专利名称：结合藻红胆素的藻蓝蛋白荧光探针的制备方法
技术领域：
本发明涉及生物技术中色素蛋白质材料领域，更具体地说，它涉及一种结合藻红胆素(PEB)的藻蓝蛋白类荧光蛋白质的制备方法。
背景技术：
藻胆蛋白(phycobilipi"otein)是蓝藻和红藻光合作用捕光复合物的功能组分。根据其吸收光谱和荧光光谱特征，藻胆蛋白可以分为藻红蛋白(phycoerythrin，简称CPE)、藻红蓝蛋白(phycoerythrocyanin，简称PEC)、藻蓝蛋白(phycocyanin，简称CPC)和变藻蓝蛋白(allophycocyanin，简称APC)。 CPE、 PEC、 CPC和APC含alpha和beta亚基，每个亚基中藻胆色素(phycobilin)通过硫醚键与藻胆蛋白脱辅基蛋白(apo-phycobiliprotein)半胱氨酸残基的巯基共价结合，其种类及其与脱辅基蛋白的相互作用决定藻胆蛋白的光谱性质。藻胆色素与脱辅基蛋白共价结合形成特定的构象，使得CPE主要吸收约560nm的可见光，发射约580nm的荧光；PEC吸收约570nm的可见光，发射约630nm的荧光；CPC吸收约620nm的可见光，发射约640nm的荧光；APC吸收约650 660nm的可见光，发射约660 670nm的荧光。CPE结合的辅基色素为藻红胆素(phycoerythrobilin，简称PEB); PEC的alpha亚基结合的辅基色素为藻紫胆素(phycoviolobilin，简称PVB); PEC的beta亚基结合的辅基色素为藻蓝胆素(phycocyanobilin，简称PCB); CPC和APC结合的辅基色素都为藻蓝胆素PCB。
CPC的alpha亚基可以通过大肠杆菌基因工程菌来生产(Tooley A J, Cai Y A, GlazerA N. Biosynthesis of a fluorescent cyanobacterial C-phycocyanin holo-alpha subunitin a heterologous host [J]. Proc Natl Acad Sci USA, 2001， 98 (19) : 10560 10565)。与前人的方法不同，我们发现Anabaena sp. PCC7120中aZrt^7基因编码beta裂合酶，在其它蓝藻中也存在同源的beta裂合酶。这类beta裂合酶不仅能催化藻蓝胆素PCB与CPC的beta亚基及其同源蛋白质的84位半胱氨酸巯基(或同源的半胱氨酸巯基)共价结合生成藻蓝蛋白类荧光蛋白质，还能催化藻红胆素PEB与CPC的beta亚基及其同源蛋白质的84位半胱氨酸巯基(或同源的半胱氨酸巯基)共价结合生成一种新型的结合了PEB的藻蓝蛋白类荧光蛋白质。藻红胆素PEB可由HOl、 PebA、 PebB协同催化生成(Alvey' R. M., Karty, J. A. etc. Lesionsin Phycoerythrin Chromophore Biosynthesis in Fremyella diplosiphon RevealCoordinated Light Regulation of Apoprotein and Pigment Biosynthetic Enzyme GeneExpression. Plant Cell 15 (10)， 2448-2463 (2003))。在绝大部分的蓝藻和红藻中，都存在有编码CPE脱辅基蛋白、CPC脱辅基蛋白、APC脱辅基蛋白、beta裂合酶以及PEB生物合成所需的酶的基因，其中某些缺乏PE而具有异形胞的蓝藻中存在PEC;隐藻中没有藻胆体，不存在上述基因中的APC的基因。
藻胆蛋白类荧光蛋白质可以应用于食品、化妆品、医药和生物工程领域。目前使用的藻胆蛋白类荧光蛋白质主要从蓝藻和红藻中提取(高纯度藻胆蛋白的分离方法，CN1344723，2002.04.17。 一种水华蓝藻制备藻蓝蛋白的方法，CN1563083， 2005.01.12)。本方法不利用藻类作为原料，而是利用基因工程方法生产新型的藻蓝蛋白。藻蓝蛋白类荧光蛋白质具有优良的荧光性质，这种结合PEB的新型藻蓝蛋白，为开发新型荧光探针提供了更多的选择。本方法为藻蓝蛋白类色素蛋白质功能材料应用于食品、化妆品、医药和生物工程领域奠定了基础。
发明内容
本发明的目的在于提供一种结合藻红胆素的藻蓝蛋白类荧光蛋白质的制备方法，它是应用beta裂合酶催化PEB与藻蓝蛋白类脱辅基蛋白共价结合，从而制备新型藻蓝蛋白类荧光蛋白质(天然状态下藻蓝蛋白类脱辅基蛋白是与PCB结合)。将含有beta裂合酶基因、藻蓝蛋白类脱辅基蛋白基因和PEB生物合成酶基因的表达质粒依次转入宿主菌，得到相应的工程菌，通过如此设计的基因工程菌生产结合藻红胆素的藻蓝蛋白类荧光蛋白质。
本发明的技术方案是这样实现的 一种结合藻红胆素的藻蓝蛋白荧光探针的制备方法，包括下述步骤
(1) 用基因工程方法，将beta裂合酶基因或其同源基因克隆于表达载体中，得到beta裂合酶表达质粒；
(2) 用基因工程方法将藻蓝蛋白类脱辅基蛋白基因或其同源基因克隆于第二个表达载体中，得到脱辅基蛋白表达质粒；
(3) 用基因工程方法将藻红胆素生物合成酶基因力o7和pe/^或其同源基因克隆于第三个表达载体中，得到Zw7和peM表达质粒；
(4) 用基因工程方法将藻红胆素生物合成酶基因peM或其同源基因克隆于第四个表达载体中，得到pe^表达质粒；
(5) 将beta裂合酶表达质粒、脱辅基蛋白表达质粒、力o7和peZ^表达质粒及pe^表达质粒依次转入配套的宿主菌，当这些表达质粒都转入宿主菌后，得到相应的工程菌，应用此工程菌通过发酵工程能生产结合藻红胆素的藻蓝蛋白类荧光蛋白质；发酵后，按常规蛋白质提纯技术，提纯得到相应的结合藻红胆素的藻蓝蛋白类荧光蛋白质。
本发明的技术方案也可以这样实现一种结合藻红胆素的藻蓝蛋白荧光探针的制备方法，包括下述步骤(1) 用基因工程方法，将beta裂合酶基因或其同源基因和藻蓝蛋白类脱辅基蛋白基因或其同源基因同时克隆于表达载体中，得到beta裂合酶和藻蓝蛋白类脱辅基蛋白表达质粒；
(2) 用基因工程方法将藻红胆素生物合成酶基因力W和pe力5或其同源基因克隆于第二个表达载体中，得到力^和/ e6S表达质粒；
(3) 用基因工程方法将藻红胆素生物合成酶基因peM或其同源基因克隆于第三个表达载体中，得到pe^表达质粒；
(4) 将beta裂合酶表达质粒和脱辅基蛋白表达质粒、力oJ和pe力5表达质粒及表达质粒依次转入配套的宿主菌，当这些表达质粒都转入宿主菌后，得到相应的工程菌，应用此工程菌通过发酵工程能生产结合藻红胆素的藻蓝蛋白类荧光蛋白质；发酵后，按常规蛋白质提纯技术，提纯得到相应的结合藻红胆素的藻蓝蛋白类荧光蛋白质。
上述结合藻红胆素的藻蓝蛋白荧光探针的制备方法中，所述的宿主菌为大肠杆菌；所述的beta裂合酶基因是指与/^a6ae;7a sp. PCC7120中sJr^677基因同源的基因；所述的藻蓝蛋白类脱辅基蛋白基因是指与七a6ae朋sp. PCC7120或M Ja/zu';70^A sp. PCC7603中cpc"基因同源的基因。
本发明与现有技术相比，具有以下优点
1、 不使用藻类为原料而是利用大肠杆菌生产藻蓝蛋白类荧光蛋白质，大肠杆菌繁殖快，可以大大縮短周期；
2、 与藻类相比，大肠杆菌细胞壁容易破碎，纯化过程中可节省能源；
