专利名称：：一种具有抗白血病作用的miR-21反义寡核苷酸及其应用的制作方法1451122.36812.23680.524.47362.101145366.3526.63520.513.27041.695146977.0327.70320.515.40641.453147174.9687.49680.514.99361.3611473240.10424.01040.548.02081.452147437.363.7360.57.4721.185147584.1448.41440.516.82881.2721481128.88812.88880.525.77761.4561482132.15213.21520.526.43041.501148495.4569.54560.519.09121.561148891.6169.16160.518.32321.546148981.7128.17120.516.34241.3151492261.78426.17840.552.35681.21495132.26413.22640.526.45281.303149656.5445.65440.511.30881.4461503300.430.040.560.081.147150439.2563.92560.57.85121.132150754.1285.41280.510.82561.432151498.7529.87520.519.75041.397151773.7047.37040.514.74081.2841530341.18434.11840.568.23681.2210810.80.521.61.3761536106.55210.65520.521.31041.52154249.2724.92720.59.85441.212154688.6888.86880.517.73761.056154766.2086.62080.513.24161.3725,-tcaac^ltcagtctg^ltaaLgcta-3,(22bp)s所述的具有抗白血病作用的miR-21反义寡核苷酸可以经过不同的化学修饰，如甲氧修饰、硫代修饰等。本发明的另一目的是提供这种具有抗白血病作用的miR-21反义寡核苷酸在制备治疗白血病药物中的应用。所述的应用是将所述的核苷酸按本领域常用的方法制成各种制剂。本发明所述的具有抗白血病作用的miR-21反义寡核苷酸的序列是根据白血病细胞K562中的miR-21序列设计的反义寡核苷酸序列(Antisense-micro,s-oIigo歐leotides，AMO)。所以相对应地，5'-tcaacatcagtctgataagcta-3'在本发明中称为扁-miR-21。本发明所述的具有抗白血病作用的miR-21反义寡核苷酸能够有效地抑制白血病细胞中的miR-21和miR-181a这两种基因的表达，促迸白血病细胞凋亡，从而能够有效地治疗白血病。并且抑制效果呈现明显的量效关系，经实验证明，AMO浓度为0.6nmol/L时对白血病细胞生长的抑制效果为最佳。图1为不同浓度AM0对白血病细胞K562的生长抑制作用(72h)图。图2至图5为AM)(0.6nmol/L)作用于白血病细胞K56224h对细胞周期的影响图(其中p2:subG1;P3:GQ/G1;P4:S;P5:G2/M，图2为随机对照组，图3为空白对照组，图4为AMO-miR-181a组，图5为AMO-miR-21组)。图6至图9为AM0(0.6iimol/L)作用于白血病细胞K56248h对细胞周期的影响图(其中P2:subG1;P3:G。/G1;P4:S;P5:G2/M，图6为AMO-mfR-21组，图7为AMO-miR_181a组，图8为空白对照组，图9为随机对照组)。图10为miR-21的标准曲线图(CT值为8.30、13.00、17.07、20.98、25.36、28.57)。图11是不同时间AMO对白血病细胞K562的生长抑制作用(0.6umol/L)图。具体实施方式实施例1本发明的具有抗白血病作用的miR-21反义寡核苷酸(以下简称AMO)的制得白血病细胞K562的miR-21序歹寸为5'-uagcu腳cag腦gaugu卿c-3'(23bp);miR-181a序歹ij为5,-aaceiuucaacgcugucggugagu-3'(23bp)。