专利名称：人食管癌细胞Fascin基因启动子区调控元件的制作方法
技术领域：
本发明涉及基因表达调控，具体地说，涉及一种人食管癌细胞的Fascin基因启动子区调控元件。
背景技术：
食管癌是我国常见恶性肿瘤，在河南、河北、山西、江苏和四川等省的部分地区发病率高。广东省潮汕沿海地区食管癌的发病率也高，是中国六大食管癌高发区之一，而且是唯一的沿海食管癌高发区。目前，食管癌的发病机制尚不明确。我们最近的研究结果显示，Fascin表达上调是食管癌发生的早期事件，而且它的过表达不仅促进了食管癌细胞的分裂增殖，还与癌细胞的侵袭移动及粘附密切相关。
Fascin基因又称Fascinl，定位于染色体7p22，人类Fascin DNA长度约为17kb，含5个外显子。编码区长度为1482bp，编码493个氨基酸，分子量为55kDa。Fascin基因的蛋白编码产物是一种F-actin结合蛋白，可使F-actin交联成束，但对球状肌动蛋白G-actin没有作用。为了使F-actin交联在一起，Fascin蛋白至少需要含有2个肌动蛋白结合位点，一个位于第277～493氨基酸残基之间；而另一个则位于第33～47氨基酸残基之间，即最保守的第1个β-三叶草折叠区段。有研究显示，Fascin蛋白是蛋白激酶Cα(PKCα)的底物。在33～47区段，肌动蛋白的结合位点之一，有一高度保守的磷酸化位点Ser-39。该位点的磷酸化不仅能抑制Fascin蛋白与肌动蛋白结合，同时还能促使Fascin蛋白与活化的PKCα的调节亚基结合。另外有研究证明，Fascin蛋白通过其第三和第四β-三叶草结构域能够与p75神经营养因子受体(p75NTR)的胞浆端发生相互作用。
Fascin主要分布在间叶组织和神经组织，主要生理功能是使肌动蛋白丝交联成束，促进细胞膜表面丝状伪足和微棘的形成。近年来，有研究证明，Fascin基因在许多上皮来源的肿瘤组织中异常过表达，但不同肿瘤组织中Fascin基因的阳性表达率有时相差很大。研究发现，1)95％以上的胰腺癌和89％的早期非小细胞肺癌表达Fascin基因；2)胃癌早期粘膜内肿瘤仅有12.5％表达Fascin；3)T4期胃癌Fascin基因的阳性表达率明显上升，达53.3％。由此可见，Fascin基因在肿瘤中的表达具有组织特异性，且与肿瘤的进展有一定的相关关系。最近，本课题组和Hashimoto等人的研究结果一致表明，Fascin基因在食管癌的发生发展中异常过表达，有可能发展成为食管癌早期诊断或判定恶性度的分子标志物，有可能发展成为抑制食管癌侵袭转移的一个有效治疗靶点。然而关于Fascin基因在肿瘤细胞中的转录表达调控机制研究，尚少见报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种人食管癌细胞Fascin基因启动子区调控元件，确定人Fascin基因的5′上游转录调控区域-74～-41。
本发明的另一个目的在于提供含有上述基因启动子区调控元件的载体。
本发明的进一步目的在于提供含有上述载体的宿主细胞。
本发明提供的人食管癌细胞Fascin基因启动子，命名为F-2900，其长度为3022 bp，核苷酸序列如SEQ ID NO1所示，保留了Fascin基因5’上游-2900～+122的片段，在SEQ ID NO1中，+1为转录起始位点。
为了鉴别控制Fascin基因表达的调控序列，必须对人Fascin基因的5′调控区域进行缺失分析。在缺失分析中，利用PCR和嵌套缺失技术，使Fascin基因启动子F-2900从5′上游-2900处开始逐渐缩短，得到一系列含不同长度启动子序列的表达质粒，利用萤火虫荧光素酶报告基因，检测这些质粒在食管癌细胞EC109中的转录活性。为减少细胞培养微环境所造成的误差，以表达海肾荧光素酶的质粒pRL-TK作为内参照，与上述嵌套缺失质粒同时转染EC109，测定萤火虫荧光素酶与海肾荧光素酶的酶活性，用二者的比值，即相对荧光素酶活性表示启动子转录活性。结果显示，-74～-41之间为主要转录活性调控区域。