一种小肽及由该小肽连接形成的组合物的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物医药工程技术领域，具体涉及一种小肽，及其筛选方法与应用，在 应用方面涉及由该小肽连接载体部分和靶向肽组成的递送组合物和由该小肽连接载体部 分和具有促进免疫功能的短肽组成的具有促进免疫功能的组合物。
【背景技术】
[0002] exosome是一种由细胞及体液分泌的生物纳米囊泡结构，直径约为30-100nm，能 够携带内源的mRNA、miRNA和蛋白等，是生物体内天然的细胞信使，可以介导细胞间信号传 导、细胞物质的交换以及细胞中抗原的递呈等生物学过程。最近的研究表明，exosome具 备携带供体细胞生物学信息的特性，可作为临床疾病诊断的指标、其携带miRNA的exosome 可以用于肿瘤的治疗、通过将药物转载到exosome中，可作为生物纳米药物运输载体等方 面。但目前对于exosome的表面修饰的研究报道较少，已有的研究均为利用重组质粒将靶 向短肽和exosome表面膜蛋白在细胞水平进行重组表达，通过收集释放的exosome，达到对 exosome的表面修饰。但由于该方法存在质粒转染效率较低、革E1向短肽融合表达表达构象不 清以及exosome回收效率较低等缺点，严重影响到exosome做为运输载体的开发应用前景。 因此，研发一种新型高效的exosome表面修饰方法，对于exosome作为运输载体的研究具有 非常重要的意义。
[0003] 本发明利用exosome膜表面稳定表达的膜蛋白⑶63进行噬菌体展示文库筛选，获 得和CD63蛋白特异性结合的小肽，并确认小肽和exosome表面的CD63蛋白具有特异结合 的能力，并能够将特定的靶向短肽或具有促进免疫功能的短肽连接到exosome表面，达到 对exosome的表面进行修饰的目的。通过对修饰后exosome在体内、体外功能的检测，确定 小肽作为linker短肽的修饰方法可行，为后续的研究提供一种高效、简便的修饰手段。
【发明内容】
[0004] 本发明创造提供一种小肽及由该小肽连接形成的组合物，其中所述小肽的多核苷 酸包含选自SEQIDN0:1 或SEQIDN0:3 或SEQIDN0:5 或SEQIDN0:7 或SEQIDN0:9 SSEQIDN0:llSSEQIDN0:13SSEQIDN0:15SSEQIDN0:17SSEQIDN0:19S SEQIDNO:21或SEQIDNO:23 或SEQIDNO:25 或SEQIDNO:27 或SEQIDNO:29 或SEQ IDN0:31 或SEQIDN0:33 或SEQIDN0:35 或SEQIDN0:37 或SEQIDN0:39 或与上述 任一序列具有至少80%同源性的序列，再优选为至少具有90%相同性，更优选为至少具有 95%、96%、97%、98%、99% 的相同性。
[0005] 其中所述小肽的氨基酸序列为与SEQIDN0:2或SEQIDN0:4或SEQIDN0:6 或SEQIDN0:8 或SEQIDNO: 10 或SEQIDNO: 12 或SEQIDNO: 14 或SEQIDNO: 16 或 SEQIDNO: 18 或SEQIDNO: 20 或SEQIDNO: 22 或SEQIDNO: 24 或SEQIDNO: 26 或SEQ IDNO:28 或SEQIDNO:30 或SEQIDNO:32 或SEQIDNO:34 或SEQIDNO:36 或SEQID N0:38或SEQIDN0:40具有至少80%同源性的序列，再优选为至少具有90%相同性，更优 选为至少具有95%、96%、97%、98%、99%的相同性。
[0006] 进一步，其中所述小肽的氨基酸序列为SEQIDN0:2或SEQIDN0:4或SEQID N0:6SSEQIDN0:8SSEQIDN0:10SSEQIDN0:12SSEQIDN0:14SSEQIDN0:16 或SEQIDNO:18 或SEQIDNO:20 或SEQIDNO:22 或SEQIDNO:24 或SEQIDNO:26 或 SEQIDNO: 28 或SEQIDNO: 30 或SEQIDNO: 32 或SEQIDNO: 34 或SEQIDNO: 36 或SEQ IDNO: 38 或SEQIDNO: 40,并优先为SEQIDNO: 2 或SEQIDNO: 4。
[0007] 进一步，所述小肽为人工合成或利用噬菌体肽库筛选所得。
[0008] 进一步，所述小肽的筛选方法为体外重组跨膜蛋白loop区，并以此为底物进行噬 菌体肽库筛选，所得小肽通过与载体共孵育的方式连接到载体表面跨膜蛋白的loop区上。
