专利名称：：一种染色液及其染色方法和应用的制作方法
技术领域：
：本发明属于细胞活力检测领域，特别涉及一种用于鉴别原虫细胞活力的染色液及使用该染色液鉴别原虫细胞活力的方法及该方法在鉴别家蚕微孢子虫活力中的应用。
背景技术：
：养蚕业是我国的传统产业，有着悠久的历史，在满足人民物质生活需要的同时，也成为我国人民与睦邻各国友好交往的纽带，其中著名的丝绸之路便源自桑蚕生产。现今养蚕业在丰富人民物质生活、增加农民收益的同时，也为国家创造了大量的外汇和财富。然而，长期以来，养蚕业却受家蚕微粒子病的困扰。家蚕微粒子病是由家蚕微孢子虫(Mwewa/)o/ntyds)引起的一种危害严重的传染病，也是蚕业生产唯一被检疫的对象。在19世纪中叶，家蚕微粒子病曾导致法国和意大利等国的养蚕业几乎全部毁灭。我国政府大力推行科学养蚕技术，制订了严格的蚕种生产监管法规，然而由于蚕种生产的特殊性，蚕种场仍受到微粒子病的严重威胁，全国仍有约85%的蚕种场会发生该病，一旦发病率超过国家规定的监管条例，所生产的蚕种便要遭烧毁、淘汰，有的蚕种场一年因此造成的损失数以百万元计，轻则造成企业严重亏损，重则没有蚕种供应蚕农，造成面上养蚕生产的更大损失。尤其是近年来野外昆虫微粒子病与家蚕的交叉感染引起的损失曰益严重，因此，对该病发病规律、防治方法和消毒药物筛选的进一步深入研究显得非常重要。孢子为感染期虫体，它是微孢子虫生活史中的一个发育阶段。孢子个体微小，即使在显微镜下观察，也难以从形态上区分其死活。蚕发病需要一定的活孢子数量，不同蚕品种、不同发育龄期、不同饲料质量和饲育环境，都对致病所需活孢子数量有影响，所以实际上无法确知导致蚕死亡所需的活孢子数量或具体比例。现有的一种鉴别孢子活力的方法是用生物试验将经处理的家蚕孢子添食2龄起蚕，桑叶喂养至一定时间后逐头解剖显微镜检查，最后统计患病率，以不发病区认定为孢子死亡。此法需时长(约10-20天)、工作量大、所需设备多、且中间因素影响大。现有技术中鉴別孢子活力的方法还有采用孢子发芽备别的方法，但由于孢子极丝细小(长约120140nm,宽约0.1pm),即使用相差显微镜观察，其效果也欠佳，如要观察出准确的活孢子数目或孢子的活力程度则更难则更难。而通常鉴别细胞活力的染色方法，如苔盼蓝染色法、美兰染色法等，由于孢子外壁的特殊结构，如皮膜很厚等原因，染色效果均不理想。本发明就是针对上述现有技术中存在的不足而提出的一种鉴别微孢子虫的孢子活力的新方法。本发明所称的孢子活力是指孢子的生存状态，孢子有可能处于存活、死亡或正在死亡的状态。
发明内容本发明的目的在于提供一种用于鉴别原虫细胞活力的染色液。本发明的另一目的在于提供一种鉴别原虫细胞活力的方法。本发明的又一目的在于提供所述方法在鉴别家蚕微孢子虫活力中的应用。本发明提供的一种用于鉴别原虫细胞活力的染色液包括如下组分0.05%-0.3%吖啶橙溶液3份；0.0067%-0.026%碘化丙咬溶液1份，所述吖咬橙溶液、碘化丙咬溶液是由0.38%NaCl溶液或双蒸水配制而成。在本发明的一个实施例中，本发明所述原虫细胞为蚕微孢子虫的孢子。本发明提供的使用所述染色液鉴别原虫细胞活力的方法，包括如下步骤(1)取材提供原虫细胞，备用；(2)配制染色液将0.05%-0.3%吖啶橙溶液和0.0067%-0.026%碘化丙咬溶液按3:1混合，过滤备用；(3)染色将原虫细胞涂片阴干，用步骤(2)提供的染色液染色，双蒸水緩慢冲洗，干燥；(4)镜检于490nm激发滤光片和510nm光柵滤光片菱光显微镜下观察；(5)鉴别根据镜检结果的颜色变化鉴别原虫细胞活力。