专利名称：具有抑菌与抗癌作用的小肽b及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及小肽及其应用，尤其涉及一种具有抑菌与抗癌双重活性的小肽B及其应 用，属生物医学领域。
背景技术：
癌症在全球是一个主要的死亡原因。2004年，癌症死亡人数达740万(约占所有死 亡人数的13%)。在各种癌症中，肺癌是常见的恶性肿瘤之一，近数十年发病率和死亡率 都有明显增高的趋势，在我国己经成为死亡率最高的癌症之一。化疗和放疗是手术切除 之外的两大治疗癌症的主要方法。目前所使用的绝大多数化疗药物，对正常细胞也有毒 性，特别是对那些新陈代谢旺盛的细胞，如骨髓细胞和黏膜细胞。所以肿瘤内科医生和 药理学家所面临的问题不只是寻找细胞毒性药物，而是要寻找在保存宿主重要细胞及其 功能的情况下能够选择性杀灭肿瘤细胞的药物。要是没有耐药现象或缺乏有选择性的药 物，肿瘤的化学治疗很可能就如同抗结核治疗一样有效(常常可以完全清除感染)。用 于人类的绝大多数抗癌化疗尚未达到这种理想的状态。肿瘤耐药问题及如何克服化疗耐 药性等问题，仍然是化学治疗学家关注的主要问题。
青霉素等抗菌药物的广泛使用，大大降低了人类受细菌感染引起死亡的威胁。也产 生了一些新的问题，其中最主要的是细菌耐药性，致病菌的耐药性已经日益严重地威胁 着人类的健康。所有的常规抗生素都出现了相应的耐药性致病株系，寻找全新类型的抗 生素是解决耐药性问题的 一条有效途径。
近几十年来，肽在人体中的作用已引起科学界的高度重视。大量研究结果表明，蛋白 质摄入后，并不完全水解成氨基酸，而是大部分以肽的形式吸收，同时发现，多肽被吸收 的速度比同组成的氨基酸要快。多肽涉及人体的激素、神经、细胞生长和生殖等各个领 域，可被广泛地应用于医疗、卫生、保健、食品、、化妆品等方面。多肽类药物的主要特 点是用量小，生物活性强,对癌症、自身免疫性疾病、记忆力减退、精神失常、高血压和 某些心血管及代谢等疾病有显著的疗效和广泛的应用前途。随着医学及生化技术的发展， 多肽类药物将成为21世纪重要的诊断、监测、预防和治疗药。因此，开展多肽药物的研 究具有重要意义。多肽类药物的研究主要包括抗肿瘤多肽、抗菌性活性肽、多肽导向药 物、多肽疫苗、细胞因子模拟肽、诊断用多肽及其它药用小肽等7大类。
发明内容
基于肽类药物的基本特性以及癌症与细菌感染临床治疗中的需要，本发明的目的是 提供一种具有抑菌与抗癌双重活性的小肽(命名为小肽B)及其应用。
本发明的小肽具有抗肿瘤细胞生长与抗细菌生长的活性，同等浓度下对人正常细胞 生长无抑制活性。可以用于癌症与细菌感染的治疗以及用作动植物转基因源头序列和饲 料与食品、化妆等行业的添加剂。
本发明所述具有抑菌与抗癌双重活性的小肽B，其特征在于它是SEQIDNO. l所 示的氨基酸序列；其所示信息为-(a) 序列特征
*长度7氨基酸 *类型氨基酸 *链型单链 *拓扑结构线性
(b) 分子类型蛋白质
(c) 序列描述SEQ ID NO. 1
Ala lie Ala Cys Cys Arg Arg 。 本发明提供的多肽氨基酸数目小于10个，不需任何修饰连接，为线性多肽，且 人工合成方便；试验证明具有抑菌与抗癌细胞生长两种功能，同时对人正常细胞无毒 性。
本发明所述小肽B在制备抗癌药物中的应用。
功能实验显示本发明所述小肽B能抑制肺癌、胃癌、宫颈癌细胞株的生长，提示 其在癌症临床治疗中具有重要的开发和应用价值。
上述制备抗癌药物中的应用中，所述抗癌药物优选是抗肺癌药物。 进一步的功能实验显示本发明的小肽B对肺癌细胞株及人肺癌紫杉醇抗性株