针对白血病细胞K562的miR-21设计其反义寡核苷酸，并采用BLAST软件进行分析，比对后得序列如SEQM).1所示5'-tcaacatcagtctgataagcta-3'(22bp)(以下称为AMO-miR-21)，针对白血病细胞K562的miR-181a设计其反义寡核苷酸，并采用BLAST软件迸行分析，比对后得序列如SEQNO.2所示5'-actcaccgacagcgttgaatgtt-3'(23bp)(以下称为層(HidR-181a)0以上两种反义寡核苷酸序列由上海生工生物工程技术服务有限公司合成，全硫代修饰，PAGE纯化，于-2(TC保存。用无血清的RPMI-1640培养基溶解配制成100umol/L储存溶液，置-20°(:备用，用时稀释成所需的使用浓度。实施树2本发明的miR-21和miR-18Ia反义核苷酸对白血病细胞K562的抑制作用和诱导凋亡作用1、主要试剂Lipofectamine2000invi加gen公司美国antisensemicroRNAs上海生工生物工程有限公司中国琼脂糖Promega公司美国羟乙基哌嗪乙磺酸Gibco公司美国RPMI-1640培养基粉Gibco公司美国RPMI-1640液体培养基展晨生物公司中国新生牛血清杭州四季青生物工程公可中国青霉素、链霉素华北制药公司中国胰酶(Trypsin)Sigma公司美国CCK-8细胞计数试剂盒曰本同仁化学研究所曰本台盼蓝(TypanBlue)&靜3公司美国1000jiL,200nL，10nLTipsAxygen公司美国1.5mL，0.2mLEP管Axygen公司美国RNA酶Sigma公司美国碘化丙锭(PI)Sigma公司美国2.试剂配制2.1Lipofectamine2000:4。C保存。2.2Antisense-microRNAs-oligo羅leotides(腦)设计实施例1中所述的针对白血病细胞K562中miR-21和miR-181a的反义寡核苷酸序列AMO-miR-21和AMO-miR-181a:序列由上海生工生物工程技术服务有限公司合成，全硫代修饰，PAGE纯化，于-2CTC保存。用无血清的RPMT-1640培养基溶解配制成100nmol/L储存溶液，置-2CTC备用，用时稀释成所需的使用浓度。2.3含酚红RPMI-1640培养基RPMI-16邻干粉(10.4g/包)，用三蒸水溶解，加入碳酸氢钠2.0g，HEPES5.0g，磁力搅拌仪充分搅拌，定容至I000mL，过滤除菌，分装，4。C保存。2.4RPMI-1640液体培养基过滤除菌，分装。2.5新生牛血清56eC、30min灭活，分装于25mL小瓶中，-20°C保存。配制新鲜RPMI-1640液时，每180mL培养液加入血清20mL，使最终细胞培养液中血清的体积分数为10%。2.60.2%台盼蓝工作液称取0.2g台盼蓝粉，用100mLPBS(pH7.2)溶解。2.7■酶配制成10mg/mL的储存液，-2(TC保存，使用时配制成工作液浓度。2.8碘化丙啶(PD染液称取20pg碘化丙啶，加入IOOOmL生理盐水，即20ug/L浓度，分装，4°C避光保存。3主要仪器3.1DL-2型台式低速离心机(北京医用离心机厂)3.2C02培养箱(ThermoForma,美国)3.3超净工作台(苏州净化设备厂)3.4微量加样器(0.5-10uL,1-20uL,10-100"L,50-200iiL，200-1000PL，Eppendorf,德国)3.5DS-IB倒置显微镜(重庆光学仪器厂)3.6NeubauerImproved细胞计数板(CarlRothGmbH&Co.KG，德国)3.7流式细胞仪(Elite,Coulter公司，美国)4实验方法(1)细胞培养白血病细胞K562用含10%新生牛血清RPMT-1640培养基于37°C、体积分数为5%0)2培养箱，饱和湿度条件下培养，0.25%的胰酶常规消化传代，2-3天传代一次。实验选用对数生长期、0.2%台盼蓝拒染率>95%的细胞接种于培养板，加入Lipofectamine"2000-AM0反义核酸，每组药物均设3个复孔。(2)Lipofectamine2000与AM0复合物的配制单独的AM0-miR对细胞的转染效率不高，需要一种合适的转染载体介导才能提高AMO-miR的作用效果使之进入细胞发挥更好的作用效果。我们采用Lipofectamine2000来作为转染载体。Lipofectamine2000与AMO按质量比为2.5:1配制，即取所需AMO量，计算所需Lipofectamine2000的量，分别用无血清培养液配制，将Lipofectamine2000缓慢加入AMO中，充分混匀，室温静置30min，即得Lipofectamine2000-AMO复合物。(3)台盼蓝拒染法检测AMO对白血病细胞K562生长的抑制作用取对数生长期白血病细胞K562，用无血清RPMI-1640培养基调整细胞浓度为5X104cells/mL接种于96孔培养板，每孔100(每孔5000个细胞)，加入药物后终体积为150piL。