建体，病毒抑制构建体，发夹抑制构建体，茎-环抑制构建体，双链RNA-生产构建体，RNAi构建体，或小RNA构建体(例如，siRNA构建体或miRNA构建体)。12.—种植物(优选玉米)，其基因组包含编码BKL5多肽的至少一个基因的破坏。优选地，所述破坏导致与不包含所述破坏的对照植物相比，所述植物表现出雄性不育。优选地，所述破坏包含一个插入，例如转座因子或序列突变。13.上述植物的任意后代，上述植物的任意种子，上述植物的后代的任意种子，和来自任意上述植物和后代的细胞。本领域普通技术人员会容易地认识到适用于相对于在基因组中包含重组DNA构建体(或抑制DNA构建体)的植物进行对比或测量的对照或参照植物。例如，作为非限制性解释对于重组DNA构建体(或抑制DNA构建体)是半合子的转化植物的后代，使得该后代分离成包含或不包含重组DNA构建体(或抑制DNA构建体)的植物通常相对于不包含重组DNA构建体(或抑制DNA构建体)的后代，测量包含重组DNA构建体(或抑制DNA构建体)的后代。重组DNA构建体(或抑制DNA构建体)向近交系中的渐渗，例如在玉米中，或向一个品种中渐渗，例如在大豆中通常相对于亲本近交或品种系，测量渐渗的系。參2个杂种系，其中第一个杂种系从2个亲本近交系生成，第二个杂种系/人除了亲本近交系之一含有重组DNA构建体(或抑制DNA构建体)以外都相同的2个亲本近交系生成通常相对于第一个杂种系，测量第二个杂种系。一种植物，在它的基因组中包含重组DNA构建体(或抑制DNA构建体)(或一种植物，其在它的基因组中包含基因的破坏)可以相对于在基因组中不包含重组DNA构建体(或抑制DNA构建体)、但是其它方面具有可与所述纟直物相比的遗传背景(例如，与包含该重组DNA构建体或抑制DNA构建体或破坏的植物比较，核遗传物质具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%,或100%所述:物。有许多可用于^分析'、对比和表征植物遗传背景的基于实验室的技术；其中有同工酶电泳，限制性片段长度多态性(RFLPs),随机扩增多态性DNA(RAPDs),任意引发的聚合酶链式反应(AP-PCR)，DNA扩增指紋法(DAF),序列表征的扩增区(SCARs),扩增片段长度多态性(AFLPs)，和也称作微卫星的单序列重复(SSRs)。本发明的重组DNA构建体向植物中的导入，可以通过任意合适的技术来实现，包括但不限于直接DNA摄取，化学处理，电穿孔，显微注射，细胞融合，感染，载体介导的DNA转移，轰击，或农杆菌介导的转化。当希望将多个或堆叠的重组DNA构建体或分离的多核苷酸整合入基因组中时(例如，以实现2个或多个分离的多核苷酸的共表达)，可以将单个分离的多核苷酸导入亲本系中，并通过传统的育种技术进行杂交，以在随后的后代植物中提供希望的组合或堆叠。在下面阐述了优选的技术，实施例3是关于玉米植物细胞的转化，实施例8是关于大豆植物细胞的转化。主要使用根癌农杆菌转化双子叶植物和得到转基因植物的其它优选方法，包括对棉花(美国专利号5,004,863,美国专利号5,159,135,美国专利号5,518,卯8);大豆(美国专利号5,569,834,美国专利号5,416,011,McCabe等人,BiolTechnology6:923(1988)，Christou等人，PlantPhysiol.87:671674(1988));芸苔(美国专利号5,463,174);花生(Cheng等人，PlantCellRep.15:653657(1996),McKently等人，PlantCellRep.14:699703(1995));木瓜；和豌豆(Grant等人，PlantCellRep.15:254258,(1995))公开的那些。还已经报道了使用电穿孔、粒子轰击和农杆菌转化单子叶植物，作为优选的方法包括，例如，在下述植物中实现的转化和植物再生，,(Bytebier等人，Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)84:5354,(1987));大麦(Wan和Lemaux,PlantPhysiol104:37(1994));玉米(Rhodes等人，Science240:204(1988)，Gordon誦Kamm等人，PlantCell2:603618(1990),Fromm等人，BiolTechnology8:833(1990)，Koziel等人，BiolTechnology11:194,(1993),Armstrong等人，CropScience35:550557(1995》;燕麦(Somers等人，BiolTechnology10:1589(1992));鸭茅(Horn等人，PlantCellRep.7:469(1988));稻(Toriyama等人，TheorAppl.Genet.205:34,(1986);Part等人，PlantMol.Biol.32:11351148,(1996);Abedmm等人，Aust.J.PlantPhysiol.24:133141(1997);Zhang和Wu,Theor.Appl.Genet.76:835(1988);Zhang等人PlantCellRep.7:379,(1988);Battraw和Hall,PlantSci.86:191202(1992);Chnstou等人，Bio/Technology9:957(1991));黑麦(DelaPena等人，Nature325:274(1987》；甘蔗(Bower和Birch,PlantJ.2:409(1992》；高羊茅草(Wang等人，BiolTechnology10:691(1992》,和小麦(Vasil等人，Bio/Technology10:667(1992);美国专利号5,631,152)。有许多从植物组织再生植物的方法。具体的再生方法取决于原始植物组织和要再生的具体植物种。从单一植物原生质体转化体或从多个转化的外植体再生、发育和培柏_植物，是本领域众所周知的(Weissbach和Weissbach,In:MethodsforPlantMolecularBiology,(Eds.),AcademicPress,Inc.SanDiego，CA,(1988))。该再生和生长过程通常包括下述步骤选择转化的细胞，通过胚发育的通常阶段，通过生根的小植抹阶段，培养那些个体化的细胞。类似地再生转基因的胚和种子。得到的转基因的生根的芽此后种植在合适的植物生长培养基例如土壤中。含有编码目标蛋白的外来的、外源性的分离的核酸片段的植物的发育或再生，是本领域众所周知的。优选地，再生的植物自花授粉，以提供纯合的转基因植物。否则，使从再生的植物得到的花粉与农艺学上重要的系的种子生长的植物杂交。相反，来自这些重要系的植物的花粉用于授粉再生的植物。使用本领域技术人员众所周知的方法，培植含有目标多肽的本发明的转基因植物。;险测蛋白的测定可以通过SDS-聚丙烯酰胺凝月交电泳或免疫测定来进行。检测底物或酶产物的水平测定可以使用气相色谱或液相色谱(用于分离)和紫外或可见光分光光度法或质谱法(用于检测)等来进行。目标酶的mRNA的水平的测定，可以使用RNA印迹法或RT-PCR技术来实现。一旦再生植物、并已经得到转基因纯合的后代植物，在后代的类似种子中将观察到具有稳定表型的植物。优选方法
