浅色黄姑鱼泌乳激素基因序列的制作方法

专利名称：：浅色黄姑鱼泌乳激素基因序列的制作方法
技术领域：
：本发明涉及一种泌乳激素基因序列，尤其涉及一种浅色黄姑鱼泌乳激素的基因序列。
背景技术：
：泌乳激素(Prolactin,PRL)是一种多肽激素，由前腺垂体的特异的催乳素细胞合成和分泌，其名称最早来自它能刺激鸽子嗉囊的上皮细胞增生，生成嗉囊乳。它也是现在PRL生物测定的依据。1928年，法国学者Stxicher和Grueler证实了有一种能诱导野兔乳汁分泌的垂体因子。近年来的研究发现，PRL除具有促进乳腺发育、启动泌乳和维持泌乳的功能外，还参与个体生殖生理的调控、免疫活动及渗透压调节、神经系统信号传递等。另外，人们还了解到，PRL的合成和分泌不只局限在垂体，生物体的其他组织和器官也具有这个能力。八十年代以来的研究证实，机体内存在免疫一神经一内分泌调节网络。其中最引人瞩目的激素就是泌乳激素。PRL不仅可以通过内分泌机制影响免疫系统的功能，而且还作为一种由免疫系统所产生、释放的细胞因子，以旁分泌和自分泌方式调节淋巴细胞的反应。自从1959年Pick-ford和Phillips发现用PRL来处理垂体切除的Killifish,可使移入淡水中的Killifish存活以来，到1974年PRL己经有80多种功能被发现(Nico11,1974)，直到现在已经有300多种功能。许多PRL的功能已经被证实。主要功能是l)水和电解质平衡；2)代谢；3)生长和发育；4)繁殖；5)脑和行为；6)免疫调节。在鱼类，PRL的生物学作用同在其他脊椎动物中一样，是多重的、变化的，包括参与渗透压调节、生殖、代谢、行为和产生黏液。
发明内容本发明的目的是提供一种浅色黄姑鱼的泌乳激素基因序列，为浅色黄姑鱼的健康养殖和可持续发展提供新的理论依据。根据鱼类的PRL基因的保守性,以简并引物NcPRL-FW和NcPRL-RV1、NcPRL-RV2进行两轮PCR扩增反应，第一轮PCR扩增用一般反应程序，退火温度采用5(TC，72°C延伸2分钟，其扩增产物中有一条2000bp左右的片段，与设计引物时预测片段大小一致，但条带太弱，所以进行第二轮PCR扩增，以便进一步确定目的片段。第二轮PCR扩增反应反应程序前25个循环，首先第一循环用7(TC退火，然后每过一循环退火温度就下降0.8'C,最后10个循环用5(TC退火，72'C延伸2分钟。从电泳结果中可知，第一轮PCR扩增的产物比较模糊，目的条带不是很明显，而第二轮PCR扩增的产物目的条带比较明显，片段大小在2000bp左右，跟设计引物时预测片段大小一致。经过二轮PCR扩增可基本确定目的片段，故将这个2000bp的片段克隆、测序。测序结果经http:〃www.ncbi.nlm.nih.gov/网站blastn比对，结果与其他鱼类PRL的碱基序列相似，与河舻(戸rcay/ave;ycera)和金头鲷(^ara^awrato)的PRL基因序列相似最高。根据已扩出的PRL中间片段序列，设计特异引物5-PRL-R1和5-PRL-R2。首先以特异引物NcPRL-FW与两个反向特异引物5-PRL-R1、5-PRL-R2分别以浅色黄姑鱼DNA为模板进行PCR扩增，在56度退火温度下都可扩出与预期目的片段大小相一致的条带。NcPRL-FW和5-PRL-R1的PCR产物大小约120bp，而与5-PRL-R2的PCR产物大小在100bp左右。再以5-PRL-Rl为引物，DNA为模板进行单引物PCR扩增。一般情况下都看不见PCR产物条带，用PCR纯化试剂盒直接回收PCR产物，为了引入另一端的引物，进行加尾反应，然后采用nested的引物5-PRL-R2和AAP，以加尾产物为模板进行巢式PCR扩增。从电泳结果来看，PCR产物呈一片弥散带。将与预期大小片段相近的一段弥散带割胶回收，在本实验中割取900bp2000bp之间的凝胶带回收。将该段回收产物与pMD18-T载体连接，转化大肠杆菌感受态细胞。随机挑10个单克隆扩大培养进行二次PCR扩增筛选，分别以5-PRL-R2和3端通用引物AP与NcPRL-FW和5-PRL-R2为引物，直接以菌液为模板进行PCR扩增筛选。其中5-PRL-R2和AAP为引物，主要检测目的片段的大小，而NcPRL-FW和5-PRL-R2为引物，则检测是否可扩出跟引物设计预期大小的片段。选取两次PCR扩增都可扩出产物，且以5-PRL-R2和AP扩增出的最大片段的菌液送测序公司测序。利用http:Vwww.ncbi.nlm.nih.gov/blastn分析，结果与其他动物PRL的碱基序列相似，可初步确定其为浅色黄姑鱼的PRL基因部分序列。用特异引物3—PRL-F1做单引物PCR扩增，其产物用PCR试剂盒直接纯化回收，根据加尾反应说明书进行加尾反应。再用nest-PCR引物3-PRL-F2和AAP，以加尾反应产物为模板，进行PCR扩增反应。PCR产物经1X琼脂糖凝胶电泳，在UV/EB下观察，呈现一片弥散带，割取在900b^2000bp之间的弥散带回收，连接构建克麟体PMD18-T-3-PRL，转化TOP10感受态细胞，在LB选择平板上获得许多个分离良好的单个白色菌落，随机挑取10个白色菌落，扩大培养，经两次菌落PCR鉴定，得到10个阳性克隆，分别命名为pMD18-T-3-PRLl、pMD18-T-3-PRL2…pMD18-T-3-PRL9、pMD18-T-3陽PRL10，取片段长度大的阳性克隆pMD18-T-3-PRL，送上海联合基因生物技术有限公司测序。