浅色黄姑鱼生长激素基因序列的制作方法

专利名称：：浅色黄姑鱼生长激素基因序列的制作方法
技术领域：
：本发明涉及一种生长激素基因序列，尤其涉及一种浅色黄姑鱼生长激素的基因序列。
背景技术：
：生长激素(growthhormone,GH)是包括鱼类在内的所有脊椎动物脑下垂体分泌的一种单链多肽激素。生长激素属于GH/PRL/SL家族(superfamily)。生长激素(CH)是一种具有广泛生理功能的生长调节素，能影响几乎所有的组织类型和细胞，包括免疫组织、脑组织及造血系统，其主要生理功能是刺激骨、软骨细胞的生长和分化；调理蛋白质、糖及脂肪的代谢[33]。GH发挥作用主要通过两种方式一是诱导肝细胞等产生GH介质，因其结构和功能与胰岛素相似，又称"胰岛素样生长因子"(insulinlikegrowthfactor,IGFs)，再由IGFs间接起作用；二是直接作用于靶细胞产生生理效应。无论哪一种方式GH都需要首先与GH结合蛋白(GHbindingprotein)结合，通过GHBP与细胞表面特异性受体结合，再由受体介导产生生物效应。GH是目前研究最为深入的一种脑垂体激素，能增强食欲、提高饲料转化率，加速鱼体的生长发育，被认为是最有效的水产养殖鱼类生长促进因子。然而，鱼类体内天然激素含量极低，分离纯化比较困难，成本较高，不可能大规模应用于生产。近年来，基因工程技术的飞速发展和日臻完善为大量生产廉价的鱼类激素提供了保证。生长激素在鱼类水产养殖业上具有重大的作用，因而得到人们越来越普遍的重视。克隆及表达鱼类生长激素基因无论在科学研究还是在生产应用上均具有重要的意义。浅色黄姑鱼(M6eaco/6oaO俗名白奈，隶属于鲈形目(Perciformes)，石首鱼科(Sciaenidae)，黄姑鱼属[1]，是近几年才发展起来的新的海水网箱养殖优良品种之一。该鱼肉质细嫩，口感独特，味道鲜美，尤其是其鱼鳔所制的鱼胶滋补养颜。"白奈鱼胶"的药用及营养价值仅次于金钱鯢，市场价格极高。随着浅色黄姑鱼的食用和药用价值逐渐为消费者所认识和接受，成品鱼国内外市场上的需求将呈现多元化及逐步扩大的趋势。但目前对浅色黄姑鱼的研究仅局限在生物学特性和人工繁殖技术方面，而对其生长发育调控机制的研究则还没有涉及。
发明内容本发明的目的是提供一种浅色黄姑鱼的生长激素基因序列，为浅色黄姑鱼的健康养殖和可持续发展提供新的理论依据。根据已知鱼类GH基因的保守序列，设计合成简并引物，采用同源克隆的方法，从浅色黄姑鱼肌肉基因组DNA中扩增到GH基因的中间片段；利用己克隆的中间片段，设计特异引物，利用单引物PCR和巢式PCR相结合的方法(也称染色体步移法)，获得了GH基因5'端和3'端的序列。通过序列拼接，获得浅色黄姑鱼GH基因全长序列，共3022bp，包括5'端的非编码区和启动子区域586bp和3'端非编码区537bp。浅色黄姑鱼GH基因含6个外显子(分别为10bp、134bp、117bp、144bp、147bp、63bp)和5个内含子(分别为378bp、416bp、324bp、85bp、81bp)，其开放阅读框(0RF)共计615bp，编码204个氨基酸残基。同鲑科鱼类和鲈形亚目鱼类一样都含有6个外显子和5个内含子，比哺乳类GH基因多出一个外显子和一个内含子。5'端启动子区域有Pit-la、Oct-1、NF-1、Spl、TBP、ICSBP、C/EBPa和MyoD等转录调节元件，3'端有典型的加尾信号AATAAA。利用SSRHunter软件分析，发现浅色黄姑鱼的基因组GH中有2个微卫星位点，分别是(ATTG)12和(AC)5序列。浅色黄姑鱼GH基因的5个内含子都起始于GT，终止于AG，符合内含子共同剪接位点序列(Breathnachandchambon,1981)。转录起始密码子ATG上游87bp以内含有TATA盒；3'端非编码区有典型的加尾信号AATAAA。根据浅色黄姑鱼GH基因序列，设计特异性引物，以浅色黄姑鱼脑垂体cDNA文库为模板，经PCR筛选，获得其GH基因的cDNA序列，长629bp，其开放阅读框(ORF)为615bp，可以翻译成由204个氨基酸残基组成的前体蛋白，分子量约为23.04kDa，理论等电点约为7.79，利用软件SignalP分析显示浅色黄姑鱼GH氨基酸序列前17个氨基酸是信号肽，经转膜剪切后形成187个氨基酸的成熟肽。浅色黄姑鱼GH包含4个半胱氨酸残基(分别位于第69、177、194、202位)，可以形成2个二硫键。另外，浅色黄姑鱼GH的前体氨基酸序列只存在一个潜在的N-糖基化位点(Asn-Xaa-Thr)。同源性分析表明，该基因与同科的红拟石首鱼(5^'3e/7叩soceW""s，AF065165)和大黄鱼(/^e"^ww'朋/7acrocea,AF231941)的GHcDNA序列的同源性最高，达到95%。