应用生物信息学手段(http://www.gene-regulation.com/pub/programs/alibaba2/index.html)对-74～-41bp之间的序列分析表明，这段序列中有两个Sp1结合位点，一个N-Myc结合位点，一个C/EBPα结合位点，一个Ap1结合位点，一个ATF结合位点，一个CREB结合位点，一个C-Jun结合位点，一个CRE-BP1结合位点及一个CPE_bind结合位点等，并且这些转录因子结合位点相互之间存在部分序列重叠。这提示Fascin基因的转录调控可能有多种转录因子的共同参与。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果本发明首次鉴定了人食管癌细胞Fascin基因启动子，并将5′端序列逐渐缺失的启动子序列插入报告基因上游构建了一系列真核表达质粒，转染哺乳动物细胞瞬时表达，确定了人Fascin基因启动子在食管癌细胞中转录活性的关键调控序列。本发明对研究Fascin在肿瘤细胞中的表达调控机制以及以Fascin为靶点的临床治疗具有重要意义。
图1为质粒pBF-2900构建流程图；图2为启动子5′端嵌套缺失质粒构建流程图；图3为应用PCR技术构建启动子5′端缺失质粒流程图；图4为启动子区嵌套缺失质粒在EC109细胞中的相对荧光素酶活性分析；图5为Fascin启动子关键调控序列上潜在转录因子结合位点分析。
具体实施例方式
实施例1 含有Fascin基因启动子的真核表达质粒的构建1、人Fascin基因5′上游片段(-2900～+122)的克隆和序列分析根据文献发表的人Fascin基因序列，设计并合成了扩增Fascin翻译起始密码子上游3022 bp片段的一对引物F2和R，所述引物序列如下F2，5′-GTCGACCAGTCAAGACCTAGCACAGGGCTCAGG-3′；R，5′-AAGCTTGGTGGCAGTAGACGAGAGGCCGCTG-3′(下划线为Hind III位点)。应用此对引物，从人食管癌细胞EC109基因组DNA中经PCR扩增出与预期一致的约3000bp的DNA片段。回收所扩增的目的片段，连接到pMD18-T vector(TaKaRa公司)中，pMD18-T vector上含有Kpn I位点。然后Kpn I/Hind III双酶切回收约3000bp的DNA片段，再亚克隆到经Kpn I/Hind III双酶切的载体pGL3-Basic(Promega公司)中。pGL3-Basic为萤火虫荧光素酶报告基因前不含启动子的表达载体。测序结果证明人Fascin基因-2900～+122片段已定向克隆至萤火虫荧光素酶基因上游，该重组质粒命名为pBF-2900。该质粒的整个构建流程如图1所示。
人食管癌细胞Fascin基因启动子F-2900的测序结果见SEQ IDNO1。与GenBank已知序列比较，核苷酸相同性为99.9％。
2、以pBF-2900为基础的启动子5′端缺失载体的构建首先，以F-2900序列为基础设计4条5′端引物，引物序列如下F3，5′-ACGCGT-1848CCTGCACTGGCAATGGACAGAGGAC-1824-3′(下划线为Mlu I位点)；F4，5′-ACGCGT-1435TGTTGGCTTGCGGTTGAGGGCTG-1413-3′(下划线为Mlu I位点)；F5，5′-ACGCGT-825GGCTGGTCTGGCTCACAGTTGCT-803-3′(下划线为Mlu I位点)F6，5′-ACGCGT-436CCTCTGGGCTTCTGTAAGGCTATGTGC-410-3′(下划线为Mlu I位点)。并以3′端引物R为共用引物进行PCR扩增(pBF-2900为模板)，回收所扩增的目的片段，Mlu I/Hind III双酶切后，与经Mlu I/Hind III双酶切的载体pGL3-Basic连接。经过转化入大肠杆菌感受态细胞JM109，挑取阳性克隆，经过酶切鉴定以及最后的测序结果证明人Fascin基因不同长度片段已定向克隆至萤火虫荧光素酶基因上游，该重组质粒分别命名为pBF-1848，pBF-1435，pBF-825，pBF-436。