利用http:Vwww.ncbi.nlm.nih.gov/blastn分析测定的序列，结果与其他动物PRL的碱基序列相似，可初步确定其为浅色黄姑鱼的PRL基因部分序列。运用clustalx软件将所得三段DNA序列进行比对拼接为一条完整DNA序列，即为浅色黄姑鱼PRL基因序歹i」，如SEQIDNO.l所述。浅色黄姑鱼PRL基因组序列全长3839bp,包括5'端的非编码区和启动子区域500bp和3'端非编码区392bp。浅色黄姑鱼PRL基因含5个外显子(分别为43bp、113bp、108bp、183bp、192bp)和4个内含子(分别为800bp、401bp、1015bp、92bp)，其开放阅读框(ORF)共计639bp。利用SSRHunter软件分析，发现浅色黄姑鱼的基因组PRL中有个微卫星位点，分别是(CA)w、(TGL和(AT)5序列。通过基因扩增获得浅色黄姑鱼PRL基因序列，根据该序列设计一对特异引物qcPRL-Fl和qcPRL-Rl。qcPRL-Fl和qcPRL-Rl引物以浅色黄姑鱼脑垂体cDNA文库为模板，扩增得到约900bp的片段。按前述方法将PCR产物经凝胶回收后，与PMD18-T载体连接构建克隆载体PMD18-T-PRL，转化TOP10感受态细胞，在LB选择平板上获得若干个分离良好的单个白色菌落，随机挑取10个白色菌落扩大培养，经菌落PCR鉴定得到5个阳性克隆，分别命名为PMD18-T-PRL1、PMD18-T-PRL1、PMD18-T-PRL2、PMD18-T-PRL3、PMD18-T-PRL4和PMD18-T-PRL5，取PMD18-T-PRL3在上海联合科技生物有限公司测序。菌落PCR扩增鉴定结果，得到约900bp的片段。浅色黄姑鱼PRL基因的cDNA序列如SEQIDN0.2所述，全长900bp。开放阅读框(ORF)为639bp，可翻译成由212个氨基酸残基组成的前体蛋白，分子量约为23.39kDa，理论等电点约为8.80。利用软件SignalP分析显示，浅色黄姑鱼PRL氨基酸序列前24个氨基酸为信号肽，经转膜剪切后形成188个氨基酸的成熟肽。该序列上有5个半胱氨酸残基，一个在信号肽区，蛋白加工过程中，该半胱氨酸将随信号肽被切除。同源性分析表明，浅色黄姑鱼PRLcDNA序列与金鲈(尸erca/7sKesc朋s)和斜带石斑鱼(^w'/7ep力e7^cw》J't/es)的PRLcDNA的同源性最高，达到87%，而浅色黄姑鱼PRL前体氨基酸序列，则与同属鲈形亚目的舌齿鲈(AhZra力和斜带石斑鱼(^^7印/ze7^cw'oWes)的PRL前体氨基酸序列同源性最高，分别为85%(E=4e-101)和86%(E:2e-则。研究得最深入的是PRL在广盐性真骨鱼类的渗透压调节和在淡水适应中的作用。同时，在淡水中PRL水平足够高时，它也可以竞争性地与GH受体结合，发挥促生长活性。图1是PRL基因中间序列PCR扩增产物电泳图；M:腦bp腿Marker;1:PCRproductwithNcPRL-FWandNcPRL-RV2primes;2:PCRproductwithNcPRL-FWandNcPRL-RVlprimes;图2是引物NcPRL-FW与5-PRL-Rl、R2的PCR扩增电泳图；M:lOObpDNAMarker;1:PCRproductwithNcPRL-FWand5-PRL-Rlprimes;2:PCRproductwithNcPRL-FWand5-PRL-R2primes;图3是PRL基因5'端序列PCR产物电泳图；M:lOObpDNAmarker;1，2:PCRproducts;图4是PRL基因5'端序列菌液PCR电泳图；M:層bpDNAmarker,Upperrow:PCRproductswithNcPRL-FWand5-PRL-R2primes;Lowerrow::PCRproductswith5-PRL-R2andAPprimes;图5是浅色黄姑鱼PRLcDNA片段的筛选扩增；M:lOObpDNAMarker;1-2:PCRproducts;图6是PRLcDNA片段菌液PCR电泳图；M:100bp腿marker;1-4:菌液PCR扩增产物。具体实施方式一、浅色黄姑鱼PRL基因序列的克隆1浅色黄姑鱼PRL中间片段1.1引物设计鱼类PRL基因具有较高的保守性，根据与浅色黄姑鱼亲缘关系较近的斜带石斑鱼(五p/"epfe/usco!'o!Vfc)、金头鲷(SpflA^做rato)和河鲈(尸em;r/tm'加'fo)的PRL基因序列，综合比较其他鱼类的PRL基因序列的同源性，设计三条兼并引物，用于扩增浅色黄姑鱼PRL基因的中间片段，引物序列如下NcPRL-FW:5,-TG(C/T)TGT(A/G)(T/C)ATGGTGGCAGCGTGC-3，NcPRL-RV1:5，陽GAGTCGCGGCGGAAGCAGGACA陽3'NcPRL-RV2:5,-CTGTAGGGCAG(C/T)GAGG(C/A)GATG陽3，1.2PRL基因组DNA中间片段的PGR扩增1.2.1第一轮PGR扩增以浅色黄姑鱼DNA为模板进行扩增，建立如下反应体系PCR反应体系10x￡x~Buffer(Mg2+)5|oL2.5mMdNTPMixture耻10一NcPRL-FW1.0(iLlO一NcPRL-RVl1.0DNA模板1.0ddH2037.75pL7b歸a￡x7l^(5U/nL)终体积50^反应参数为94。C预变性5min;以下35个循环94°C45s，57°C45s,72°C2min;72'C延伸10min，最后4'C保温。扩增的PCR产物以1.2%的琼脂糖凝胶电泳检测。