而浅色黄姑鱼GH前体氨基酸序列与红拟石首鱼(5Wae/70Aoce^st"s，AAF61751)和大眼鳜(5Yw'percaAyew'，AAP82460)的GH前体氨基酸序列同源性最高，为98%(le-106)。由于鱼类生长的快慢与其体内的生长激素水平紧密相关，通过增加鱼体内生长激素的含量可以促进鱼体的生长。为浅色黄姑鱼的健康养殖和可持续发展提供新的理论依据，本研究开展浅色黄姑鱼的生长发育相关基因的研究具有科学意义和潜在的应用价值。图1是引物F1+R3的PCR扩增结果；M:100bpDNAmarker;1:PCRproduc图2是引物F2+R3的PCR扩增结果；M:謂bp腿marker;1:PCRproduct图3是引物F2+R3的菌落PCR扩增结果；M:lOObpDNAMarker;1-8:PCRproduct;图4是引物5-GH-F与R3、R4的PCR扩增电泳图；M:腦bpDNAMarker;1:PCRproductwith5~GH-FandR4primes;2:PCRproductwith5~GH—FandR4primes;图5是GH基因5'端序列克隆菌落PCR检测电泳图；左面弓胸R4+AP，PCR扩增产物1-10;右面弓物R4+5"GH-FW，PCR扩增产物1-10;图6-(a)是3-GH-F1+R1的PCR扩增，电泳图；M:勵pDNAMarker;1:PCRproductwith3~GH-FlandRlprimes;图6-(b)是3-GH-F2+R1的PCR扩增，电泳图；M:腿pDNAMarker;1.PCRproductwith3~GH_F2andRlprimes;图7是GH基因3'端序列克隆PCR产物电泳图；M:扁bp腿marker;1,2:PCRproducts;图8是GH基因3'端序列克隆菌落PCR检测电泳图；上行弓嫩3~GH-F2+R1的PCR产慨下行引物3-"GH-F2+AP的PCR产物；图9是浅色黄姑鱼GHcDNA序列筛选电泳图；M:勵pDNAmarker;1:PCRproduc;图10是浅色黄姑鱼GH阳性克隆PCR电泳图；M:100bpDNAmarker;1~5:PCRproductsfromclones。具体实施方式一、浅色黄姑鱼DNA的提取DNA提取的方法有很多种，具体的内容可参考分子克隆(第三版)。下面是本实验从浅色黄姑鱼的肌肉组织中提取DNA的方法。具体操作如下(l)取0.3g左右肌肉组织剪碎于2mlEP管中，加DNA消化缓冲液SNET500pL，20mg/ml的蛋白酶K10nL，10%SDS5(^L，混匀反应液，放振荡恒温箱中55。C消化约2_3小时。(2滩化完全后，加等体积的用0.1mol/LTris-Cl(pH8.0)平衡过的苯酚。将离心管置于旋转器上，使离心管缓慢颠转10min以温和地混合两相。然后，10000g离心15min。(3)取上清，加等体积的酚氯仿异戊醇(25:24:1)，密闭管口，缓慢颠转10min以温和地混合均匀。然后，10000g离心15min。(4)取上清，加等体积的氯仿异戊醇(24:1)，缓慢振荡10min，再10000g离心20min.。(5)取上清，并加入2.5倍体积的无水乙醇，室温沉淀DNA15min以上。然后，4'C,12000g离心15min收集沉淀的DNA。(6)除去上清液。将DNA沉淀浸于lml70X的乙醇里。除去70%的乙醇，室温下空气中干燥沉淀约1520min。(7)加入100nL无菌水溶解沉淀DNA。(8)取34nLDNA液在1%的琼脂糖凝胶上电泳，观察其提取DNA质量。二、浅色黄姑鱼GH基因基因组序列的克隆1引物设计鱼类GH基因具有较高的保守性，根据与浅色黄姑鱼亲缘关系较近的斜带石斑鱼(五/z"e//7e/w;sco/o/flfe^AY038606)、红拟石首鱼(5Wae"o;woce〃ato，AF065165)和大黄鱼(i^ewAwdae"acrocea，AF231941)GH基因序列，综合比较其他鱼类的GH基因序列的同源性，设计二对简并引物，用于扩浅色黄姑鱼GH基因序列的中间片段，引物序列如下Fl:5-GCTGTCGGTGCTG(A/T)CT(T/C)TGG-3Rl:5-CCAC(C/T)GTCAGGTAGGTCTCC-3F2:5'-AGTTCAACACCTCCACCTGCTCGCT-3'R2:5-GAGCAGAACC(T/G)CAG(A/C)CAGA-3根据已克隆测序的浅色黄姑鱼GH基因中间片段序列，设计三条特异引物，引物序列如下F3:5-GAGGAACAGCGTCAACTCAACAA-3F4:5-GTTCTGAAGCTGCTGTCCATC-3R3:5-GTCAATCGGACTGATGATGTAAT-32GH基因中间序列的克隆2.1PCR扩增根据设计的三条特异引物连同二对简并引物，分别用不同组合配对的引物，进行PCR扩增。