然后，以pBF-1435为模板进行嵌套缺失。pGL3-Basic上有KpnI和位点，Mlu I内切酶可使DNA形成5′突出末端，进一步被外切核酸酶ExoIII降解；而Kpn I内切酶可使DNA形成3′突出末端，不被ExoIII降解。将质粒pBF-1435经Kpn I/Mlu I双酶切后，再经ExoIII酶切。取不同反应时间的酶切后产物，用S1核酸酶切除单链DNA，Klenow补平末端后，T4 DNA连接酶使片段自连，连接产物转化大肠杆菌JM109，进行抗性筛选及测序，得到一系列启动子5′端缩短的真核表达质粒pBF-1148，pBF-808，pBF-610，pBF-508，pBF-387，pBF-316，pBF+19和pBF+82。
最后，再设计5条5′端引物，引物序列如下F7，5′-ACGCGT-255CGGGGGGGTTAGGTGGCTGG-226-3′(下划线为MluI位点)；F8，5′-ACGCGT-168ACCGGTGGGGTGAGAGCACCGG-147-3′(下划线为Mlu I位点)；F9 5′-ACGCGT-88GAGCCAGGGGCGGGACAGG-70-3′(下划线为MluI位点)；F10 5′-ACGCGT-74ACAGGGGGGCGTGGCCTGG-55-3′(下划线为MluI位点)；
F11 5′-ACGCGT-40CTCGCCTATAAAATGTCCGG-21-3′(下划线为MluI位点)。并以3′端引物R为共用引物进行PCR扩增(pBF-387为模板)，回收所扩增的目的片段，Kpn I/Mlu I双酶切后，同上方法连接到pGL3-Basic载体的Kpn I/Mlu I中，经测序鉴定，又获得了系列Fascin启动子报告基因表达质粒pBF-255，pBF-168，pBF-88，pBF-74，pBF-40。
上述Fascin启动子5′端缺失载体构建流程图详见图2和图3。
实施例2 细胞培养、DNA转染和人食管癌细胞Fascin基因启动子活性分析用QIAprep Spin Miniprep Kit提取需转染的实验质粒、对照质粒pGL3-Basic(Vector)及内参照质粒pRL-TK，测定其含量和纯度。取上述表达萤火虫荧光素酶的实验质粒和对照质粒用Buffer EB(10mM Tris·Cl，pH8.5)稀释至100ng/μl，表达海肾荧光素酶的内参照质粒pRL-TK用Buffer EB稀释至20ng/μl。将实验质粒与内参照质粒按50∶1混合，即1μg∶20ng(10μl∶1μl)。
食管癌细胞EC109进行常规传代培养，接种于96孔培养板中，每孔0.1ml。24h后细胞达50％～60％满度时即可用于转染。
转染方法如下在超净工作台中，取7ml玻璃离心管若干支，做好标记，加入49μl不含血清的199基础培养液，再加入5.5μl上述混合好的相应的质粒混合液，空白管中加入5.5μlBufferEB，涡旋5sec，再加入2μl的SuperFect转染试剂(QIAGEN公司)，涡旋10sec，室温下放置5～10min。将96孔板做好标记，每个样品设2个平行孔，将每孔的培养基弃去，滴加2滴1×PBS(pH值7.4)，吸尽培养基，备用。向静置5～10min后的玻璃管中加入300μl含血清的199培养基，用加样器上下吹打混匀，迅速将混合液加入到96孔板中，每孔170μl，于37℃5％CO2培养箱中继续培养。3h后，弃去培养基，换上150μl新鲜的199培养基，继续培养至48h。收获细胞，进行双荧光素酶活性分析。
双荧光素酶报告基因的检测采用Promega公司的Dual-LuciferaseReporter Assay System进行分析。将转染有目的DNA的贴壁细胞用1×PBS洗涤一次，去尽残液，加入20μl新鲜配制的1×PLB，室温下，摇床上剧烈振荡15min以裂解细胞。取15μl上述细胞裂解液加入含100μl LARII溶液的1.5ml离心管中，测定荧火虫荧光素酶活性，再向同一离心管中加入100μl新鲜配制的1×STOP液，测定海肾荧光素酶(内参照)活性，计算出两种荧光素酶活性比值，即相对荧光素酶活性。为了保证实验结果的准确性，换另外一批质粒重复一次实验。