[0009]进一步，所述跨膜蛋白选自CD63、CD81、CD82、CD9、Lamp-1、Lamp-2、CD13、CD86、 阀蛋白、突触融合蛋白-3、⑶2、⑶36、⑶40、⑶40L、⑶41a、⑶44、⑶45、ICAM-1、整联蛋白 a4、LiCAM、LFA-l、Mac-la和 0、Vti-lA和B、CD3e和G、CD18、CD37、CD53、CXCR4、FcR、 GluR2/3、HLA-DM(MHCII)、免疫球蛋白、MHC-I或MHC-II成分、TCR0和四旋蛋白，并优选 为CD63。
[0010] 进一步，所述小肽的筛选方法为体外重组跨膜蛋白⑶63的loop区，重组的该loop 区的氨基酸序列为SEQIDN0:41，以该重组的loop区为底物进行噬菌体肽库筛选。在此需 要说明的是，跨膜蛋白⑶63在exosome膜外有大小两个loop区，本发明涉及的重组⑶63 的loop区，均为重组⑶63的大loop区。
[0011] 进一步，所述⑶63源于exosome表面的跨膜蛋白。
[0012] 本发明还提供了由上述小肽连接形成的组合物，包括载体部分、小肽和短肽部分， 所述小肽用于连接载体部分和短肽部分，所述载体部分包括位于其表面的跨膜蛋白，所述 小肽与所述载体表面的跨膜蛋白连接。
[0013] 进一步，所述短肽部分为靶向肽或具有促进免疫功能的短肽。
[0014] 当上述小肽用以连接载体部分和靶向肽时，即由该小肽连接形成了一种递送组合 物。
[0015] 进一步，所述小肽的筛选方法为包括但不限于以下三种，第一种方法为直接以载 体为底物，进行噬菌体肽库的筛选，所得小肽通过与载体共孵育的方式连接到载体表面蛋 白上；第二种方法为体外重组跨膜蛋白，并以此为底物进行噬菌体肽库筛选，所得小肽通过 与载体共孵育的方式连接到载体表面跨膜蛋白上；第三种方法为体外重组跨膜蛋白loop 区，并以此为底物进行噬菌体肽库筛选，所得小肽通过与载体共孵育的方式连接到载体表 面跨膜蛋白的loop区上；并优选第三种方法。
[0016] 进一步，所述载体为生物纳米材料或非生物纳米材料。
[0017] 进一步，所述生物纳米材料选自细胞或纳米粒。
[0018] 进一步，所述纳米粒选自脂质体、囊泡或exosome，并优选为exosome。
[0019]进一步，所述跨膜蛋白选自CD63、CD81、CD82、CD9、Lamp-1、Lamp-2、CD13、CD86、 阀蛋白、突触融合蛋白-3、⑶2、⑶36、⑶40、⑶40L、⑶41a、⑶44、⑶45、ICAM-1、整联蛋白 a4、LiCAM、LFA-l、Mac-la和 0、Vti-lA和B、CD3e和G、CD18、CD37、CD53、CXCR4、FcR、 GluR2/3、HLA-DM(MHCII)、免疫球蛋白、MHC-I或MHC-II成分、TCR0或四旋蛋白，并优选 为CD63。
[0020] 进一步，所述小肽的筛选方法为，体外重组exosome表面⑶63的loop区，重组的 该loop区的氨基酸序列为SEQIDN0:41，以该重组的loop区为底物进行噬菌体肽库筛选， 所得小肽通过与exosome共孵育的方式连接到exosome表面⑶63的loop区上。
[0021] 进一步，筛选所得小肽的氨基酸序列包括与SEQIDN0:2或SEQIDN0:4或SEQID NO:6 或SEQIDNO:8 或SEQIDNO: 10 或SEQIDNO: 12 或SEQIDNO: 14 或SEQIDNO: 16 或SEQIDNO:18 或SEQIDNO:20 或SEQIDNO:22 或SEQIDNO:24 或SEQIDNO:26 或 SEQIDNO: 28 或SEQIDNO: 30 或SEQIDNO: 32 或SEQIDNO: 34 或SEQIDNO: 36 或SEQ IDN0:38或SEQIDN0:40具有至少80%同源性的序列。
[0022] 进一步，筛选所得小肽的氨基酸序列为SEQIDNO:2或SEQIDNO:4或SEQID NO:6 或SEQIDNO:8 或SEQIDNO: 10 或SEQIDNO: 12 或SEQIDNO: 14 或SEQIDNO: 16 或SEQIDNO:18 或SEQIDNO:20 或SEQIDNO:22 或SEQIDNO:24 或SEQIDNO:26 或 SEQIDNO: 28 或SEQIDNO: 30 或SEQIDNO: 32 或SEQIDNO: 34 或SEQIDNO: 36 或SEQ IDNO: 38 或SEQIDNO: 40,并优选为SEQIDNO: 2 或SEQIDNO: 4。
[0023] 进一步，所述靶向肽为与待靶向的细胞上存在部分结合的多肽，此外，与待靶向的 细胞上存在部分结合并具有靶向作用的脂类也在本发明的保护范围内。
[0024] 进一步，所述多肽选自RVG、M12、SP94,上述多肽通过共价结合的方式与小肽连接。
[0025] 在一些技术方案中，所述载体部分负载有抗癌药物，所述载体优选为exosome，即 该递送组合物为抗癌药物的递送组合物，该抗癌药物可通过电击转化法或与exosome溶