以F1和R3引物为例，浅色黄姑鱼DNA为模板进行PCR扩增，建立如下反应体系<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>反应参数为94。C预变性5min;以下35个循环94°C30s，59°C30s,72°C3min;72'C延伸lOmiii，最后4'C保温。扩增的PCR产物以1.2%的琼脂糖凝胶检测。其它引物进行PCR扩增也同上述一样的反应体系，只在反应程序的退火温度上和引物上稍有不同。2.2PGR产物凝胶回收扩增的PCR产物以1.5%的琼脂糖凝胶电泳检测和分离。割胶回收跟预期估计大小相近的片段。方法参照DNA凝胶回收试剂盒(DNAGelExtractionKit)使用说明书进行(1)使用0.5XTBE制作的1.2%琼脂糖凝胶对目的DNA进行电泳分离。(2)在紫外灯下切出含有目的DNA的琼脂糖凝胶，用纸巾吸尽凝胶表面液体。(3)称量凝胶重量，计算胶块体积。以lmg重量换算成lpL计算。(4)根据凝胶浓度，按下表所提供的参数加BufferDE-A:凝胶浓度BufferDE-A体积<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>(5)均匀混合后于75'C加热，每隔23分钟混合一次，直至凝胶块完全融化。(6)按BufferDE-A体积的50%加入BufferDE-B,均匀混合。当回收的DNA片段小于500bp时，应再加入终浓度为20%的异丙醇。(7)将试剂盒中DNA-prepTube按置于2mlMicrofiigeTube中，将步骤6中的混合液移入DNA-prepTube中，2500Xg(或5500卬m)离心1分钟。(8)弃滤液，将DNA-prepTube置回到原2-mlMicroftigeTube中，加入500pLBufferWl，2500Xg(或5500rpm)离心1分钟。(9)弃滤液，将DNA-prepTube置回到原2-mlMicrofUgeTube中，加入700pL巳加无水乙醇的BufferW2，2500Xg(或5500rpm)离心1分钟，以同样的方法再用700^LBufferW2洗涤一次。(10)将DNA-prepTube置于1.5ml离心管中，1200Xg离心1分钟。(11)将DNA-prepTube置于另一洁净的1.5ml离心管中，在silica膜中央加入2530pLEluent或去离子水，室温静置1分钟。1200Xg离心1分钟洗脱DNA。2.3PCR产物连接采用T-A克隆法。此方法是利用普通DNATaq酶在PCR扩增过程中，以非模板依赖方式在扩增产物的3'端加脱氧腺苷(A)的特性，使PCR产物在3'端多出一个未配对的碱基A。利用线性化的T载体3，端凸出一个脱氧胸苷(T)的特性，在T4DNA连接酶作用下，将PCR产物与T载体相连，形成重组载体。参照T载体使用说明书，建立如下连接反应体系_连接反应体系__<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>终体积10&将上述反应混合物混匀后，置于PCR仪中16'C连接过夜。2.4转化2.4.1￡co〃(DH5a)感受态细胞的制备(氯化钙法)(1)从经37。C培养16-20h的新鲜平板上，用无菌牙签挑取一白色单菌落，接种于5mLLB培养基中，37。C摇菌过夜(200300转/分)。第二天按l:100比例取过夜的菌液500nL加入50mlLB培养基中，37。C剧烈摇菌2-3h(300转/分)，待OD,值约为0.3~0.4时，停止培养。(2)将细菌转入一50mL无菌离心管中，冰浴10min。(3)4000xg，4'C离心10min，回收细菌，用10mL冰冷的0.1mol/LCaCl2重悬沉淀细胞。(4)4000xg，4。C离心10min，回收细菌，沉淀重悬于2mL冰上预冷的0.1mol/LCaCl2中。(5)于4"贮存备用，或加10%的灭菌甘油，于-7(TC冻存。2.4.2连接产物的转化(化学转化)(1)取DH5a感受态细胞200置于冰上，加入5~10连接产物，轻旋混匀。(2)置冰上放置30min，其间轻轻摇动2~3次。(3)迅速于42。C水浴中热激90s，再迅速置冰上冷却2-3min。(4)加入800pLLB培养基，37°C,150rpm轻摇培养45-60min。(5)5000rpm离心2min,回收细胞，用100-200LB培养基重悬细胞，均匀涂布于含有100吗/mLAmp的选择培养基平板上(含有5pLIPTG(200mgmL")和50pLX-gal(20mg'mU1))上，将平板放于37'C培养箱中倒置培养过夜。