实验分为4组AMO-miR-2I组、AMO-miR-181a组、随机对照组组、空白对照组Lipofectamine2000与AMO的质量比为2.5:1，白血病细胞株K562每组AMO终浓度均分别为0.1拜ol/L、0.2拜ol/L、0.3nmoi/L、0.6nmoI/L,空白对照组加入与药物同体积的血清RPMI-1640培养基，脂质体对照组加入与药物同体积同浓度的Lipofectamine2000，置37°C，体积分数为5%C02培养箱转染6h，加入含血清培养基分别培养24h、48h、72h。选AMO终浓度均为0.6pimol/L，空白对照组加入与药物同体积的血清RPMI-1640培养基，脂质体对照组加入与药物同体积同浓度的Lipofectamine2000，置37。C，体积分数为5%C02培养箱分别培养72h。(4)PI单染流式细胞仪检测经AMO作用后，K562细胞周期及亚二倍体峰百分率变化情况取对数生长期白血病细胞K562用无血清RPMI-1640培养基调整细胞浓度为1.2X105cellS/mL，接种于24孔培养板，各组均设四复孔。加入无血清含AMO的RPMI-1640培养液后，每孔终体积500nL，置孵箱转染6h后，每孔加入500uL含20%血清RPMI-1640培养液继续培养。共设4组AMO-miR-181a、AMO-miR-21组、随机对照组和空白对照组。Lipofectamine2000与AMO的质量比为2.5:1，每组AMO终浓度为0.6umol/L，空白对照组加入与药物同体积的血清RPMI-1640培养基，脂质体对照组加入与药物同体积同浓度的LipofectamineTlt2000，分别培养24h、48h、72h，倒置显微镜下观察后，用0.25%胰蛋白酶-EDTA消化收集细胞，预冷PBS洗涤3次后，用70%(v/v)乙醇于4T固定过夜。上机前用预冷PBS洗涤3次后，加入碘化丙锭染色液(含RM酶)，终浓度50Pg/mL,避光染色30min,流式细胞仪分析细胞DNA含量的变化，每个样本随机分析5000个细胞，得到各组细胞亚二倍体峰百分率和各组细胞生长周期比树。(5)统计学分析所有数据采用均数土标准差(x土s)表示，使用统计软件SPSS11.5，各组均数比较采用单因素方差分析(one-wayAN0VA)。p〈0.05表示差异有统计学意义。(6)实验结果实验发现，对于白血病细胞K562，AMO-miR-21和AMO-miR-181a在浓度为0.2pM时即发挥了抑制作用；0.3拜ol/L，0.6^mol/L时抑制效果更明显，最佳作用浓度为0.6拜ol/L，呈现出明显的量效关系。终浓度0.6拜ol/L的AMO-miR-21和AMO-miR-181a转染白血病细胞K56272h时，与随机对照组相比较，对细胞生长产生明显的抑制作用，且随着作用时间的增加，其抑制效果逐渐增强(如图1所示)。终浓度为0.6拜ol/L的AMO作用于白血病细胞K562，AMO-miR-21和AMO-miR-181a在培养48h时开始对细胞的生长出现抑制作用，且随着作用时间的增加，其抑制效果逐渐增强。72h时作用效果十分明显，有明显的时效关系(如图II所示)。流式细胞仪分析各组DNA含量的细胞周期分析图中，P2峰代表亚二倍体峰，代表DNA含量不足二倍体的细胞，用来估计凋亡细胞的比例;P3峰代表处于G。/G,期的细胞，P4峰代表处于S期的细胞，P5峰代表处于G2/M期的细胞。AMO转染白血病细胞K56224h、48h、72h后(AMO终浓度为0.6Pmol/L),与随机对照组相比，AMO-miR-21组和AMO-miR-181a组凋亡峰十分明显，有显著的统计学差异(尸〈0.05)(见表l)，细胞周期中各时期所占细胞周期的比例如表2所示。表IAMO(0.6umol/L)作用于白血病细胞K562不同时间亚二倍体峰所占细胞周期的比例(％，5±S，77=3)空白对照组随机对照组AMOmiR-21组AMO-miR-181a组*与随机对照组相比较，尸<0.05表2AM0(0.6ymol/L)作用于白血病细胞K562不同时间对细胞周期的影响(％,^土S,/7=3)分组subGi(p2)Go/Gi(P3)S(P4)G2/M(M)24h空白对照组12.66±0.6552.24±2.7927.67±1.477.63±0.41随机对照组15.39±0.8152.43±2.8125.94±1.326.72±0.36AMO-miR-21组19.68±1.01*49.39±2.6523.55±1.258.12±0.46AMO-miR-181a组22.39±1.16*51.27士2.7020.96±1.115.11±0.2748h空白对照组32綠1.6749.12±2.6323.65±1.267.99±0.45随机对照组33.27±1.7650.61±2.6819.87±1.015.68±0.31AMO-miR-21组44.39±2.30*47.64±2.5215.58±0.814.33±0.26AMO-miR-181a组38.62±2.01*46.59±2.4715.01±0.783.39±0.1972h空白对照组18.52±0.9440.01±2.1221.31±1.096.57±0.37随机对照组24.03±1.2340.24±2.1318.38±0"86.34±0.36AMOmiR-21组32.33±1.68*38.16±2.0214.65±0.782.67±0.14AMO-miR-181a组35.17±1.83*34.61±1.8918.13±0.988.04±0.45从上述结果可以看出AMO-miR-21与AMO-miR-181a可以有效促进白血病细胞K562的凋亡，从而抑制白血病细胞的生长。实施例3实时定量PCR技术检测AM0作用肿癍细胞后microRNA的水平一实验材料1主要试剂Lipofectamine2000Invitrogen公司美国antisensemicroRNAs上海生工生物工程有限公司中菌羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)Gibco公司美国RPMI-1640培养基粉Gibco公司美国RPMI-1640液体培养基展晨生物公司中国新生牛血清杭州四季青生物工程公司中国青霉素、链霉素华北制药公司中国胰酶(Trypsin)Sigma公司美国台盼蓝(TypanBlue)公司美国1OOOnL,200nL,1OpLTipsAxygen公司美国1.5mL，0.2mLEP管Axygen公司美国实时定量PCR管Sigma公司美国DEPCSigma公司美国TrizolInvftrogen公司美国MMLV逆转录酶Promega公司美国RnaseInhibitorPromega公司美国d證(10mM)Takara公司財RNase-fteeH20Takara公司日本Hairpin-it窗miRNAsReal-Time±^*玛制，技术有^么、司中国PCRQuantitationKit2试剂配制2.ILipofectamine2000:4。C保存。2.2Antisense—micro咖As-oligonucleotides(AMO):AM)序列由上海生工生物工程技术服务有限公司合成，全硫代修饰，PAGE纯化，于-20。C保存。用无血清的RPMT-1640培养基溶解配制成100wmol/L储存溶液，置-20nc备用，用时稀释成所需的使用浓度。2.3含酚红RPMI-1640培养基RP1I-1640干粉(10.4g/包)，用三蒸水溶解，加入碳酸氢钠2.0g，HEPES5.0g，磁力搅拌仪充分搅拌，定容至mOOmL，过滤除菌，分装，4。C保存。2.4RPMI-1640液体培养基过滤除菌，分装。2.50.2%台盼蓝工作液称取0.2g台盼蓝粉末，用100mLPBS(pH7.2)溶解。2.60.25%胰酶-0.02%EDTA混合消化液称取0.5g胰酶于烧杯中，用100mLD-Hanks液溶解，称取EDTA0.04g于烧杯中，用100mLD-Hank，s液溶解，将溶解的胰酶-EDTA液体等体积混合。在超净台内用0.20陶滤器过滤除菌，分装至小瓶，-20。C冻存。2.7Hairpin_itmi腿sReal-TimePCRQuantitationKit-20°C保存。3主要仪器3.1DL-2型台式低速离心机(北京医用离心机厂)3.2C02培养箱(ThermoForma，美国)3.3超净工作台(苏州净化设备厂)3.4微量加样器(O.5-10yL，1-20uL，10-100uL，50-200uL，200-1000yL，Eppendorf，德国)3.5DS-IB倒置显微镜(重庆光学仪器厂)3.6NeubauerImproved细胞计数板(CarlRothGmbH&Co.KG，德国)3.7实时定量PCR扩增仪(Bio-rad公司，美国)3.8紫外分析仪(UVP叩land，美国)3.9超低温冰箱(Forma702，美国)二实验方法I实时定量PCR检测方法(Hairpin-itmiRMsReal-TimePCRQuantitationKit):实验选用针对miR-21设计的实时定量PCR检测试剂盒，该试剂盒能够高度特异地检测miR-21在肿瘤细胞中的表达水平。