3、 通过大肠杆菌生产，目标蛋白含量高，有His-tag标记，且体系中几乎没有性质类似的蛋白，提取方便；
4、 生成结合PEB的新型藻蓝蛋白，具有与天然藻蓝蛋白不同的光谱特性，为发展荧光藻胆蛋白类色素蛋白质功能材料提供更多选择。
图1为本发明中Alr0617催化下生成的结合PEB的藻蓝蛋白类荧光蛋白质的吸收与荧光光谱；其中实线为吸收光谱，而虚线为荧光光谱。
具体实施例方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步地详细说明，但不构成对本发明的任何限制。实施例1
(1)从GeneBank中可以査到，藻种^7a力ae"s sp. PCC7120的全序列己经测定完成，y！/ 7柳i/ os"s sp. PCC7603和CaJot力rijf sp. PCC7601部分序列已经测定。^a6ae/ a sp. PCC7120在GeneBank中编号为BA000019,可从所査到序列中找到所需基因(c; c5、 a化。^ ;7、力o7);
5M Ja肌V ows sp. PCC7603中所用到基因序列在GeneBank中编号为M34254,可从所查到序列中找到所需基因(cpc^); CaJ"力rh sp. PCC7601中所用到基因序列在GeneBank中编号为AY363679，可从所查到序列中找到所需基因。e似和/;e/^)。通过基因工程方法，将力/7aZ7ae/7asp.PCC7120中的s^W77基因克隆于Novagen公司的pETDuet-1中，所得质粒叫pETDuet-aJrOW7，在大肠杆菌中能表达beta裂合酶。
根据GeneBank中查到的基因序列，设计引物，利用相应的藻种提取总DNA作为模板，通过PCR扩增得到所需片段，通过上下游引物中设计的酶切位点，把目标片段转入相应质粒中同样的酶切位点上。
(2) 将^7a力ae朋sp. PCC7120中的藻蓝蛋白类脱辅基蛋白基因cpc^克隆于Novagen公司的表达载体pET30中，所得质粒叫pET30-cp^，在大肠杆菌中能表达脱辅基蛋白藻蓝蛋白B。
(3) 将藻红胆素生物合成酶基因(力o7和pe/^)克隆于Novagen公司的pCDFDuet-1中，所得质粒叫pCDFDuet-力W-; eM，在大肠杆菌中能同时表达H01和PebB。
(4) 将藻红胆素生物合成酶基因(pe似)克隆于Novagen公司的pACYCDuet-1中，所得质粒叫pACYCDuet-pe似，在大肠杆菌中能表达PebA。
即脱辅基蛋白基因c/ M在pET30中是在AcoRV和两个酶切位点之间；裂合酶基因aZr^77在pETDuet-l中，处于第二个多克隆位点《WII和J/ o I之间；PEB合成酶基因是3个(Z o厶/ eW和/ e65)， Z o7和pe/^在同一个载体pCDFDuet-l中，力o7在第一个多克隆位点Afco I和尸"I之间，peM在第二个多克隆位点船e I和J/ o I之间，pe/W在pACYCDuet-1中第二个多克隆位点^§711和之间。
基因插入载体的步骤为根据基因序列设计引物，分上下游， 一对；上游下游引物分别带有酶切位点；利用相应的藻种提取总DNA作为模板；经过PCR扩增得到所需基因片段，把所得基因片段进行电泳，回收；所得片段用设计的限制性内切酶进行酶切，同时把载体用同样的限制性内切酶进行酶切，分别回收基因片段和载体；基因片段和载体大致l: 1混合，在T4连接酶作用下连接一定时间(一般4 6小时)；连接产物转化进入大肠杆菌，利用含抗生
素的平板筛选，挑取克隆，验证正确即可。
(5) 将pETDuet-aZrt W7、 pET30-c; c仏pCDFDuet-Z o7-peZ^和pACYCDuet-; eZ^转入大
肠杆菌，当这些质粒都转入大肠杆菌后得到大肠杆菌工程菌；将此工程菌接种于pH 7.0的LB培养基中，37。C振荡培养至0De。。为0. 5至0. 8，加入异丙基硫代-P-D-半乳糖苷(isoprophylthio-(3-D-galactoside，简称IPTG)至终浓度为lmraol/L， 20。C至37。C振荡表达约12小时，生产藻蓝蛋白类荧光蛋白质藻红胆素-藻蓝蛋白B;离心收集菌体细胞，加入缓冲液、破碎细胞后，离心收集上清液，通过Ni2+亲和层析，可提纯得到相应的藻蓝蛋白类荧光蛋白质藻红胆素-藻蓝蛋白B。其吸收与荧光光谱见附图1中所示，其中实线为吸收光谱，而虚线为荧光光谱。
将所用到的质粒的组合转入大肠杆菌中的转化方式如下
从新鲜涂布的平板上挑取大肠杆菌菌株BL21(DE3)单菌落，接种于5mLLB培养基，37°C振荡培养过夜；取lOOpL饱和培养物，无菌转接至5mL LB培养基，37'C振荡培养至OD6。。 = 0. 3 0.4时，将菌液转移至5mL无菌离心管中，冰上放置10min;离心lmin (10000g， 4。C)弃去上清，收集沉淀菌体;用lmL预冷的O. lmol/LCaCl2无菌溶液重悬菌体，离心30s(10000g， 4'C)去上清，菌体沉淀用10(^L预冷的0. lmol/L CaCl2重悬，放置于冰上，加入一定量的构建好的质粒，混匀后冰浴放置30min， 42。C热休克90s，冰浴5min后加入30(^L LB培养基，37°C低速振荡培养45min，无菌涂布在含有相应抗生素的LB培养基平板上，倒置于37'C培养箱至
形成可见的单克隆菌斑。
提取3个左右菌落，分别接种到5ml含相应抗生素的LB培养基中，振荡培养至饱和；分别从中取IO(VL转接至5ml含相应抗生素的LB培养基中；37'C振荡培养至OD6。。=0. 5-0. 7时，冰浴约30min，加入IPTG诱导表达；避光、20°C、 150转/分，表达约12小时。离心收集细胞，细胞加入缓冲液重悬；通过光谱仪测其产物荧光量，选取荧光产量高的菌株进行大量表达。
实施例2
(1) 从GeneBank中可以查到，藻种A3a6ae朋sp.PCC7120的全序列已经测定完成，7a/wV7asi/s sp. PCC7603和Ca7ot/ ri义sp. PCC7601部分序列已经测定。Z朋6ae/ 3 sp. PCC7120
在GeneBank中编号为BA000019，可从所查到序列中找到所需基因(cpc5、 aZrt W7、力o/);M 7a肌V o^s sp. PCC7603中所用到基因序列在GeneBank中编号为M34254,可从所査到序列中找到所需基因(c; ci ); 6^"/ r" sp. PCC7601中所用到基因序列在GeneBank中编号为AY363679，可从所査到序列中找到所需基因。e^和pe/^)。通过基因工程方法，将Z/7aZ^e/ asp.PCC7120中的WrM77基因克隆于Novagen公司的pETDuet-1中，所得质粒叫pETDuet-aZrt 677，在大肠杆菌中能表达beta裂合酶。
根据GeneBank中査到的基因序列，设计引物，利用相应的藻种提取总DNA作为模板，通过PCR扩增得到所需片段，通过上下游引物中设计的酶切位点，把目标片段转入相应质粒中同样的酶切位点上。
(2) 将sp.PCC7120中的藻蓝蛋白类脱辅基蛋白基因cpc^(C1551)克隆于Novagen公司的表达载体pET30中，所得质粒叫pET30-cpc5(C1551)，在大肠杆菌中能表达脱辅基蛋白藻蓝蛋白B。