2.5菌液PCR鉴定用灭菌牙签随机挑取单菌落，接种于含有100pg/mLAmp的LB液体培养基中，37°C，200300ipm摇菌培养34小时后，直接取菌液进行PCR鉴定。用25pL反应体系，反应程序同2.2.2对应的PCR扩增程序。PCR反应体系lOxfixr叫Buffer(Mg2+Plus)2.52.5mMdNTPMixture10pMFl引物0.5|xL10pMR3引物O单菌液1.0^ddH2018.375pLMai"￡x(5U/pL)0.125nL终体积25(jL扩增的PCR产物以1.2%的琼脂糖凝胶电泳检测。2.6序列测定将PCR鉴定为阳性的克隆放大培养分装，选送上海联合基因科技有限公司用AB3730自动测序仪进行序列测定。3GH基因5'端和3'端序列的克隆为了取得浅色黄姑鱼GH基因的5'端和3'端序列，采用染色体步移法，根据上述己取得的中间序列，设计合成基因特异性引物(见表3-l)。在第一轮扩增反应中利用基因特异性引物进行单引物PCR扩增；然后为了引入接头引物，进行加尾反应；在第二轮扩增反应中利用嵌套特异性引物和锚式引物AAP(见表3-l)，以加poly(C)尾的第一轮PCR产物为模板，进行PCR扩增。3.1引物设计根据己测定的浅色黄姑鱼GH基因的中间序列，用PrimerPremier5.0软件设计，并由上海博亚生物技术有限公司合成基因特异性引物、AAP与通用接头引物Adaptorprimer见表3-1。表3-l实验中所用的引物序列Tab.3-1Oligonucleotideprimersusedinexperiments引物名称name引物序歹寸sequence(5，—3，)用途5-GH-FW5-GATGGTGCTACGGAGAAGTCAG國3前三条用于GHR3(前已设)GTCAATCGGACTGATGATGTAAT5'端序列的扩增R4TCTGAGCGAGCAGGTGGAGGTGT3-GH-F1GCTGGCTCCGTATGGGAACT中间三条用于3-GH-F2CGAGTCGCTGAGACGAACCT3'端序列的扩增Rl(前已设)CCAC(C/T)GTCAGGTAGGTCTCCAAPGGCCACGCGTCGACTAGTACGi6后三条用于设计接Oligo(dT)n-adapterGGCCACGCGTCGACTAGTACT17头引物AdaptorprimerGGCCACGCGTCGACTAGTAC3.2GH基因5'端序列扩增3.2.1PCR扩增为了检测设计的特异引物的可用性。以浅色黄姑鱼DNA为模板，以R3与5-GH-FW和R4与5-GH-FW为引物分别进行PCR扩增。建立如下反应体系PCR反应体系10x五;cr"《Buffer(Mg2+)5|jL2.5mMdNTPMixture4pL10一R3或R41.010|xM5-GH-FW1,0DNA模板1.0ddH2037.75^L五x7^(5U/(xL)0.25pL终体积50反应参数为94。C预变性4min;以下35个循环94°C30s，58°C30s,72°C4min;72'C延伸10min，最后4匸保温。扩增的PCR产物以1.2%的琼脂糖凝胶电泳检测。3.2.2单引物PCR扩增以浅色黄姑鱼DNA为模板，以R3为引物进行PCR扩增。建立如下反应体系PCR反应体系10x五jc7hBuffer(Mg。52.5mMdNTPMixture4^iL10|iMR31.0DNA模板1.0ddH2038.75^LraA:aia五jcTa《(5U/pL)0.25|xL终体积_50pL反应参数为94。C预变性5min;以下35个循环94°C30s，52°C30s,72°C4min;72'C延伸10min，最后4'C保温。扩增的PCR产物以1.2%的琼脂糖凝胶电泳检测。3.2.3PCR产物直接纯化回收直接取PCR产物用PCR清洁试剂盒(V-gene)纯化回收。具体操作步骤参照PCR清洁试剂盒说明书进行，其步骤如下1)在PCR反应液中，加入3个体积的BufferPCR-A，若需加的BufferPCR-A不足lOOpL，则加入100|aLBufferPCR-A。2)将DNA-prepTube置于2mlMicrofogeTube中，将步骤1中的混合液移入DNA-prepTube中，2500Xg(或5500rpm)离心1分钟。3)弃滤液，将DNA-prepTube置回到原2mlMicrofogeTube中，加入500(aLBufferWl，2500Xg(或5500rpm)离心1分钟。4)弃滤液，将DNA-prepTube置回到原2mlMicroAgeTube中，加入700pL已加无水乙醇的BufferW2，2500Xg(或5500rpm)离心1分钟，以同样的方法再用700ulBufferW2洗涤一次。