技术领域：
：本发明也包括改变植物茎机械强度的方法；评价植物茎机械强度的方法；评价植物中纤维素含量的方法；改变植物的细胞壁纤维素含量和/或生长速率的方法，赋予植物雄性不育的方法，和降低植物高度和/或植物的器官大小的方法。优选地，所述植物是单子叶植物或双子叶才直物，更优选玉米或大豆4直物，更优选玉米纟直物。所述植物也可以是向日葵，高梁，卡诺拉苔，小麦，苜蓿，棉花，稻，大麦或粟。改变(优选增力。)植物茎机械强度的优选方法包含(a)将重组DNA构建体导入可再生的才直物细l包，以生成转化的植物细l包，所述重组DNA构建体含有至少一个调节元件(优选地，在植物中有功能的启动子)，所述调节元件可操作地连接到(i)编码与茎机械强度有关的多肽的核苷酸序列，其中所述多肽的氨基酸序列基于ClustalV比对方法，与SEQIDNO:4,6,8,10,12,14，16或18比4支，具有至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性，或80%至100%之间的任意其它整数，或(ii)该核苷酸序列的互补序列，其中所述互补序列和核苷酸序列由相同数目的核苷酸组成，且是100%互补；和(b)从所述转化的植物细胞再生转基因植物，其中所述转基因植物在它的基因組中包含所述重组DNA构建体，且其中与不包含所述重组DNA构建体的对照植物相比，所述转基因植物表现出茎机械强度的改变(优选增力口)。评价植物茎机械强度的一种优选方法包含(a)向可再生的植物细月包中导入重组DNA构建体，以生成转化的植物细月包，所述重组DNA构建体包含在植物中有功能的启动子，该启动子可操作地连接到(i)多核普酸，其编码基于ClustalV比对方法，与SEQIDNO:4,6,8，10,12,14,16,和18比4支，氨基酸序列具有至少80%序列同一性、或从81%至最高达(且包括)100%的任意整数序列同一性的多肽，或(ii)上述(a)(i)所述多核苦酸的全长互补序列；(b)从所述转化的植物细胞再生转基因植物；和(c)评价所述转基因植物的茎机械强度。该方法另外可以包含(d)获取源自所述转基因植物的后代植物；和(e)评价所述后代植物的茎机械强度。评价植物茎机械强度的另一种优选方法包含(a)向可再生的植物细胞中导入重组DNA构建体，以生成转化的植物细胞，所述重组DNA构建体包含在植物中有功能的启动子，该启动子可操作地连接到(i)多核苷酸，其编码基于ClustalV比对方法，与SEQIDNO:4,6，8,10,12，14,16，和18比4交，氨基酸序列具有至少80%序列同一性、或从8P/。至最高达(且包括)100%的任意整数序列同一性的多肽，或(b)上述(a)(i)所述多核苷酸的全长互补序列；(b)从所述转化的植物细胞再生转基因植物；(c)获取源自所述转基因植物的后代植物；和(d)评价所述后代植物的茎机械强度。评价植物纤维素含量的一种优选方法包含(a)向可再生的植物细胞中导入重组DNA构建体，以生成转化的植物细胞，所述重组DNA构建体包含可操作地连接到在植物中有功能的启动子上的多核苷酸，其中所述多核苷酸编码基于ClustalV比对方法，与SEQIDNO:4,6,8,10,12,14，16,和18比较，氨基酸序列具有至少80%序列同一性、或从81%至最高达(且包括)100%的任意整数序列同一性的多肽；(b0从所述转化的植物细胞再生转基因植物；和(c)评价所述转基因植物的纤维素含量。该方法另外可以包含(d)获取源自所述转基因植物的后代植物；和(e)评价所述后代植物的纤维素含量。评价植物纤维素含量的另一种优选方法包含(a)向可再生的植物细胞中导入重组DNA构建体，以生成转化的植物细胞，所述重组DNA构建体包含可操作地连接到在植物中有功能的启动子上的多核苷酸，其中所述多核苷酸编码基于ClustalV比对方法，与SEQIDNO:4,6，8,10,12,14,16,和18比较，氨基酸序列具有至少80%序列同一性、或从81%至最高达(且包括)100%的任意整数序列同一性的多肽；(b)从所述转化的植物细胞再生转基因植物；(c)获取源自所述转基因植物的后代植物；和(d)评价所述后代植物的纤维素含量。选择具有改变的纤维素含量的植物的一种优选方法包含(a)得到本发明的任意植物(例如任一个上面讨论的优选实施方案)；(b)评价在步骤(a)中得到的植物的纤维素含量；和(c)当纤维素含量与对照植物相比改变时，选择步骤(b)的评价的植物。优选地，当纤维素含量增加时，甚至更优选地，当纤维素含量是至少35%、40%、45%、50%、55%,或60%时，和/或当纤维素干物质含量是至少100mg/cm,200mg/cm,300mg/cm,400mg/cm,或500mg/cm时，选择评价的植物。在本文实施例10中，阐述了测量纤维素含量的优选方法。改变(优选增加)植物的细胞壁纤维素含量和/或改变(优选提高)生长速率的一种优选方法包含，向植物的基因组中整合入(例如，通过转基因技术或转基因技术和传统育种的组合)一个或多个重组DNA构建体，从而共表达(a)至少一个选自下组的分离的多核苷酸(i)多核普酸，其编码基于ClustalV比对方法，与SEQIDNO:2,4,6,8,10,12，14,16,和18比较，氨基酸序列具有至少80%序列同一性、或从81%至最高达(且包括)100%的任意整数序列同一性的多肽；(ii)多核苷酸，其核酸序列基于ClustalV比对方法，与SEQIDNO:1，3,5,7,9,11,13,15,和17比较，具有至少60%序列同一性、或从61%至最高达(且包括)100%的任意整数序列同一性；和(iii)上述(a)(i)或(a)(ii)的多核苷酸的全长互补序列；和(b)至少一个选自下述的分离的多核苷酸(i)多核苷酸，其编码基于ClustalV比对方法，与SEQIDNO:20,22,24,26,28,30,32,34,36，38,40,和42比较，氨基酸序列具有至少80%序列同一性、或从81%至最高达(且包括)100%的任意整数序列同一性的多肽；(ii)多核苷酸，其核酸序列基于ClustalV比对方法，与SEQIDNO:21，23,25,27,29，31，33，35,37,39,和41比较，具有至少60%序列同一性、或从61%至最高达(且包括)100%的任意整数序列同一性；和(iii)上述(b)(i)或(b)(ii)的多核苷酸的全长互补序列。