1.2.2第二轮PCR扩增第一轮PCR扩增产物稀释10倍为模板，以NcPRL-FW和NcPRL-RV2为引物进行扩增。反应体系同上。1.3PGR产物凝胶回收扩增的PCR产物以1.5%的琼脂糖凝胶电泳检测和分离。割胶回收跟预期估计大小相近的片段。方法参照DNA凝胶回收试剂盒(DNAGelExtractionKit)使用说明书进行(1)使用0.5XTBE制作的1.2%琼脂糖凝胶对目的DNA进行电泳分离。(2)在紫外灯下切出含有目的DNA的琼脂糖凝胶，用纸巾吸尽凝胶表面液体。(3)称量凝胶重量，计算胶块体积。以lmg重量换算成lpL计算。(4)根据凝胶浓度，按下表所提供的参数加BufferDE-A:凝胶浓度BufferDE-A体积<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>(5)均匀混合后于75。C加热，每隔23分钟混合一次，直至凝胶块完全融化。(6)按BufferDE-A体积的50%加入BufferDE-B，均匀混合。当回收的DNA片段小于500bp时，应再加入终浓度为20%的异丙醇。(7)将试剂盒中DNA-prepTube按置于2mlMicrofUgeTube中，将步骤6中的混合液移入DNA-prepTube中，2500Xg(或5500rpm)离心1分钟。(8)弃滤液，将DNA-prepTube置回到原2-mlMicrofogeTube中，加入500pLBufferWl，2500Xg(或5500rpm)离心1分钟。(9)弃滤液，将DNA-prepTube置回到原2-mlMicrofugeTube中，加入700pL已加无水乙醇的BufferW2，2500Xg(或5500rpm)离心1分钟，以同样的方法再用700pLBufferW2洗涤一次。(10)将DNA-prepTube置于1.5ml离心管中，1200Xg离心1分钟。(11)将DNA-prepTube置于另一洁净的1.5ml离心管中，在silica膜中央加入253(HiLEluent或去离子水，室温静置1分钟。1200Xg离心1分钟洗脱DNA。1.4PCR产物连接、转化连接采用T-A克隆法。此方法是利用普通DNATaq酶在PCR扩增过程中，以非模板依赖方式在扩增产物的3'端加脱氧腺苷(A)的特性，使PCR产物在3'端多出一个未配对的碱基A。利用线性化的T载体3'端凸出一个脱氧胸苷(T)的特性，在T4DNA连接酶作用下，将PCR产物与T载体相连，形成重组载体。参照T载体使用说明书，建立如下连接反应体系_<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>将上述反应混合物混匀后，置于PCR仪中16'C连接过夜。转化(1)￡co〃(DH5a)感受态细胞的制备(氯化钙法)(1)从经37。C培养16~20h的新鲜平板上，用无菌牙签挑取一白色单菌落，接种于5mLLB培养基中，37'C摇菌过夜(200300转/分)。第二天按l:100比例取过夜的菌液500nL加入50mlLB培养基中，37。C剧烈摇菌2-3h(300转/分)，待OD咖值约为0.3~0.4时，停止培养。(2)将细菌转入一50mL无菌离心管中，冰浴10min。(3)4000xg，4'C离心10min，回收细菌，用10mL冰冷的0.1mol/LCaCl2重悬沉淀细胞。(4)4000xg，4'C离心10min，回收细菌，沉淀重悬于2mL冰上预冷的0.1mol/LCaCl2中。(5)每份200pL感受态细胞分装于1.5mL离心管中，于4'C贮存备用，或加10%的灭菌甘油，于-7(TC冻存。(2)连接产物的转化(化学转化)(1)取DH5a感受态细胞200pL置于冰上，加入5~10连接产物，轻旋混匀。(2)置冰上放置30min，其间轻轻摇动2~3次。(3)迅速于42'C水浴中热激90s，再迅速置冰上冷却2-3min。(4)加入800pLLB培养基，37°C，150rpm轻摇培养45~60min。(5)5000rpm离心2min，回收细胞，用100~200LB培养基重悬细胞，均匀涂布于含有100pg/mLAmp的选择培养基平板上(含有5pLIPTG(200mgmL")和50pLX-gal(20mgmL—1))上，将平板放于37'C培养箱中倒置培养过夜。1.5菌液PCR鉴定假阳性克隆直接取随机挑取的单克隆菌液进行PCR鉴定。25^L反应体系如下PCR反应体系10x&7^Buffer2.52.5mMdNTPMixture2(oL10一NcPRL-FWO单10pMNcPRL-RV2O单菌液1.0|iLddH2018.375pL7^幽￡xr一5u/nL)0.125nL终体积25nL反应程序同第二轮PCR扩增。扩增的PCR产物以1.2%的琼脂糖凝胶电泳检测，结果见图1。.1.6序列测定、分析将菌液PCR和酶切鉴定均为阳性的克隆放大培养分装，送上海博亚生物技术有限公司用AB377自动测序仪进行序列测定。2.PRL基因5'端序列和3'端序列的克隆为了取得浅色黄姑鱼PRL基因5'端和3'端序列，采用染色体步移法，根据上述己取得的中间序列，设计合成4条基因特异性引物(见表4-l)。在第一轮扩增反应中利用基因特异性引物F1或R1进行单引物PCR扩增；然后，进行加尾反应；在第二轮扩增反应中利用基因特异性引物F2或R2和锚式引物AAP(见表4-l)扩增DNA。2.1引物设计根据已测定的浅色黄姑鱼PRL基因组DNA中间序列，用PrimerPremier5.0设计并由上海博亚生物技术有限公司合成4条基因特异性引物3-PRL-Fl、3-PRL-F2和5-PRL-R1以及锚式引物01igo(dT)n-adapter、AAP与通用接头引物Adaptorprimer。