缺失质粒实验结果(图4)表明，在人食管癌细胞中，Fascin基因5′端侧翼区的3022bp序列具有明显的转录活性，当启动子F-2900从5′端-74处缩短到-40时，pBF-40的转录活性显著下降至接近质粒pGL3-Basic的水平，表明启动子转录活性已达到最低，在-74～-41之间存在关键转录调控元件。对-74～-41bp之间的序列进行生物信息学分析(图5)发现，这段序列中有多个转录因子结合位点，并且这些结合位点相互之间存在部分序列重叠。这提示Fascin基因的基本转录调控可能有多种转录因子的共同参与。
人食管癌Fascin基因启动子序列表SEQUENCE LISTING<110>汕头大学医学院<120>人食管癌细胞Fascin基因启动子区调控元件<130>
<160>1<170>Patent In version 3.2<210>1<211>3022<212>DNA<213>人食管癌细胞(HUMAN ESOPHAGEAL CANCER CELLS)<400>1-2900CAGTCAAGAC CTAGCACAGG GCTCAGGCCT AAAAAAAAGC TGTTGAGGAG GGTGTGAGGC-2840TGCAACGTTG CGGTGAGAAG GGGGTCCCCA GGGAGGGCGC AGCAGGAAGC CCCAGGGAAG-2780TGCCTGGGAG AGGGAGGTTG TGCAGCCAGA AGGAGCAGCC CGCAGCCTTT GGTTGTTGAC-2720TCCTGCTTTG TAAGTGGCAG TCTGGTTGGG TAGGACAGGG TCCGAGTCCT CACTCAGGGA-2660ACTGAGTCCA GGGTGAGCTG AGCAGCCCTT CCTGGTGGCC TCACTTTCCC CTGCAGAGCC-2600TGCTGCATGG TGTCCAGTGG CCAGCCTGGG AGGAGCTCAG GACTGGCCTC ACCTCGTGCC-2540ACGCCCTCGT ACCAAGGTGG CTCAGATGGC ACCTGGGTTC CCGAAGGGCC CAGGAACACA-2480GCGTCCATGT CCCCATCCTT CCCCGGAGGG ACTTGGGGTG GGGCCTGCAG GAAGGATCAT-2420GTGACTTGTT CAAGGGCAGC TTGTCCTGCC CCGGACACAG AGGTGCCCAT CGTAAGCGAG-2360ATGCAGGCAA GGTGAGGACA GGGCATGGTG CCGAGCAGGA ATGATTTTCG AAAATGCTAC-2300TCTGTGGTCG GGCACGGTGG CTCACTCCTG TAATCCCAGT ACTTTGGGAG GCCCAGGCGG-2240GCAGATCATG AGGTCAGGAG TTCAAGACCA GCCTGGCCAA CATGGTGAAA CCCCTTCTCT-2180ACTGAAAATA CAAAAAACTA CCCGGGCGTG GTGGTGGATG CCTGTAATCC CAGCTACTCA-2120GGAGGCTGAG GCAGGAGAAT CGCTTGAACC CTGGAGGTGA AGGTTGCAAT GAGCCGAGAT-2060TGCACCACTG CACTCCGACC TGGGCGACAG AGAAAGACTC CGTCTGAAAA ACAAACAAAC-2000AAAACCCCGA GATTCTCTTT TCCCCCGTCC GGAGCTCTAT GGCCATCTGG AGCTCGTTCT-1940GTCCACAAGG ACACATTTCC TGGCAGCAGC TGTGGACCAG GGCTCACTCA CTCACATCTG-1880TACCCAATCT AGAGCAGGAC AAACACCTAT CACCTGCACT GGCAATGGAC AGAGGACAGT-1820GGCAGCCCCA TCACCAGAGG CATTCAAGCC AAGGCATTTT CTATCGTCTA TTTATCTATC-1760TATCTATCTA TCTATCTATC TATCTATCTA TCTATCTATC TAGATGAGAT CTTGCTATGT-1700TGCCCAGGTT GAACTCCTGG