(3) 将藻红胆素生物合成酶基因(力o7和peZ^)克隆于Novagen公司的pCDFDuet-1中，所得质粒叫pCDFDuet-/w7-peZ^，在大肠杆菌中能同时表达H01和PebB。
(4) 将藻红胆素生物合成酶基因(pe/W)克隆于Novagen公司的pACYCDuet-1中，所得质粒叫pACYCDuet-/ eM,在大肠杆菌中能表达PebA。
即脱辅基蛋白基因c/^5(C155I)在pET30中是在化oRV和I两个酶切位点之间；裂合酶基因WrW77在pETDuet-l中，处于第二个多克隆位点^71I和X力oI之间；PEB合成酶基因是3个(力o厶pe/M和peM)，力W和； eM在同一个载体pCDFDuet-1中，力o7在第一个多克隆位点Afcol和尸"I之间，； e/^在第二个多克隆位点M/el和J力ol之间，peM在pACYCDuet-1中第二个多克隆位点5^11和之间。
基因插入载体的步骤为根据基因序列设计引物，分上下游， 一对；上游下游引物分别带有酶切位点；利用相应的藻种提取总DNA作为模板；经过PCR扩增得到所需基因片段，把所得基因片段进行电泳，回收；所得片段用设计的限制性内切酶进行酶切，同时把载体用同样的限制性内切酶进行酶切，分别回收基因片段和载体；基因片段和载体大致l: l混合，在T4连接酶作用下连接一定时间(一般4 6小时)；连接产物转化进入大肠杆菌，利用含抗生
素的平板筛选，挑取克隆，验证正确即可。
(5) 将pETDuet-alrt W7、 pET30-cpcS(C1551) 、 pCDFDuet-力o7-pe65和pACYCDuet-peM转入大肠杆菌，当这些质粒都转入大肠杆菌后得到大肠杆菌工程菌；将此工程菌接种于pH 7. 0的LB培养基中，37。C振荡培养至0De。。为0.5至0.8，加入异丙基硫代-P-D-半乳糖苷(isopr叩hyl thio-p-D-galactoside,简称IPTG)至终浓度为1画1/L， 20。C至37。C振荡表达约12小时，生产藻蓝蛋白类荧光蛋白质藻红胆素-藻蓝蛋白B;离心收集菌体细胞，加入缓冲液、破碎细胞后，离心收集上清液，通过Ni"亲和层析，可提纯得到相应的藻蓝蛋白类荧光蛋白质藻红胆素-藻蓝蛋白B。
将所用到的质粒的组合转入大肠杆菌中的转化方式与实施例1相同。实施例3
(1)从GeneBank中可以査到，藻种J朋6ae朋sp. PCC7120的全序列已经测定完成，iZ 7a/w'/ os〃ssp. PCC7603和CW"Arizsp. PCC7601部分序列已经测定。^jatee/ asp. PCC7120在GeneBank中编号为BA000019，可从所查到序列中找到所需基因(cpcA aZrt^77、力o/);i/. h/w'/wws sp. PCC7603中所用到基因序列在GeneBank中编号为M34254,可从所查到序列中找到所需基因(cpc5); sp. PCC7601中所用到基因序列在GeneBank中编号为
AY363679，可从所査到序列中找到所需基因(peM和； e/^)。通过基因工程方法，将力"aZ^e朋
8sp.PCC7120中的s7^^/7基因和藻蓝蛋白类脱辅基蛋白基因cpc^克隆于Novagen公司的pETDuet-1中，所得质粒叫pETDuet-c/^5^介W77，在大肠杆菌中能表达藻蓝蛋白类脱辅基蛋白B和beta裂合酶。
根据GeneBank中查到的基因序列，设计引物，利用相应的藻种提取总DNA作为模板，通过PCR扩增得到所需片段，通过上下游引物中设计的酶切位点，把目标片段转入相应质粒中同样的酶切位点上。
(2) 将藻红胆素生物合成酶基因(力o7和/7eM)克隆于Novagen公司的pCDFDuet-l中，所得质粒叫pCDFDuet-力o卜pe/^，在大肠杆菌中能同时表达H01和PebB。
(3) 将藻红胆素生物合成酶基因(peW)克隆于Novagen公司的pACYCDuet-1中，所得质粒叫pACYCDuet-peM，在大肠杆菌中能表达PebA。
即脱辅基蛋白基因c;x^和裂合酶基因a^^W7在pETDuet-l中，c/ c^处于第一个多克隆位点，酶切位点是fcoR I和尸"I ， s&W77处于第二个多克隆位点《WII和J力o I之间；PEB合成酶基因是3个(力o7、 / e^和pe/^)， /w7和peZ^在同一个载体pCDFDuet-1中，力o7在第一个多克隆位点Afco I和尸W I之间，peM在第二个多克隆位点yVA I和J/ o I之间，peZvl在pACYCDuet-l中第二个多克隆位点勘JII和i7w I之间。
基因插入载体的步骤为根据基因序列设计引物，分上下游， 一对；上游下游引物分别带有酶切位点；利用相应的藻种提取总DNA作为模板；经过PCR扩增得到所需基因片段，把所得基因片段进行电泳，回收；所得片段用设计的限制性内切酶进行酶切，同时把载体用同样的限制性内切酶进行酶切，分别回收基因片段和载体；基因片段和载体大致l: l混合，在T4连接酶作用下连接一定时间(一般4 6小时)；连接产物转化进入大肠杆菌，利用含抗生素的平板筛选，挑取克隆，验证正确即可。
(4) 将pETDuet-c/^^a7/^^/;7、 pCDFDuet-力o7-pe/^和pACYCDuet-pe似转入大肠杆菌，当这些质粒都转入大肠杆菌后得到大肠杆菌工程菌；将此工程菌接种于pH 7.0的LB培养基中，37'C振荡培养至0De。。为0.5至0.8，加入异丙基硫代-P-D-半乳糖苷(isoprophylthio-p-D-galactoside，简称IPTG)至终浓度为1画1/L， 20。C至37。C振荡表达约12小时，生产藻蓝蛋白类荧光蛋白质藻红胆素-藻蓝蛋白B;离心收集菌体细胞，加入缓冲液、破碎细胞后，离心收集上清液，通过Ni2+亲和层析，可提纯得到相应的藻蓝蛋白类荧光蛋白质藻红胆素-藻蓝蛋白B。
将所用到的质粒的组合转入大肠杆菌中的转化方式与实施例1相同。实施例4
(1)从GeneBank中可以查到，藻种^!/7a6ae朋sp.PCC7120的全序列己经测定完成，
9tK 7柳i"os〃ssp. PCC7603和6k ot/ rixsp. PCC7601部分序列已经测定。」朋6ae朋sp. PCC7120在GeneBank中编号为BA000019，可从所査到序列中找到所需基因(cpc万、a7r^77、必7a^'"aws sp. PCC7603中所用到基因序列在GeneBank中编号为M34254，可从所查到序列中找到所需基因(c/ c^); Ca7"/ n> sp. PCC7601中所用到基因序列在GeneBank中编号为AY363679，可从所査到序列中找到所需基因(pe6/J和；7e/^)。通过基因工程方法，将力朋6ae朋sp.PCC7120中的WrW77基因和藻蓝蛋白类脱辅基蛋白基因cpM (C155I)克隆于Novagen公司的pETDuet-l中，所得质粒叫pETDuet-cpc5 (C155I) -aZr^77，在大肠杆菌中能表达藻蓝蛋白类脱辅基蛋白B和beta裂合酶。
根据GeneBank中査到的基因序列，设计引物，利用相应的藻种提取总DNA作为模板，通过PCR扩增得到所需片段，通过上下游引物中设计的酶切位点，把目标片段转入相应质粒中同样的酶切位点上。