当步骤(1)提供的原虫细胞是冷藏的，需置室温下恢复常温才可备用。在本发明的一个实施例中，步骤(2)中所述的吖啶橙溶液、碘化丙啶溶液是由0J8。/oNaCl溶液配制而成。优选地，步骤(3)中所述的染色时间为5-20分钟，优选IO分钟。在本发明的一个实施例中，步骤()提供的原虫细胞为蚕微孢子虫的孢子。本发明提供的所述染色液在鉴别家蚕微孢子虫活力中的应用是根据所述方法获得的镜检结果的颜色变化来鉴别蚕微孢子虫的孢子的活力，以此来检测家蚕是否带有微粒子病。本发明一种用于鉴别原虫细胞活力的染色液及其使用方法，对鉴别家蚕微孢子虫孢子的活性，具有快捷、灵敏、准确、直观的特点，克服了现有技术的不足。鉴于家蚕微粒子病长期严重威胁蚕种生产，采用本发明鉴别家蚕微孢子虫的活力技术，对蚕业生产有重大的生产应用价值，对进一步深入研究家蚕微粒子虫的传染规律、微粒子病的发病规律、微粒子病防治技术、微孢子虫消毒和治疗药物筛选等有重要意义。本发明也为昆虫学、医学、畜牧兽医学等其他原虫研究领域提供很好的借鉴作用。图1是经清水处理的凝:孢子虫孢子的荧光显獨t镜观察图。图2是经5mg/L二氧化氯溶液处理10分钟的微孢子虫孢子的焚光显微镜观察图。图3是经5mg/L二氧化氯溶液处理30分钟的微孢子虫孢子的焚光显微镜观察图。图4是经10mg/L二氧化氯溶液处理30分钟的微孢子虫孢子的菱光显微镜观察图。图5是经15mg/L二氧化氯溶液处理30分钟的微孢子虫孢子的荧光显微镜观察图。图6是经20mg/L二氧化氯溶液处理30分钟的微孢子虫孢子的焚光显微镜观察图。图7是经25mg/L二氧化氯溶液处理30分钟的微孢子虫孢子的萸光显微镜观察图。图8是经50mg/L二氧化氯溶液处理30分钟的微孢子虫孢子的荧光显微镜观察图。图9是经500mg/L二氡化氯溶液处理30分钟的微孢子虫孢子的萸光显微镜观察图。图10是经IOO'C水蒸汽处理IO分钟的微孢子虫孢子的焚光显微镜观察图。具体实施方式本发明提供的用于鉴别原虫细胞活力的染色液包括吖。定橙溶液和碘化丙。定溶液两种组分。其中吖啶橙为浸润性染料，可侵入活细胞休内，并在荧光显微镜下发绿色荧光；碘化丙啶为排斥性染料，不能进入活细胞体内，但可与死亡或者正在死亡的细胞的核酸结合，在焚光显微镜下发红色荧光。故可以根据吖啶橙和碘化丙啶染色后原虫细胞在荧光显微镜下颜色的变化来鉴别原虫细胞的活力。使用本发明的技术方案时，焚光显微镜设置为激发光滤光片490nm,光4册滤光片510nm。下面阐述本发明的技术方案。实施例一、染色液配制方法1.染料来源吖咬橙，碘化丙啶为Sigma公司分装。2.配制方法用0.38%NaCl溶液配制成0.2%吖啶橙溶液和0.013%碘化丙啶溶液，吖啶橙溶液与石典化丙啶溶液按3:1比例混合，0.22pm混合纤维素酯微孔滤膜过滤，除去染料溶液中杂质和细菌，备用。使用0.38%NaCl溶液配制所述染料能够使染色后的涂片更便于观察，镜检图像效果更好。实施例二、染色液配制方法1.染料来源吖咬橙，*^丙啶为Sigma公司分装。2.配制方法用双蒸水配制成0.3%吖啶橙溶液和0.0067%碘化丙啶溶液，吖咬橙溶液与石^f匕丙啶溶液按3:l比例混合，0.22pm混合纤维素酯微孔滤膜过滤，除去染料溶液中杂质和细菌，备用。实施例三、染色液配制方法1.