Hairpin-itmiRNAsqPCRQuatitationAssay包括两步①Stem-loopRT②Real—timePCR。在Stem-loopRT这一步中，Stem-loopRTprimer与miRNA分子的3'端结合，然后用逆转录酶将RNA逆转录成cDNA。Stem-lo叩RTprimer是针对miR-21特殊设计的具有茎环结构的RT引物，由于设计的专一性，它只与miR-21结合而不与其他miRNA结合，保证了检测的高特异性。而且这种茎环状结构的RT引物只与成熟的miRNA结合，消除了miRNA前体的非特异性扩增。得到的RT产物与miR-21特异引物以及荧光标记的探针一起迸行优化的Real-timePCR反应，根据标准曲线可以定量分析PCR反应中模板的拷贝数，从而反应miR-21的表达水平。2细胞培养白血病细胞K562用含10%新生牛血清的RPMI-1640培养基于37°C、体积分数为5%0)2培养箱，饱和湿度条件下培养，0.25%的胰酶常规消化传代，2-3天传代一次。实验选用对数生长期、0.2%台盼蓝拒染率〉95%的细胞接种于培养板，加入LipofectamineTM2000-AM0反义核酸，每组药物均设3个复孔。3Lipofectamine2000与AMO复合物的配制Lipofectandne2000与AM0按质量比为2.5:1配制，即取所需AMO量，计算所需Lipofectamine2000的量，分别用无血清培养液配制，将Lipofectamine2000缓慢加入AMO中，充分混匀，室温静置30min，即得Lipofectamine2000-AMO复合物。4实时定量PCR技术检测经AMO作用不同时间，白血病细胞K562中microRNA的水平①细胞培养取对数生长期白血病细胞K562，用无血清RPMI-1640培养基调整细胞浓度为1.2X10Scells/mL，接种于24孔培养板，各组均设六复孔。24h后细胞贴壁达50%-70%时，吸尽培养液上清，更换无血清含AM0的RPMI-1640培养液，所有AM0复合物都是按质量比2.5:1比例制备。每孔终体积500nL，置孵箱转染6h后，每孔加入500PL含2(m血清RPMI-l:6邻培养液继续培养。共设4组AM0-miR-21组、AMO-miR-18la组、随机对照组和空白对照组。Lipofectamine2000与AM0的质量比为2.5:1，每组AMO终浓度为O.6umol/L，空白对照组加入与药物同体积的血清RPMI-1640培养基，脂质体对照组加入与药物同体积同浓度的Lipofectamine1112000。②RNA提取分别培养48h、72h收集细胞，预冷D-hank，s液洗涤2次后，用0.25%胰蛋白酶-EDTA消化收集细胞，将每组细胞悬液收集到同一离心管中。1000r/min，离心8min，PBS洗二次，同样条件离心，去上清，每管加入TRIzol1mL，加入200"L氯仿，充分震荡，室温静止放置10min，12000/转离心10min，吸取809&上清于另一EP管中，加入500uL异丙醇，混合均匀，10000r/min离心6分钟，去上清，沉淀用1mL75%(v/v)乙醇洗涤后，10000r/min离心6分钟，去上清，沉淀于超净台内干燥3-5min，加入20-50iiLRNasefreeH20。提取后的各组总RNA经紫外分析仪测吸光度并计算浓度后，调整成相同的浓度用来迸行下一步的RT反应。提取的RNA均放入超低温冰箱保存。③RT反应合成cDNA:按照Hairpin-itmiRNAsReal-TimePCRQuantitationKit提供的说明书进行操作，反应为25nL体系。5Xbuffer5uL;dNTPMixture(10mM)0.75yL;MIR-RTPrimers(1PM)1.25uL;RNasin(40U/PL)0.25uL;亂VReverseTranscriptase(200U/uL)0.5yL;RNAsample2yL;RNasefreeH2015.25PL。反应参数16。C30min—42°C30min—85。C5min。反应产物于-20。C保存。Real-TimePCR检测各组cDNA样品中miR-21，miR-181a的表达情况按照Hairpin-itmiRNAsReal-TimePCRQuantitationKit提供的说明书进行操作，反应为20uL体系。