注意确认在BufferW2中巳按试剂瓶上指定的体积加入无水乙醇。1)将DNA-prepTube置于1.5ml离心管中，12000Xg离心1分钟。2)将DNA-prepTube置于另一洁净的1.5ml离心管中，在silica膜中央加入2530pLEluent或去离子水，室温静置1分钟。12000Xg离心1分钟洗脱DNA。3.2.4加尾反应在冰上向微量离心管中加入以下成分PCR产物加尾反应体系DEPC-treatedWater6.5TerminalTransferase5xBuffer52mMdCTP2.5jxL纯化的PCR产物_10总体积24^轻柔混匀，于PCR仪上94。C孵育23min，立即于冰上冷却2min，简短离心后置于冰上，加入lpL末端转移酶(TdT)，轻旋混匀，置于PCR仪上37t:孵育60min，接着7(TC加热10min终止反应，简短离心后产物贮于-20'C备用。3.2.5第二次PGR扩增以加poly(C)尾的PCR产物为模板，建立以下反应体系，包括_第二次PCR扩增反应体系10x￡x7^Buffer(Mg2+)2.5mMdNTPMixture10|iMAAP10pMR45.0pL4.0pL1.0|xL1.0pL加Poly(C)尾的PCR产物1.0nLddH2017.3pL￡x~(511批)_0.2|xL终体积25PCR反应参数为94t:预变性5min;以下35个循环94。C变性30s，60。C退火30s，72。C延伸5min;循环结束后72'C延伸10min，最后4"C保温。取510pLPCR产物于1.0%琼脂糖凝胶上电泳检测扩增效果。此PCR产物作为连接PCR产物。3.2.6PGR产物割胶回收扩增的PCR产物以1.0%的琼脂糖凝胶电泳检测和分离。割胶回收跟预期估计大小范围相近的一段胶。方法参照DNA凝胶回收试剂盒(DNAGelExtractionKit)使用说明书进行，方法同2.2。3.2.7连接、转化涂平板方法步骤同2.3与2.4。3.2.8克隆PGR扩增检测随机挑取几个单菌落进行过夜培养，直接取菌液进行二次PCR扩增鉴定。第一次PCR扩增分别以各菌液为模板，R4+AAP为引物，检测插入片段的大小。反应体系为25ul，反应程序同3.2.5。第二次PCR扩增分别以各菌液为模板，以5-GH-FW+R4为引物，检测插入片段是否为目的片段。反应体系为25ul，反应程序同3.2.1。3.2.9序列测定和分析选两次PCR鉴定均为阳性的克隆放大培养分装，送上海联合基因科技有限公司用AB3730自动测序仪进行序列测定。在http:〃www.ncbi.nlm.nih.gov/上对序列进行Blastn进行分析。3.3GH基因3'端序列的克隆3.3.1PCR扩增为了检测设计的特异引物的可行性。以浅色黄姑鱼DNA为模板，以R1与3-GH-F1和Rl与3-GH-F2为引物分别进行PCR扩增。建立如下反应体系PCR反应体系10x五x7i^Buffer(Mg2+)5nL2.5mMdNTPMixture争10pM3-GH-F1或3-GH-F21.0pLIO一RI1.0DNA模板1.0pLddH2037.75pL7hXaifl￡xrfl《(5U/nL)0.25pL终体积50nL反应参数为94。C预变性4min;以下35个循环94°C30s，52°C(或57。C)30s，72。C4min;72。C延伸10min，最后4"C保温。扩增的PCR产物以1.2%的琼脂糖凝胶电泳检测。3.3.2单引物PCR扩增以浅色黄姑鱼DNA为模板，以3-GH-Fl为引物进行PCR扩增。建立如下反应体系PCR反应体系10x五x7i^Buffer(Mg2+)5(iL2.5mMdNTPMixture4|iL10nM3-GH-Fl1.0DNA模板1,0ddH2038.75pL￡jcT^(5U/nL)0.25nL终体积50nL反应参数为94"C预变性5min;以下35个循环94°C30s，52°C30s,72°C4min;72'C延伸10min，最后4'C保温。扩增的PCR产物以1.2%的琼脂糖凝胶电泳检测。3.3.3PCR产物直接纯化回收方法步骤同3.2.3。3.3.4加尾反应方法步骤同3.2.4。3.3.5第二次PCR扩增以加poly(C)尾的PCR产物为模板，建立以下反应体系，包括第二次PCR扩增反应体系10x五jc7i^Buffer(Mg2+)5.0^2.5mMdNTPMixture4.0&lO^MAAP1.0^10^M3-GH陽F21.0加Poly(C)尾的PCR产物1.0ddH2037.75(iLMaia￡x7i^(5U/nL)0.25^终体积50PCR反应参数为94'C预变性5min;以下40个循环94。C变性30s，56。C退火30s，72。