表4-l实验中所用的引物序列Tab.4-1Oligonucleotideprimersusedinexperiments_引物名称name引物序歹'Jsequence(5，—3，)用途information5-PRL-R1GACCAGGTCTTGACTGAGCATTG前两条用于PRL基因5-PRL-R2AAGGGAGTGTAGCGTGTCAGAC5端岸列的扩增3-PRL-FlATGTCACTGGCTCGCTCA用于PRL基因3端序列的3-PRL-F2CTGTTAAGACCCTGCCTCACCCA扩增AAPGGCCACGCGTCGACTAGTACG,6用于接出未知端序列的Oligo(dT)i7-adarrterGGCCACGCGTCGACTAGTACTi7引物AdaDtorDiimerGGCCACGCGTCGACTAGTAC2.2prl基因5'端序列的克隆2.2.1pgr扩增为了检测设计的特异引物的可行性。以浅色黄姑鱼DNA为模板，以5-PRL-R1与NcPRL-FW和5-PRL-R2与NcPRL-FW为引物分别进行PCR扩增。建立如下反应体系PCR反应体系io必r"《Buffer(Mg2+)5(jL2.5mMdNTPMixture4j^L105-PRL-R1或5-PRL-R21.0^10一NcPRL陽FW1.0nLDNA模板1.0ddH2037.75nL0.25pL终体积50nL反应参数为94。C预变性4min;以下35个循环94°C30s，54°C30s,72。Clmin;72'C延伸10min，最后4"保温。扩增的PCR产物以1.2%的琼脂糖凝胶电泳检测，结果见图2。2.2.2单引物pcr扩增以浅色黄姑鱼DNA为模板，以PRL-R1为引物进行PCR扩增。建立如下反应体系PCR反应体系10x￡x7^Buffer(Mg2+)5|uL2.5mMdNTPMixture4jaL10pM5-PRL-R11.0pLDNA模板1.0ddH2038.75pLra扁aficT^(5U/pL)0.25nL终体积50nL反应参数为94'C预变性5min;以下35个循环94。C30s，56。C30s，72°C4min;72匸延伸10min，最后4"C保温。扩增的PCR产物以1.2%的琼脂糖凝胶电泳检测。2.2.3PCR产物直接纯化回收直接取PCR产物用PCR清洁试剂盒(V-gene)纯化回收。具体操作步骤参照PCR清洁试剂盒说明书进行，步骤同1.3。2.2.4加尾反应在冰上向微量离心管中加入以下成分PCR产物加尾反应体系DEPC陽treatedWater6.5|iLTerminalTransferase5xBuffer5jjL2mMdCTP2.5纯化的PCR产物_10总体积24轻柔混匀，于PCR仪上94。C孵育23min，立即于冰上冷却2min，简短离心后置于冰上，加入lnL末端转移酶(TdT),轻旋混匀，置于PCR仪上37。C孵育60min，接着70。C加热10min终止反应，简短离心后产物贮于-2(TC备用。2.2.5PGR二次扩增以加poly(C)尾的第一链cDNA为模板，建立以下反应体系，包括第一轮PCR扩增反应体系10x五;c7^Buffer(Mg2+)5.0)LiL2.5mMdNTPMixture4.0lO^MAAP1.010pM5-PRL-R21.0pL加Poly(C)尾的第一链cDNA1.0|iLddH2017.3roKa及o!五x7^(5U/iiL)0.2终体积25pLPCR反应参数为94r预变性5min;以下25个循环94。C变性45s，52"退火45s，72。C延伸60s;循环结束后72。C延伸10min，最后4"C保温。取510PCR产物于1.2%琼脂糖凝胶上电泳检测扩增效果，结果见图3。此PCR产物作为连接PCR产物。2.2.6PCR产物割胶回收扩增的PCR产物以1.2%的琼脂糖凝胶电泳检测和分离。割胶回收跟预期估计大小范围相近的一段胶。方法参照DNA凝胶回收试剂盒(DNAGelExtractionKit)使用说明书进行。2.2.7连接、转化涂平板。方法同1.4。2.2.8PRL基因5'端PCR产物的克隆检测随机挑取几个单菌落进行过夜培养，直接取菌液进行二次PCR扩增鉴定。第一次PCR扩增分别以各菌液为模板，PRL-R2+AAP为引物，检测插入片段的大小。反应体系为25ul，反应程序同2.3.2.5。第二次PCR扩增分别以各菌液为模板，以PRL-F0+PRL-R2为引物，检测插入片段是否为目的片段，其电泳结果如图4所示。反应体系为25ul，反应程序2.3.2.1。2.2.9序列测定PCR鉴定均为阳性的克隆放大培养分装，送上海博亚生物技术有限公司用AB377自动测序仪进行序列测定。2.3PRL基因3'端序列的克隆步骤方法同PRL基因5'端序列获得方式。2.3.1PRL基因序列全长拼接运用CLUSTAL软件，将所得的三段DNA序列进行比对拼接为一条完整的DNA序列，即为PRL基因组全长DNA序列。2.3.2序列分析将拼接得到的DNA序列，输入GenBank-EMBL核酸数据库，经过BLAST程序进行相似性比对检索。碱基序列翻译成相应的氨基酸序列，其他特征通过CLUSTALW、DNATools等软件分析，用Mega2.0计算其与其他物种的相似百分比，并构建系统进化树。二、浅色黄姑鱼PRLcDNA序列的获得1.