优选地，增加植物细胞壁纤维素含量的方法包含，向植物的基因组中整合入一个或多个重组DNA构建体，/人而共表达(a)至少一个选自下组的分离的多核苷酸(i)多核苷酸，其编码基于ClustalV比对方法，与SEQIDNO:2比较，氨基酸序列具有至少80%序列同一性、或从81%至最高达(且包括)100%的任意整数序列同一性的多肽；(ii)多核苷酸，其核酸序列基于ClustalV比对方法，与SEQIDNO:l比较，具有至少60%序列同一性、或从61%至最高达(且包括)100%的任意整数序列同一性；和(iii)上述(a)(i)或(a)(ii)的多核苷酸的全长互补序列；和(b)至少一个选自下组的分离的多核苷酸(i)多核苷酸，其编码基于ClustalV比对方法，与SEQIDNO:38,40,和42比较，氨基酸序列具有至少80%序列同一性、或从81%至最高达(且包括)100%的任意整数序列同一性的多肽；(ii)多核苷酸，其核酸序列基于ClustalV比对方法，与SEQIDNO:37，39,和41比较，具有至少60%序列同一性、或从61%至最高达(且包括)100%的任意整数序列同一性；和(iii)上述(b)(i)或(b)(ii)的多核苷酸的全长互补序列。优选地，提高植物生长速率的方法包含，向植物的基因组中整合入一个或多个重组DNA构建体，/人而共表达(a)至少一个选自下组的分离的多核苷酸(i)多核苷酸，其编码基于ClustalV比对方法，与SEQIDNO:6比较，氨基酸序列具有至少80%序列同一性、或从81%至最高达(且包括)100%的任意整数序列同一性的多肽；(ii)多核苷酸，其核酸序列基于ClustalV比对方法，与SEQIDNO:5比较，具有至少60%序列同一性、或从61%至最高达(且包括)100%的任意整数序列同一性；和(iii)上述(a)(i)或(a)(ii)的多核苷酸的全长互补序列；和(b)至少一个选自下组的分离的多核苷酸(i)多核苷酸，其编码基于ClustalV比对方法，与SEQIDNO:20,32,和34比较，氨基酸序列具有至少80%序列同一性、或从81。/。至最高达(且包括)100%的任意整数序列同一性的多肽；(ii)多核苷酸，其核酸序列基于ClustalV比对方法，与SEQIDNO:19,31,和33比4支，具有至少60%序列同一性、或从61%至最高达(且包括)100%的任意整数序列同一性；和(iii)上述(b)(i)或(b)(ii)的多核苷酸的全长互补序列。赋予植物雄性不育的一种优选方法包含(a)向可再生的植物细胞中导入抑制DNA构建体，后者包含在植物中有功能的启动子，该启动子可操作地连接到(i)以下核酸序列的全部或部分(A)核酸序列，其编码基于ClustalV比对方法，与SEQIDNO:10比4交，氨基酸序列具有至少50%序列同一性、或从51%至最高达(且包括)100%的任意整数序列同一性的多肽，或(B)上述(i)(A)的核酸序列的全长互补序列；或(ii)源自目标靶基因的全部或部分有义链或反义链的区域，所述区域的核酸序列基于ClustalV比对方法，与得到所述区域的全部或部分有义链或反义链比较，具有至少50%序列同一性、或从51%至最高达(且包括)100%的任意整数序列同一性，且其中所述目标革巴基因编码Bk2L5多肽；和(b)从所述转化的植物细胞再生转基因植物，其中所述转基因植物在它的基因组中包含所述抑制DNA构建体，且其中与不包含所述抑制DNA构建体的对照植物相比，所述转基因植物表现出降低的植物高度和/或减小的器官大小。该方法另外可以包含(c)获取源自所述转基因植物的后代植物，其中所述后代植物在它的基因组中包含所述抑制DNA构建体。降低植物高度和/或减小植物器官大小的一种优选方法包含(a)向可再生的植物细胞中导入抑制DNA构建体，后者包含在植物中有功能的启动子，该启动子可操作地连接到(i)以下核酸序列的全部或部分(A)核酸序列，其编码基于ClustalV比对方法，与SEQIDNO:6比较，氨基酸序列具有至少50%序列同一性、或从51%至最高达(且包括)100%的任意整数序列同一性的多肽，或(B)上述(i)(A)的核酸序列的全长互补序列；或(ii)源自目标靶基因的全部或部分有义链或反义链的区域，所述区域的核酸序列基于ClustalV比对方法，与得到所述区域的全部或部分有义链或反义链比41，具有至少50%序列同一性、或从51%至最高达(且包括)100%的任意整数序列同一性，且其中所述目标耙基因编码Bk2L3多肽；和(b)从所述转化的植物细胞再生转基因植物，其中所述转基因植物在它的基因组中包含所述抑制DNA构建体，且其中与不包含所述抑制DNA构建体的对照植物相比，所述转基因植物表现出降低的植物高度和/或减小的器官大小。该方法另外可以包含(c)获取源自所述转基因植物的后代植物，其中所述后代植物在它的基因组中包含所述抑制DNA构建体。分离的核酸和蛋白和本发明的任意实施方案可以用于广范围的植物类型，尤其单子叶植物，例如禾本科的种，包括两色蜀黍和玉米。本发明的分离的核酸和蛋白也可以用于来自下述属的种南瓜属，玫瑰属，葡萄属，胡桃属，草莓属，百脉根属，苜蓿属，驴食豆属，三叶草属，胡声巴属，虹豆属，柑桔属，亚麻属，老鹳草属，木薯属，胡萝卜属，拟南芥，芸苔属，萝卜属，芥属，颠茄属，辣椒属，曼陀罗属，t菪属，番茄属，烟草属，茄属，碧冬茄属，毛地黄属，Majorana,Ciahorium,向日葵属，莴苣属，雀麦属，天门冬属，金鱼草属，Heterocallis,Nemesis,天竺葵属，Panieum,《良尾草属，毛复属，千里光属，Salpiglossis,黄瓜属，Browaalia,大豆属，豌豆属，菜豆属，黑麦草属，稻属，燕麦属，大麦属，黑麦属，小麦属，箣竹属，牡竹属，和梨竹属。实施例在下面的实施例中进一步解释了本发明，其中份数和百分比按重量计，度数是摄氏度，除非另有说明。应当理解，这些实施例尽管指明了本发明的优选实施方案，仅仅作为解孝奪而给出。从上面的讨论和这些实施例中，本领域技术人员可以确定本发明的基本特征，在不背离其精神和范围的情况下，可以作出本发明的多种变化和改进，使它适用于多种用途和条件。因而，本领域才支术人员,人前面的描述，可以明白除了本文显示和描述的那些以外的本发明的多种改进。这样的改进也在所附权利要求书的范围内。实施例1编码Bk2-样蛋白的玉米cDNA的表征玉米應差2(bk2)表型首次报道于1940年(Langham,MNL14:21-22(1940))，通过表型作图在100厘摩区周围的标记umc95和bnl7.13之间的chr9L(Howe11等人，MNL65:52-53(1991))。