(2) 将藻红胆素生物合成酶基因(力W和； eM)克隆于Novagen公司的pCDFDuet-1中，所得质粒叫pCDFDuet-力o7-; eM，在大肠杆菌中能同时表达HOI和PebB。
(3) 将藻红胆素生物合成酶基因(/3eW)克隆于Novagen公司的pACYCDuet-1中，所得质粒叫pACYCDuet-/ eM，在大肠杆菌中能表达PebA。
即脱辅基蛋白基因cpc^ (C155I)和裂合酶基因alrt W7在pETDuet-1中，cpc^处于第一个多克隆位点，酶切位点是^boR I和尸"I ， W/^W7处于第二个多克隆位点^§711和/力0I之间；PEB合成酶基因是3个(力o7、 peZ^和peZ^),力o7和peZ^在同一个载体pCDFDuet-1中，力o/在第一个多克隆位点Afco I和尸W I之间，peM在第二个多克隆位点AWe I和J力o I之间，； e^在pACYCDuet-1中第二个多克隆位点勘J n和J力o I之间。
基因插入载体的步骤为根据基因序列设计引物，分上下游， 一对；上游下游引物分别带有酶切位点；利用相应的藻种提取总DNA作为模板；经过PCR扩增得到所需基因片段，把所得基因片段进行电泳，回收；所得片段用设计的限制性内切酶进行酶切，同时把载体用同样的限制性内切酶进行酶切，分别回收基因片段和载体；基因片段和载体大致l: l混合，在T4连接酶作用下连接一定时间(一般4 6小时)；连接产物转化进入大肠杆菌，利用含抗生素的平板筛选，挑取克隆，验证正确即可。
(4) 将pETDuet-c; cj9(C1551) -aZrM7;7、 pCDFDuet-力o7-; ^^和pACYCDuet-peM转入大肠杆菌，当这些质粒都转入大肠杆菌后得到大肠杆菌工程菌；将此工程菌接种于pH 7. 0的LB培养基中，37'C振荡培养至0D,为0. 5至0. 8，加入异丙基硫代-半乳糖苷(isoprophylthio-p-D-galactoside，简称IPTG)至终浓度为l腿ol/L， 2(TC至37。C振荡表达约12小时，生产藻蓝蛋白类荧光蛋白质藻红胆素-藻蓝蛋白B;离心收集菌体细胞，加入缓冲液、破碎细胞后，离心收集上清液，通过Ni2+亲和层析，可提纯得到相应的藻蓝蛋白类荧光蛋白质藻红 胆素-藻蓝蛋白B。
将所用到的质粒的组合转入大肠杆菌中的转化方式与实施例1相同。
实施例5
(1) 从GeneBank中可以查到，藻种勘a&e朋sp. PCC7120的全序列已经测定完成， ^ h/w'刀os〃s sp. PCC7603和Ca"t力rizsp. PCC7601部分序列已经测定。^ a力ae/ a sp. PCC7120 在GeneBank中编号为BA000019，可从所査到序列中找到所需基因(cpc5、 a7r^W7、
7a肌'/ asi^ sp. PCC7603中所用到基因序列在GeneBank中编号为M34254,可从所查到序 列中找到所需基因(卬c5); C^"力ri;r sp. PCC7601中所用到基因序列在GeneBank中编号为 AY363679,可从所查到序列中找到所需基因。eW和pe65)。通过基因工程方法，将力朋6朋朋 印.PCC7120中的aZrt^77基因克隆于Novagen公司的pETDuet-1中，所得质粒叫 pETDuet-Wr^W;7，在大肠杆菌中能表达beta裂合酶。
根据GeneBank中查到的基因序列，设计引物，利用相应的藻种提取总DNA作为模板，通 过PCR扩增得到所需片段，通过上下游引物中设计的酶切位点，把目标片段转入相应质粒中 同样的酶切位点上。
(2) 将力朋6ae朋sp.PCC7120中的藻蓝蛋白类脱辅基蛋白基因cpc5克隆于Novagen公 司的表达载体pCOLADuet-l中，所得质粒叫pCOLADuet-cpc5，在大肠杆菌中能表达脱辅基蛋 白藻蓝蛋白B。
(3) 将藻红胆素生物合成酶基因(力o7和pe/^)克隆于Novagen公司的pCDFDuet-1中， 所得质粒叫pCDFDuet-力o7-pe6A在大肠杆菌中能同时表达H01和PebB。
(4) 将藻红胆素生物合成酶基因。e^)克隆于Novagen公司的pACYCDuet-1中，所得 质粒叫pACYCDuet-pe^，在大肠杆菌中能表达PebA。
即脱辅基蛋白基因cp"在pC0LADuet-1第一个多克隆位点^boR I和Pst I两个酶切位点 之间；裂合酶基因a&W77在pETDuet-1中，处于第二个多克隆位点设7II和J力oI之间； PEB合成酶基因是3个(力o入peW和/ eM)，力o7和peM在同一个载体pCDFDuet-l中，力o7 在第一个多克隆位点I和/^t I之间，/ eM在第二个多克隆位点A^e I和Wo I之间，pe^ 在pACYCDuet-1中第二个多克隆位点力^II和/力o I之间。
基因插入载体的步骤为根据基因序列设计引物，分上下游， 一对；上游下游引物分别 带有酶切位点；利用相应的藻种提取总DNA作为模板；经过PCR扩增得到所需基因片段，把 所得基因片段进行电泳，回收；所得片段用设计的限制性内切酶进行酶切，同时把载体用同 样的限制性内切酶进行酶切，分别回收基因片段和载体；基因片段和载体大致l: 1混合，在
11T4连接酶作用下连接一定时间(一般4 6小时)；连接产物转化进入大肠杆菌，利用含抗生 素的平板筛选，挑取克隆，验证正确即可。
(5)将pETDuet-aZr。W7、 pC0LADuet-cpc5、 pCDFDuet-力o7-;7e力S和pACYCDuet-pe似转 入大肠杆菌，当这些质粒都转入大肠杆菌后得到大肠杆菌工程菌；将此工程菌接种于pH 7. 0 的LB培养基中，37。C振荡培养至0D柳为0.5至0.8，加入异丙基硫代-p-D-半乳糖苷 (isopr叩hyl thio-(3-D-galactoside，简称IPTG)至终浓度为l隱ol/L， 2(TC至37。C振荡表 达约12小时，生产藻蓝蛋白类荧光蛋白质藻红胆素-藻蓝蛋白B;离心收集菌体细胞，加入 缓冲液、破碎细胞后，离心收集上清液，通过N广亲和层析，可提纯得到相应的藻蓝蛋白类 荧光蛋白质藻红胆素-藻蓝蛋白B。
将所用到的质粒的组合转入大肠杆菌中的转化方式与实施例1相同。
实施例6
(1) 从GeneBank中可以査到，藻种A a6a朋a sp. PCC7120的全序列已经测定完成， 必Jafflj'/ os〃s sp. PCC7603和CaJoM/v、' sp. PCC7601部分序列已经测定。^ a6ae/ a sp. PCC7120 在GeneBank中编号为BA000019，可从所查到序列中找到所需基因(cpc5、 aZrt W7、力o7); M 7a/z i;70犯s sp. PCC7603中所用到基因序列在GeneBank中编号为M34254,可从所査到序 列中找到所需基因(c/7c5); sp. PCC7601中所用到基因序列在GeneBank中编号为 AY363679，可从所査到序列中找到所需基因(peW和pe6i9)。通过基因工程方法，将^ a力ae朋 sp.PCC7120中的aZrt W7基因克隆于Novagen公司的pETDuet-1中，所得质粒叫 pETDuet-a^rt^77，在大肠杆菌中能表达beta裂合酶。
根据GeneBank中查到的基因序列，设计引物，利用相应的藻种提取总DNA作为模板，通 过PCR扩增得到所需片段，通过上下游引物中设计的酶切位点，把目标片段转入相应质粒中 同样的酶切位点上。