染料来源吖啶橙，碘化丙啶为Sigma公司分装。2.配制方法用双蒸水配制成0.05%吖咬橙溶液和0.026%硤化丙咬溶液，吖咬橙溶液与碘化丙啶溶液按3:1比例混合，0.22pm混合纤维素酯微孔滤膜过滤，除去染料溶液中杂质和细菌，备用。实施例四、使用所述染色液鉴别家蚕微孢子虫的活力按下述步骤鉴别家蚕微孢子虫的活力1.取才才分别以浓度为5mg/L，10mg/L,15mg/L,20mg/L,25mg/L，50mg/L,500mg/L的二氧化氯处理家蚕微孢子虫孢子30分钟，再以浓度为5mg/L的二氧化氯处理家蚕微孢子虫孢于10分钟，以清水处理做阴性对照，以IOO'C水蒸汽处理IO分钟做阳性对照。2.染色将处理孢子液涂片阴干(如冰箱冷藏的孢子，要置室温下恢复常温后再操作)，用实施例一制备的染色液染色IO分钟，双蒸水緩慢冲洗，干燥。3.镜检于490nm激发滤光片和510nm光栅滤光片荧光显微镜下观察。4.鉴别镜检结果见附图1-10:图1是经清水处理的微孢子虫孢子的荧光显微镜观察图，清水处理的活孢子为翠绿色；图2是经5mg/L二氧^f匕氯溶液处理10分钟的微孢子虫孢子的焚光显微镜观察图，孢子绿中带黄；图3是经5mg/L二氧化氯溶液处理30分钟的微孢子虫孢子的荧光显微镜观察图，孢子黄色加深，翠绿色孢子显著减少；图4是经10mg/L二氧化氯溶液处理30分钟的微孢子虫孢子的焚光显微镜观察图，大部分孢子成为黄色，只有少数为翠绿色；图5是经15mg/L二氧化氯溶液处理30分钟的微孢子虫孢子的荧光显微镜观察图，孢子几乎为黄色，只有极个别孢子绿中带黄；图6是经20mg/L二氧化氯溶液处理30分钟的微孢子虫孢子的荧光显微镜观察图，孢子几乎为黄色，只有极个别孢子绿中带黄；图7是经25mg/L二氧化氯溶液处理30分钟的微孢子虫孢子的荧光显微镜观察图，孢子为橙黄色；图8是经50mg/L二氧化氯溶液处理30分钟的微孢子虫孢子的荧光显凝:镜观察图，孢子为橙黄色；图9是经500mg/L二氧化氯溶液处理30分钟的微孢子虫孢子的荧光显微镜观察图，孢子为橙红色；图10是经IO(TC水蒸汽处理10分钟的孩i孢子虫孢子的荧光显微镜观察图，孢子为橙红色；用荧光显微镜观察经不同方式处理的孢子的形态，15mg/L以上浓度的二氧化氯处理和IO(TC水蒸汽处理的死"I包子为橙红色，清水处理的活孢子为翠绿色，活孢子和死孢子之间不同活性的孢子呈现过渡型的颜色，由绿黄色—黄绿色—黄色—橙红色，通过涂片的颜色可以判断孢子的生存状态，即是处于生存或死亡或正在死亡的状态。为验证本发明鉴别的效果，以生物试验进行验证。生物试验的方法为分别将经不同浓度二氧化氯处理的家蚕微孢子虫以及相同浓度时不同处理时间的家蚕微孢子虫添食家蚕，以清水处理做阴性对照，以100。C水蒸汽处理IO分钟做阳性对照，桑叶喂养至一定时间后逐头解剖显微镜检查，最后统计患病率，以不发病区认定为孢子死亡。生物试验的结果见表l:用清水处理过的孢子可导致家蚕实际发病83.3%、校正发病率为100%;15mg/L及其以上浓度的二氧化氯处理30分钟，其实际发病率和校正发病率均为0;5mg/L二氧化氯处理IO分钟，校正发病率为13.2%;5mg/L二氧化氯处理30分钟，校正发病率8.0%;10mg/L二氧化氯处理30分钟，校正发病率5.2%。此结果与本发明染色方法家别的结果完全吻合，充分表明本发明对鉴别家蚕微孢子虫的活性，具有快捷、灵敏、准确、直观的特点，而且可以鉴别不同死亡时期的孢子。