以前，证实了克隆csclc.pk005.k4:fis(SEQIDNO:l)编码脆茎2多肽(SEQIDNO:2)(国际申请号PCT/US2005/035450，其要求2004年10月6日提交的美国临时申请号60/615,868的优先权，其完整内容在本文中引作参考)。还公开了Bk2基因家族的另外2个成员(SEQIDNO:7和8和SEQIDNO:13和14)。在该公开内容中，这些基因已经命名为Bk2-样(Bk2L)。使用国家生物技术信息中心(NCBI)提供的BLASTN或TBLASTN算法，对几个数据库检索在核酸和氨基酸水平与玉米應,2(BW)序列(SEQIDNO:1)同源的其它玉米cDNA序列，所述数据库包括、但不限于，DuPont的内部专有数据库(基础的局部比对检索工具；Altschul等人，汄A/o/.Ao/.215:403-410(1993);Altschul等人，M/c/e/c25:3389-3402(1997))和可公开得到的玉米基因组查询序列(GSS)和TIGR玉米基因组集合(TIGR基因指数数据库，TheInstituteforGenomicResearch,Rockville,MD20850;Quackenbush等人,J.A/"wc/e/c爿c/AW仏28(1):141-145(2000))。分离出了Bk2基因家族的6个新成员(Bk2Ll、Bk2L3、Bk2L5、Bk2L6、Bk2L8和Bk2L9)。表1歹'J出了在本说明书中公开的除了Bk2自身以外所有Bk2-样蛋白。表1<table>tableseeoriginaldocumentpage49</column></row><table>图1A-1F显示了在表1中报道的氨基酸序列的ClustalV比对，其中使用缺省参数。图2显示的图表对比了图1A-1F所示的9个氨基酸序列之间的同一性百分比(和下半三角中的趋异性百分比)，其中使用ClustalV比^t方法。通过对公开数据库进行EST的BLAST(基础的局部比对检索工具；Altschul，S.F.，等人，丄M)/.肠/.215:403-410(1993))检索,进一步筌别出每个cDNA编码的多肽的可能的功能。对在BLAST"nr"数据库(包含所有非冗余的GenBankCDS翻译，源自3-维结构Brookhaven蛋白数据库的序列，SWISS-PROT蛋白序列数据库的最新主版本，EMBL,和DDBJ数据库)中包含的序列进行相似性检索。使用国家生物技术信息中心(NCBI)提供的BLASTN算法，分析序列的相似性。将DNA序列翻译在所有可读框中，并使用NCBI提供的BLASTX算法(Gish,W.和States,D.丄，Atowre3:266-272(1993》，与"nr"数据库中包含的所有可公开得到的蛋白序列对比相似性。在表2中显示了由包含指定的cDNA克隆的整个cDNA插入物编码的整个Bk2-样蛋白的氨基酸序列的"评分"结果。表2中的数据也显示了SEQIDNO:2，4,6，8，10,12,14,16和18所述氨基酸序列的同一性百分比的计算结果，在NCBI—般标识符编号列中指出了序列表2编码与Bk2-样蛋白同源的多肽的序列的BLAST结果基因(SEQIDNO::NCBi—般标识符)l编号(登记号)l评分(比特)同一性百分比Bk2Ll(SEQIDNO:3)Bk2L3(SEQIDNO:Bk2L4(SEQIDNO:5)7)iNCBIGII34733385|1266|(AA281633.1)」INCBIGII30090026I868I(AAOi;7706.1)INCBIGII30090026I922I(AAO17706.1)100%95%97%Bk2L5(SEQIDNO:9)Bk2L6(SEQIDNO:NCBIGI52076665|1079(BAD45565.1〉NCBIGI50939113I742(XP479084.1)79%81%Bk2L7(SEQIDNO:13)NCBIGI50939113(XP479085,1)751Bk2L8(SEQIDNO:15)NCBIGI34898176(NP—910434.1)83882%65%Bk2L9(SEQIDNO:17)NCBIGI50927043(XP—473354.1)59763%图6显示了来自玉米的Bk2L蛋白、来自稻的BC1L蛋白和来自拟南芥的COBL蛋白(NCBI登记号在括号中)的种系发生分析。沿着分支的数字是启发式检索超过5,000个重复得到的自引导值。仅显示了得到>50%时间支持的单系组的自引导值。分支长度与推断的氨基酸差异成比例。实施例2Bk2-样蛋白的基因表达分析使用Solexa的大量平行信号测序(MPSS)技术(参见表3)(Brenner等人，淑S她c/mo/.18:630-634(2000);Brenner等人，尸rac.淑/.JcW.U.S.A.97:1665-1670(2000》，检查了在表1中公开的^:2-^^基因家族的表达的组织特异性。MPSSTM包含从已经逆转录的mRNA样品建立17个石咸基的信号标志。对标志同时测序，并分配给值，然后对比不同组织之间的标志表达或标志丰度。因而，MPSStm平台可以用于测定特定基因的表达模式，和它在不同组织中的表达水平。数字是在第二列中列出的每个组织的多个文库的平均值。表3玉米中Bk2基因家族的PPM表达<table>tableseeoriginaldocumentpage52</column></row><table>SW(表3,第3列和图3)在外壳、叶、根、茎和分离的维管束中表达，但是在仁、分生组织、花粉或穗丝组织中不表达。该表达模式与SM基因在次生壁形成中的作用相一致，因为表达它的所有组织都含有至少一些木质化的细胞。在图4(也参见图5A,第2歹'j)中显示了Bk2的表达水平与12个玉米CesA基因的表达水平的相关系数分析。SH基因的表达模式非常类似于以前公开的形成次生壁的CesA基因，即CesAlO,11和12的表达沖莫式(参见2005年8月16日授权的美国专利号6,930,225中的图5，其完整内容在本文中引作参考)。更具体地，相对于该类中的任意其它基因，Bk2与玉米CesAlO，11,和12基因中的每一个显示出更高的相关系数，约〉0.8。因为3个CesA基因也共表达，它们的对应蛋白可能与Bk2蛋白一起形成功能性复合物。表4列出了迄今为止已知的所有形成初生壁和次生壁的CesA蛋白(美国专利号6,930,225,2004年10月12日授权的美国专利号6,803,498，其完整内容在本文中引作参考)。