(2) 将力/7afee朋sp.PCC7120中的藻蓝蛋白类脱辅基蛋白基因cpc风C1551)克隆于 Novagen公司的表达载体pCOLADuet-1中，所得质粒叫pC0LADuet-c; cMC1551)，在大肠杆菌 中能表达脱辅基蛋白藻蓝蛋白B。
(3) 将藻红胆素生物合成酶基因(力o/和peZ^)克隆于Novagen公司的pCDFDuet-l中， 所得质粒叫pCDFDuet-力o卜; eZ^，在大肠杆菌中能同时表达H01和PebB。
(4) 将藻红胆素生物合成酶基因(peW)克隆于Novagen公司的pACYCDuet-1中，所得 质粒叫pACYCDuet-; e^,在大肠杆菌中能表达PebA。
即脱辅基蛋白基因cpc5(C155I)在pCOLADuet-l第一个多克隆位点^boR I和Pst I两个 酶切位点之间；裂合酶基因sJrOW7在pETDuet-l中，处于第二个多克隆位点《WII和/力oI之间；PEB合成酶基因是3个(力o入peM和pe65)，力o7和/ eZ^在同一个载体pCDFDuet-1 中，力o7在第一个多克隆位点Afco I和尸W I之间，/3eM在第二个多克隆位点We I和J力o I 之间，pe/W在pACYCDuet-l中第二个多克隆位点《^1I和J/ o I之间。
基因插入载体的步骤为根据基因序列设计引物，分上下游， 一对；上游下游引物分别 带有酶切位点；利用相应的藻种提取总DNA作为模板；经过PCR扩增得到所需基因片段，把 所得基因片段进行电泳，回收；所得片段用设计的限制性内切酶进行酶切，同时把载体用同 样的限制性内切酶进行酶切，分别回收基因片段和载体；基因片段和载体大致h l混合，在 T4连接酶作用下连接一定时间(一般4 6小时)；连接产物转化进入大肠杆菌，利用含抗生 素的平板筛选，挑取克隆，验证正确即可。
(5 ) 将 pETDuet—Wi^W7 、 pC0LADuet-c; cMC1551) 、 pCDFDuet—力o7—peZ^禾口 pACYCDuet-pe^转入大肠杆菌，当这些质粒都转入大肠杆菌后得到大肠杆菌工程菌；将此工 程菌接种于pH 7. 0的LB培养基中，37。C振荡培养至0Ds。。为0. 5至0. 8，加入异丙基硫代-P-D-半乳糖苷(isoprophyl thiof D-galactoside，简称IPTG)至终浓度为lmmol/L， 20。C至37 'C振荡表达约12小时，生产藻蓝蛋白类荧光蛋白质藻红胆素-藻蓝蛋白B;离心收集菌体细 胞，加入缓冲液、破碎细胞后，离心收集上清液，通过附2+亲和层析，可提纯得到相应的藻 蓝蛋白类荧光蛋白质藻红胆素-藻蓝蛋白B。
将所用到的质粒的组合转入大肠杆菌中的转化方式与实施例1相同。
实施例7
(1) 从GeneBank中可以査到，藻种力朋6朋朋sp. PCC7120的全序列已经测定完成， yK 7a/wi"omssp. PCC7603和Ca7ot/ n';rsp. PCC7601部分序列已经测定。^"atee朋sp. PCC7120 在GeneBank中编号为BA000019，可从所查到序列中找到所需基因(cpcS、 aZr^77、力o7); M 7柳i/7osi/s sp. PCC7603中所用到基因序列在GeneBank中编号为M34254,可从所查到序 列中找到所需基因(cpM); Ca几t力ri;r sp. PCC7601中所用到基因序列在GeneBank中编号为 AY363679，可从所査到序列中找到所需基因(; e/W和peZ^)。通过基因工程方法，将^ afee/73 印.PCC7120中的a7r。W7基因克隆于Novagen公司的pETDuet-1中，所得质粒叫 pETDuet-a7/^W7，在大肠杆菌中能表达beta裂合酶。
根据GeneBank中查到的基因序列，设计引物，利用相应的藻种提取总DNA作为模板，通 过PCR扩增得到所需片段，通过上下游引物中设计的酶切位点，把目标片段转入相应质粒中 同样的酶切位点上。
(2) 将尨h/wV70幼ssp. PCC7603中的藻蓝蛋白类脱辅基蛋白基因c/ c5克隆于Novagen 公司的表达载体pET30中，所得质粒叫pET30-c/x^，在大肠杆菌中能表达脱辅基蛋白藻蓝蛋
13白B。
(3) 将藻红胆素生物合成酶基因(力o7和pe/^)克隆于Novagen公司的pCDFDuet-1中， 所得质粒叫pCDFDuet-力o/-peZ^，在大肠杆菌中能同时表达H01和PebB。
(4) 将藻红胆素生物合成酶基因。eZ^)克隆于Novagen公司的pACYCDuet-l中，所得 质粒叫pACYCDuet-在大肠杆菌中能表达PebA。
即脱辅基蛋白基因cp"在pET30中是在AcoRV和J力ol两个酶切位点之间；裂合酶基因 aZr^W7在pETDuet-l中，处于第二个多克隆位点《^1I和J力o I之间；PEB合成酶基因是3 个(力o厶pe似和peZ^)， Z o7和pe/^在同一个载体pCDFDuet-1中，Z o7在第一个多克隆位 点I和尸st I之间，peM在第二个多克隆位点AWe I和J7 o I之间，peM在pACYCDuet-1 中第二个多克隆位点5Wn和i7 o I之间。
基因插入载体的步骤为根据基因序列设计引物，分上下游， 一对；上游下游引物分别 带有酶切位点；利用相应的藻种提取总DNA作为模板；经过PCR扩增得到所需基因片段，把 所得基因片段进行电泳，回收；所得片段用设计的限制性内切酶进行酶切，同时把载体用同 样的限制性内切酶进行酶切，分别回收基因片段和载体；基因片段和载体大致l: l混合，在 T4连接酶作用下连接一定时间(一般4 6小时)；连接产物转化进入大肠杆菌，利用含抗生 素的平板筛选，挑取克隆，验证正确即可。
(5) 将pETDuet-aZrt W7、 pET30-cpc厌pCDFDuet-力o卜/ e65和pACYCDuet-/7eM转入大 肠杆菌，当这些质粒都转入大肠杆菌后得到大肠杆菌工程菌；将此工程菌接种于pH 7.0的 LB培养基中，37。C振荡培养至006。。为0. 5至0. 8，加入异丙基硫代-p-D-半乳糖苷(is叩r叩hyl thio-(3-D-galactoside，简称IPTG)至终浓度为lmmol/L， 2CTC至37。C振荡表达约12小时， 生产藻蓝蛋白类荧光蛋白质藻红胆素-藻蓝蛋白B;离心收集菌体细胞，加入缓冲液、破碎细 胞后，离心收集上清液，通过附2+亲和层析，可提纯得到相应的藻蓝蛋白类荧光蛋白质藻红 胆素-藻蓝蛋白B。
将所用到的质粒的组合转入大肠杆菌中的转化方式与实施例1相同。 实滩例8
(1)从GeneBank中可以査到，藻种力/7a6腦a sp.PCC7120的全序列已经测定完成， 必7a/wV osi/s sp. PCC7603和&7"A/7>sp. PCC7601部分序列已经测定。力/7aZ ae/7a sp. PCC7120 在GeneBank中编号为BA000019,可从所查到序列中找到所需基因(cpc5、 alrW77、力o/); M〗a/w'; os^ sp. PCC7603中所用到基因序列在GeneBank中编号为M34254,可从所查到序 列中找到所需基因(c/ c5); Ca7"力n'义sp. PCC7601中所用到基因序列在GeneBank中编号为 AY363679，可从所査到序列中找到所需基因(peM和pe65)。通过基因工程方法，将^7a6ae朋sp.PCC7120中的a7r6^7基因克隆于Novagen公司的pETDuet-1中，所得质粒叫 pETDuet-Wi^W7，在大肠杆菌中能表达beta裂合酶。