2XReal-TimePCRMasterMix10uL;miRspecificPrimerset(5yM)0.8yL;micro,RTproduct2uL;TaqDNApolymerase(5U/uL)0.2uL;ddEA7uL。PCR反应参数1.Incubateat94&Cfor00:03:002.Incubateat94°Cfor00:00:203.Incubateat50°Cfor00:00:254.PlateRead5.Incubateat72°Cfor00:00:206.Gotoline2for45moretimes7.Incubateat37&Cforever5统计学分析所有数据采用均数土标准差(矛土s)表示，使用统计软件SPSS11.5，各组均数比较采用单因素方差分析(one-wayAN0VA)，尸〈0.05表示差异有统计学意义。6实验结果终浓度为0.6umol/L的AM0作用于白血病细胞K56248h和72h，将所得到的模板同一批反应进行实时定量PCR检测。miR-21的标准曲线如图IO所示，标准品的CT值分别为8.30、13.00、17.07、20.98、25.36、28.57，相关系数为0.998,相关性很好。均以miR-21的标准曲线为参照，K562细胞中不同AMO组raiR-21Ct僮如表3所示。经统计学分析，与随机对照组相比较，AMO作用于白血病细胞K56248h和72h时，miR-21在白血病细胞K562中的表达量有显著的统计学差异(尸〈0.05)，K562细胞中不同AMO组miR-21分子相应的摩尔数参看表4。表3AMO作用于白血病细胞K562不同时间miR-21的Ct僮比校Table3ComparisononmiR—21CTvalueofLeukemiacellsaftertreatmentwithAJK)atdifferenttimespoints(^土s,/7=3〉<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>*与随机对照组组比，*P<0.05表4AM0作用于白血病细胞K562不同时间miR-21分子摩尔数比较Table4ComparisononmiR-21molesofLeukemiacellsaftertreatmentwithAMOatdifferenttimespoints(i±s,/=3)wmoles<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>*与随机对照组组比，*尸<0.05从表3和表4的实验结果可以看出，AMO-miR-21和AM0-miR-181a能够显著抑制白血病細胞K562的生长。SEQUENCELISTING〈110〉暨南大学〈120〉一种具有抗白血病作用的miR-21反义寡核苷酸及其应用<160>2<170〉Patentlnversion3.3〈210〉1〈211〉22<212>DNA〈213〉AMO-miR-21序列〈400〉1tcaacatcagtctgataageta22<210〉2〈211〉23<212>DNA<213〉AMO-miR-181a序列〈400〉2actcaccgacagcgttgaatgtt2权利要求1、一种具有抗白血病作用的miR-21反义寡核苷酸，其特征是，包含如下所示碱基序列5′-tcaacatcagtctgataagcta-3′。2、根据权利要求1所述的一种具有抗白血病作用的miR-21反义寡核苷酸，其特征是，所述反义寡核苷酸经过化学修饰。3、根据权利要求2所述的一种具有抗白血病作用的miR-21反义寡核苷酸，其特征是，所述的反义寡核酸经过硫代修饰。4、根据权利要求2所述的一种具有抗白血病作用的miR-21反义寡核苷酸，其特征是，所述的反义寡核酸经过甲氧修饰。5、权利要求14任意一项所述的具有抗白血病作用的miR-21反义寡核苷酸在制备治疗白血病药物中的应用。全文摘要本发明涉及一种具有抗白血病作用的miR-21反义寡核苷酸及其应用，本发明所述的具有抗白血病作用的miR-21反义寡核苷酸，包含如下所示碱基序列之一5′-tcaacatcagtctgataagcta-3′。本发明所述的具有抗白血病作用的microRNA反义寡核苷酸能够有效地抑制白血病细胞K562中的miR-21和miR-181a这两种基因的表达，促进白血病细胞凋亡，从而能够有效地治疗白血病。并且对白血病细胞K562的抑制效果呈现明显的量效关系。文档编号C12N15/11GK101215560SQ200710032809公开日2008年7月9日申请日期2007年12月26日优先权日2007年12月26日发明者兰菲菲,誉刘,嘉费申请人:暨南大学