玉米CesAlO，11，和12基因和它们的来自拟南芥和稻的定向直向同源基因已经被认为参与次生壁形成(Tanaka等人，尸/awf尸/^ho/.133:73-83(2003);Taylor等人，/Voc.A^f/.Jcat/.U.S.A.100:1450-1455(2003);Appenzeller等人，Ce〃w/o"11:287-299(2004))。Bk2和形成次生壁的CesA基因的共表达，支持了Bk2在玉米次生壁形成中的作用。表4<table>tableseeoriginaldocumentpage53</column></row><table>显示出与CesA基因的相关表达的另一个Bk2L基因是Bk2L3。Bk2L3的表达模式非常类似于以前报道的参与初生壁形成的CesA基因(Holland等人，尸/a"f尸/z"w/.123:1313-1323(2000);Dhugga，Cw".Op/".尸/虛腺.4:488-493(2001);Appenzeller等人，Ce〃w/麼11:287-299(2004))。3个基因，具体地是CesAl，7和8,似乎可能形成功能性纤维素合酶复合物，用于初生壁形成。Bk2L3基因的表达与这3个CesA基因高度相关，似乎类似于由3个CesA蛋白和一个Bk2蛋白组成的次生壁纤维素合酶复合物，这4个蛋白可以形成功能性纤维素合酶复合物，用于初生壁形成。Bk2L5仅在花粉中表达。有些在穗丝中的表达最可能源自在其中生长的花粉管。Bk2L8似乎是叶-优选的，Bk2L6是胚乳-特异性的。在图5A和5B中显示了从SolexaMPSStm研究的来自玉米的所有不同SM和CeM基因的表达水平之间的关联。实施例3预示实施例在茎特异性的强启动子控制下，通过过表达玉米S^々f基因，构建增强的茎强度构建嵌合转基因，以组织特异性的方式直接过表达Bk2基因/多肽。转基因构建体包含编码Bk2L3和/或Bk2L6的玉米cDNA(例如，SEQIDNO:5或SEQIDNO:11),其可操作地连接到来自苜蓿的茎特异性的S2A基因的启动子上(Abrahams等人，尸/Mo/.AW.27:513-528(1995))。然后将含有Bk2L3或Bk2L6ORF的DNA融合至5'末端上的S2A启动子和3'末端上的pinll终止子，以生成图3所示的表达盒。然后将构建体连接到含有CaMV35S启动子驱动的bar基因和pinll终止子的选择标记盒上。本领域技术人员会明白，可以采用不同的启动子、5，末端序列和/或3'末端序列来达到可比较的表达结果。使用Zhao(美国专利号5,981,840,1999年11月9日授权；其内容特此引作参考)的基于农杆菌的转化方法，通过用该表达盒转化未成熟的玉米胚，生成转基因玉米植物。尽管为S2A启动子-B&2L3(或BW丄6)表达盒转化玉米才直物描述了下面的方法，本领域普通4支术人员会^人识到，该方法可以用于使用包含连接到玉米^:2fJ(或^:2^5)基因上的启动子的任意核苷酸构建体或表达盒生产转化的玉米植物，用于在植物中表达。从玉米分离未成熟的胚，使胚接触农杆菌悬浮液，其中该细菌能将S2A启动子-BWZJ(或^:2Z^)表达盒(上面解释的)转移至至少一个未成熟的胚的至少一个细胞(步骤1:感染步骤)。在该步骤中，将未成熟的胚浸入农杆菌悬浮液中以起始接种。将胚与农杆菌共同培养一段时间(步骤2:共培养步骤)。在感染步骤后，将未成熟的胚在固体培养基上培养。在该共培养阶段后，进行任选的"静止"步骤。在该静止步骤中，在至少一种抗生素的存在下培养胚，已知该抗生素在不加入植物转化林的选择剂时能抑制农杆菌的生长(步骤3:静止步骤)。在具有抗生素但没有选择剂的固体培养基上培养未成熟胚以去除农杆菌，并为受感染细胞提供静止期。此后，在含有选择剂的培养基上培养经接种的胚，生长中的经转化愈伤组织被收集(步骤4:选择步骤)。优选地，在具有选择剂的固体培养基上培养未成熟的胚，造成经转化细胞的选择性生长。通过在固体选择培养基上培养愈伤组织，使得到的愈伤组织随后再生成为植物(步骤5:再生步骤)。实施例4预示实施例在茎特异性强启动子控制下，通过用在启动子区中含有增强子元件的玉米Bk2-样基因的转基因表达，构建增强的茎强度通过将异源增强子元件置于天然SA:2^3(或SW丄6)基因的启动子区中，增强BMZJ(或^:2丄6)基因的表达。构建一个表达盒，其包含与BA2L3(或S々2L6)的天然启动子和全长cDNA融合的增强子元件例如CaMV35S。然后可以通过用实施例3所述的表达盒转化未成熟的玉米胚，生产转基因玉米植物。实施例5预示实施例通过玉米^:2-^^和CesA基因的过表达，构建增强的茎强度筌于形成次生壁的基因主要影响植物组织的机械强度、不影响形态表型，形成初生壁的基因可以影响植物生长速率，因而它们的调控可以用于提高生长速率。以前证实了玉米基因CesAl,7,和8在多种组织中共表达，表明它们可能形成功能性酶复合物。Bk2L3与这3个CesA基因共表达，强烈表明所有这4个基因的蛋白产物形成一种功能性酶复合物。在由不同启动子、优选其表达与细胞伸长有关的基因的启动子驱动的玉米中同时过表达这4个基因，这些基因作为单一多基因构建体或作为含有这些基因的不同组合的分开的构建体，可以生产具有增加的生长速率的转基因植物。任意其它的Bk2L基因也可以与上述的3个CesA基因组合使用，以生产具有增加的生长速率的转基因植物。实施例6预示实施例通过玉米^^-//和CesA基因的过表达，构建增强的茎强度除了有助于机械强度以外，次生壁占植物生物质的大部分。鉴于机械强度可以用于减少作物倒伏，品质和数量生物质对于许多其它用途是重要的，包括乙醇生产。Bk2基因与玉米CesAlO,11,和12基因一起，提供了一条增加细胞壁中纤维素比例的途径。乙醇生产的效率与生物质中纤维素的量直接相关。用纤维素替代木质素，在青贮饲料消化率方面也是有用的。关于形成初生壁的基因，如实施例5所述，可以使Bk2基因与CesAlO,11，和12基因共表达，但是在次生壁-特异性的启动子控制下，以生产具有提高的茎强度和生物质品质的转基因植物。实施例7预示实施例构建玉米5^-//基因的减量调节由于形成初生壁的CesA基因有助于细胞扩充，它们的有限的减量调节可以用于降低植物高度或器官大小。更具体地，Bk2L3基因的表达与形成初生壁的CesA基因高度相关。鉴于可能需要过表达功能性酶复合物的所有成员来提高酶活性，仅一个成员的减量调节可能足以降低活性。例如Bk2L3(和/或Bk2L5，对于雄性不育)的减量调节，可以通过共抑制、RNAi、反义RNA或微RNA中的任意技术来实现，产生矮小的转基因植物。高度降低已经用于一些收获指数较低且需要提高的作物植物。例如，现代的小麦和稻品种，比它们的更老的副本明显更低。降低植物高度的能力，主要是每种这样的作物的绿色革命的原因。