根据GeneBank中査到的基因序列，设计引物，利用相应的藻种提取总DNA作为模板，通 过PCR扩增得到所需片段，通过上下游引物中设计的酶切位点，把目标片段转入相应质粒中 同样的酶切位点上。
(2) 将必^zu'/7oms sp. PCC7603中的藻蓝蛋白类脱辅基蛋白基因cpc5(C155I)克隆于 Novagen公司的表达载体pET30中，所得质粒叫pET30-cpcS(C1551)，在大肠杆菌中能表达脱 辅基蛋白藻蓝蛋白B。
(3) 将藻红胆素生物合成酶基因(力o/和/jeM)克隆于Novagen公司的pCDFDuet-1中， 所得质粒叫pCDFDuet-力o7-pe6"，在大肠杆菌中能同时表达H01和PebB。
(4) 将藻红胆素生物合成酶基因(peM)克隆于Novagen公司的pACYCDuet-1中，所得 质粒叫pACYCDuet-peM，在大肠杆菌中能表达PebA。
即脱辅基蛋白基因c/x^(C155I)在pET30中是在AcoRV和i7w I两个酶切位点之间；裂 合酶基因a7r^《77在pETDuet-l中，处于第二个多克隆位点5^711和J力oI之间；PEB合成酶 基因是3个(Z o厶pe^禾Bpe6v9)，力o7和peM在同一个载体pCDFDuet-1中，Z o7在第一个 多克隆位点Afcol禾口尸"I之间，pe65在第二个多克隆位点A^el和i7 oI之间，peW在 pACYCDuet-1中第二个多克隆位点5g7II和J力ol之间。
基因插入载体的步骤为根据基因序列设计引物，分上下游， 一对；上游下游引物分别 带有酶切位点；利用相应的藻种提取总DNA作为模板；经过PCR扩增得到所需基因片段，把 所得基因片段进行电泳，回收；所得片段用设计的限制性内切酶进行酶切，同时把载体用同 样的限制性内切酶进行酶切，分别回收基因片段和载体；基因片段和载体大致l: l混合，在 T4连接酶作用下连接一定时间(一般4 6小时)；连接产物转化进入大肠杆菌，利用含抗生 素的平板筛选，挑取克隆，验证正确即可。
(5) 将pETDuet-W/^W7、 pET30-cpc5(C1551) 、 pCDFDuet-力o7-peZ^和pACYCDuet-pe^
转入大肠杆菌，当这些质粒都转入大肠杆菌后得到大肠杆菌工程菌；将此工程菌接种于pH 7. 0
的LB培养基中，37。C振荡培养至0Ds。。为0.5至0.8，加入异丙基硫代-(3-D-半乳糖苷
(isoprophyl thio-卩-D-galactoside，简称IPTG)至终浓度为lmmol/L， 20。C至37。C振荡表
达约12小时，生产藻蓝蛋白类荧光蛋白质藻红胆素-藻蓝蛋白B;离心收集菌体细胞，加入
缓冲液、破碎细胞后，离心收集上清液，通过Ni2+亲和层析，可提纯得到相应的藻蓝蛋白类
荧光蛋白质藻红胆素-藻蓝蛋白B。
将所用到的质粒的组合转入大肠杆菌中的转化方式与实施例1相同。
15实施例9
(1) 从GeneBank中可以査到，藻种^7atee/ a sp. PCC7120的全序列已经测定完成， 7a肌'/70幼s sp. PCC7603和C3J"/ n>sp. PCC7601部分序列已经测定。」/7aA3e朋sp. PCC7120
在GeneBank中编号为BA000019，可从所査到序列中找到所需基因(c; c^、 aZrW77、 M Ja啦'/7asiAS sp. PCC7603中所用到基因序列在GeneBank中编号为M34254,可从所査到序 列中找到所需基因(cpc5); Ca"tAr^ sp. PCC7601中所用到基因序列在GeneBank中编号为 AY363679，可从所査到序列中找到所需基因(; eZ^和peZ^)。通过基因工程方法，将^73&e/7a sp. PCC7120中的WrW77基因和尨Ja肌'/7oms sp. PCC7603中的藻蓝蛋白类脱辅基蛋白基因 cpc^克隆于Novagen公司的pETDuet-l中，所得质粒叫pETDuet-c/ c&W/t^77，在大肠杆菌 中能表达藻蓝蛋白类脱辅基蛋白B和beta裂合酶。
根据GeneBank中査到的基因序列，设计引物，利用相应的藻种提取总DNA作为模板，通 过PCR扩增得到所需片段，通过上下游引物中设计的酶切位点，把目标片段转入相应质粒中 同样的酶切位点上。
(2) 将藻红胆素生物合成酶基因(力o7和peM)克隆于Novagen公司的pCDFDuet-1中， 所得质粒叫pCDFDuet-力o7-pe65，在大肠杆菌中能同时表达H01和PebB。
(3) 将藻红胆素生物合成酶基因(peM)克隆于Novagen公司的pACYCDuet-1中，所得 质粒叫pACYCDuet-peW，在大肠杆菌中能表达PebA。
即脱辅基蛋白基因cpc5和裂合酶基因WrOW7在pETDuet-1中，cpc5处于第一个多克 隆位点，酶切位点是￡boR I和尸"I ， a^^W7处于第二个多克隆位点i9g7II和J力o I之间； PEB合成酶基因是3个(力o厶peW和pe/w5)，力o7和pe6i9在同一个载体pCDFDuet-l中，力W 在第一个多克隆位点I和尸"I之间，peM在第二个多克隆位点A^e I和J力o I之间，pe^ 在pACYCDuet-1中第二个多克隆位点^ /II和J/w I之间。
基因插入载体的步骤为根据基因序列设计引物，分上下游， 一对；上游下游引物分别 带有酶切位点；利用相应的藻种提取总DNA作为模板；经过PCR扩增得到所需基因片段，把 所得基因片段进行电泳，回收；所得片段用设计的限制性内切酶进行酶切，同时把载体用同 样的限制性内切酶进行酶切，分别回收基因片段和载体；基因片段和载体大致l: l混合，在 T4连接酶作用下连接一定时间(一般4 6小时)；连接产物转化进入大肠杆菌，利用含抗生 素的平板筛选，挑取克隆，验证正确即可。
(4) 将pETDuet-cpc^"aZrt 577、 pCDFDuet-力o7-pe65和pACYCDuet-pe/W转入大肠杆菌， 当这些质粒都转入大肠杆菌后得到大肠杆菌工程菌；将此工程菌接种于pH 7.0的LB培养基 中，37。C振荡培养至0D印。为0.5至0.8，加入异丙基硫代-(H3-半乳糖苷(isoprophylthio-13-D-galactoside，简称IPTG)至终浓度为l腿ol/L， 20。C至37。C振荡表达约12小时， 生产藻蓝蛋白类荧光蛋白质藻红胆素-藻蓝蛋白B;离心收集菌体细胞，加入缓冲液、破碎细 胞后，离心收集上清液，通过附2+亲和层析，可提纯得到相应的藻蓝蛋白类荧光蛋白质藻红 胆素-藻蓝蛋白B。
将所用到的质粒的组合转入大肠杆菌中的转化方式与实施例1相同。
实施例10
(1) 从GeneBank中可以査到，藻种^Wae朋sp. PCC7120的全序列已经测定完成， yK〗a/zw'/70s"ssp. PCC7603和Ca7ot/ rj'xsp. PCC7601部分序列已经测定。J/7a力3e/7a sp. PCC7120 在GeneBank中编号为BA000019，可从所查到序列中找到所需基因(c/ c5、 a7^ W7、
7a配'/70s"s sp. PCC7603中所用到基因序列在GeneBank中编号为M34254,可从所查到序 列中找到所需基因(c/7C^); CaJot/ ri义sp. PCC7601中所用到基因序列在GeneBank中编号为 AY363679，可从所查到序列中找到所需基因(/^W和pe力5)。通过基因工程方法，将力朋6朋朋 sp. PCC7120中的aZrW77基因和M 7s迈i/ o犯s sp. PCC7603中的藻蓝蛋白类脱辅基蛋白基因 c; c5 (C155I)克隆于Novagen公司的pETDuet-1中，所得质粒叫pETDuet-cpc5 (C155I) -a7^ W7，在大肠杆菌中能表达藻蓝蛋白类脱辅基蛋白B和beta裂合酶。
根据GeneBank中查到的基因序列，设计引物，利用相应的藻种提取总DNA作为模板，通 过PCR扩增得到所需片段，通过上下游引物中设计的酶切位点，把目标片段转入相应质粒中 同样的酶切位点上。
(2) 将藻红胆素生物合成酶基因(力o7和peM)克隆于Novagen公司的pCDFDuet-l中， 所得质粒叫pCDFDuet-Z o7-; eZ^，在大肠杆菌中能同时表达H01和PebB。
(3) 将藻红胆素生物合成酶基因(peM)克隆于Novagen公司的pACYCDuet-l中，所得 质粒叫pACYCDuet-pe/W，在大肠杆菌中能表达PebA。
即脱辅基蛋白基因cpcA (C155I)和裂合酶基因W/^^^在pETDuet-1中，cpc5处于第 一个多克隆位点，酶切位点是^coR I和尸"I ， WrW77处于第二个多克隆位点5g7II和J力o I之间；PEB合成酶基因是3个(力o入； e似和pe力5)，力o7和pe/^在同一个载体pCDFDuet-l 中，力o7在第一个多克隆位点I和尸"I之间，； e^在第二个多克隆位点We I和J力o I 之间，/ e^在pACYCDuet-1中第二个多克隆位点5gJII和之间。
基因插入载体的步骤为根据基因序列设计引物，分上下游， 一对；上游下游引物分别 带有酶切位点；利用相应的藻种提取总DNA作为模板；经过PCR扩增得到所需基因片段，把 所得基因片段进行电泳，回收；所得片段用设计的限制性内切酶进行酶切，同时把载体用同
样的限制性内切酶进行酶切，分别回收基因片段和载体；基因片段和载体大致l: l混合，在T4连接酶作用下连接一定时间(一般4 6小时)；连接产物转化进入大肠杆菌，利用含抗生 素的平板筛选，挑取克隆，验证正确即可。
(4)将pETDuet-cpc5(C1551) _aZrt 677、 pCDFDuet-力o7-/ e/^和pACYCDuet-转入 大肠杆菌，当这些质粒都转入大肠杆菌后得到大肠杆菌工程菌；将此工程菌接种于pH 7. 0的 LB培养基中，37。C振荡培养至0D6。。为0. 5至0. 8，加入异丙基硫代-p-D-半乳糖苷(isoprophyl thio-P-D-galactoside，简称IPTG)至终浓度为1画1/L， 2(TC至37。C振荡表达约12小时， 生产藻蓝蛋白类荧光蛋白质藻红胆素-藻蓝蛋白B;离心收集菌体细胞，加入缓冲液、破碎细 胞后，离心收集上清液，通过Ni2+亲和层析，可提纯得到相应的藻蓝蛋白类荧光蛋白质藻红 胆素-藻蓝蛋白B。
将所用到的质粒的组合转入大肠杆菌中的转化方式与实施例1相同。
实施例11
(1) 从GeneBank中可以査到，藻种勘a&e/7a sp. PCC7120的全序列己经测定完成， yK Ja啦'"os"s sp. PCC7603和CaJ"力rizsp. PCC7601部分序列已经测定。^朋力ae朋sp. PCC7120 在GeneBank中编号为BA000019，可从所查到序列中找到所需基因(cpc仏WrOW7、力o";
Ja/z y/ asdAS sp. PCC7603中所用到基因序列在GeneBank中编号为M34254,可从所查到序 列中找到所需基因(c; c5); sp. PCC7601中所用到基因序列在GeneBank中编号为
AY363679，可从所查到序列中找到所需基因。eM和pe力历。通过基因工程方法，将力朋力ae朋 sp.PCC7120中的aJ/^W7基因克隆于Novagen公司的pETDuet-1中，所得质粒叫 pETDuet-Wi^W 7，在大肠杆菌中能表达beta裂合酶。
根据GeneBank中査到的基因序列，设计引物，利用相应的藻种提取总DNA作为模板，通 过PCR扩增得到所需片段，通过上下游引物中设计的酶切位点，把目标片段转入相应质粒中 同样的酶切位点上。
(2) 将尨Ja肌'/7owssp. PCC7603中的藻蓝蛋白类脱辅基蛋白基因cpc万克隆于Novagen 公司的表达载体pCOLADuet-l中，所得质粒叫pC0LADuet-c; cA在大肠杆菌中能表达脱辅基 蛋白藻蓝蛋白B。
(3) 将藻红胆素生物合成酶基因(力o/和pe6《克隆于Novagen公司的pCDFDuet-1中， 所得质粒叫pCDFDuet-力o7-pe6A在大肠杆菌中能同时表达H01和PebB。
(4) 将藻红胆素生物合成酶基因(peW)克隆于Novagen公司的pACYCDuet-1中，所得 质粒叫pACYCDuet-pe力A在大肠杆菌中能表达PebA。
即脱辅基蛋白基因cpW在pC0LADuet-l第一个多克隆位点feoR I和Pst I两个酶切位点 之间；裂合酶基因a7r。W7在pETDuet-1中，处于第二个多克隆位点《 7II和J力ol之间；PEB合成酶基因是3个(力o7、 ； e^和； eZ^)，力o7和pe65在同一个载体pCDFDuet-1中，Z o7 在第一个多克隆位点I禾n尸"I之间，peM在第二个多克隆位点A^e I和Z力o I之间，peM 在pACYCDuet-l中第二个多克隆位点勘JII和J力o I之间。
基因插入载体的步骤为根据基因序列设计引物，分上下游， 一对；上游下游引物分别 带有酶切位点；利用相应的藻种提取总DNA作为模板；经过PCR扩增得到所需基因片段，把 所得基因片段进行电泳，回收；所得片段用设计的限制性内切酶进行酶切，同时把载体用同 样的限制性内切酶进行酶切，分别回收基因片段和载体；基因片段和载体大致l: l混合，在 T4连接酶作用下连接一定时间(一般4 6小时)；连接产物转化进入大肠杆菌，利用含抗生 素的平板筛选，挑取克隆，验证正确即可。
(5)将pETDuet-aZr。W7、 pC0LADuet-c; c仏pCDFDuet-/ o7-pe65和pACYCDuet-/ e力力转 入大肠杆菌，当这些质粒都转入大肠杆菌后得到大肠杆菌工程菌；将此工程菌接种于pH 7. 0 的LB培养基中，37'C振荡培养至0D6。。为0.5至0.8，加入异丙基硫代-P-D-半乳糖苷 (isoprophyl thio-(3-D-galactoside,简称IPTG)至终浓度为1扁1/L， 20。C至37。C振荡表 达约12小时，生产藻蓝蛋白类荧光蛋白质藻红胆素-藻蓝蛋白B;离心收集菌体细胞，加入 缓冲液、破碎细胞后，离心收集上清液，通过附2+亲和层析，可提纯得到相应的藻蓝蛋白类 荧光蛋白质藻红胆素-藻蓝蛋白B。