H460taxR的生长有较明显的抑制作用，同等浓度下对人正常成纤维细胞生长无有影响，
揭示本发明的小肽B为制备治疗具有紫杉醇抗性的肺癌相关的药物奠定了基础并在肺癌
临床治疗中具有关阔的应用前景。
本发明所述小肽B在制备抗菌药物中的应用。
功能实验显示本发明所述小肽B可以抑制革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌和霉菌等
多种致病菌的生长，为新型抗菌药物的研发提供了基础。
上述制备抗菌药物的应用中，所述抗菌药物优选是抗革兰氏阴性菌药物。
本发明所述小肽B在制备转基因生物中的应用。
实验已证实本发明的小肽B有抑菌和抗癌细胞生长作用；因此本领域普通技术人 员根据氨基酸与密码子的对应关系反推而成的核酸序列可以作为功能基因用于制备转 基因动物及植物，创造新品种及表达功能蛋白。
本发明所述小肽B在制备词料、食品或化妆品用添加剂中的应用。
鉴于本发明所述的小肽B有抑菌和抗癌细胞生长作用；因此本领域普通技术人员可 以人工大量合成后，作为有抑菌效果的饲料、食品或化妆品用添加剂在工业和农业生产 中使用。
图1. 2352号肽(小肽B)对H460和NHFB细胞生长的抑制作用检测。 图2. 2352号肽(小肽B)对大肠杆菌生长的抑制作用检测。
具体实施例方式
实施例1:
多肽的设计与合成1、 提取国际主要抗菌肽数据库(http:〃aps. unmc. edu/AP/raain. php ; http://penbase.immunaqua.com/ ; http://www. bbcm.univ.trieste. it/ ; http:〃www. imtech.res. in/raghava/antibp/)中登陆的抗菌肽的序列，分析其一级结 构与活性的关系的对应关系，同时设计人工短肽序列。
2、 利用蛋白质分析数据库http:〃wwv.e邓asy.org/，分析已知活性的多肽序列与设 计的多肽序列的二级结构的相似度，结合其它物理化学参数预测进行设计序列的修正。
3、 多肽序列送至生物公司合成或利用自动多肽合成仪合成全序列。HPLC检测纯度要 大于96%，同时通过质谱检测确定多肽合成质量。样品以冻干状态保存。
4、 合成后的多肽进行抑菌及抗癌功能检测筛选。
5、 通过功能检测，最终获得具有抑菌及抗癌双重功能的多肽序列，试验序列号为2352 号肽，本发明中命名为小肽B，其氨基酸序列为Ala lie Ala Cys Cys Arg Arg 。
实施例2: 利用MTT法检测多肽体外抑癌活性
2. 1材料与试剂
1) 2352号肽(本发明中命名为小肽B)，上海生工生物工程技术服务有限公司合成
2) H460细胞(人非小细胞肺癌株系)、H460taxR细胞(人肺癌细胞H460株系，抗紫杉 醇)、NHFB细胞(人正常成纤维细胞株系)、Hela细胞(人宫颈癌细胞)，SGC-7901 细胞(人胃癌细胞株系)，中国科学院细胞库/中国科学院上海生命科学研究院细胞资源 中心。
3) RPMI1640培养基，为美国GIBCO公司产品
4) DMEM培养基，为美国HyClone公司产品
5) 新生小牛血清，为杭州四季青公司产品
6) 二甲基亚砜(DMSO)，四甲基偶氮唑(MTT)和胰蛋白酶为Sigma公司产品。 2.2实验
1) 用稀释液(无菌PBS或无菌水或者相应的细胞培养基)将2351号肽稀释至lmM的初 始测量浓度，过滤除菌，分装后-2(TC冻存。