实施例8子贞示实施例在茎-特异性的强启动子控制下，双子叶植物细^>中重组DNA构建体的表达可以构建在cDNA片段的5'的包含来自苜蓿茎-特异性的S2A基因的启动子的表达盒(Abrahams等人，尸/"WAZo/.Ao/.27:513-528(1995)),并用于在转化的大豆中表达本发明的多肽。pinll终止子可以置于cDNA片段的3'。这样的构建体可以用于过表达BA:2-y一基因。会认识到，本领域技术人员可以采用不同的启动子和/或3'末端序列来达到相当的表达结果。使用适当的寡核苷酸引物，通过cDNA克隆的聚合酶链式反应(PCR)，可以制备该基因的cDNA片段。可以将克隆位点掺入寡核苷酸，以在插入表达载体时提供合适的DNA片段方向。然后如上所述进行扩增，将分离的片段插入携带种子表达盒的pUC18载体中。然后可以用包含编码本发明的多肽的序列的表达载体转化大豆胚。为了诱导体细胞胚，即子叶，将大豆品种A2872的表面灭菌的、未成熟的种子切成3-5mm长，在26°C、在光照或黑暗中在适宜的琼脂培养基上培养6-10周。然后切离生成次生胚的体细胞胚，置于合适的液体培养基中。重复选择作为早期球形阶段的胚繁殖的体细胞胚簇后，如下所述维持悬浮液。在旋转摇床(150rpm)上于26。C将大豆胚发生悬浮培养物保持在35ml液体培养基中，用荧光灯提供16:8小时昼/夜循环。通过将约35mg组织接种到35ml液体培养基中，每两周将培养物进行继代培养。然后通过粒子枪轰击的方法(Klem等人(1987)A^fwe(London)327:70-73，美国专利号4,945,050),转化大豆胚发生悬浮培养物。DuPontBiolisticPDS1000/HE仪器(helmmretrofit)可以用于这些转化。可以用于促进大豆转化的选择标记基因，是包含来自花椰菜花叶病毒的35S启动子(Odell，爭乂，(1985)脂廳313:810-812)、来自质粒pJR225的潮霉素磷酸转移酶基因(来自大肠杆菌；Gritz,爭乂，(1983)G匿25:179-188)和来自根癌农杆菌Ti质粒的T-DNA的胭脂碱合酶基因的3'区域组成的转基因。可以将包含菜豆球蛋白5'区(该片段编码本发明的多肽)和菜豆球蛋白3'区的种子表达盒分离为限制性片段。然后可以将该片段插入携带标记基因的载体的独特的限制位点。向50pl60mg/ml中，加入1[im金颗粒悬浮液(按顺序)5plDNA(1pg/pl),20pi亚精胺(O.lM)，和50piCaCl2(2.5M)。然后将颗粒制品搅拌3分钟，在微量离心机中旋转10秒，去除上清液。然后在400pl70。/o乙醇中洗涤DNA-包被的颗粒1次，重新悬浮于40pl无水乙醇中。可以将DNA/颗粒悬浮液声处理3次，每次1秒。随后将5piDNA+包被的金颗粒加样至各个大载体盘中。将约300-400mg的2周龄悬浮培养物置于空的60x15mm培养皿中，使用移液管将残留液体从组织上去除。对于每次转化实验，正常轰击约5-10个平板的组织。膜破坏压力设定为1100psi,将箱体抽真空至28英寸7义柱的真空度。将组织;改在离留置筛(retainingscreen)约3.5英寸处，且轰击3次。轰击后，将组织分成2半，放回到液体中，如上所述进行培养。轰击后5-7天，将液体培养基更换为新鲜培养基，轰击后11-12天，更换为含有50mg/ml潮霉素的新鲜培养基。该选择培养基每周更新。轰击后7-8周，观察到从未经转化的坏死胚发生簇中生长出绿色的经转化的组织。取走分离出的绿色组织，接种至各烧瓶中，以生成新的、无性繁殖的转化的胚发生悬浮培养物。各个新林系被作为独立的转化事件加以处理。这些悬浮液随后可继代培养，并维持为未成熟的胚簇，或通过各体细胞胚的成熟和萌发再生为整纟朱才直物。实施例9予贞示实施例在茎特异性的强启动子控制下,58微生物细胞中重组DNA构建体的表达可以将编码本发明的脆茎2-样多肽的cDNA(SEQIDNO:1,3,5,7,9,11,13,15或17)插入T7大肠杆菌表达载体pBT430。该载体是pET-3a的衍生物(Rosenberg等人(1987)G匿5(5:125-135),它使用噬菌体T7RNA聚合酶/T7启动子系统。通过首先在它们的起始位置破坏pET-3a中的EcoRI和HindIII位点，构建质粒pBT430。将含有EcoRI和HindIII位点的寡核苷酸游f接子插入pET-3a的BamHI位点。这会建立具有额外的独特克隆位点的pET-3aM,该位点用于将基因插入表达载体中。然后，使用定位于寡核苷酸的诱变，将在翻译起始位置的Ndel位点转化成Ncol位点。该区域中pET-3aM的DNA序列，即5'-CATATGG,在pBT430中转化成5'-CCCATGG。可以适当地消化含有cDNA的质粒DNA，以释》文编码该蛋白的核酸片段。然后可以在1%低熔点琼脂糖凝胶上纯化该片段。緩冲液和琼脂糖含有10ug/ml溴化乙锭，以使DNA片段显影。然后可以根据生产商的说明书，通过GELaseTM(EpicentreTechnologies,Madison,WI)消化，从琼脂糖凝胶纯化片段，乙醇沉淀，干燥，重新悬浮于20uL水中。使用T4DNA连接酶(NewEnglandBiolabs(NEB),Beverly,MA),可以将适当的寡核苷酸衔接子连接到片段上。使用如上所述的低熔点琼脂糖，可以从多余的衔接子纯化出含有连接的衔接子的片段。消化载体pBT430,用碱性磷酸酶(NEB)去磷酸化，用如上所述的苯纷/氯仿去蛋白化。然后可以在16。C连接制备的载体pBT430和片段15小时，随后转化进DH5电感受态细月包(GIBCOBRL)。可以在含有LB培养基和100ug/mL氨千西林的琼脂平板上选择转化体。然后通过限制酶分析，筛选含有编码本发明的多肽的基因的转化体的T7启动子的正确方向。为了高水平表达，可以将含有cDNA插入物(相对于T7启动子是正确的方向)的质粒克隆转化进大肠杆菌菌株BL21(DE3)(Studier等人(1986)J.Mo/.Ao/./S9:113-130)。在25。C在含有氨节西林(100mg/L)的LB培养基中生长培养物。在600nm约1的光密度，加入IPTG(异丙基硫代-p-半乳糖苷，诱导物)至0.4mM的终浓度，继续在25°C温育3h。然后通过离心收获细胞，重新悬浮于50uL含有O.lmMDTT和0.2mM苯基曱基石黄酰氟的50mMTris-HClpH8.0中。加入小量的1mm玻璃珠，用微探针超声处理器将混合物超声处理3次，每次约5秒。离心混合物，测定上清液的蛋白浓度。通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，可以分离来自培养物的可溶级分的1ug蛋白。