将所用到的质粒的组合转入大肠杆菌中的转化方式与实施例1相同。
实施例12
(1) 从GeneBank中可以查到，藻种力朋/bae朋sp.PCC7120的全序列已经测定完成， yK 7柳i/7os"s sp. PCC7603和C^ot/ /7>sp. PCC7601部分序列已经测定。力/ atee/33 sp. PCC7120 在GeneBank中编号为BA000019，可从所査到序列中找到所需基因(cpc万、a7rW77、力o7); M Jay772'/70s"s sp. PCC7603中所用到基因序列在GeneBank中编号为M34254,可从所査到序 列中找到所需基因(cpc5); Ca7"/ ri义sp. PCC7601中所用到基因序列在GeneBank中编号为 AY363679，可从所查到序列中找到所需基因(pe^和peZ^)。通过基因工程方法，将^ a^e朋 sp.PCC7120中的aJ^^77基因克隆于Novagen公司的pETDuet-1中，所得质粒叫 pETDuet-a7/^W7，在大肠杆菌中能表达beta裂合酶。
根据GeneBank中査到的基因序列，设计引物，利用相应的藻种提取总DNA作为模板，通 过PCR扩增得到所需片段，通过上下游引物中设计的酶切位点，把目标片段转入相应质粒中 同样的酶切位点上。
(2) 将必7柳i/70S^ sp. PCC7603中的藻蓝蛋白类脱辅基蛋白基因cpc5(C1551)克隆于 Novagen公司的表达载体pCOLADuet-l中，所得质粒叫pC0LADuet-c/x^(C1551)，在大肠杆菌中能表达脱辅基蛋白藻蓝蛋白B。
(3) 将藻红胆素生物合成酶基因(力o7和克隆于Novagen公司的pCDFDuet-1中， 所得质粒叫pCDFDuet-/ o7-; e/^，在大肠杆菌中能同时表达H01和PebB。
(4) 将藻红胆素生物合成酶基因(peM)克隆于Novagen公司的pACYCDuet-l中，所得 质粒叫pACYCDuet-pe似，在大肠杆菌中能表达PebA。
即脱辅基蛋白基因cpc^(C155I)在pCOLADuet-1第一个多克隆位点feoR I和Pst I两个 酶切位点之间；裂合酶基因aZrt W7在pETDuet-1中，处于第二个多克隆位点5^HI和Z力o I之间；PEB合成酶基因是3个(力o7、 pe似和/ e65)，力o/和peZ^在同一个载体pCDFDuet-l 中，力o/在第一个多克隆位点tVco I和尸W I之间，； eM在第二个多克隆位点M/e I和i7w I 之间，pe/W在pACYCDuet-1中第二个多克隆位点餘7II和J力o I之间。
基因插入载体的步骤为根据基因序列设计引物，分上下游， 一对；上游下游引物分别 带有酶切位点；利用相应的藻种提取总DNA作为模板；经过PCR扩增得到所需基因片段，把 所得基因片段进行电泳，回收；所得片段用设计的限制性内切酶进行酶切，同时把载体用同 样的限制性内切酶进行酶切，分别回收基因片段和载体；基因片段和载体大致l: l混合，在 T4连接酶作用下连接一定时间(一般4 6小时)；连接产物转化进入大肠杆菌，利用含抗生 素的平板筛选，挑取克隆，验证正确即可。
(5 ) 将 pETDuet-a^r。W7 、 pC0LADuet-c; Ci9(C1551) 、 pCDFDuet-力o -peZ^和 pACYCDuet-; eW转入大肠杆菌，当这些质粒都转入大肠杆菌后得到大肠杆菌工程菌；将此工 程菌接种于pH 7. 0的LB培养基中，37'C振荡培养至0Ds。。为0. 5至0. 8，加入异丙基硫代-p-D-半乳糖苷(isopr叩hyl thio-(3-D-galactoside，简称IPTG)至终浓度为1画1/L， 20。C至37 'C振荡表达约12小时，生产藻蓝蛋白类荧光蛋白质藻红胆素-藻蓝蛋白B;离心收集菌体细 胞，加入缓冲液、破碎细胞后，离心收集上清液，通过附2+亲和层析，可提纯得到相应的藻 蓝蛋白类荧光蛋白质藻红胆素-藻蓝蛋白B。
将所用到的质粒的组合转入大肠杆菌中的转化方式与实施例1相同。
20
权利要求
1. 一种结合藻红胆素的藻蓝蛋白荧光探针的制备方法，其特征在于包括下述步骤(1)用基因工程方法，将beta裂合酶基因或其同源基因克隆于表达载体中，得到beta裂合酶表达质粒；(2)用基因工程方法将藻蓝蛋白类脱辅基蛋白基因或其同源基因克隆于第二个表达载体中，得到脱辅基蛋白表达质粒；(3)用基因工程方法将藻红胆素生物合成酶基因hol和pebB或其同源基因克隆于第三个表达载体中，得到hol和pebB表达质粒；(4)用基因工程方法将藻红胆素生物合成酶基因pebA或其同源基因克隆于第四个表达载体中，得到pebA表达质粒；(5)将beta裂合酶表达质粒、脱辅基蛋白表达质粒、hol和pebB表达质粒及pebA表达质粒依次转入配套的宿主菌，当这些表达质粒都转入宿主菌后，得到相应的工程菌，应用此工程菌通过发酵工程能生产结合藻红胆素的藻蓝蛋白类荧光蛋白质；发酵后，按常规蛋白质提纯技术，提纯得到相应的结合藻红胆素的藻蓝蛋白类荧光蛋白质。
2. —种结合藻红胆素的藻蓝蛋白荧光探针的制备方法，其特征在于包括下述步骤(1) 用基因工程方法，将beta裂合酶基因或其同源基因和藻蓝蛋白类脱辅基蛋白基因或其同源基因同时克隆于表达载体中，得到beta裂合酶和藻蓝蛋白类脱辅基蛋白表达质粒；(2) 用基因工程方法将藻红胆素生物合成酶基因力o7和pe/^或其同源基因克隆于第二个表达载体中，得到力W和peM表达质粒；(3) 用基因工程方法将藻红胆素生物合成酶基因pe似或其同源基因克隆于第三个表达载体中，得到pe^表达质粒；(4) 将beta裂合酶表达质粒和脱辅基蛋白表达质粒、力o7和pW万表达质粒及pe^表达质粒依次转入配套的宿主菌，当这些表达质粒都转入宿主菌后，得到相应的工程菌，应用此工程菌通过发酵工程能生产结合藻红胆素的藻蓝蛋白类荧光蛋白质；发酵后，按常规蛋白质提纯技术，提纯得到相应的结合藻红胆素的藻蓝蛋白类荧光蛋白质。
3. 根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述的宿主菌为大肠杆菌。
4. 根据权利要求1和2所述的方法，其特征在于，所述的beta裂合酶基因是指与力/7ate朋asp. PCC7120中alrt W7基因同源的基因。
5. 根据权利要求1和2所述的方法，其特征在于，所述的藻蓝蛋白类脱辅基蛋白基因是指与力朋力ae朋sp. PCC7120或尨JaM'/7o幼s sp. PCC7603中c;x^基因同源的基因。
全文摘要
本发明公开了一种结合藻红胆素的藻蓝蛋白类荧光蛋白质的制备方法，通过应用藻胆蛋白beta裂合酶催化藻红胆素与藻蓝蛋白类脱辅基蛋白共价结合，制备结合藻红胆素的藻蓝蛋白类荧光蛋白质；本发明的方法应用生物过程生产新型的藻蓝蛋白类荧光蛋白质，是一种环境友好的生产方法；藻蓝蛋白类荧光蛋白质能应用于食品、保健与医药功能材料领域，特别是应用为生物和医学分子监测领域的荧光探针。
文档编号C12N15/60GK101463356SQ20071003271
公开日2009年6月24日 申请日期2007年12月19日 优先权日2007年12月19日
发明者伍贤军, 明 周, 坤 夏, 赵开弘 申请人:广州天宝颂原生物科技开发有限公司;华中科技大学