表l生物试验的发病率和校正发病率<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>在本发明的实施例四中，当以叶足虫类的溶组织内阿米巴为二氧化氯的处理对象，然后进行染色、4免检，也可获得相同的4竟检结果，通过镜;^结果的涂片颜色判断出溶组织内阿米巴的生存状态，以此来判断溶组织内阿米巴的活力。本发明对鉴别家蚕微孢子虫孢子的活性，具有快捷、灵敏、准确、直观的特点，克服了现有技术的不足。鉴于家蚕孩i粒子病长期严重威胁蚕种生产，采用本发明鉴别家蚕微孢子虫的活力技术，对蚕业生产有重大的生产应用价值，对进一步深入研究家蚕微粒子虫的传染规律、微粒子病的发病规律、微粒子病防治技术、微孢子虫消毒和治疗药物筛选等有重要意义。本发明也为昆虫学、医学、畜牧兽医学等其他原虫研究领域提供很好的借鉴作用。权利要求1.一种用于鉴别原虫细胞活力的染色液，包括如下组分0.05％-0.3％吖啶橙溶液3份，0.0067％-0.026％碘化丙啶溶液1份。2.如权利要求1所述的用于鉴别原虫细胞活力的染色液，其特征在于所述吖咬橙溶液浓度为0.2%,所述s^f乜丙啶溶液浓度为0.013%。3.如权利要求1或2所述的用于鉴别原虫细胞活力的染色液，其特征在于所述吖啶橙溶液、碘化丙啶溶液是由0.38。/。NaCl溶液配制而成。4.如权利要求1或2所述的用于鉴别原虫细胞活力的染色液，其特征在于所述原虫细胞为家蚕微孢子虫的孢子。5.—种鉴别原虫细胞活力的方法，包括如下步骤(1)取材提供原虫细胞，备用；(2)配制染色液将0.05%-0.3%吖啶橙溶液和0.0067%-0.026%碘化丙啶溶液按3:1混合，过滤备用；(3)染色将原虫絢胞涂片阴干，用步骤(2)提供的染色液染色，双蒸水緩慢冲洗，干燥；(4)镜检于490nm激发滤光片和510nm光栅滤光片突光显微镜下观察；(5)筌别根据镜检结果的颜色变化鉴别原虫细胞活力。6.如权利要求5所述的鉴别原虫细胞活力的方法，其特征在于步骤(2)中所述吖咬橙溶液浓度为0.2%,所述珙化丙啶溶液浓度为0.013%。7.如权利要求5所述的筌别原虫细胞活力的方法，其特征在于步骤(2)中所述吖咬橙溶液、碘化丙夂溶液是由0.38%NaCl溶液配制而成。8.如权利要求5所述的鉴別原虫细胞活力的方法，其特征在于步骤(3)中所述的染色时间为IO分钟。9.如权利要求5所述的鉴别原虫细胞活力的方法，其特征在于步骤(1)提供的原虫细月包为家蚕孩i孢子虫的；包子。10.如权利要求9所述的鉴别原虫细胞活力的方法在筌别家蚕微孢子虫活力中的应用。全文摘要本发明属于细胞活力检测领域，特别涉及一种用于鉴别原虫细胞活力的染色液及一种鉴别原虫细胞活力的方法及该方法在鉴别家蚕微孢子虫活力中的应用。本发明提供的染色液包括如下组分0.05％-0.3％吖啶橙3份；0.0067％-0.026％碘化丙啶1份，所述吖啶橙、碘化丙啶是由0.38％NaCl溶液配制而成。本发明提供的鉴别原虫细胞活力的方法，包括取材、配制染色液、染色、镜检以及根据镜检结果的颜色变化鉴别原虫细胞活力。本发明对鉴别家蚕微孢子虫孢子的活性，具有快捷、灵敏、准确、直观的特点，克服了现有技术的不足。文档编号C12Q1/04GK101225428SQ20071002644公开日2008年7月23日申请日期2007年1月19日优先权日2007年1月19日发明者廖富蘋,林健荣,王正勇申请人:华南农业大学