可以观察凝胶上迁移到预期的分子量的蛋白带。实施例10玉米的野生型WA:2)和脆茎(M2-rg/)突变体的茎组织的表征从玉米基因组COOP原种中心(USDA/ARS&CropSciences/UIUC,S-123TurnerHall,1102S.GoodwinAvenue,Urbana，IL61801-4798),得到含有的参照等位基因(M2-ref)的玉米原种。在开花后约2周，评价3抹温室生长的植物(各自是M2-^^M2-^/和它的野生型姐妹株Bk2/^:2-^/;二者源自从相同自交穂得到的种子)的不同特性。使用4411型Instron电机械实验装置(InstronCorp.,Canton,MA),对在穗下的3个结间段(结间段3，4,和5,从穗结点编号)进行3点弯曲实验。锚定点之间的跨宽度是20cm。铁砧以20cm/min的恒定速度垂直压向在水平放置的茎的结点上面约3cm的结间区域，直到它塌陷或折断。将断裂的最大载荷用作区分结间段和茎的强度的度量。在穗结点下面的茎部分，测量总干物质。通过用緩冲液(25mMMOPS，pH7)煮沸粉碎的茎材料2次30分钟，在3林植物的每一抹上的穗结点以下第三和第四结间段，一式两份地测定结构性的干物质和纤维素含量。将剩余的材料悬浮于甲醇/氯仿(3/1，v/v)中1小时，干燥，称重。通过Updegraff方法(Updegraff,」"a/.Aoc/zew.32:120-124(1969)),测定晶状纤维素。简而言之，将磨碎的茎材料置于沸水浴(醋酸水；肖酸的8:2:1混合物)中1小时，用水、然后用95%乙醇洗涤晶状物3次，随后在Speedvac中干燥。如下测定Klason木质素用72。/。(w/w)硫酸温育磨碎的茎材料1小时，用72%硫酸在水中的1:20稀释液洗涤2次，在65。C加热30分钟，用水洗涤l次，在80。C干燥残余物过夜。如(Appenzdler等人，Ce〃w/,11:287-299(2004))所述测定糖组成。总之，茎组织中机械强度的降低与纤维素量的减小及表皮下和维管周厚壁组织纤维中次生细胞壁材料的不均匀沉积高度相关。纤维素的量越低，突变体的壁越薄，反映为每单位长度的茎的千物质含量越低。茎组成和机械强度的领'J量<table>tableseeoriginaldocumentpage61</column></row><table>权利要求1.分离的多核苷酸，其包含(a)编码与茎机械强度有关的多肽的核苷酸序列，其中所述多肽的氨基酸序列基于ClustalV比对方法，与SEQIDNO16或18比较，具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性，或80％至100％之间的任意其它整数；或(b)该核苷酸序列的互补序列，其中所述互补序列和核苷酸序列由相同数目的核苷酸组成，且是100％互补。2.包含权利要求1的多核苷酸的重组DNA构建体，所述多核苷酸可操作地连接到在植物中有功能的启动子上。3.改变植物茎机械强度的方法，其包含(a)向可再生的植物细胞中导入权利要求2的重组DNA构建体，以生成转一化的植物细月包；和(b)从所述转化的植物细胞再生转基因植物，其中所述转基因植物在它的基因组中包含所述重组DNA构建体，且其中与不包含所述重组DNA构建体的对照植物相比，所述转基因植物表现出茎机械强度的改变。4.权利要求3的方法，另外包含(c)获取源自所述转基因植物的后代植物，其中所述后代植物在它的基因组中包含该重组DNA构建体。5.权利要求3的方法，其中所述转基因植物表现出茎机械强度的增力口。6.7.8.—种植物，在它的基因组中包含权利要求2所述的重组DNA构建体。9.权利要求1的分离的多核苷酸，其中通过3点弯曲实验测量所述茎机械强度。10.评价植物茎机械强度的方法，其包含(a)向可再生的才直物细胞中导入重组DNA构建体，以生成转化的植物细胞，所述重组DNA构建体包含在一直物中有功能的启动子，该启动子可操作地连接到(0多核苷酸，其编码基于ClustalV比对方法，与SEQIDNO:4,6,8,10，12,14,16,和18比较，氨基酸序列具有至少80。/。序列同一性的多肽，或(b)上述(a)(i)所述多核苷酸的全长(b)从所述转化的植物细胞再生转基因植物；和(c)评价所述转基因植物的茎机械强度。11.权利要求10的方法，另外包含(d)获取源自所述转基因植物的后代植物；和Ce)评价所述后代植物的茎机械强度。12.评价植物茎机械强度的方法，其包含(a)向可再生的才直物细l包中导入重组DNA构建体，以生成转4匕的植物细胞，所述重组DNA构建体包含在植物中有功能的启动子，该启动子可操作地连接到(i)多核苷酸，其编码基于ClustalV比对方法，与SEQIDNO:4,6,8,10,12,14,16，和18比4交，氨基酸序列具有至少80%序列同一性的多肽，或(b)上述(a)(i)所述多核苷酸的全长互补序列；(b)从所述转化的植物细胞再生转基因植物；(c)获取源自所述转基因植物的后代植物；和(d)评价所述后代植物的茎机械强度。13.—种植物，在它的基因组中包含(a)第一种重组DNA构建体，其包含至少一个在植物中有功能的启动子，该启动子可操作地连接到至少一个选自下组的第一种分离的多核苷酸(i)多核苷酸，其编码基于ClustalV比对方法，与SEQIDNO:2,4,6,8,10,12,14,16,和18比4支，氨基酸序列具有至少80%序列同一性的多肽；(ii)多核苷酸，其核酸序列基于ClustalV比对方法，与SEQIDNO:1,3,5,7,9，11,13,15,和17比4交，具有至少60%序列同一性；和(iii)(a)(i)或(a)(ii)的多核苷酸的全长互补序列；和(b)第二种重组DNA构建体，其包含至少一个在植物中有功能的启动子，该启动子可操作地连接到至少一个选自下组的第二种分离的多核苦酸(iv)多核苷酸，其编码基于ClustalV比对方法，与SEQIDNO:20,22,24,26,28,30,32,34,36,38，40,和42比较，氨基酸序列具有至少80%序列同一性的多肽；(v)多核苷酸，其核酸序列基于ClustalV比对方法，与SEQIDNO:21，23,25，27，29,31,33,35,37，39,和41比较，具有至少60%序列同一性；和(vi)上述(b)(iv)或(b)(v)的多核苷酸的全长互补序列，且其中与不包含所述第一种重组DNA构建体和所述第二种重组DNA构建体的对照植物相比，所述植物表现出增加的细胞壁纤维素含量或增加的生长速率。14.