C延伸5min;循环结束后72。C延伸10min，最后4'C保温。取510pLPCR产物于1.0%琼脂糖凝胶上电泳检测扩增效果。此PCR产物作为连接PCR产物。3.3.6PCR产物割胶回收扩增的PCR产物以1.0%的琼脂糖凝胶电泳检测和分离。割胶回收跟预期估计大小范围相近的一段胶。方法参照DNA凝胶回收试剂盒(DNAGelExtractionKit)使用说明书进行。方法同2.2。3.3.7连接、转化涂平板方法步骤同2.3、2.4。3.3.8阳性克隆检测随机挑取几个单菌落进行过夜培养，直接取菌液进行二次PCR扩增鉴定。第一次PCR扩增分别以各菌液为模板，3-GH-F2+AAP为引物，检测插入片段的大小。反应体系为25pL，反应程序同3.3.5。第二次PCR扩增分别以各菌液为模板，以3-GH-Fl+Rl为引物，检测插入片段是否为目的片段。反应体系为25piL，反应程序3.3.1。3.3.9序列测定和分析PCR鉴定均为阳性的克隆放大培养分装，送上海联合基因科技有限公司用3730自动测序仪进行序列测定。在http:Vwww.ncbi.nlm.nih.gov/对序列进行Blastn进行分析。4浅色黄姑鱼GH基因全长序列的拼接运用CLUSTAL软件，将所得的五段DNA序列进行比对拼接为一条完整的DNA序列，即为GH基因组全长DNA序列。图1是浅色黄姑鱼GH基因全长拼接图。5色黄姑鱼GHcDNA序列的获得5.1引物设计根据拼接的浅色黄姑鱼GH基因序列设计一对特异引物，以其来扩增GHcDNA的全长序列，设计的引物序列如下qcGH-Fl:5-ACCAGACCAGCCATGAACA隱3qcGH-Rl:5陽GGCTACAGCGTGCAGTTG-35.2浅色黄姑鱼GHcDNA的PCR扩增浅色黄姑鱼脑垂体cDNA文库总菌液为模板进行扩增，建立如下反应体系PCR反应体系10x五jc7i^Buffer(Mg2+)5|jL2.5mMdNTPMixture10(xMqcGH-Fl1.0^10拜qcGH-Rl1.0cDNA文库总菌液1.0pLddH2037.75pL7a扁fl5jcr叫(5U4iL)0.25pL终体积50}xL反应参数为94'C预变性5min;以下前5个循环94°C30s，50°C30s，72°Clmin;72。C延伸3min，再反应35个循环94°C30s，58。C30s,72°Clmin;72。C延伸10min，最后4'C保温。扩增的PCR产物以1.2%的琼脂糖凝胶电泳检测。5.3PCR产物凝胶回收方法步骤同2.2。5.4连接、转化方法步骤同2.3和2.4。5.5菌液PCR鉴定阳性克隆用灭菌牙签随机挑取单菌落，接种于含有100pg/mLAmp的LB液体培养基中，37°C，200300rpm摇菌培养34小时后，分别直接取菌液进行PCR鉴定。25^L反应体系如下反应程序同GH基因cDNA序列PCR扩增，本节的2.3.2。扩增的PCR产物以1.2%的琼脂糖凝胶电泳检测。5.6序列测定和序列分析将菌液PCR鉴定为阳性的克隆放大培养分装，送上海联合基因科技有限公司用AB3730自动测序仪进行序列测定。http:〃www.ncbi.nlm.nih.gov/对序列进行blastn对序列进行比对分析、ClustalX1.83对脊椎动物中GH前体的氨基酸序列进行比对、Mega2.0软件对它们进行系统进化分析、DNAstar对各序列同源性进行计算。6结果6.1GH基因中间序列的PCR扩增根据设计的两条特异引物连同前面第一节设计的简并引物，分别用不同组合配对的引物，分别进行PCR扩增。其中以F1和R3，F2禾QR3，F3和R2以及F4和Rl为引物时分别可以扩增出与预期目的片段大小一致的产物。例如图l、2是引物F1和R3与引物F2和R3的PCR扩增产物电泳检测结果。通过割胶纯化回收，连接PMD18—T载体，转化大肠杆菌TOP10感受态细菌，LB平板选择培养，随机挑选白色菌落扩大培养，进行菌落PCR检测。其中，引物F2+R3的菌落PCR检测结果如图3所示。最后选菌液送上海联合基因科技有限公司测序。通过序列分析得到，Fl+R3扩出634bp(图l)，含第二内含子416bp;F2+R3获得520bp(图2)，在F1+R3区域内，包含第二内含子416bp;F3+R2获得504bp，包括第三内含子324bp;F4+R1获得500bp，包含第四和第五内含子，分别为85bp和81bp。6.2GH基因5'端序列的扩增首先以特异引物5-GH-FW与两个反向特异引物R4、R3分别以浅色黄姑鱼DNA为模板进行PCR扩增，其电泳结果见图4。从图中可知，在58t:退火温度下都可扩出与预期目的片段大小相一致的条带，其中5-GH-FW和R3的PCR产物大小约760bp，而与R4的PCR产物大小在240bp左右。