CCTCAAGCGA TCCTCCTGCT TCAGCCTCCC AAAGTGTTGG-1640GATTTCAGGT GTGAACCACT GTACCTGGCT GGAGTGCAGT GGCACTGTCA TAGCTCACTG-1580CAGCCTCCAC CTCCTGGGCT CAAGGAATCC TCTTTCCTCA GCCTCCTGAG TAGCTGGGAC-1520CACAGGCATG CACCATCACA CCCAGCTAAA CCTTGATTTT TTCCATAGTA TATGGCTCAG-1460GGCAGAGCAA AGAAGCACAA AAACATGTTG GCTTGCGGTT GAGGGCTGAT GGGAGGGGGT-1400TCTGGCCAAA GCCCAAAATT AACAGCCACA ACGTCAGTGT CTGTGGGAGG GGTTGCCAGG-1340GGCGTGCGGG TTCTGGGGCT CAAGGCCCTG CCGGTAAACC CATTTGAAGC AGGATGGCAA-1280GAAGGTGACA CCATCTTCCC CCGCGCACTG AAAGCCCCTG GCTGGGATTG CCTGGGGCAG-1220ACACAGGCTC GGACCAGCCC CAGCAATCCC AGTTTATCAG CGAGCCGGCT GAGGGCCCGG-1160AGTTATCTCA GTGCCCGGCC TGAGACCTTG TGGGCAGCCT GTGGTCATGC TGGCATTCCA-1100GGGGCCTTTT GGCATGTGGG GAATGTCCAG GAAAAGCCTC AGCCTTCGGT GAGGCGCAGA-1040AAAGGGAAGT GTCCCTAGAG GGGGTGGGTG AGGGCGTGGG AGGTGGTGTC TGCAGGGAAT-980GTCCCCTTTG GGGGAGGAGG ATGGAGGGTT GGGATTCTGA GGATGGGGGG GGGGGCTGTA-920GCCAGCACCA TGTCCCTCCT GTGTGACCAG CTCAGAGTCC CATGAAATTG GGGCTTGGGA-860GGGGAAGGGA CACTGGCCTG GGAACCAGAG ACCTGGGCTG GTCTGGCTCA CAGTTGCTGG-800ACCTCTGTGA TCCGTGTCAA AAAACGAGAA CACCAATTCC TGTCCTGCCC ACTCACCACC-740AGGTGGGACC TGAACCCTGG CATCGCCAGC ATTGGGAATG TCGGCCACTG ACTCAACCAC-680TCTCCCGGAG ACCTATTTGG GCCACCCGAG GCGGGTGCCT GGGCCACACG GAGGGGTCCT-620GGTGGTCTTC AGGGCAGCGG CTGTGGGGCT GAAGCCTCAA GGAACCACAT CTCTGCATAG-560GAGGGCCAGG CTGCAGGGCC TCGGGAGACA ACCTAGTTGG GCGTGTTGGG GTCTGTGGGT-500CCCAGGTCCT GGCCTCACCG GGTCCCCACC GCGCTGTCAG CTCCCAGCCT CTTTCCCTCG-440TCTGCCTCTG GGCTTCTGTA AGGCTATGTG CTCCAAGGCC ACCTCCTCCA GGCAGCCCTC-380AGACCCCCAC CTTCGCCCAG TACCGATCTG CACCGTGGTC TCTGACGTCT CCATCGTGAC-320CTCAAACCTG GCTCGTCCTT GCTCCTAGCG AGGCTTGGGG TCGGGGTGTC CGAGGTGGGG-260GACATCCGGG GGGGTTAGGT GGCTGGCGCG GGGAGCCGGG GTTGTGAGGG GTGATGTCCT-200CAGGCGGCGG CGCTGCGGGG TGCGGCGAGG ACACCGGTGG GGTGAGAGCA