引物设计根据拼接的PRL基因组DNA序列设计二对特异引物，以其扩增PRLcDNA的全长序列，设计的引物序列如下qcPRL-Fl:5-ACCAGACCAGCCATGAACA-3qcPRL-Rl:5-GGCTACAGCGTGCAGTTG-32.PRLcDNA的PCR扩增浅色黄姑鱼脑垂体cDNA文库为模板进行扩增，建立如下反应体系:PCR反应体系10x￡x7^Buffer(Mg2+)52.5mMdNTPMixture争10qcPRL-Fl1.0&10[iMqcPRL陽Rl1.0}AcDNA文库l.Oi^LddH2037.75nL7ixKa/oEx7i^(5U/(xL)0.25nL终体积50|iL反应参数为94。C预变性5min;以下前5个循环94。C30s，50。C30s，72°Clmin;72。C延伸3min，再反应35个循环94°C30s，58°C30s,72°Clmin;72。C延伸lOmin，最后4'C保温。扩增的？01产物以1.2%的琼脂糖凝胶电泳检测，电泳结果见图5。3.PGR产物凝胶回收方法步骤同1.3。4.连接、转化方法步骤同1.4。5.菌液PGR鉴定假阳性克隆用灭菌牙签随机挑取单菌落，接种于含有100pg/mLAmp的LB液体培养基中，37'C，200300rpm摇菌培养34小时后，直接取菌液进行PCR鉴定。25pL反应体系如下PCR反应体系10x￡Jc7^Buffer(Mg2+)2.5pL2.5mMdNTPMixture2(jLlO^MqcPRL-Fl0单10岸qcPRL-Rl0.5^菌液l単ddH2018.375nL0.125pL终体积25^反应程序同GH基因cDNA序列PCR扩增。扩增的PCR产物以1.2%的琼脂糖凝胶电泳检测。6.序列测定和序列分析将菌液PCR鉴定为阳性的克隆放大培养分装，送上海博亚生物技术有限公司用AB377自动测序仪进行序列测定。http:〃www.ncbi.nlm.nih.gov/对序列进行blast、DNAStar软件对序列进行翻译分析、ClustalW1.83对脊椎动物中PRL的氨基酸序列进行比对、Mega2.0软件对它们进行系统进化分析、DNAstar软件包对各序列同源性进行计算。图6是菌落PCR扩增鉴定结果，从图上可见经PCR扩增都可得到约900bp的片段。序列表<110>中国水产科学研究院南海水产研究所<120>浅色黄姑鱼泌乳激素基因序列<160>3<210>1<211>3839<212>DNA<213〉浅色黄姑鱼(Nibeacoibor)<220><221>gene<222>(1)...(3839)<220><221〉promoter<222>(1)...(500)<220><221>satellite<222>(231)...(250)<220><221>exonl<222>(501)...(543)<220><221>intronl<222>(544)...(1343)<220><221>satellite<222>(577)...(586)<220><221>exon2<222>(1344)...(1456)<220><221>intron2<222>(1457)...(1857)<220><221>satellite<222>(1474)...(1501)<220><221>exon3<222>(1858)...(1965)<220><221>intron3<222>(1966)...(2980)<220><221>exon4<222>(2981)...(3163)<220><221>intron4<222>(3164)...(3255)<220><221>exon5<222>(3256)...(3444)<400>1tgaccaggccttgactgagcattgtgccacggtgactttttgatttgattgacttcacta60tctataatgcaccttgtgagtgattacttttttcatccctgacagtaaatgagaagatca120gatgagatgatgacatgttcatcagccatttaagcateaaatgattattattacaacata180ctgtggaaacatcagtgtttttattcatccatctaattaagatctttttccacacacaca240cacacacacacgcatgcatgtgcacagacatgcacagcatcatcaacctgttgcatccat300tcacctttccttcaccatgtttctcattatgaactggaccaaacaagttccaaacaatca360gcacacgctccccgagctgctgcataaccaaacgaaacagatgaagccgaggaactataa420aacagagtcaacctccgtgctgaagaggaagaaacagcgaggaagagaagacgcaaaggc480tgacaaagacacgaagagagatggetcagagaaaaateaatggaageaaa530MetAlaGinArgLysHeAsnGlySerLys1510etcttcatgacgggtgagaggagctcagctgctctgtgaaattatgatatata583LeuPheMetThrtattatgtgtgtcatgtgtcagctgatgagaaactattgttcattgtatgtctaagattt643gtttgaggtgatttagaaacagagttacacagtttgtgtgacaggttcattaaaatgttc703cacttggtgcatgctgtatattgattacacttttttaatgatatatattttattgatccc763gagggacattcaagcatccagtagcagcatgagacacagtaaacacacagtgtgcattca823gattagcttatacagcaataaacatgeaatgagctgaatctgcatttgaatgaagecaga883gtagtttgacatgtgcaaagaagaaatgaaacacactgggatactgtgacctaagagctt943tataaatagaaaactttataaaagtaaaactagaataacatctttcatataaaaataaga1003aatagacctacaaaaaaactgtctacagttaactgaggctctagacactgaatgaagatc1063acagcattgcaaactgagtctaaatccttttcataataaccgctgUgttaaagaatatc1123acaatatattgagattttttatatattattgtggagaggtaaaatactgagatataatac1183ttcatggatatgagctacagctgctggtcgatcactgaatctgctgaacctcagagaact1243ttagttcactgctgctgattcataaactcctctgacacactgtatgtatgtgacatttgt1303gatagctctgatgtctctgtcatgtctccgtgctccacagtgttgtatgtggtggca1360ValLeuTyrValValAla1520gcgtgcggtgetgttcccateagegacctgetcgacegggcatctcag1408AlaCysGlyAlaValProlieSerAspLeuLeuAspArgAlaSerGin253035cgctctgacacgetacacteccttageacaatgetcagtcaagacctg1456ArgSerAspThrLeuHisSerLeuSerThrMetLeuSerGinAspLeu404550gtcagtacctctaatagtgtgtgtatgtgtgtgtgtgagtgtgtgctgagtcctcccaaa1516tgtaaatgttaaagcatatgttaaagttctagttgtgctcatggcttcctgattgecctg1576ageccgaattgcacagggcagcttagttgaacctgtatgtaeigtctattgttgttgttU1636tttcatgtcttcagcaacagaaaagatgagagattcagtttagctcttgtteatgeaggt1696cataccaggagttttttatgatctaaaacttccaattagccaaatgttcctgtcccagtt1756tattttttttacatttatttgcagggtaaacagttcattgtgattgtacagtacaatata1816aaagcatctcttctcctaatcgtcctatgtccctcccccaggactctcatttccctcca1875AspSerHisPheProPro55ataggceggatgattatgcctcgccccteaatgtgccacacctectct1923lieGlyArgMetlieMetProArgProSerMetCysHisThrSerSer606570ctgcagacacccaatgacaaggagcaagccctgcaagtateagtgagtcact1975LeuGinThrProAsnAspLysGluGinAlaLeuGinValSer758085gctcctccttattcctcctttctactccgcttccatttgtttcactgatgtcctgattat2035atttacttcatcattgtggtatcaggcatgagtacagacaaagatgtaataaatagacta2095ccgcagctttcacccaaataactaagtgagtgaatgttttaaeteittgaagcaagcctcaa2155tttattttgagagaacttgctgaagttgaacaagtcttacatgaatgtacctgatttcac2215catgacaacatgtatatgaagcagcgttgatggatatgacatgatatgaaaattagegag2275caagagagtgtgacatacaagtctgtgtaaaggtaattccaagatttctaatacgtgaaa2335tatgttgaaaatagttgctgaaaacatgtgaaaagattttgaaggatatattagtgaaat2395gtggagttagaggttcaaacagtttgtcaccagttttcagtccaggattttgtgggcggt2455ccttaaagggtggctcgatgacacgctgaggtcaccctgagcatacccctgcacccctag2515cagagagatagagatgaattcatctcactcagagtgtttcaaagttagttatgtcatttt2575ctgaactcatctgacacattggccaatgttgcccacaagtggacgtggcttcagcacatt2635cagaggacacgcccccacagtcctggagctgagaattcatttttacctgattttgacacc2695taatttcataaacttgttgatatttttaatcattcaaatttggctggttgattaatggca2755ctttcttttttggtctgacaaactaagaacacatttatttcttctttacatggcctttaa2815cttgaagagatttgtaacatttactgtaggccaacaagtgaattagatgatctttggaag2875acacaggtggttgtccatgcacagactggtttagtgaaaagcatgcttttgatctcttca2935gcgtactgtattgtcttaatattatccttttggcttcttctgcaggagteagacctg3992GluSerAspLeu卯atgteactggetcgcteactgetccaagcctggtctgaccccetagaa3040MetSerLeuAlaArgSerLeuLeuGinAlaTrpSerAspProLeuGlu95100105gtcctgtecacttctgttaagaccctgcctcacccagcccaaaacage3088ValLeuSerThrSerValLysThrLeuProHisProAlaGinAsnSer110115120atatecaacaagateaaggagctgcaggagcactecaagagectggga3136lieSerAsnLyslieLysGluLeuGinGluHisSerLysSerLeuGly125130135140gacggcctgaacatettatctggcaaggtgagcaagtgagaaaatgatgaatccata3193AspGlyMetAsnlieLeuSerGlyLys145tgaagacattttgagttgcttttcgcaaacgtctttacttccttgctttgtttctcgttc3253agatgggtccggcggetcagaccatetecteactgccctacagaggtggc3303MetGlyProAlaAlaGinThrlieSerSerLeuProTyrArgGlyGly150155160165aatgacateggccaggataggatttecaaactgaccaacttccatttc3351AsnAsplieGlyGinAspArglieSerLysLeuThrAsnPheHisPhe170175180ctgUgtectgcttccgcagggacteceacaagattgacagettcetc3399LeuLeuSerCysPheArgArgAspSerHisLyslieAspSerPheLeu185190195aaagtcetccgctgccgtgcggcaaaactgcaacctgagatgtgttaa3447LysValLeuArgCysArgAlaAlaLysLeuGinProGluMetCys*200205210agagtgagagtgaagcageeagcttcactttgagggagacttttctaaaagcttgtattg3507tctgccaactatagattagcatgttttagaaatctgcatgatttgagctgtcagagggtg3567aagttagggaggggttacacagcccatacacaaatgattgaagtgacaccttttactgat3627cgtggtgcccaaaattgeceaattgttaatgtgactgtgtttactcaaaaatataaggta3687aggcattttaggttgggaaggtttatcctattgtccagacttgctatggttcattggaca3747gagcatgggtcacacactttcccgggtctttccagcttctggcattataaactgtgactc3807ctcctcatcttttccttccactacaccatttc3839<210>2<211>749<212>cDNA<213>浅色黄姑鱼(Nibeacoibor)<220><221>CDS<222>(38)...(676)<220><221>sig_peptide<222>(38)...(106)<400>2agagaagacgcaaaggctgacaaagacacgaagagagatggetcagagaaaaate55MetAlaGinArgLyslie15aatggaageaaaetcttcatgacggtgttgtatgtggtggcagcgtgc103AsnGlySerLysLeuPheMetThrValLeuTyrValValAlaAlaCys101520ggtgetgttcccateagegacctgetcgacegggcatctcagcgctct151GlyAlaValProlieSerAspLeuLeuAspArgAlaSerGinArgSer253035gacacgetacacteccttageacaatgetcagtcaagacctggactct199AspThrLeuHisSerLeuSerThrMetLeuSerGinAspLeuAspSer404550catttccctccaataggceggatgattatgcctcgccccteaatgtgcHisPheProProlieGlyArgMetlieMetProArgProSerMetCys55606570cacacctectctctgcagacacccaatgacaaggagcaagccctgcaaHisThrSerSerLeuGinThrProAsnAspLysGluGinAlaLeuGin758085gtateagagteagacctgatgteactggetcgcteactgetccaagccValSerGluSerAspLeuMetSerLeuAlaArgSerLeuLeuGinAla9095100tggtctgaccccetagaagtcctgtecacttctgttaagaccctgcctTrpSerAspProLeuGluValLeuSerThrSerValLysThrLeuPro105110115cacccagcccaaaacageatatecaacaagateaaggagctgcaggagHisProAlaGinAsnSerlieSerAsnLyslieLysGluLeuGinGlu120125130cactecaagagectgggagacggaatgaacatettatctggcaagatgHisSerLysSerLeuGlyAspGlyMetAsnlieLeuSerGlyLysMet135140145150ggtccggcggetcagaccatetecteactgccctacagaggtggcaatGlyProAlaAlaGinThrlieSerSerLeuProTyrArgGlyGlyAsn155160165gacateggccaggataggatttecaaactgaccaacttccatttcctgAsplieGlyGinAspArglieSerLysLeuThrAsnPheHisPheLeu170175180ttgtectgcttccgcagggacteccacaagattgacagettcetcaaaLeuSerCysPheArgArgAspSerHisLyslieAspSerPheLeuLys185190195gtcetccgctgccgtgcggcaaaactgcaacctgagatgtgttaaValLeuArgCysArgAlaAlaLysLeuGinProGluMetCys*200205210agagtgagagtgaagcageeagcttcactttgagggagacttttctaaaagcttgtattgtctaccaactata247295343391439487535583631676736749<210>3<211>212<212>PRT<213>浅色黄姑鱼(Nibeacoibor)<400>3MetAlaGinArgLyslieAsnGlySerLysLeuPheMetThrValLeu151015TyrValValAlaAlaCysGlyAlaValProlieSerAspLeuLeuAsp202530ArgAlaSerGinArgSerAspThrLeuHisSerLeuSerThrMetLeu354045SerGinAspLeuAspSerHisPheProProlieGlyArgMetlieMet505560ProArgProSerMetCysHisThrSerSerLeuGinThrProAsnAsp65707580LysGluGinAlaLeuGinValSerGluSerAspLeuMetSerLeuAla85卯95ArgSerLeuLeuGinAlaTrpSerAspProLeuGluValLeuSerThr100105110SerValLysThrLeuProHisProAlaGinAsnSerlieSerAsnLys115120125lieLysGluLeuGinGluHisSerLysSerLeuGlyAspGlyMetAsn130135140lieLeuSerGlyLysMetGlyProAlaAlaGinThrlieSerSerLeu145150155160ProTyrArgGlyGlyAsnAsplieGlyGinAspArglieSerLysLeu165170175ThrAsnPheHisPheLeuLeuSerCysPheArgArgAspSerHisLys180185190lieAspSerPheLeuLysValLeuArgCysArgAlaAlaLysLeuGin195200205ProGluMetCys210权利要求1.一种浅色黄姑鱼泌乳激素的基因，它的核苷酸序列如序列表中SEQIDNO.1所述。2、权利要求l所述的浅色黄姑鱼泌乳激素的基因的cDNA的序列，如SEQIDNO.2所述。3、权利要求1所述的浅色黄姑鱼泌乳激素的基因的PRT序列，如SEQIDNO.3所述。全文摘要本发明公开了一种浅色黄姑鱼泌乳激素基因序列，根据鱼类的PRL基因的保守性，以简并引物NcPRL-FW和NcPRL-RV1、NcPRL-RV2进行两轮PCR扩增反应，得到PRL中间片段序列；再以所得的PRL中间片段序列设计特异引物5-PRL-R1和5-PRL-R2进行PCR扩增反应；通过基因扩增获得浅色黄姑鱼PRL基因序列，根据该序列设计一对特异引物qcPRL-F1和qcPRL-R1。qcPRL-F1和qcPRL-R1引物以浅色黄姑鱼脑垂体cDNA文库为模板，扩增得到约900bp的片段。研究得最深入的是PRL在广盐性真骨鱼类的渗透压调节和在淡水适应中的作用。同时，在淡水中PRL水平足够高时，它也可以竞争性地与GH受体结合，发挥促生长活性。文档编号C12N15/16GK101225392SQ200710026380公开日2008年7月23日申请日期2007年1月18日优先权日2007年1月18日发明者张殿昌,江世贵,邵艳卿申请人:中国水产科学研究院南海水产研究所