然后以R3为引物，浅色黄姑鱼DNA为模板进行单引物PCR扩增。一般情况下，都看不见其PCR产物的特异性亮带，用PCR纯化试剂盒直接回收其PCR产物。为了引入5'端的接头引物，进行Poly(C)的加尾反应，然后采用嵌套引物R4和接头引物AAP，PCR反应体系10x^jc7i^Buffer(Mg2+)2.5mMdNTPMixture10nMqcGH-Fl10pMqcGH隱Rl各菌液ddH202.50.5nLO单1.018.375pL0.125^L以加尾产物为模板进行第二次PCR扩增。从电泳结果来看，PCR产物呈一片弥散，将与预期大小片段相近的一段弥散带割胶回收，在本实验中割取900bp2000bp之间的凝胶带回收。连接pMD18-T载体，转化大肠杆菌TOP10感受态细胞，在LB选择性平板上获得许多个分离良好的白色菌落。随机挑取10个单克隆扩大培养，进行二次PCR扩增筛选。分别以R4和通用引物AP或AAP与5-GH-FW和R4为引物，直接以各个菌液为模板进行PCR扩增筛选。其PCR扩增产物电泳结果如图5所示。从图可知，插入T载体的目的片段大小不一，而5-GH-FW和R4为引物的PCR扩增，其相对应的克隆中只有l、5、8号克隆可检测到240bp的目的片段。综合此两次的PCR筛选结果，可以初步预测5和8号的克隆所插入的片段是浅色黄姑鱼GH基因的5'端的序列。不过，为了最大可能的获得GH基因5'端的序列信息，我们选插入片段最大的克隆PMD18-T-GH5，送上海联合基因科技有限公司3730测序。利用网站http:〃www.ncbi.nlm.nih.gov/上的blast软件分析，结果与其他鲈形目鱼类GH基因的序列有很高的同源性。经DNA序列分析，确认此为浅色黄姑鱼的GH基因5'端序列，其大小为1091bp，含转录起始密码子ATG，并且发现TATA盒。起始密码子ATG上游还有586bp。6.3GH基因3'端序列的扩增按前述方法，同5'端序列的获得方式。首先用引物Rl分别与3-GH-F1和3-GH-F2进行PCR扩增，分别扩增出201bp和159bp的片段，其电泳结果如图6(a、b)所示。说明所设计的引物没有问题，可以用于后续实验。然后，用特异引物3-GH-Fl做单引物PCR扩增，其产物用PCR试剂盒直接纯化回收，根据Poly(C)加尾反应说明书进行加尾反应。再用嵌套PCR引物3-GH-F2和AAP，以加尾产物为模板，进行PCR扩增反应。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳，在UV/EB下观察，呈现一片弥散，割取在900bp2000bp之间的弥散带回收(见图7,2号泳道)，构建克隆载体PMD18-T-3-GH，转化大肠杆菌TOP10感受态细胞，在LB选择平板上获得许多个分离良好的单个白色菌落，随机挑取10个白色菌落，扩大培养，经两次菌落PCR鉴定，电泳结果如图8所示。从图可以看出，两次PCR扩增都可扩出目的片段的是克隆1、2、3、6、7、8和9共7个。其中pMD18-T-3-GH2克隆插入片段偏小，而pMD18-T-3-GH3克隆好像是在一个克隆中插入了两个目的片段。最后，在剩下的5个阳性克隆中，选取插入片段大的阳性克隆pMD18-T-3-GH7，送上海联合基因科技有限公司测序。图8，是菌落PCR鉴定结果，从图上可见用菌液作模板，以3-GH-F2和AP为引物，经PCR扩增得到的片段大小不一，这是由于割胶回收的是一片弥散带，因其中包含许多大小不同的扩增产物所造成的，选取插入片段最大的克隆去测序，有利于获得含有更多信息的目的序列。取片段长度大的阳性克隆pMD18-T-3-GH7，送上海联合基因生物科技有限公司测序。利用http:〃www.ncbi.nlm.nih.gov/blastn分析测定的序列，结果与其他鱼类GH基因的序列同源性很高，可确定其为浅色黄姑鱼的GH基因3'端序列，其大小约为739bp，含有转录终止密码子TAA。6.4GH基因全长的拼接和序列分析运用clustalX软件将所得七段DNA序列进行比对拼接为一条完整DNA序列，即为浅色黄姑鱼GH基因序列。利用软件BLAST与GenBank-EMBL中已知的GH基因序列进行同源性比较分析，结果证实其为浅色黄姑鱼GH基因。浅色黄姑鱼GH基因脱氧核糖核苷酸序列及序列分析如SEQIDNO.1所述。浅色黄姑鱼GH基因序列，全长共3022bp，包括5'端非编码和启动子区域586bp和3'端非编码区537bp。浅色黄姑鱼GH基因含6个外显子和5个内含子。其中第一外显子10bp，编码3个氨基酸残基；第二外显子134bp，编码45个氨基酸残基；第三外显子117bp，编码39个氨基酸残基；第四外显子144bp，编码48个氨基酸残基；第五外显子147bp，编码49个氨基酸残基；第六外显子63bp，编码20个氨基酸残基，其开放阅读框(ORF)共计615bp，编码204个氨基酸。