2) 细胞培养:癌细胞于含10y。小牛血清的RPMI 1640培养液中(含IOO U/mL青霉素和链霉 素)培养，细胞每2—3天传代1次；正常细胞于DMEM培养基中培养，4-5天传代一次。 细胞生长呈80%左右融合状态时，采用胰酶消化的方法消化分离细胞，用相应的培养基 制备单细胞悬液并调整合适的细胞浓度，分瓶传代，置于37"C、体积分数为5y。C0:的湿 化环境中培养，实验时用对数生长期细胞。
3) 细胞已贴壁后，弃去孔中原培养基，实验组分别加入含有梯度稀释(在初始浓度基 础上以10倍体积稀释)肽的100^L培养基。阴性对照组加入含有同等浓度稀释液的同体 积培养基，C02恒温培养箱中培养48h。
4) 显微镜下观察细胞生长状态，然后每孔加入20pl (5mg/mL) MTT溶液。培养4h。
5) 小心吸尽孔中液体，每孔加入150W DMSO，置于WD-9405B型水平摇床上轻摇 10min，以便紫色结晶充分溶解于DMSO中。
6) 使用Model680酶标仪测定每孔在570nm处的吸光值，记录数据。7)利用sigmaplotlO和Excel软件分析处理数据。
结果显示，2352号肽(本发明中命名为小肽B)在小于lmM浓度下能抑制肺癌、胃癌、宫颈癌细胞株的生长，抑制效果浓度依赖性较小。在O. lmM和O. lpM的低浓度时肺癌细胞株H460的存活率都为70。/。左右，同等浓度下人正常成纤维细胞存活率为110%左右。显微镜观察可见癌细胞生长速率降低，细胞边缘出现小泡现象的发生。结果见附图l。
本发明的小肽B序列具有的对肿瘤细胞的选择性杀伤能力使其可以直接用于制备癌症治疗的临床药物，或者开发为联合化疗的临床药物使用，有较好的应用前景。
实施例3 :
利用液体生长抑制法检测多肽的抑菌活性
3. 1材料、试剂
1) 氨苄青霉素(Amp)为solarbio公司产品， 一次性滤器，为美国PALL公司产品，其它药品试剂为国产分析纯。
2) 选用革兰氏阳性菌枯草芽孢杆菌(&Cz7/MW"^'fc (^/^"6wg) Co/ ")、金黄色
葡萄球菌(S啤/^/occociW i ose"6flc/2)、藤黄微球菌 (MfcrococcwWirf卿)、
苏云金芽抱杆菌(Sflc/〃w51 Awr/"g/e"w'50 、巨大芽胞杆菌(丑ac/〃W51附eg加er/w附)；革兰氏阴性菌大肠杆菌(Eyc/zm'cWflco/z')、弧菌(F 6rz'o)、肺炎克氏杆菌(iC/eZwW/a/7恥w附画'ae );真菌茄病镰刀菌(尸〃5"arz'咖so/朋i)、尖孢镰刀菌(尸"sari"/i7 o;r/57 or湖)、瓜类炭疽病菌(C。Wetetr/c/ 鹏2浙e/ ari咖)、苹果炭疽病菌(67oeasporj'"/z aJ6咖)棉花黄萎病菌(ZerticiWi"/7 血力h'ae)进行测试。山东大学微生物国家重点实验室菌种室提供。
3) 封闭液 0.4%BSA (w/v) ， 0.02%冰醋酸，配制后过滤除菌。
4) PB液体培养基
胰蛋白胨(Tryptone) 10g/L氯化钠(NaCl) 5g/LPH 7.4-7.6
3.2实验
1) 向无菌96孔酶标板所使用的孔中加入200nL封闭液，室温封闭24h。
2) 用PB液体培养基过夜培养不同的细菌，转培养使细菌处于对数生长期。用PB培养基调整菌液OD柳为约0.002。
3) 弃去封闭液，每孔加卯iuLOD6oo约为0.222的含菌PB培养基，再加入10nL无菌水配好的不同浓度梯度(初始浓度lmM)的本发明的小肽B。阴性对照为90nL含菌培养基+10^iL无菌水；阳性对照为卯^含菌培养基+10ML浓度为0.25mg/mL氨苄青霉素溶液(终浓度为0.025mg/mL，约62pM )。