一种植物，在它的基因组中包含至少一个调节序列，该调节序列可操作地连接到(a)至少一个选自下组的分离的多核苷酸(i)多核苷酸，其编码基于ClustalV比对方法，与SEQIDNO:2，4,6,8，10,12,14,16,和18比较，氨基酸序列具有至少80%序列同一性的多肽；(ii)多核苦酸，其核酸序列基于ClustalV比对方法，与SEQIDNO:1，3，5，7,9，11，13,15，和17比较，具有至少60%序列同一性；和(iii)上述(a)(i)或(a)(ii)的多核苷酸的全长互补序列；和(b)至少一个选自下组的分离的多核苷酸(i)多核苷酸，其编码基于ClustalV比对方法，与SEQIDNO:20,22,24,26,28,30，32,34,36,38，40,和42比4交，氨基酸序列具有至少80%序列同一性的多肽；(ii)多核苷酸，其核酸序列基于ClustalV比对方法，与SEQIDNO:21，23,25，27，29，31，33，35,37,39,和41比4交，具有至少60%序列同一性；和(iii)上述(bXi)或(b)(ii)的多核苷酸的全长互补序列，且其中与不包含所述至少一个可操作地连接到所述(a)和(b)上的调节序列的对照植物相比，所述植物表现出增加的细胞壁纤维素含量或增加的生长速率。15.权利要求14的植物，其中(a)所述至少一个多核苷酸选自(i)多核普酸，其编码基于ClustalV比对方法，与SEQIDNO:2比较，氨基酸序列具有至少80%序列同一性的多肽；(ii)多核苷酸，其核酸序列基于ClustalV比对方法，与SEQIDNO:1比净交，具有至少60%序列同一性；和(iii)上述(a)(i)或(a)(ii)的多核苷酸的全长互补序列；和(b)所述至少一个分离的多核苷酸选自(i)多核苷酸，其编码基于ClustalV比对方法，与SEQIDNO:38,40，和42比4交，氨基酸序列具有至少80%序列同一性的多肽；(ii)多核苷酸，其核酸序列基于ClustalV比对方法，与SEQIDNO:37,39,和41比4交，具有至少60%序列同一性；和(iii)上述(b)(i)或(b)(ii)的多核苷酸的全长互补序列，且其中与不包含所述至少一个可操作地连接到所述(a)和(b)上的调节序列的对照植物相比，所述植物表现出增加的细胞壁纤维素含量。16.权利要求14的植物，其中(a)所述至少一个多核苷酸选自(i)多核苷酸，其编码基于ClustalV比对方法，与SEQIDNO:6比较，氨基酸序列具有至少80%序列同一性的多肽；(ii)多核苷酸，其核酸序列基于ClustalV比对方法，与SEQIDNO:5比较，具有至少60%序列同一性；和(iii)上述(a)(i)或(a)(ii)的多核苷酸的全长互补序列；和(b)所述至少一个分离的多核苷酸选自(i)多核苷酸，其编码基于ClustalV比对方法，与SEQIDNO:20,32,和34比较，氨基酸序列具有至少80%序列同一性的多肽；(ii)多核苷酸，其核酸序列基于ClustalV比对方法，与SEQIDNO:19,31,和33比较，具有至少60%序列同一性；和(iii)上述(b)(i)或(b)(ii)的多核苷酸的全长互补序列，且其中与不包含所述至少一个可操作地连接到所述(a)和(b)上的调节序列的对照植物相比，所述植物表现出增加的生长速率。17.—种植物，在它的基因组中包含至少一个调节序列，所述调节序列可操作地连接到至少2个选自下组的分离的多核苷酸(a)多核苷酸，其编码基于ClustalV比对方法，与SEQIDNO:2,4,6，8，10,12，14,16，和18比4交，氨基酸序列具有至少80%序列同一性的多肽；(b)多核苷酸，其核酸序列基于ClustalV比对方法，与SEQIDNO:1,3，5,7，9,11,13，15,和17比4交，具有至少60%序列同一性；和(c)上述(a)或(b)的多核苷酸的全长互补序列。18.—种4直物，在它的基因组中包含抑制DNA构建体，该构建体包含在才直物中有功能的启动子，该启动子可操作地连接到(a)以下核酸序列的全部或部分(i)核酸序列，其编码基于ClustalV比对方法，与SEQIDNO:2,4，6,8,10,12,14,16,和18比较，氨基酸序列具有至少50%序列同一性的多肽，或(ii)上述(a)(i)的核酸序列的全长互补序列；或(b)源自目标耙基因的全部或部分有义链或反义链的区域，所述区域的核酸序列基于ClustalV比对方法，与得到所述区域的全部或部分有义链或反义链比较，具有至少50%序列同一性，且其中所述目标靶基因编码选自Bk2、Bk2Ll、Bk2L3、Bk2L4、Bk2L5、Bk2L6、Bk2L7、Bk2L8和Bk2L9的多肽，且其中与不包含所述抑制DNA构建体的对照植物相比，所述植物表现出降低的茎机械强度。19.权利要求18的植物，其中所述抑制DNA构建体包含共抑制构建体，反义构建体，病毒抑制构建体，发夹抑制构建体，茎-环抑制构建体，双链RNA-生产构建体，RNAi构建体，或小RNA构建体。20.—种才直物，在它的基因组中包含抑制DNA构建体，该构建体包含在才直物中有功能的启动子，该启动子可操作地连接到(a)以下核酸序列的全部或部分(i)核酸序列，其编码基于ClustalV比对方法，与SEQIDNO:6比较，氨基酸序列具有至少50%序列同一性的多肽，或(ii)上述(a)(i)的核酸序列的全长互补序列；或域的核i序列基于ClustalV比;于;法，与得l'j所述区域的:部或部分有义链或反义链比较，具有至少50%序列同一性，且其中所述目标靶基因编码Bk2L3多肽，且其中与不包含所述抑制DNA构建体的对照植物相比，所述才直物表现出降低的植物高度和/或减小的器官大小。21.—种植物，在它的基因组中包含抑制DNA构建体，该构建体包含在^t物中有功能的启动子，该启动子可操作地连接到(a)以下核酸序列的全部或部分(i)核酸序列，其编码基于ClustalV比对方法，与SEQIDNO:10比專交，氨基酸序列具有至少50%序列同一性的多肽，或(ii)上述(a)(i)的核酸序列的全长互补序列；或(b)源自目标耙基因的全部或部分有义链或反义链的区域，所述区域的核酸序列基于ClustalV比对方法，与得到所述区域的全部或部分有义链或反义链比较，具有至少50%序列同一性，且其中所述目标靼基因编码Bk2L5多肽，且其中与不包含所述抑制DNA构建体的对照植物相比，所述植物表现出雄性不育。全文摘要本发明涉及编码脆茎2-样(Bk2L)家族多肽的分离的多核苷酸。本发明也涉及以有义或反义方向编码Bk2L多肽的全部或一部分的嵌合基因的构建，其中嵌合基因的表达导致转化的宿主细胞中Bk2L多肽的水平的改变。文档编号C12N15/82GK101379190SQ200680052191公开日2009年3月4日申请日期2006年2月3日优先权日2006年2月3日发明者K·S·杜加申请人:先锋高级育种国际公司