xosome，并置冰上裂解30min。
[0120] (2)将ProteinA-beads加入细胞裂解液中孵育，4°C15min，4°C，14000g离心 15min〇
[0121] (3)取上清进行浓度测定，加入1ug的⑶63抗体和50ugProteinA-beads，4°C 缓慢摇动过夜（同时以IgG抗体为对照）。
[0122] (4) 14000g离心收集沉淀，弃上清，用预冷的裂解buffer洗3遍。
[0123] (5)沉淀与小肽CP05-H6共孵育4°C过夜，3000g离心。
[0124] (6)PBS清洗 3 次，每次 5min。
[0125] (7)加入适量Loadingbuffer，变性，进行SDS-PAGE电泳，并以His-tag抗体进行 检测。结果见图2c。
[0126] 2. 6小肽与exosome表面⑶63蛋白的特异性结合测试
[0127] (1)超离法离心收集exosome，用蛋白IP裂解液裂解exosome。
[0128] (2)将带有组氨酸标签的小肽CP05-H6、CP07-H(^V别与20yg的exosome进行4°C 摇床孵育过夜。
[0129] (3)加入适量Loadingbuffer，变性，进行SDS-PAGE电泳，以His-tag抗体进行 westernblot检测，结果见图2d所示。
[0130] 2. 7小肽与exosome表面⑶63蛋白的结合稳定性测试
[0131] 小肽与exosome通过表面蛋白CD63结合，形成的复合结构CP05+EX0在血清存在 的环境中的稳定性对于基于小肽的exosome修饰方法研究具有非常重要的意义。因此，本 专利利用流式细胞术、荧光共振能量转移（FRET)等方法深入检测了CP05+EX0结构经血清 消化后的稳定性，为该小肽的后期修饰提供理论支持。
[0132] 流式细胞术检测具体方法如下：
[0133] (1)将罗丹明标记的小肽与exosome共孵育过夜。
[0134] (2)利用100KD的滤膜将多余的小肽去除，PBS洗3次，回收exosome。
[0135] (3)exosome中加入20%FBS，置37°C中消化不同时间点，分别收集0h、30min、lh、 2h、6h、12h共6个时间点。
[0136] (4)收集不同时间点处理的exosome，将exosome与磁珠共孵育2小时，利用流式 细胞仪检测不同时间点exosome上所携带的荧光强度，结果见图3a。
[0137] 荧光共振能量转移（FRET)方法如下：
[0138] (1)将罗丹明标记的小肽与cellmaskdeepred标记的exosome于4°C共孵育过 夜。
[0139] (2)收集exosome，加入20%FBS置37°C中消化不同时间点。分别收集0h、30min、 lh、2h、6h、12h共6个时间点。
[0140] (3)收集不同时间点处理的exosome，将exosome加入到无血清培养的hepa1-6细 胞中，12小时后利用共聚焦显微镜观察FRET减弱程度，结果见图3b。
[0141] 3、小肽的体内验证
[0142] 3. 1小肽与革E1向肽及exosome结合后在小鼠体内分布情况测试
[0143] 选取已报道靶向短肽RVG(脑靶向肽）、M12(肌肉靶向肽）和SP94(肝癌靶向肽） 为验证模型，将以上三种短肽分别与CP05在体外以偶联的形式合成嵌合短肽，并分别命名 为RVG-CP05、M12-CP05和SP94-CP05,将上述三种嵌合短肽分别与PKH67标记的exosome共 孵育过夜，将孵育产物RVG-CP05+EX0、M12-CP05+EX0和SP94-CP05+EX0分别通过尾静脉注 射到小鼠体内，30min后取材，并利用小动物活体成像系统检测上述孵育产物在小鼠体内的 分布情况，同时以未修饰的exosome为对照。
[0144] 具体方法如下：
[0145] (1)超速离心收集exosome，并利用PKH67对exosome进行焚光标记。
[0146] (2)将PKH67标记的exosome按30yg中加入100yg嵌合短肽，4°C孵育过夜。
[0147] (3)将孵育后形成的SP94-CP05+EX0以尾静脉注射的方法注入小鼠体内，同时以 未修饰的exosome作为对照。
[0148] ⑷注射2h后，用PBS进行肝门静脉灌流，取材。
[0149] (5)小动物成像系统观察各组织中荧光信号，结果见图4。
[0150] 3. 2小肽靶向修饰其他牛物腊的功能测试