4) 将加好菌液和药品的酶标板置于28'C摇床，100rpm恒温培养。分别在培养后0h、 3h、12h、 15h、 24h、 36h，用BIOTEKELX800酶标仪测定每孔的630nm吸光值(OD630)。
5) 利用sigmaplotlO和Excel软件分析处理数据。
结果表明，本发明的小肽B对革兰氏阳性菌抑菌效果不明显，对革兰氏阴性菌(以大肠杆菌为例)抑菌效果受浓度影响不大。试验显示本发明的小肽B在低至0.5u
6M的浓度时，与革兰氏阴性菌孵育3小时后表现出抑菌活性，在15小时表现最大抑菌活力。具体结果见附图2。本发明的小肽B对真菌的抑菌效果与革兰氏阴性菌的类似。提示了该小肽有望用于制备相关的临床用新型抗菌药物。
实施例4:
小肽序列用于产生转基因生物的核酸序列及其使用方法
由于本发明的小肽B为线性序列，无任何修饰，根据密码子表，此小肽可以由其氨基酸对应的三联体密码碱基序列的任意组合获得相应的核酸序列，根据密码子的简并性，相对该序列可以获得的核酸序列可达74左右。然后将此核酸序列通过载体或直接注射入需要转入基因的动物、植物或微生物体内，使遗传信息进行翻译表达便可。此方面己有成熟、详细的方法，视具体生物品种参照操作指南执行。
例如以转基因微生物为例，简述如下，由本发明的小肽B可以获得如下核酸序列
5' ttacatcatgctattgct 3'，将此核酸序列人工合成后，以常规方法连入基因工程载体如大肠杆菌的表达载体pET30a，转化BL21 (DE3),获得阳性克隆后，过夜培养，转培养3-4小时后，用IPTG诱导表达，便可获得转入此核酸片段，同时有外源多肽产生的转基因微生物新品种。序列表
〈110>山东大学
<120>具有抑菌与抗癌作用的小肽B及其应用
〈141〉 2009-9-10
〈160〉 1
<210> 1
〈211〉 7
〈212〉 PRT
〈221〉人工序列
<222〉 (1)…(7)
<400> 1
Ala lie Ala Cys Cys Arg Arg权利要求
1.一种具有抑菌与抗癌双重活性的小肽B，其特征在于它是SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列；其所示信息为(a)序列特征*长度7氨基酸*类型氨基酸*链型单链*拓扑结构线性(b)分子类型蛋白质(c)序列描述SEQ ID NO.1Ala Ile Ala Cys Cys Arg Arg。
2. 权利要求l所述小肽B在制备抗癌药物中的应用。
3. 如权利要求2所述的应用，其特征在于所述抗癌药物是抗肺癌药物。
4. 权利要求1所述小肽B在制备抗菌药物中的应用。
5. 如权利要求4所述的应用，其特征在于所述抗菌药物是抗革兰氏阴性菌药物。
6. 权利要求l所述小肽B在制备转基因生物中的应用。
7. 权利要求1所述小肽B在制备饲料、食品或化妆品用添加剂中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种具有抑菌与抗癌双重活性的小肽B，它具有SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列；所述小肽B在较低浓度下具有抗癌与抑菌活性的多肽序列，在相应浓度时对人正常细胞的生长无影响。本发明还公开了所述小肽在制备抗癌和抗革兰氏阴性菌药物中的应用，在制备转基因生物中的应用以及在制备饲料、食品和化妆品用添加剂中的应用。
文档编号C07K7/06GK101648992SQ200910018758
公开日2010年2月17日 申请日期2009年9月17日 优先权日2009年9月17日
发明者孟令军, 康翠洁, 王金星 申请人:山东大学