而第一内含子有378bp，第二内含子416bp，第三内含子324bp，第四内含子85bp,第五内含子81bp。同鲑科鱼类和鲈形亚目鱼类一样都含有6个外显子和5个内含子，比哺乳类GH基因多出一个外显子和一个内含子。浅色黄姑鱼GH基因的5个内含子都起始于GT，终止于AG，符合内含子共同剪接位点序列(Breathnachandchambon,1981)。转录起始密码子ATG上游87bp以内含有TATA盒；3'端非编码区有典型的加尾信号AATAAA。利用软件SSRHunter分析发现，浅色黄姑鱼GH基因的第三内含子中发现一个重复12次出现的微卫星序列(ATTG)!2;而在第四内含子则有一个重复5次出现的微卫星序列(AC)5o7、浅色黄姑鱼GHcDNA序列的克隆7.1cDNA序列PCR扩增根据已克隆的浅色黄姑鱼GH基因序列设计一对特异引物qcGH-F和qcGH-R。引物qcGH-F和qcGH-R以浅色黄姑鱼脑垂体cDNA文库为模板，筛选得到约600bp的片段(见图9)，与预计的产物片段长度相近，可预测己扩增出目的片段，进行下一步的克隆测序。按前述方法将PCR产物经凝胶回收后，构建克隆载体PMD18-T-qcGH，转化大肠杆菌TOP10感受态细胞，在LB选择平板上获得若干个分离良好的单个白色菌落，随机挑取5个白色菌落扩大培养，经菌落PCR鉴定得到5个都是阳性克隆，如图10所示。从图上可见经PCR扩增都可得到约600bp的片段，分别命名为PMD18-T-GH1、PMD18-T-GH2、PMD18-T-GH3、PMD18-T-GH4和PMD18-T-GH5。选菌液PMD18-T-GH1和PMD18-T-GH3送上海联合基因科技有限公司测序。7.2序列测定及分析取重组质粒PMD18-T-GH1和PMD18-T-GH3进行测序，其测序结果一致，说明在扩增过程中未发生突变。由测序可知，该cDNA片段由629bp组成，与预计的目的片段大小一致。经网上Blastn分析发现与其他物种的GH基因cDNA序列具有较高的同源性，确认此为浅色黄姑鱼GHcDNA序列。其脱氧核糖核苷酸序列及按三联体密码子推导出的氨基酸序列如SEQIDNO.2所述。浅色黄姑鱼GHcDNA开放阅读框(ORF)全长为615bp,编码204个氨基酸残基组成的前体多肽。该序列上有4个半胱氨酸残基，分别位于第69、177、194、202位，可以形成2个二硫键。另外，浅色黄姑鱼GH的前体氨基酸序列只发现一个潜在的N-糖基化位点(Asn-Xaa-Thr)，而鲤鱼和鲑鱼GH氨基酸序列有两个潜在的N-糖基化位点(Asn-Xaa-Ser和Asn-Xaa-Thr)。序列表〈110>中国水产科学研究院南海水产研究所〈120〉浅色黄姑鱼生长激素基因序列〈160〉3<210>1<211麓2<212〉DNA〈213〉浅色黄姑鱼(Nibeacoibor)<220〉〈221〉gene〈222〉(1)…(3022)<220〉<221〉promoter〈222>(1)...(586)〈220〉<221〉TATA_signal<222>(500)...(506)<220>〈221〉exonl〈222〉(587)…(596)〈220〉〈221〉intronl〈222>(597)...(974)<220〉<221>exon2<222>(975)..(1108)〈220〉〈221〉intron2<222>(1109)...(1524)〈220>〈221〉exon3〈222>(1525)...(1640)<220>〈221〉intron3〈222〉(1641)...(1965)〈220〉〈221〉satellite〈222〉(1911)...(1958)〈220>〈221〉exon4<222〉(1966)...(2109)〈220〉〈221〉intron4〈222〉(2110)..(2194)<220>〈221>satellite<222〉(2116)...(2125)<220〉〈221〉exon5<222>(2195)...(2341)<220>〈221〉intron5<222〉(2342)...(2422)〈220〉<221>exon6〈222>(2423)...(2485)〈220〉<221>polyA—signal<222>(2547)...(2552)<400>1cgctgaataaattcagttttcggtgcgatgttcctgttaaatgtctaatc60gacagctg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