[0151] 为验证候选短肽CP05与其他类型生物膜结构的结合能力，本研究进一步提取了 细胞分泌的另一种囊泡结构（microvesicles，MV)将M12-CP05与MV共孵育，利用小动物成 像系统检测经过靶向修饰的MV的体内分布情况，用以判断CP05在其他类型生物膜结构上 应用的广泛性。
[0152] 具体方法如下：
[0153] (1)高速离心法收集肌肉细胞C2C12分泌的MV，并利用PKH67对MV进行荧光标记。
[0154] (2)将PKH67标记的MV按30yg中加入100yg嵌合短肽，4°C孵育过夜。
[0155] (3)将孵育后形成的SP94-CP05+MV以尾静脉注射的方法注入小鼠体内，同时以未 修饰的MV作为对照。
[0156] ⑷注射2h后，用PBS进行肝门静脉灌流，取材。
[0157] (5)小动物成像系统观察各组织中荧光信号，结果见图5。
[0158] 3. 3革巴向条饰后的exosome作为药物运输载体的功會艮测试
[0159] Exosome的药物装载效率直接决定了exosome应用于临床治疗的意义。2' -0-甲 氧乙基修饰的RNA(2' -0-MethoxyethylRNA，简称M0E)是一种反义寡核苷酸类药物，本发 明中用于介导dystrophin基因发生特异性外显子跳读，诱导dystrophin蛋白恢复表达，从 而达到治疗杜兴肌肉萎缩症的效果。本发明通过对exosome中药物装载方法的优化，利用 电击转化法，在400V，125uF的条件下将反义寡核苷酸药物M0E装载到exosome中，并检测 装载有M0E的M12-CP05+EX0介导mdx小鼠外显子跳读效率及诱导dystrophin蛋白表达水 平，结果见图6。
[0160] 具体操作方法如下：
[0161] 肌肉组织免疫组化染色：
[0162] (1)利用冰冻切片机将小鼠前胫骨肌（TA)组织切成8ym厚的切片；
[0163] (2)?83浸泡151^11，加入含20%胎牛血清$83)，20%山羊血清（如3)的封闭液封 闭1小时；
[0164] (3)弃封闭液，加入dystrophin抗体（1:3000)孵育2小时；
[0165] (4)PBS洗3遍，加入荧光二抗，孵育1小时；
[0166] (5)PBS洗3遍，封片，晾干，荧光显微镜观察。
[0167] 肌肉组织RNA提取方法如下：
[0168] (1)用冷冻切片机收集组织于1. 5mlEP管内，按250yL/孔加入TRIzol试剂，吹打 混匀；
[0169] (2)按50yL/管加入氯仿，振荡器振荡混匀15s，室温静置5mins;
[0170] (3) 12OOOr/mirufC离心 15mins;
[0171] (4)将上清转移到已加有125iiL/管的异丙醇中，用手轻轻混匀，室温静置 20mins；
[0172] (5) 12 000r/min、4°C离心lOmins;
[0173] (6)弃上清，按250yL/管加入75%乙醇（DEPC水配制），用手晃动几次使沉淀悬 起来；
[0174] (7) 7GOOr/mirufC离心 5mins;
[0175] (8)弃上清，微甩一下，用枪将上清尽量去除，开盖风干10_15mins;
[0176] (9)2〇1117管0￡卩(：水回溶，55°(：加热1〇1111118;
[0177] (10)Nanodrop测定RNA浓度。
[0178] RT-PCR和PCR反应条件
[0179] RT-PCR反应体系：
[0180]
[0181] RT-PCR反应条件见图8。
[0182] PCR反应体系：
[0183]
[0184] PCR反应条件见图9。
[0185] 结果与分析部分：
[0186] 1、小肽体外验证结果
[0187] 本次筛选通过将体外重组的⑶63蛋白包被在酶联板孔中，通过3轮噬菌体展示文 库筛选，利用二代高通量测序，获得能够和CD63蛋白结合的小肽CP05和CP07。为验证小肽 和⑶63蛋白的特异性结合效率，本研究体外合成CP05和CP07,分别将2条His-tag标记的 小肽与细胞共孵育，利用免疫荧光染色法检测在细胞水平，CP05、CP07和细胞膜表面CD63 蛋白的共定位情况（结果见图la)，结果显示小肽能够与细胞膜表面的CD63蛋白结合。进 一步为验证小肽与CD63蛋白的结合的特异性及结合效率，本研究提取细胞蛋白并用免疫 共沉淀法浓缩⑶63蛋白，分别将CP05-H6、0?07-116与免疫共沉淀获得的⑶63蛋白共孵育， 结果显示两条小肽都能够与CD63蛋白结合（结果见图lb，c)。将CP05-H#PCP07-H6与细 胞裂解物共孵育后验证特异性结合反应，结果显示二者均与CD63蛋白有特异性结合（结果