CCGGCGGGGC-140AGCAGCGGGG GCCGCAGCGC CGGGTCCCTC GGCCCGGGGC CCCTCCCGCG CGGAGCCAGG-80GGCGGGACAG GGGGGCGTGG CCTGGTGGCG CTGACGTCAC CTCGCCTATA AAATGTCCGG-20GGCGCCGCTA GCTGGGCTTT GTGGAGCGCT GCGGAGGGTG CGTGCGGGCC GCGGCAGCCG+41AACAAAGGAG CAGGGGCGCC GCCGCAGGGA CCCGCCACCC ACCTCCCGGG GCCGCGCAGC+101GGCCTCTCGT CTACTGCCAC CA<210>2<211>34
人食管癌Fascin基因启动子序列表<212>DNA<213>人食管癌细胞(HUMAN ESOPHAGEAL CANCER CELLS)<400>2-74 acaggggggc gtggcctggt ggcgctgacg tcac<210>3<211>
<212>DNA<213>引物<400>3F2 5’-GTCGACCAGTCAAGACCTAGCACAGGGCTCAGG-3’F3 5’-ACGCGTCCTGCACTGGCAATGGACAGAGGAC-3’F4 5’-ACGCGTTGTTGGCTTGCGGTTGAGGGCTG-3’F5 5’-ACGCGTGGCTGGTCTGGCTCACAGTTGCT-3’F6 5’-ACGCGTCCTCTGGGCTTCTGTAAGGCTATGTGC-3’F7 5’-ACGCGTCGGGGGGGTTAGGTGGCTGG-3’F8 5’-ACGCGTACCGGTGGGGTGAGAGCACCGG-3’F9 5’-ACGCGTGAGCCAGGGGCGGGACAGG-3’F10 5’-ACGCGTACAGGGGGGcGTGGCCTGG-3’F11 5’-ACGCGTCTCGCCTATAAAATGTCCGG-3’R 5’-AAGCTTGGTGGCAGTAGACGAGAGGCCGCTG-3’
权利要求
1.一种人食管癌细胞Fascin基因启动子区调控元件，其核苷酸序列选自下组(1)SEQ ID NO2所示的核苷酸序列，(2)SEQ ID NO2所示的核苷酸序列的互补序列，或(3)SEQ ID NO2所示的核苷酸序列中发生一处或多处缺失突变或替换突变的功能等价物。
2.如权利要求1所述的人食管癌细胞Fascin基因启动子区调控元件，其特征在于含有至少一个控制Fascin基因表达的调控元件。
3.如权利要求2所述的人食管癌细胞Fascin基因启动子区调控元件，其特征在于所述调控元件含有SEQ ID NO2中的核苷酸-74～-41。
4.一种载体，其特征在于，它含有权利要求1所述的人食管癌细胞Fascin基因启动子区调控元件。
5.如权利要求4所述的载体，其特征在于，它还含有所述的启动子区调控元件可操作地连接的外源基因。
6.如权利要求5所述的载体，其特征在于，所述外源基因是报告基因。
7.一种宿主细胞，其特征在于，它含有权利要求4所述的载体。
8.如权利要求7所述的宿主细胞，其特征在于，所述的宿主细胞是哺乳动物细胞。
9.如权利要求8所述的宿主细胞，其特征在于，所述哺乳动物细胞是人的细胞。
全文摘要
本发明涉及基因表达调控，公开了一种人食管癌细胞Fascin1基因启动子区调控元件。本发明首次鉴定了人食管癌细胞Fascin1基因启动子，并将5′端序列逐渐缺失的启动子序列插入报告基因上游构建了一系列真核表达质粒，转染哺乳动物细胞瞬时表达，确定了人Fascin1基因启动子在食管癌细胞中转录活性的关键调控元件－74～－41。本发明对研究Fascin1在肿瘤细胞中的表达调控机制以及以Fascin1为靶点的临床治疗具有重要意义。将有助于从分子水平上探索食管癌的发病机制，为食管癌的防治提供新的理论依据。
文档编号C12N15/85GK101016545SQ200710026290
公开日2007年8月15日 申请日期2007年1月12日 优先权日2007年1月12日
发明者许丽艳, 郭张燕, 高书颖, 杨章民, 谢剑君, 李恩民 申请人:汕头大学医学院